专利名称：抗细菌的胺衍生物的制作方法
杀细菌和其它致病生物体的氨基化合物的甲醛衍生物。
溶血性尿毒综合征(HUS)或“汉堡病”这一问题在美国呈上升趋势。其引起严重的胃抽筋，带血腹泻并且经常使儿童和老年丧命。这种疾病由称为大肠杆菌0157:H7的细菌引起。其发病可能在卫生部门有机会干预之前它已发作，因为在食用被污染的食品后2-7天才会出现症状而且感染大肠杆菌0157:H7的许多人开始都被认为是染上流感并等待其恢复。对于儿童，这种延误常常导致晚期感染，约20％晚期感染会发展为HUS。染上HUS后约2％的人死亡。1993年一个公知事故发生在Kings County,WA的一个具体餐厅，人们食用牛肉后导致超过400成年人和儿童感染。其中两个儿童死亡，几个人病情严重，一个人持续昏迷。这种疾病不限于烹调后的肉和家禽产品。1991年在Fall River MA区当人们饮用鲜榨苹果汁后大肠杆菌0157:H7爆发引起23人病情严重，但是没有发生死亡事件。在新伤口中也可能发生组织的直接感染。
现在美国人每年经历约20,000起食品引起的(foodborn)的大肠杆菌0157:H7感染并且其数量在增长。大肠杆菌0157:H7是特别有毒的细菌。患者仅需要被几个细菌感染则出现食物中毒症状，因为其可以在肠中生长，最后引起肠内壁溃疡。该细菌还产生与高度中毒的志贺氏毒素相关的毒素，然后其通过肠溃疡进入血流。该细菌毒素流向肾，被肾捕集并损伤肾，引起HUS。患有HUS的人没有肾功能，为了维持生命必须进行透析或者进行肾移植。
许多不同的抗菌化合物是已知的，其可消除食物中的细菌污染，可消毒药物和医疗设备，并能治愈动物和植物的系统或局部感染。但是，由于即使是低感染量的高毒性细菌也能引起疾病，所以仅仅灭菌一次还不能保证的物品绝对安全，因为食品和其它物品在初次灭菌处理后有时可能很容易被再次污染。最近美国食品和药品管理局(FDA)已经批准用二氧化氯作浸泡液用于杀死牛肉上的大肠杆菌和沙门氏菌。然而由于二氧化氯和牛肉中的有机化合物之间的化学反应，其杀细菌活性短时间后消失，因此其不能提供长期保护免受再污染。本发明提供杀死高毒性细菌的方法及保护处理过的物品免受细菌再度污染。本发明还提供对细菌感染的系统和局部处理的方法。
本发明目的之一是提供杀细菌组合物，该组合物包括(a)甲醛与(b)具有两个NH基团的式Ⅰ化合物的反应产物，R1NH(COR2)CH(CH2)nR3, (Ⅰ)其中R1是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，或R4CO基团；R4是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，C1-10烷氧基，C1-10烷基氨基，C1-10二烷基氨基或C1-10硫代烷基；R2是H，C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，C1-10烷氧基，C1-10烷基氨基，C1-10二烷基氨基或C1-10硫代烷基；及R3是R5NH-,R5NHCO-,R5CONH-,-NC(=NR5)NHR5,-NC(=NR5)NR5R5或含有NH部分的杂环基，其中R5独立地是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，及n是0-6之间的整数。
本发明另一个目的是提供没有被大肠杆菌0157:H7污染并且抵制进一步被细菌污染的人或动物用食品，其含有甲醛和式Ⅰ化合物的反应产物。
本发明另一个目的是提供消毒或保护物品免受细菌污染的方法，该方法包括将被细菌污染的物品用有效量的(a)甲醛和(b)式Ⅰ化合物的反应产物处理。
本发明另一个目的是提供杀细菌组合物，该组合物包括1-50％(重量)(1)赖氨酸，精氨酸，组氨酸，谷酰胺，苏氨酸或天冬氨酸或其盐，和(2)甲醛的的反应产物；和载体。
本发明另一个目的是提供式H2N(CO2H)CH(CH2)4NHCH2NH(CO2H)CH(CH2)4NH2抗菌化合物或其盐。
本发明胺-甲醛加合物用作(1)人和动物食品的化学防腐剂以防止食品因微生物变质和延长其存放期，(2)消毒以减少，消除或防止食品或其它物品如用于食品制作的布，塑料和金属被细菌污染及(3)用于植物和动物的系统或局部细菌感染处理。
本发明抗微生物化合物的生产是通过将上述式Ⅰ化合物的溶液或固体暴露在甲醛中形成杀微生物的产物。微生物包括以下细菌属埃希氏杆菌属，沙门氏菌属，利斯特氏菌属，梭状芽孢菌属，芽孢杆菌属，葡萄球菌属，弯曲杆菌属和耶尔森氏菌属。它们特别被用于控制涉及食品安全的微生物，如大肠杆菌0157:H7，单核细胞增生利斯特氏菌，肉毒梭状芽孢杆菌，Clostridiumhermosaccharolyticum，嗜热脂肪芽孢杆菌，酪丁酸梭状芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，产气荚模梭状芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲杆菌空肠亚种，鼠伤寒沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。
可以用本发明控制的涉及农作物的微生物包括土壤杆菌属，欧文氏杆菌属，假单孢菌属，黄单孢菌属，和芽孢杆菌属。
可以用本发明产物处理的动物感染包括以下菌属链球菌属，葡萄球菌属，棒状杆菌属，利斯特氏菌属，丹毒丝菌属，芽孢杆菌属，梭状芽孢杆菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌，巴斯德氏菌属，布鲁氏菌属，嗜血菌属，莫拉氏菌属，分支杆菌属，放线菌属(Actinomyus)，放线芽孢杆菌属，诺卡氏菌属，嗜皮菌属，梭杆菌属，弯曲杆菌属，和钩端螺旋体属。
在本公开中，抗污染指对于每克中有1000cfu大肠杆菌0157:H7的食品经过在25℃培养24小时后使每25克食品中只有1cfu或更少的大肠杆菌0157:H7。
本发明化合物在水溶液中保持较长时间的生物活性，因此被认为不会释放甲醛，但是现在还不知其作用方式。形成产物的化学反应可以缩合反应为特征。
式Ⅰ化合物可以游离胺或有机酸盐或无机酸盐形式反应。盐酸盐可提高水溶性并且是优选的盐。可以使用的其它盐包括乙酸盐，甲酸盐和硫酸盐。当与甲醛的反应在溶液中进行时，优选溶剂是水或水和C1-4醇的混合物。可以使用的其它有机溶剂包括卤代烃，乙酸乙酯，乙腈和二甲基甲酰胺。当如果与固体式Ⅰ化合物反应时，游离碱是优选的。
一般用以下方法方便地提供甲醛通过将空气或氮气(300至500cc/分钟)通入37％甲醛水溶液(福尔马林)中或在空气或氮气流中加热低聚甲醛以形成气态甲醛并且使该气体通过式Ⅰ化合物的溶液或粉末状固体式Ⅰ化合物同时搅拌粉末。该反应通常需要1-15摩尔当量的甲醛。
通过减压蒸发溶剂分离产物，并且通过Sephadex，离子交换树脂，硅胶或反相(亲水)树脂等，柱色谱纯化剩余物，并用已知方法及用水，C1-4醇类，乙腈，乙酸乙酯，C1-10烃及其混合物作溶剂。
可以用胺衍生物制成抗污染食物的动物类食品包括但不限于牛肉，猪肉，家禽，羊肉，鱼和其它海鲜。一般将抗菌组合物撒在食品表面或者将食品浸泡在浓度0.1-1.0wt％的抗菌水溶液中。如果动物类食品已经被粉碎，如火腿肠或香肠，可向其中加入0.1-1.0wt％的固体或0.1-1.0wt％的溶液量的抗菌组合物。
可以消毒动物饲料并且使其抗污染。实例包括但不限于烤制促酵物饲料和烤制生长物饲料。
可以免受细菌污染的具体食品包括水，牛奶，奶酪，鸡肉，所有类型的鱼肉，用于蛋黄酱的蛋清，牛肉馅，处理过的肉，香蕉，西红柿，其它水果和蔬菜，尿布产品，粉末或液体婴儿用产品，用于预防或处理女性酵母菌感染的产品，花类和肥皂。
消毒溶液的具体用途包括医院，家庭护理，日护理(daycare)中心和医生办公室的清洁剂，患处药膏，手套用涂料和手术室用布，在手术期间开放区域杀菌用喷剂，在艾滋病护理设备中杀菌用喷剂，药物，卫生纸，湿巾，空气导管系统，绷带担架箱，农作物撒布组合物，装载液体或块状食品的清洁车或容器，类似Lysol的空气喷雾剂，淋浴器和厕所用清洁剂，乳牛奶头浸泡，进入冰库或加工厂之前洗涤鹿以保持肉新鲜，动物围栏中覆盖的地板，在护理人员进行口对口复苏术前拭抹以清洁口腔，医疗或牙科设备的清洁剂，人类食品的防腐剂，狗食防腐剂，罐头食品的防腐，牙膏添加剂和口腔洗液添加剂。
优选的含蛋产品是加工的蛋，蛋架，奶酪，沙拉酱，面条，和面包店货物。优选的含牛奶产品是奶粉，婴儿配方，冰淇淋，酸奶，牛奶巧克力，乳酪和奶酪。
在上述式(Ⅰ)中，术语芳基指取代或未取代的苯基和取代或未取代的萘基。含有NH部分的杂环基包括吡咯基，咪唑基，吡唑基，异吲哚基，吲哚基，吡咯烷基，咪唑啉基和二氢吲哚基。优选的基团是组氨酸的5-咪唑基。术语5-或6-员杂环基指未取代或取代的硫代苯基，呋喃基，吡咯基，咪唑基，吡啶基，异噁唑基，咪唑烷基，哌啶基，哌嗪基和吗啉基。在芳基，含有NH部分的杂环基，5-或6-员杂环基上的任意取代基是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10烷氧基，氟，氯，溴，碘，C1-10一或二烷基氨基，C1-10烷氧基和氰基。
用下列非限定性实施例说明本发明。
实施例1将d,l-赖氨酸(2,6-二氨基己酸)仔细研磨并真空干燥。将干燥的粉末(100g)转移至1升圆底烧瓶中。通过充入福尔马林(500ml/分钟)(37％的甲醛水溶液)产生甲醛蒸气并且通过粉末表面96小时。将该产物真空干燥并在Sephadex G-10(600ml)上进行柱色谱纯化，用蒸馏水洗脱。根据时间收集柱洗脱液的流出液并用用于蛋白测定的Bradford方法鉴定含有产物的流出液。合并含有产物的流出液并冷冻干燥为干粉。产率40％，在Bradford方法中，蓝色染料结合蛋白中特定氨基酸中的芳香基团。与标准曲线比较测定蛋白的浓度。染料将结合氨基酸中的其它基团但是不敏感(特定)。
实施例2分别将下列氨基酸(2g)溶解在500ml Erlenmeyer烧瓶中的200ml去离子水中。通过充入37％甲醛溶液(500ml/分钟)6小时加入甲醛至每个水溶液中。将溶液冷冻并冷冻干燥脱水。将剩余物转移至铝锅中并通过在40℃干燥24小时蒸发任何残余的甲醛。然后在60℃干燥加合物48小时。通过将100mg加合物溶解在10ml 98％的乙醇(10mg/ml)获得加合物的储存溶液。将储存液稀释在水中用于抗微生物试验。
加合物的抗微生物试验将鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌(0157:H7)的培养物转移至小牛肉浸泡的肉汤中并在37℃培养24小时。通过系列稀释液和选择性琼脂平皿测定细菌的数量(细胞/ml)。用小牛肉浸泡肉汤稀释细菌/ml浓度至107。将加合物溶液的等分液加到含有沙门氏菌和大肠杆菌的小牛肉浸泡肉汤的试验试管中以得到最终浓度为1mg/ml的加合物。将培养物在5℃培养1和24小时。将游离赖氨酸和赖氨酸加合物用作负和正对照。处理1和24小时后，将100μl小牛肉浸泡肉汤铺在选择性琼脂平皿上。在计算细菌前将该平皿在37℃培养。
实施例3
抗菌化合物用于火腿肉防腐的试验方案1．将1kg买到的火腿肠肉充分混合并分成两个500g小样品。
2．将含有大肠杆菌0157:H7的等分小牛肉浸泡肉汤加到每个500g小样品中以得到最终浓度为100菌落形成单位/g。
3．将50g根据实施例2获得的抗菌化合物的水溶液(10wt％溶液)加到一个小样品中并与火腿肉充分混合。
4．将50g去离子水(对照处理)加到第二个小样品中并与肉充分混合。
5．将25g处理过的肉放在无菌陪替氏平皿中并在7-8℃培养5天。每种处理一式10份样品。
6．5天后，从陪替氏平皿中除去每种处理的1个样品并转移至500ml含有225ml的磷酸盐缓冲液的瓶中。
7．将该溶液用腕作用振荡摇动30分钟，用无菌磷酸盐缓冲液系列稀释并铺在选择性琼脂中。
8．将培养盘在35℃培养24小时然后计数大肠杆菌，总细菌和肠杆菌属。
9．在6,7,8,9,10,12,14,16和18天重复步骤6到8。
实施例4计数饲料和食品中的大肠杆菌群通过机械搅拌将细菌悬浮在磷酸盐缓冲液中。将上清液放在选择性培养基上并在计数前培养18-24小时。
试剂TX-100储存液将20.0g Triton X-100移液至500ml安纳晶试剂瓶中。加入400ml去离子水并搅拌。储存在冰箱中。该溶液可储存多达4星期。
Butterfield磷酸盐/TX-缓冲稀释液(BX)将510g磷酸钾(KH2PO4)溶解在15L小口玻璃瓶中的7500ml去离子水中。加入2850ml 1N氢氧化钠(NaOH)以调节pH至7.2。加入4650ml去离子水以调节体积至15L。加入127.5ml氯化钠(NaCl)。移液15ml TX-100储存液。分液至2L试剂瓶中。在121℃加压灭菌45分钟(注意在加压灭菌期间应盖上瓶盖)。当试剂已经冷却至室温时，无菌加到灭菌Brinkmann Dispensette上并检查校准。
MacConkey琼脂板将50g MacConkey琼脂基质加到agarmatic容器(多达最大容量3L/转)的1L去离子水中。灭菌15分钟。当循环完成后，连接灭菌分液装置。准备和进行Pourmatic分液14ml/板。小心将各堆积从含量计算器的agarmatic左侧的圆盘除去，堆积转移盘上的板以固化。用定量控制每批信息迅速编码琼脂板。
方法用样品分割机获得约10克要试验的食品。这种小样品应为要试验的大量食品的代表。在多数实例中，分析中误差达到95％就无法得到试验用代表性的小样品。在样品处理瓶中称重10.00+/-0.01g小样品。移液90ml BX溶液至样品瓶中。盖紧盖并在腕动振荡器上剧烈振荡30分钟。带样品编号的标记螺旋质量盘，带样品编号的铺开的盘及复制盘标为“A”,“B”和“C”。打开Electrapette控制台，选择细菌平皿接种程序。用1000μl尖管将100μl样品上清液转移至3个样品盘中的每一个。(如果样品阻塞尖管，用无菌巴斯德氏移液管)。用假玻璃棒(95％乙醇)铺展样品。装好带标记样品杯的无菌过滤仪，更换过滤块并除去滴罩。移液前轻轻搅拌样品。用无菌、大体积移液管和移液助剂转移约4ml过滤得到的样品上清液至杯子中。过滤后，在除去过滤块前更换滴罩以防止交叉污染。用铝箔覆盖样品并小心地将支架(rack)从通风橱转移至螺旋盘。用螺旋盘机铺样品。小心倒置所有盘并放在37℃培养器中，A样品放在架子顶部，B样品放在架子中间，C样品放在架子底部。培养24小时后计数形成菌落单元，大肠杆菌群菌落的颜色由粉到红，伴有或没有沉淀的胆汁区。
参考文献<细菌学分析手册>(Bacteriological AnalyticalManual)(1984),6th Edition,A.O.A.C.,Arlington Virginia,Difco Manual(1985),10th Edition,Detroit,Michigan。
实施例5
甲醛∶赖氨酸加合物的形成从饲料加工厂购得饲料级赖氨酸一盐酸盐粉末(纯度98.2％)并用喷雾器将37％甲醛溶液喷在粉末上使它们混合。甲醛和赖氨酸的摩尔比如下表所示。<
>使用甲醛后,将产物转移至敞开容器中并储存3天使甲醛蒸气消失。
饲料处理用沙门氏菌(108cfu/ml)的液体培养物(2ml/kg饲料)污染家禽促酵物饲料。将赖氨酸加合物与饲料以重量比0.5∶100,1∶100或2∶100混合。24小时后，评价饲料中的沙门氏菌。<
>这些数据说明其有杀菌活性。
甲醛∶赖氨酸加合物的形成从饲料加工厂购得饲料级赖氨酸一盐酸盐(纯度98.2％)并研磨成细粉。将甲醛(37％溶液)加到粉末赖氨酸中，同时通过喷雾混合。赖氨酸被甲醛饱和后，通过在35-40部分真空干燥5天从赖氨酸中除去未结合的甲醛。用蒸馏和比色衍生法测定残余甲醛(0.203％)。
饲料处理将家禽饲料用加压灭菌连续两天灭菌1小时。用沙门氏菌(108×cfu/ml)的液体肉汤培养物(2ml/kg饲料)污染无菌饲料并使细菌群灭菌24小时。将赖氨酸加合物与污染的饲料以0,2,8,16，和32kg/吨处理水平混合。处理24小时后，评价饲料中的沙门氏菌。
实施例9甲醛∶赖氨酸加合物的形成从饲料加工厂购得饲料级赖氨酸一盐酸盐(纯度98.2％)并研磨成细粉。通过喷雾将甲醛(37％溶液)加到粉末赖氨酸同时混合。赖氨酸被甲醛饱和后，通过在35-40℃部分真空干燥5天从赖氨酸中除去未结合的甲醛。用蒸馏和比色衍生法测定残余甲醛(2.03％)。
饲料处理从饲料加工厂购得家禽饲料并用加压灭菌连续两天灭菌1小时。用大肠杆菌的液体肉汤培养物(2ml/kg饲料，105×cfu/ml)污染无菌饲料并对细菌群灭菌24小时。将赖氨酸加合物与污染的饲料以0,2,8,16，和32kg/吨处理水平混合。处理24小时后，评价饲料中的大肠杆菌。
结果
显然，许多修改和变化可以根据上文所述进行，但在下面的权利要求范围内，本发明可以不用本文所述的具体方法实现。
权利要求
1．免受大肠杆菌0157:H7污染的食品，包括(a)甲醛与(b)具有两个NH基团的式Ⅰ化合物的反应产物或所说反应产物的盐，R1NH(COR2)CH(CH2)nR3,(Ⅰ)其中R1是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，或R4CO基团；R4是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，C1-10烷氧基，C1-10烷基氨基，C1-10二烷基氨基或C1-10硫代烷基；R2是H，C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，C1-10烷氧基，C1-10烷基氨基，C1-10二烷基氨基或C1-10硫代烷基；及R3是R5NH-,R5NHCO-,R5CONH-,-NC(=NR5)NHR5,-NC(=NR5)NR5R5或含有NH部分的杂环基，其中R5独立地是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，及n是0-6之间的整数。
2．权利要求1的食品，其中每克有1000cfu大肠杆菌0157:H7的食品经过在25℃培养24小时后使每25克食品中只有1cfu或更少的大肠杆菌0157:H7。
3．权利要求1的食品，其中含有食品总重量的0.1-10wt％的反应产物。
4．权利要求1的食品，其中含有动物源成分。
5．权利要求1的食品，其中所说动物源的成分是粉碎的牛肉。
6．含有0.1-20wt％、结构为H2N(CO2H)CH(CH2)4NHCH2NH(CO2H)CH(CH2)4NH2或其盐的防腐剂的食品。
7．权利要求6的食品，其中每克有1000cfu大肠杆菌0157:H7的食品经过在25℃培养24小时后使每25克食品中只有1cfu或更少的大肠杆菌0157:H7。
8．权利要求7的食品，其中含有动物源成分。
9．权利要求8的食品，其中所说动物源成分是粉碎的牛肉。
10．一种保护物品免受细菌污染的方法，包括将经过细菌污染的物品用有效量的(a)甲醛与(b)具有两个NH基团的式Ⅰ化合物的反应产物或所说反应产物的盐处理，R1NH(COR2)CH(CH2)nR3,(Ⅰ)其中R1是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，或R4CO基团；R4是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，C1-10烷氧基，C1-10烷基氨基，C1-10二烷基氨基或C1-10硫代烷基；R2是H,C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，C1-10烷氧基，C1-10烷基氨基，C1-10二烷基氨基或C1-10硫代烷基；及R3是R5NH-,R5NHCO-,R5CONH-,-NC(=NR5)NHR5,-NC(=NR5)NR5R5或含有NH部分的杂环基，其中R5独立地是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，及n是0-6之间的整数。
11．权利要求10的方法，其中所说物品是抗大肠杆菌0157:H7污染的食品，因而每克有1000cfu大肠杆菌0157:H7的食品在经过25℃培养24小时后使每25克食品中只有1cfu或更少的大肠杆菌0157:H7。
12．权利要求11的方法，其中所说食品含有动物源成分。
13．权利要求10的方法，用食品总重量的0.1-10wt％的反应产物处理物品。
14．权利要求10的方法，其中所说反应产物是H2N(CO2H)CH(CH2)4NHCH2NH(CO2H)CH(CH2)4NH2或其盐。
15．一种抗菌组合物，包括(a)甲醛与(b)具有两个NH基团的式Ⅰ化合物的缩合反应产物，R1NH(COR2)CH(CH2)nR3, (Ⅰ)其中R1是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，或R4CO基团；R4是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，C1-10烷氧基，C1-10烷基氨基，C1-10二烷基氨基或C1-10硫代烷基；R2是H,C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，C1-10烷氧基，C1-10烷基氨基，C1-10二烷基氨基或C1-10硫代烷基；及R3是R5NH-,R5NHCO-,R5CONH-,-NC(=NR5)NHR5,-NC(=NR5)NR5R5或含有NH部分的杂环基，其中R5独立地是C1-10烷基，C1-10链烯基，C1-10炔基，芳基，5-或6-员杂环，及n是0-6之间的整数。
16．权利要求15的抗菌组合物，包括0.1-50wt％的赖氨酸和甲醛的缩合反应产物或其盐及载体。
17．一种抗菌组合物，包括0.1-50wt％的H2N(CO2H)CH(CH2)4NHCH2NH(CO2H)CH(CH2)4NH2或其盐和载体。
全文摘要
通过甲醛和具有两个NH部分的化合物反应得到的抗菌组合物。该产物被用于保护食品和其它物品免受大肠杆菌0157∶H7和其它细菌的感染及用于治疗动物和植物的系统和局部感染。
文档编号A01N37/44GK1230876SQ97198037
公开日1999年10月6日 申请日期1997年7月30日 优先权日1996年7月31日
发明者B·J·布兰德, K·E·里萨德森 申请人:阿尼托克斯公司