一种用于MDBK细胞的无血清冻存培养基的制作方法

本发明属于细胞及生物工程技术领域，涉及一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基。

背景技术：

细胞培养技术广泛用于生命科学研究的研究，在实验中有必要对细胞株进行的冷冻保存留种及方便后续不同时间实验的进行。连续细胞株的冻存可减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变以及避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。一般是用甘油或二甲基亚砜(dmso)以及血清添加在基础培养基中来冻存细胞，这些添加剂能保护细胞抵抗细胞内冰晶和渗透效应引起的冷冻损伤。冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，一般可分为渗透性与非渗透性两类。一般非渗透性保护剂是大分子聚合物，不能渗透到细胞内部，通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤和结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶损伤。常用的有：蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)、葡聚糖(dextran)、白蛋白(albumin)及羟乙基淀粉(hes)等。而渗透性保护剂则主要为小分子物质，多易溶于水，与水分子结合的能力强，易穿透细胞膜进入细胞内部，在细胞内能降低细胞的冰点；并提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成；复苏时促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤；稀释未结冰溶液中电解质的浓度，减少溶质损伤。主要有以下几种：甘油、二甲基亚砜(dmso)、丙二醇、乙二醇等。

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂缓慢冷冻法来冻存细胞，如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水份会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应，如：细胞脱水使局部电解质浓度增高、导致ph值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，从而引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易被破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核dna空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，这样可以最大限度的保存细胞活力。在现有技术中冻存细胞均使用血清与dmso混合的方法，因动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致；取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性，且血清成本高昂。

1957年2月18日，s.h.madin和n.b.darby从一只表观正常的成年牛肾脏建立了mdbk细胞株。通常mdbk细胞是以贴壁方式生长的上皮样细胞。目前，mdbk细胞系广泛用于多种牛源病毒的增殖和纯化，如：牛副流感病毒3型(bovineparainfluenzavirustype3,bpiv3)，牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheavirus,bvdv），牛疱疹病毒1型(bovineherpesvirus1,bohv-1)，牛呼吸道合胞体病毒(bovinerespiratorysyncytialvirus,brsv)等。现有的针对mdbk细胞的冻存方案常采用10％dmso及20~50％fbs的冻存方案去保存mdbk细胞，该方案能够很好的为细胞提供营养物质，该含血清细胞冻存方案其细胞回收率约可达到85~90％，细胞活率约可达到93~95％左右。细胞经短时间冻存再复苏后仍能维持较高的活率。但是，在细胞培养及冻存中使用的胎牛血清或小牛血清可导致一些问题，尤其是mdbk细胞作为牛源细胞系，广泛应用于牛源病毒的研究及疫苗制备等研究，其对牛血清内存在的病毒敏感，应用于细胞培养及冻存的血清质量易对其造成影响。而且近年来，针对于包括mdbk细胞在内的许多动物细胞系的低血清、无血清培养基及该种培养方式的研究已经成为热点，促使我们需要开发无血清冻存的方式来维持这种无血清培养模式。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基，用于解决目前在冻存mdbk细胞时，需要添加胎牛血清或小牛血清，容易引入牛源病毒的问题。

本发明通过以下技术方案来实现：一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基，包含的组分及体积百分比浓度为：9～11%的二甲基亚砜、1～3％的右旋糖酐40溶液，余量为dmem高糖培养基，其中，所述的右旋糖酐40溶液为质量百分比浓度为10%的右旋糖酐40的dmem高糖培养基溶液。本发明对所述dmem高糖培养基的来源没有特殊的限制，具体的，可采用gibco公司提供的规格为500ml/瓶的dmen高糖培养基，该培养基为常规的市售产品。

进一步的，所述的二甲基亚砜的体积百分比浓度为10%。本发明对所述二甲基亚砜的来源没有特殊的限制，采用常规的市售商品即可。

进一步的，所述的右旋糖酐40溶液的体积百分比浓度为1%。本发明对所述右旋糖酐40的来源没有特殊的限制，具体的，可采用合肥博美生物科技有限责任公司有限公司提供的右旋糖酐40粉末。

作为本发明的进一步改进，所述的体积百分比浓度为1～3％的右旋糖酐40溶液被体积百分比浓度为6～8%的海藻糖溶液替换，所述的海藻糖溶液为浓度为1mol/l的海藻糖的dmem高糖培养基溶液。

进一步的，所述的二甲基亚砜的体积百分比浓度为10%。本发明对所述二甲基亚砜的来源没有特殊的限制，采用常规的市售商品即可。

进一步的，所述的海藻糖溶液的体积百分比浓度为7%。本发明对所述海藻糖的来源没有特殊的限制，具体的，可采用合肥博美生物科技有限责任公司有限公司提供的海藻糖粉末。

具体的，冻存培养基中细胞浓度不得低于4～5×10⁶cells/ml。

采用上述技术方案的积极效果：本发明中的dmso易穿透细胞，在细胞冻存过程中可以使冰点下降，减少细胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤；右旋糖酐40和海藻糖则起到稳定细胞膜的作用，避免细胞遭受冻存伤害；dmem高糖培养基则维持电解质平衡及提供营养成分；由于不添加动物来源的血清，避免了动物来源的病毒污染，实验结果表明，使用本发明中冻存液的两种技术方案在冻存90d后的细胞复苏率分别为92.77±2.99％和92.74±1.23％。

附图说明

图1为采用本发明的技术方案一冻存mdbk细胞90d后复苏后培养12h的细胞状态图；

图2为采用本发明的技术方案二冻存mdbk细胞90d后复苏后培养12h的细胞状态图；

图3为采用血清冻存对照组冻存mdbk细胞90d后复苏后培养12h的细胞状态图。

具体实施方式

本发明中生物材料的来源：

1、mdbk细胞购自中国兽医药品监察所。

下面结合具体的实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基，包含的组分及体积百分比浓度为：11%的二甲基亚砜、2％的右旋糖酐40溶液，余量为dmem高糖培养基。其中，所述的右旋糖酐40溶液为质量百分比浓度为10%的右旋糖酐40的dmem高糖培养基溶液，指的是将dmem高糖培养基作为溶剂，将右旋糖酐40稀释成质量百分比浓度为10%的溶液。

实施例2

一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基，包含的组分及体积百分比浓度为：10%的二甲基亚砜、1％的右旋糖酐40溶液，余量为dmem高糖培养基。其中，所述的右旋糖酐40溶液为质量百分比浓度为10%的右旋糖酐40的dmem高糖培养基溶液，指的是将dmem高糖培养基作为溶剂，将右旋糖酐40稀释成质量百分比浓度为10%的溶液。

实施例3

一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基，包含的组分及体积百分比浓度为：9%的二甲基亚砜、3％的右旋糖酐40溶液，余量为dmem高糖培养基。其中，所述的右旋糖酐40溶液为质量百分比浓度为10%的右旋糖酐40的dmem高糖培养基溶液，指的是将dmem高糖培养基作为溶剂，将右旋糖酐40稀释成质量百分比浓度为10%的溶液。

实施例4

一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基，包含的组分及体积百分比浓度为：9%的二甲基亚砜、8%的海藻糖溶液，余量为dmem高糖培养基。其中，所述的海藻糖溶液为浓度为1mol/l的海藻糖的dmem高糖培养基溶液，指的是将dmem高糖培养基作为溶剂，将海藻糖稀释成浓度为1mol/l的溶液。

实施例5

一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基，包含的组分及体积百分比浓度为：10%的二甲基亚砜、7%的海藻糖溶液，余量为dmem高糖培养基。其中，所述的海藻糖溶液为浓度为1mol/l的海藻糖的dmem高糖培养基溶液，指的是将dmem高糖培养基作为溶剂，将海藻糖稀释成浓度为1mol/l的溶液。

实施例6

一种用于mdbk细胞的无血清冻存培养基，包含的组分及体积百分比浓度为：11%的二甲基亚砜、6%的海藻糖溶液，余量为dmem高糖培养基。其中，所述的海藻糖溶液为浓度为1mol/l的海藻糖的dmem高糖培养基溶液，指的是将dmem高糖培养基作为溶剂，将海藻糖稀释成浓度为1mol/l的溶液。

试验例1

无血清冻存mdbk细胞：

使用pbs清洗贴壁mdbk细胞表面两次，使用胰蛋白酶分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。在dmem培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。以大约200r/min离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

使用实施例1-3的技术方案做成冻存培养基。

每个冻存管冻存液加1.5ml的冻存培养基，初始冻存细胞数为平均3.8×106cells/ml，细胞活率99.1％。在冻存液中悬浮细胞，分装进冻存管，设立三组重复，将冻存管放入4℃冰箱中30min，-20℃冰箱中90min，在将冻存管放到-80℃的冰箱中过夜，然后转移到液氮中贮存。

冻存mdbk细胞的复苏。冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。细胞对冻存剂dmso敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。取出贮存细胞，本试验中选用40℃下先溶解后再37℃恒温水浴锅中复苏的方式进行细胞复苏，细胞所在的冻存液温度并未达到40℃的水浴温度，但同时加快了冻存细胞的解冻时间，有利于快速复苏，提高复苏成活率。把1.5ml冻存细胞加入到大约15ml完全生长培养基，轻轻混匀。以大约1000r/min离心5到10分钟，弃去上清，用10%fbs培养基轻轻吹吸使细胞再次悬浮，转入25cm2方瓶中培养。最后，放入5％co2湿度37℃恒温培养箱中培养。

取10μl0.4％台盼蓝与10μl冻存细胞复苏后混合液均匀混合后，用移液枪点样到血球计数板，置于倒置显微镜下观察、计数。显微镜图片如图1所示。

技术方案一复苏后细胞计数结果如下，复苏后总细胞数(1.66±0.31)×10⁶，细胞回收率为47.42±8.86％，活细胞数为(1.54±0.24)×10⁶，细胞活率为92.77±2.99％。

试验例2

无血清冻存mdbk细胞：

使用pbs清洗贴壁mdbk细胞表面两次，使用胰蛋白酶分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。在dmem培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。以大约200r/min离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

使用实施例4-6的技术方案做成冻存培养基。

每个冻存管冻存液加1.5ml的冻存培养基，初始冻存细胞数为平均3.8×10⁶cells/ml，细胞活率99.1％。在冻存液中悬浮细胞，分装进冻存管，设立三组重复，将冻存管放入4℃冰箱中30min，-20℃冰箱中90min，在将冻存管放到-80℃的冰箱中过夜，然后转移到液氮中贮存。

冻存mdbk细胞的复苏。冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。细胞对冻存剂dmso敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。取出贮存细胞，本试验中选用40℃下先溶解后再37℃恒温水浴锅中复苏的方式进行细胞复苏，细胞所在的冻存液温度并未达到40℃的水浴温度，但同时加快了冻存细胞的解冻时间，有利于快速复苏，提高复苏成活率。把1.5ml冻存细胞加入到大约15ml完全生长培养基，轻轻混匀。以大约1000r/min离心5到10分钟，弃去上清，用10%fbs培养基轻轻吹吸使细胞再次悬浮，转入25cm2方瓶中培养。最后，放入5％co2湿度37℃恒温培养箱中培养。

取10μl0.4％台盼蓝与10μl冻存细胞复苏后混合液均匀混合后，用移液枪点样到血球计数板，置于倒置显微镜下观察、计数(重复3次计数)。显微镜图片如图2所示。

技术方案二复苏后细胞计数结果如下，复苏后总细胞数(1.24±0.21)×106，细胞回收率为35.43±6.00％，活细胞数为(1.15±0.18)×106，细胞活率为92.74±1.23％。

试验例3

操作方法同试验例1-2，采用总体积分数10％dmso及20％fbs以及余量为dmem高糖培养基的冻存方案去保存mdbk细胞，血清冻存对照组复苏后细胞计数结果如下，复苏后总细胞数为（5.27±0.34)×10⁶，细胞回收率为90.83±0.05%，活细胞数为（5.05±0.18)×10⁶，细胞活率为95.82±3.41%。显微镜图片如图3所示。

由试验例1-3对比可以看出，本发明的无血清冻存培养基在冻存90d后的细胞复苏率与以往的添加牛血清的培养基相比，复苏后细胞活率几乎相当，且由于不添加动物来源的血清，避免了动物来源的病毒污染，可保证后期实验的进行以及保证实验结果的可靠性。