-PRAK在ΙΟηΜ保持恒定，而ρ38α添加至200pM的最终浓度。激酶反应在室温孵育且在添加IMAP结合溶液120分钟后淬灭。在这些条件 下，大约20%的Hsp27肽底物被磷酸化。通过添加激活的ρ38α引发反应，除预孵育实验 以外，其通过添加Hsp27肽和MgATP引发反应。在添加ΑΤΡ和Hsp27肽以引发催化之前，将 ρ38α与抑制剂或Ρ38α与未激活的GST-MK2或未激活的GST-PRAK和抑制剂的预孵育在室 温下以2Χ最终测定浓度进行240分钟。由来自ρ38α/ΜΚ2级联测定的剂量反应IC50值或 Ki值定量ρ38α化合物的抑制效能，同时底物选择性计算为Ρ38a/PRAK:p38α/ΜΚ2IC50 值的比值。预期在本测定中评价的上文描述的式（I)的化合物物质在治疗诸如自身免疫疾 病和淋巴瘤的Ρ38激酶介导的疾病中提供治疗益处。
[0349] 根据以上所述的测定测试了化合物，获得的IC50值如下所述：
[0350]
[0351] 实施例D:人单核细胞中的细胞因子调节：已显示ρ38途径是包括TNFa、IL-Ιβ 和IL-6在内的多种促炎细胞因子的生物合成的关键。因此，p38MAPK途径的抑制通 过减少促炎细胞因子的生物合成来降低炎症反应。本研究显示了抑制TNFa、IL-6和 IL-Ιβ(促炎细胞因子）的生物合成所需的本发明化合物的半量。这是本发明化合物 有助于降低炎症的效果的反映，该效果有助于治疗许多疾病，包括自身免疫病况、淋巴 瘤和类风湿性关节炎。使用人U937细胞系对p38抑制剂阻断细胞因子产生的效能和 功效进行了评价。U937人前单核细胞系获得自从美国典型培养物保藏中心（American TypeCultureCollection(Rockville,MD))。这些细胞分化成如Burnette(Burnette等 人，（2009).SD0006:apotent,selectiveandorallyavailableinhibitorofp38 kinase,Pharmacology84(1) :42-60)所述的单核细胞表型/巨噬细胞表型。在完全培养 基中，将分化的U937细胞接种于96孔组织培养板中（200000个细胞/孔）。24小时后，在 存在或不存在化合物的情况下，将该细胞预处理60分钟，然后用LPS(0. 1μg/mL)刺激4小 时。然后收集培养基用于通过ELISA测定TNFα、IL-6或IL-1β水平。使用四参数逻辑模 型由重组蛋白标准曲线推算细胞因子浓度且在迭代最佳最小二乘法拟合后求解IC5。。预期 在本测定中评价的上文描述的式（I)的化合物物质在治疗诸如淋巴瘤或炎症的P38激酶介 导的疾病中提供治疗益处。
[0352] 根据以上所述的测定测试了化合物，获得的IC50值如下所述：
[0353]
[0355] 实施例E:人单核细胞中的磷蛋白分析：本研究显示了本发明化合物在抑制JNK途 径中的效果和选择性。JNK途径通过促进炎性细胞因子产生而导致炎症增加。该途径的抑 制将产生较少的炎症且因此治疗许多疾病，包括自身免疫病况、淋巴瘤和类风湿性关节炎。 典型的P38抑制剂阻断p38下游底物的磷酸化而提高诸如JNK的平行途径的活性。分别使 用针对两种途径的磷酸化HSP27和磷酸化JNK对不同种类的p38抑制剂在调节p38途径 和JNK途径的影响进行评价。使用人U937细胞系对p38抑制剂影响磷蛋白质水平的效能 和功效进行评价。U937人前单核细胞系获得自美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD)。 这些细胞分化成如Burnette(Burnette等人，（2009).SD0006:apotent,selectiveand orallyavailableinhibitorofp38kinase,Pharmacology84(1) :42-60)所述的单核细 胞表型/巨噬细胞表型。悬浮细胞（在T75cm2的组织培养瓶中大约50万个/毫升）在含 有10%牛胎儿血清（FBS) +抗生素的RPMI中生长。第一天，将佛波醇12-十四酸酯13-乙 酸酯（PMA，20ng/ml)添加至培养瓶中且将该细胞在37°C/5%C02中孵育过夜。第二天，通 过离心和重悬浮于不含PMA的新鲜培养基中洗涤细胞。第三天，通过刮削、离心和以1百万 个/毫升的密度重悬浮于新鲜的培养基中收获贴壁细胞。然后将PMA分化的U937细胞分 配到平底96孔组织培养板的每个孔中（100ml/孔）且使得100, 000个细胞/孔回收、孵育 过夜。在将测定的新鲜培养基（50ml/孔）添加至板的当天，然后添加化合物（25ml/孔，浓 度反应）保持1小时。在l〇〇ml的最终测定体积中用LPS(100ng/ml)刺激该细胞。30分 钟后，添加完全裂解缓冲液（50ml/孔MSDTris裂解缓冲液，补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶 抑制剂），且在_20°C冷冻保存前，将该板置于振荡器上于4°C保持30分钟。解冻细胞裂解 液（25ml/孔）且将其从测定板转移至中尺度检测板，用于测定磷酸化Hsp27/总Hsp27或 磷酸化JNV总JNK。
[0356] 根据以上所述的测定测试了化合物，获得的IC50和EC50值如下所述：
[0357]
[0358] 实施例F:人全血中产生的内毒素诱导的细胞因子：将来自无NSAID的供体的人全 血（HWB;25-45ml)收集至含有肝素钠（10ml，158USP单位）的真空采血收集管中，在被分配 至圆底96孔组织培养板（180ml/孔）的每个孔之前，合并并轻轻地摇晃。使用一次性96 聚丙稀针式工具（disposable96polypropylene pin tool)添加化合物（10ml/孔，浓度 反应）且将其轻柔地混合15-20秒，然后将该板在37°C/5% C02中孵育1小时。在200ml 的最终测定体积中用LPS (100ng/ml)刺激HWB。3小时后，将该板在240xg旋转5分钟以沉 淀红细胞。将血浆小心地转移至另一圆底96孔板中且用测定培养基（含有10%牛胎儿血 清（FBS)+抗生素的DMEM)稀释2倍。最终，将稀释的血浆（25ml/孔）转移至中尺度检测 板用于测定IL-1、IL-6或TNFa。
[0359] 实施例G:测定A549细胞中IL-1诱导的IL-6产生：使A549贴壁细胞（每T75cm2 组织培养瓶中大约5百万个）在含有10%胎牛血清（FBS) +抗生素的F-12K培养基中生长。 使该细胞胰蛋白酶化，洗涤且以30万个/毫升重悬浮。然后将A549细胞分配至平底96孔 组织培养板的每个孔中（100ml/孔），且使得30, 000个细胞/孔回收、孵育过夜。在将测 定的新鲜培养基（50ml/孔）添加至板的当天，然后添加化合物（25ml/孔，浓度反应）保 持1小时。在100ml的最终测定体积中用LPS(100ng/ml)刺激该细胞。3小时后，将培养 液（25ml/孔）从测定板转移至中尺度定制涂层检测板，用于测定IL-6水平。将该检测板 在4°C孵育过夜，然后添加磺基标记的抗体混合物（25ml/孔），在室温下于剧烈振荡中保持 1小时。添加读取缓冲液（150ml/孔，MSD4x读取缓冲液（用dH20稀释四倍））且用Meso ScaleSectorImager6000读取该板。在电刺激检测板后，在读取缓冲液中的共反应物增 强电化学反应，从而引起能量以光的形式释放。通过内部CCD相机捕获该信号且定量。使 用MTT分析来测定A549细胞的活力。在用LPS孵育细胞3小时以及收集培养液后，倒置 测定板且轻叩以去除任何剩余液体。添加MTT(在测定培养基中制备的lmg/ml溶液）且 将该板返回至37°C/5% 0)2的培养箱中保持3小时。再次倒置该板以去除任何液体且使 其干燥过夜。添加异丙醇（l〇〇ml/孔）以溶解所得的甲馈晶体且使用MolecularDevices SpectraMax分光光度计在570nm/650nm读取该板。
[0360] 实施例Η:在类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞（RASF)中产生IL-1β诱导的前列 腺素：类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞（RASF)来源于经受全膝关节置换术的女性RA患者 的发炎的滑膜。从邻近软骨梳理出滑膜组织且将其用胶原酶分散成单细胞。将细胞扩增且 保存。如上文Burnette所述进一步培养RASF细胞。将RASF细胞接种于含有完全生长培 养基的96孔组织培养板（5xl04个细胞/孔）中。24小时后，用含有1 %FBS的新鲜生长 培养基替换该培养基。用连续浓度（30000-0.OlnM)的化合物或二甲基亚砜（DMSO)媒介物 对照处理细胞 1 小时，然后在 37°C用Ing/mLIL-Ιβ(R&DSystems,Minneapolis,MN)刺激 18-20小时且收集条件培养基。通过ELISA(CaymanChemical,AnnArbor,MI)定量培养基 中的pge2水平。预期在本测定中评价的上文描述的式（I)的化合物物质在治疗诸如淋巴 瘤和类风湿性关节炎的P38激酶介导的疾病中提供治疗益处。
[0361] 实施例J:HUVEC细胞中的底物选择性：当用p38/MK2的选择性抑制从生物化学 表征步骤中鉴定化合物时，随后将其置于基于细胞的测定中以验证细胞可译性的酶。这些 测定利用人脐静脉内皮细胞（HUVEC)来证实抑制Hsp27磷酸化（p38/MK2激活的生物标 志物），同时避免产生与P38的另一下游底物（MSK)相关联的组织因子（TF)。在96孔形 式中，用连续稀释的化合物处理贴壁的HUVEC(5代或更少）1小时，所述化合物包括作为 参考的非选择性P38抑制剂或用于对照的媒介物。对于Hsp27磷酸化，然后用500pg/mL IL-Ιβ刺激细胞0.5小时，去除培养基，裂解细胞，且通过酶联免疫吸附测定（ELISA)(Life Technologies,Carlsbad,CA)来定量裂解物中的磷酸化Hsp27。TF释放程序与基于ELISA 的测定（AmericanDiagnostica,Stanford,CT)相类似，除了IL-Ιβ刺激进行了 5小时以 外。TF抑制IC50:HSP27磷酸化抑制IC50的比值被定义为这些细胞的底物选择性指数。预 期在本测定中评价的上文描述的式（I)的化合物物质在治疗诸如淋巴瘤和自身炎症性疾 病的P38激酶介导的疾病中提供治疗益处。
[0362] 实施例K :犬B细胞生长调节：p38抑制剂已显示出唯一地抑制犬B细胞增殖和 存活。可利用这种对犬B细胞的选择性作用治疗性治疗犬B细胞淋巴瘤，其为影响美国 >40, 000只陪伴动物的绝症。P38抑制剂对B细胞生长影响的定量为B细胞淋巴瘤中细胞 功效的指标。预期在本测定中评价的上文描述的式（I)的化合物物质在治疗诸如淋巴瘤 的P38激酶介导的疾病中提供治疗益处。这些测定利用圣路易斯大学动物管理及使用委员 会（Saint Louis University Animal Care and Use Committee)批准的方案与Seventh Wave Laboratories合作获得的比格犬脾脏。用Histopaque 1077通过离心将白细胞从 脾细胞分离。为了评价对增殖的作用，然后将白细胞在存在媒介物或测试化合物的情况下 于96孔板中培养48小时。用针对TLR4刺激的LPS、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)B细胞丝裂原或伴刀豆球蛋白-A T细胞丝裂原刺激细胞，然后用BRDU联合 ELISA (Roche, Mannheim, Germany)对增殖进行定量。对于细胞凋亡实验，将白细胞置于聚丙 烯U型底96孔板中且在不存在或存在放线菌素D或放线菌酮（如果需要增加细胞凋亡速 率）的情况下用P38MAPK抑制剂或星孢菌素（作为阳性对照）处理高达24小时。使用半 胱天冬酶-Glo 3/7发光试验（Promega，Madison，WI)测定细胞凋亡。在两个试验中，将孵 育后随着抑制剂浓度的增加而产生的值与无抑制剂的阴性对照进行比较。
[0363] 实施例L:LPS诱导大鼠中产生TNFa:在口服给药前将大鼠禁食18小时，且在 整个实验中允许自由饮水。每个治疗组由五只动物组成。在由0.5%甲基纤维素（Sigma Aldrich,St.Louis,M0)、0· 025%Tween20(SigmaAldrich)组成的媒介物中将化合物制 备为混悬液。通过灌胃口服施用体积为lmL的化合物或媒介物。每组实验使用两个媒介物 组以控制内部实验可变性。在以0. 5mL无菌盐水中lmg/kg化合物的剂量静脉注射4小时 后，施用LPS(大肠杆菌血清型0111 :B4,SigmaAldrich)。注射LPS90分钟后，通过心脏穿 刺在血清分离管中收集血液，此时间点对应于最高的TNFa和IL-Ιβ产生。凝血后，取出 血清，在-20°C保存，并通过ELISA定量IL-1β和TNFa的水平（如之前Burnette所述）。 预期在本测定中评价的上文描述的式（I)的化合物物质在治疗诸如淋巴瘤或炎症的P38激 酶介导的疾病中提供治疗益处。
[0364] 所有提到的文件通过引用的方式并入，如同本文所写。当引入本发明的要素或其 示例性实施方案时，冠词"一（a)"、"一（an)"、"该（the)"和"所述（said)"意欲表示一个 或多个要素。术语"包含（comprising) "、"包括（including)"和"具有（having)"意欲是 包含在内的且表示除了所列出的要素之外还可以存在其它要素。尽管已就具体实施方案对 本发明进行了描述，这些实施方案的细节不应解释为限制。
【主权项】
1. 式⑴的化合物：或其药物可接受的盐，其中： X为CH或N; R1选自H、C「C6烷基、氟、氯、溴、氰基或-CF3; R2选自H、甲基、氰基或氟； R3选自： R4选自H、甲基、0H和〇-〇13;R5为Η或CfC3烷基；m为1或2 ; η为0或1 ; Ρ为1 ;以及q为0或1。2. 如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式（II)的结构：或其药物可接受的盐，其中： X为CH或N; R1选自H、C「C6烷基、氟、氯、溴、氰基或-CF3; R2选自H、甲基、氰基或氟； R3爻R4选自H、甲基、OH和-0CH3; R5为H或CfC3烷基；m为1或2 ;以及 η为0或1。3.如权利要求2所述的化合物，其中R3选自3, 5-二氟吡啶-2-基、3-氟吡啶-2-基、 5_氟-3-甲基吡啶-2-基、6-氟吡啶-2-基、6-氟-4-甲基吡啶-2-基、3-氟-5-甲基吡 啶_2_基和5_氣啦啶_2_基。4. 如权利要求3所述的化合物，其中所述化合物具有式（III)的结构：或其药物可接受的盐，其中： X为CH或Ν; R1为氯或溴；且R2为-Η或甲基。5. 如权利要求4所述的化合物，其中所述化合物选自： 3_溴-4- ((3, 5-二氟吡啶-2-基）甲氧基）-6 " - (2-羟基丙-2-基）-3 "，5 '，6-三甲 基-2Η-[1，4' ：2'，2"_ 三联吡啶]-2-酮； 3_氯-4- ((3, 5-二氟吡啶-2-基）甲氧基）-6 " - (2-羟基丙-2-基）-3 "，5 '，6-三甲 基-2Η-[1，4' ：2'，2"_ 三联吡啶]-2-酮； 3_溴-4-((3, 5-二氟吡啶-2-基）甲氧基）-2' - (2-(2-羟基丙-2-基）-5-甲基嘧 啶-4-基）-5'，6_ 二甲基-2H-[1，4' -联吡啶]-2-酮； 3_氯-4-((3, 5-二氟吡啶-2-基）甲氧基）-2' - (2-(2-羟基丙-2-基）-5-甲基嘧 啶-4-基）-5'，6_ 二甲基-2H-[1，4' -联吡啶]-2-酮； 3_溴_4-((3, 5-二氟吡啶-2-基）甲氧基）-6"-(2_羟基丙-2-基）-5'，6-二甲 基-2H-[1，4' ：2'，2"_ 三联吡啶]-2-酮； 3_氯_4-((3, 5-二氟吡啶-2-基）甲氧基）-6"-(2_羟基丙-2-基）-5'，6-二甲 基-2H-[1，4' ：2'，2"_ 三联吡啶]-2-酮； 3-溴-4-((3, 5-二氟吡啶-2-基）甲氧基）-2' -(2-(2-羟基丙-2-基）嘧 啶-4-基）-5'，6_ 二甲基-2H-[1，4' -联吡啶]-2-酮； 3_氯_4-((3, 5-二氟吡啶-2-基）甲氧基）-2' -(2-(2-羟基丙-2-基）嘧 啶-4-基）-5'，6_ 二甲基-2H-[1，4' -联吡啶]-2-酮。6.如权利要求3所述的化合物，其中所述化合物选自： 3_氯-4-((5-氟吡啶-2-基）甲氧