一种脐带间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法
【技术领域】
[0001]本发明设及干细胞领域，具体设及一种厮带间充质干细胞的冻存保护液及冻存方 法。
【背景技术】 阳00引干细胞（stemcell)是一类具有自我复制能力（self-renewing)的多潜能细胞。 在一定条件下，它可W分化成多种功能细胞。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells, MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有自我复制、 自我更新、多方向分化潜能、造血支持W及免疫调控等特性。在特定的机体外分化环境下， 能够诱导分化为神经、屯、脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术 的最有希望的来源细胞之一。除此W外，间充质干细胞能分泌多种营养物质，包括血管内 皮生长因子（vEGF)、胎盘生长因子（PGF)、成纤维细胞生长因子（FGFs)、血小板源生长因子 (PDGF)、转化生长因子（TGF-P)、肝细胞生长因子（HG巧等在内的各种生长因子，运些生长 因子可参与多种细胞反应，促进细胞生长，而收集条件培养基是获得运些活性成分的有效 方法。
[0003] 而来源于人厮带的间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，生物学 特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，成本低，对捐献者无损害及不设及伦理问题等优 势，使其成为未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想选择。
[0004] 间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，可作 为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，研究一种有效的厮带 间充质干细胞的冻存方法，使具有临床应用价值的厮带间充质干细胞能在体外长期保存并 维持原有的多向分化能力，显得尤为重要。
[0005] 厮带间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有特定 成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于超低溫冰箱或者液氮中进行 长期冻存。
[0006] 目前现有技术中，厮带间充质干细胞的细胞冻存保护液配方一种是WDMS0和血 清为主要成分，另一种是W培养基、DMS0和血清为主要成分。此外还有一些配方是在上述 两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质。但上述配方冻存厮带间充质干细胞均效果不 理想，复苏后细胞回收率及细胞活率低。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种厮带间充质干细 胞的冻存保护液及冻存方法。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 一种厮带间充质干细胞的冻存保护液，包括
[0010] DMS0 lOv/v% -20v/v%
[0011] 厮带间充质干细胞条件培养基 30v/v%-80v/v%
[0012] 胎牛血清 lOv/v%-50v/v%。
[0013]其中，所述厮带间充质干细胞的冻存保护液中所述厮带间充质干细胞条件培养基 的制备方法为：取P1-P5代的厮带间充质干细胞酶解消化后传代，连续培养24-7化后，收集 培养上清，离屯、后取上清。
[0014] 在一些实施方案中，所述厮带间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述P1-P5 代的厮带间充质干细胞优选为汇合度80-90 %厮带间充质干细胞。
[0015] 在一些实施方案中，所述厮带间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述 酶解消化具体为向细胞中加入0. 015血/cm2-0. 04mL/cm2的0. 05 % -0. 3 %的膜酶和 0. 01 % -0. 04%邸TA消化lmin-3min，完全培养基终止酶解。
[0016] 在一些优选实施方案中，所述终止酶解的完全培养基的加入量为消化液体积的5 倍~10倍。
[0017]在一些实施方案中，所述厮带间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述传代为 酶解消化后的细胞离屯、，完全培养基重选后，按80000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2的传 代密度传代，细胞连续生长24h-72h。
[0018] 其中，所述酶解消化后的离屯、优选为200g-400g离屯、5min。
[0019] 本领域技术人员可W理解，本发明所述完全培养基的组成为DMEM-F12 80v/ v%-95v/v%，FBS5v/v%-20v/v%。
[0020] 本发明所述厮带间充质干细胞条件培养基的制备方法在厮带间充质干细胞传代 后收集培养上清，离屯、后取上清获得厮带间充质干细胞条件培养基。其中，所述离屯、优选为 200g-400g离屯、5min。
[0021] 本发明还提供了所述厮带间充质干细胞的冻存保护液的制备方法，按比例将厮带 间充质干细胞条件培养基与胎牛血清混合，然后加入DMS0,冰水浴中降溫至0°C。
[0022] 本发明还提供了一种厮带间充质干细胞的冻存方法，将厮带间充质干细胞消化离 屯、，加入厮带间充质干细胞条件培养基，调整细胞密度至0. 1X106个/mL-10X106个/mL，加 入等体积的所述厮带间充质干细胞的冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，-80°C中冻存1 天-5天，转移至液氮中长久保存。 阳02引其中，所述的冻存方法中，所述消化为向细胞中加入0. 015血/cm2-0. 04mL/cm2的 0. 05 % -0. 3 %的膜酶和0. 01 % -0. 04%邸TA消化lmin-3min，用5倍-10倍于消化液的完 全培养基终止酶解。
[0024] 在一个具体实施例中，本发明分别采用不同的冻存保护液冻存厮带间充质干细 胞，比较不同的冻存保护液冻存复苏后细胞回收率、细胞活率W及细胞增殖情况，对比本发 明所述厮带间充质干细胞的冻存保护液与常规冻存液的冻存效果，结果显示虽然细胞活率 没有明显差异，但经本发明所述厮带间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏的细胞回收率 明显高于其他常规冻存液。而增殖情况结果显示本发明所述厮带间充质干细胞的冻存保护 液冻存的细胞相对常规冻存液冻存的细胞，扩增的倍数更多。
[0025] 由此可见，采用本发明所述厮带间充质干细胞的冻存保护液，结合本发明所述的 冻存方法进行厮带间充质干细胞的冻存，将起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在回 收率上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规冻存液。
[00%] 本发明还提供了一种厮带间充质干细胞的冻存试剂盒，包含本发明所述厮带间充 质干细胞的冻存保护液。
[0027] 本发明所述厮带间充质干细胞的冻存保护液包括lOv/v% -20v/v%DMS0、30v/ V% -80v/v%厮带间充质干细胞条件培养基、lOv/v% -50v/v%胎牛血清。与常规细胞冻存 液相比，采用本发明所述厮带间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏，不仅在细胞回收率 上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规细胞冻存液，可W用于间充质干细 胞的长期保存及应用。本发明所述厮带间充质干细胞的冻存方法将厮带间充质干细胞消化 离屯、后，加入厮带间充质干细胞条件培养基，调整细胞密度，加入等体积的本发明所述冻存 保护液后冻存细胞。与常规的冻存方法相比，本发明厮带间充质干细胞的冻存方法冻存的 细胞复苏后不仅在细胞回收率上明显高于其他常规方法，细胞增殖能力也优于常规的冻存 方法。
【附图说明】
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0029] 图1示实施例1复苏后各组细胞增殖情况图。
【具体实施方式】
[0030] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0031] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。 阳0巧对比例1、
[0033] 分别采用表1中不同的冻存保护液冻存厮带间充质干细胞，比较不同的冻存保护 液冻存复苏后细胞回收率、细胞活率W及细胞增殖情况。
[0034] 表1不同的冻存保护液
[0035]
[0036]
[0037] 冻存方法如下：
[0038] 1、配制厮带间充质干细胞条件培养基：取汇合度80%的P2代的厮带间充质干细 胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0. 015血/cm2的0. 25%的膜酶+0. 04%邸TA消化Imin， 用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，200g离屯、5min，用完全培养基重选后，接种于培 养瓶中，传代密度为10000个细胞每cm2。细胞连续生长48h，收集培养上清，200g离屯、5min， 取上清，分装后置于-80°C保存备用。
[0039] 2、取汇合度80 %的P3代的厮带间充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入 0. 015血/cm2的0. 25%的膜酶+0. 04%邸TA消化Imin，用10倍于消化液的完全培养基终 止酶解，取样计数，平均分成S管，分别命名为A组、B组和C组。200g离屯、5min，去上清，A 组加入厮