福寿螺胆碱酯酶抑制剂、制备方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于杀螺剂的技术领域，更具体的说，本发明涉及一种福寿螺胆碱酯酶抑 制剂、制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 福寿螺（Pomacea canaliculata)是近些年来备受国际关注的危害性外来入侵动 物，软体动物门腹足纲前鳃亚纲腹足目瓶螺科瓶螺属，原产南美洲亚马逊河流域。福寿螺对 环境适应性强、食性杂、个体大、生长迅速、繁殖力强，是危害生物多样性、农业生产和人类 健康的世界性恶性入侵水生动物，在2000年，世界自然保护联盟外来入侵物种专家委员会 将其列为世界100种恶性外来入侵物种之一。2003年3月，国家环保总局将福寿螺列入首 批入侵我国的16种"危害最大的外来物种"之一。目前，我国对螺害的控制以化学杀螺剂 防治为主，在一定程度为农业的发展发挥了巨大作用，但是随着农业的发展，杀螺剂的使用 越来越广泛，再加上不合理利用杀螺剂，造成了环境污染，给生物的生存带来了威胁。因此 寻找开发可持续的、环境友好的植物来源的杀螺剂，越来越受到研究者们的重视。
[0003] 胆碱酯酶已成为杀虫剂开发研究的重要靶酶，胆碱酯酶主要存在于动物神经系统 中的一种水解酶，它的作用是水解胆碱能神经末梢释放的神经介质乙酰胆碱。如果胆碱酯 酶的作用被抑制，就会发生乙酰胆碱过剩而集聚现象，引起胆碱能神经过度兴奋、类似有机 磷中毒的症状。胆碱酯酶抑制剂的使用能够抑制福寿螺胆碱酯酶的活性，突触后神经纤维 长期处于兴奋状态，同时突触部位的正常神经冲动传导受阻塞，导致福寿螺中毒死亡，已成 为螺害防治的重要途径。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种福寿螺胆碱 酯酶抑制剂、制备方法及其用途。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：
[0006] -种福寿螺胆碱酯酶抑制剂的制备方法，其特征在于：以薇甘菊的叶、五爪金龙的 茎，或薇甘菊与南美蟛蜞菊的叶为原料，以乙醇水溶液为溶剂利用超声波提取工艺得到。
[0007] 其中，所述乙醇为75~95wt%的乙醇水溶液；原料与乙醇水溶液的质量体积比为 Ig ； 3ml ~Ig ； IOml〇
[0008] 其中，超声波提取的时间为20~60min，提取温度为0~30°C。
[0009] 其中，超声波提取后过滤得到提取液，然后蒸发浓缩形成浸膏。
[0010] 本发明的第二方面，还涉及一种福寿螺胆碱酯酶抑制剂。
[0011] 本发明所述的福寿螺胆碱酯酶抑制剂，其特征在于：以薇甘菊的叶或五爪金龙的 茎为原料，以乙醇水溶液为溶剂利用超声波提取、并经过过滤、蒸发浓缩得到。
[0012] 其中，所述抑制剂为膏剂。
[0013] 其中，所述抑制剂为水溶液。
[0014] 本发明的第三方面，还涉及上述福寿螺胆碱酯酶抑制剂的用途，其特征在于：用于 福寿螺的杀灭。
[0015] 其中，所述福寿螺胆碱酯酶抑制剂的浓度为0. 1~0. 5mg/ml，优选为0. 1~ 0· 2mg/ml 〇
[0016] 本发明所述的福寿螺胆碱酯酶抑制剂具有以下有益效果：
[0017] 当质量浓度为0. lmg/ml以上时，对福寿螺胆碱酯酶的抑制率接近阳性对照组的 抑制率，证明其对福寿螺两种胆碱酯酶的活性具有较强的抑制作用，说明了这两种入侵植 物具有开发为福寿螺植物源杀螺剂的潜力。
【具体实施方式】
[0018] 以下将结合具体实施例对本发明所述的福寿螺胆碱酯酶抑制剂、制备方法及其用 途做进一步的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准 确和深入的理解。
[0019] 实施例
[0020] 1. 1动物材料
[0021] 福寿螺成螺采自广东省潮州市湘桥区社光村田间水沟，采集后洗净敲去壳，取斧 足组织。
[0022] 1. 2植物材料
[0023] 薇甘菊、南美蟛蜞菊和五爪金龙均采集于韩由师范学院校内。经清洗后自然晾干， 分离出茎和叶，剪成段，分别放入干燥箱，60°C干燥至恒重后磨碎，置于干燥处保存备用。
[0024] 1. 3入侵植物乙醇提取物的制备
[0025] 取每种磨碎的植物样品20g，用95%乙醇100mL浸泡，超声波提取30min，过滤得到 提取液后，放进60°C干燥箱蒸发浓缩成浸膏。称取适量的浸膏，用超纯水配制成0. 1、0. 05、 0. 025、0. 0125mg/ml的提取物溶液，4°C冰箱中保存备用。
[0026] L 4酶液的制备
[0027] 用手术刀将其斧足组织切碎，PBS清洗后放入离心管中，按质量体积比1/10 (g/ ml)加入裂解缓冲液（IOmmol · L 1HEPES, ρΗ7· 5, Immol · L 1EDTA, Immol · L 1EGTA, 500mmol · L 1NaCLO. 5 % Triton X-100,10 μ g/ml leupeptin, 20 μ mol · L 1Pepstatin, and 2.5m mol .Libenzamidine HC1)后，4 °C 勾衆，12000rpm 30s，间隔 30s，重复 2 次， 4°C 1600rpm离心10min，转移上清液至新的离心管中，12000rpm 4°C离心20min，取上清 液，-20 °C冰箱中保存备用。
[0028] 1. 5胆碱酯酶活性的测定及抑制率的计算
[0029] 采用改进的Ellman方法（Ellman et al.，1961)在96孔酶标板上测定样品的AChE 和BChE抑制活性。具体操作如下：
[0030] 样品孔：在96孔酶标板中依次加入155 μ L PBS(0.2mol .L SpH= 7.5)，20 μ L待 测样品溶液，5 μ L酶液。4°C孵育20min后，加10 μ L DTNB (12. 5mmol .L 3，室温静置30min， 加入10 μ L底物溶液（12. 5mmol .L 1ATCH或BTCH)。37°C孵育30min后，用酶标仪在405nm 下测定其吸光度值。
[0031] 样品本底对照孔：用5 μ L PBS代替5 μ L酶液，其它条件不变。
[0032] 阴性对照孔：用20 μ L PBS代替20 μ L待测样品溶液，其它条件不变。
[0033] 阳性对照孔：用20 μ L BW284c51或iso-OMPA (2mmol .L 3代替20 μ L待测样品溶 液，其它条件不变。实验结果如表1和表2所示。
[0034] 表1不同提取物对福寿螺AChE活性的抑制效果
[0036] 阳性对照组（0· Immol · L 4^28^51)抑制率：90· 21 ±5. 89%
[0037] 表1中，薇甘菊+南美蟛蜞菊的复配中，薇甘菊与南美蟛蜞菊的质量比为1 : 1，且 对于该复配物，其中的浓度为二者的总浓度。
[0038] 表2不同提取物对福寿螺BChE活性的抑制效果
[0040] 阳性对照组（0· Immol · L Hso-OMPA)抑制率：92· 67±7. 66%
[0041] 表2中，薇甘菊+南美蟛蜞菊的复配中，薇甘菊与南美蟛蜞菊的质量比为1 : 1，且 对于该复配物，其中的浓度为二者的总浓度。
[0042] 酶活性分析结果显示薇甘菊和五爪金龙的乙醇提取物对福寿螺AChE活性均具 有较强的抑制作用，而薇甘菊与南美蟛蜞菊的复配能产生更优的复配效果（表1)。不同 植物提取物对福寿螺AChE的抑制强度不同，五爪金龙和薇甘菊比南美蟛蜞菊的抑制作用 较强。同种植物不同部位的乙醇提取物对福寿螺AChE的抑制强度也不同，薇甘菊和南美 蟛蜞菊的叶提取物均比茎提取物的抑制作用强，五爪金龙的茎提取物的抑制作用则比叶 提取物强；在供试质量浓度为0. lmg/ml时，五爪金龙的茎和薇甘菊的叶提取物对福寿螺 AChE的抑制作用最强，抑制率分别为78. 96±3. 32%和77. 83±4. 27%，接近于阳性对照 组的抑制率（90. 21±5. 89% )，其后依次为南美蟛蜞菊的叶和薇甘菊的茎，抑制率分别为 65. 38±8. 95%和58. 65±9. 21%，抑制率低于50%的为南美蟛蜞菊的茎和五爪金龙的叶。 同种植物同个部位的提取物对福寿螺AChE的抑制作用具有浓度依赖性特点，浓度越大抑 制作用越强，随着浓度的降低，其抑制作用也随着减弱。
[0043] 由表2可以看出，薇甘菊和五爪金龙的乙醇提取物对福寿螺BChE活性均具有较强 的抑制作用。不同植物提取物对福寿螺BChE的抑制强度不同，五爪金龙和薇甘菊比南美 蟛蜞菊的抑制作用较强，而薇甘菊与南美蟛蜞菊的复配能产生更优的复配效果（表2)。同 种植物不同部位的乙醇提取物对福寿螺BChE的抑制强度也不同，薇甘菊和南美蟛蜞菊的 叶提取物均比茎提取物的抑制作用强，五爪金龙的茎提取物的抑制作用则比叶提取物强； 在供试质量浓度为〇. lmg/ml时，五爪金龙的茎和薇甘菊的叶提取物对福寿螺BChE的抑制 作用最强，抑制率分别为86. 69±8. 96%和82. 86±7. 19%，接近于阳性对照组的抑制率 (92. 67±7. 66% )，其后依次为薇甘菊的茎、五爪金龙的叶和南美蟛蜞菊的叶，抑制率分别 为 65. 38±8· 95%、59· 47±8· 33%和 58. 65±9· 21%。
[0044] 在本发明中，所述的对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明 进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方 法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直 接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种福寿螺胆碱酯酶抑制剂的制备方法，其特征在于：以薇甘菊的叶、五爪金龙的 茎，或薇甘菊与南美蟛蜞菊的叶为原料，以乙醇水溶液为溶剂利用超声波提取工艺得到。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述乙醇水溶液为75~95wt%的乙 醇水溶液；原料与乙醇水溶液的质量体积比为Ig : 3ml~Ig : 10ml。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：超声波提取的时间为20~60min，提 取温度为〇~30°C。4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：超声波提取后过滤得到提取液，然后 蒸发浓缩形成浸膏。5. -种福寿螺胆碱酯酶抑制剂，其特征在于：以薇甘菊的叶或五爪金龙的茎为原料， 以乙醇水溶液为溶剂利用超声波提取、并经过过滤、蒸发浓缩得到。6. 根据权利要求1所述的福寿螺胆碱酯酶抑制剂，其特征在于：所述抑制剂为膏剂。7. 根据权利要求1所述的福寿螺胆碱酯酶抑制剂，其特征在于：所述抑制剂为水溶液。8. 权利要求5所述的福寿螺胆碱酯酶抑制剂的用途，其特征在于：用于福寿螺的杀灭。9. 权利要求8所述的福寿螺胆碱酯酶抑制剂的用途，其特征在于：所述福寿螺胆碱酯 酶抑制剂的浓度为〇. 1~〇. 5mg/ml。
【专利摘要】本发明涉及一种福寿螺胆碱酯酶抑制剂、制备方法及其用途，属于杀螺剂的技术领域。本发明所述的福寿螺胆碱酯酶抑制剂，是以薇甘菊的叶、五爪金龙的茎，或薇甘菊与南美蟛蜞菊的叶为原料，以乙醇水溶液为溶剂利用超声波提取、并经过过滤、蒸发浓缩得到。当质量浓度为0.1mg/ml以上时，对福寿螺胆碱酯酶的抑制率接近阳性对照组的抑制率，证明其对福寿螺两种胆碱酯酶的活性具有较强的抑制作用，说明了这两种入侵植物具有开发为福寿螺植物源杀螺剂的潜力。
【IPC分类】A01P9/00, A01N65/12
【公开号】CN104996474
【申请号】CN201510419790
【发明人】邹湘辉, 谢东, 吴丽娜, 查广才, 孙延杰
【申请人】韩山师范学院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月16日