转基因玉米事件mon87403和其检测方法
【专利说明】转基因玉米事件M0N87403和其检测方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年10月9日提交的美国临时申请第61 /888，978号的权益，该申请 W引用方式整体并入本文中。
[0003] 序列表的并入
[0004] 序列表包含在名为"M0NS342W0_ST25.txt"的文件中，其在Microsoft Windows操 作系统中测定的大小为24千字节并生成于2014年9月30日，该文件W电子提交方式与此一 道递交，并且W引用方式并入本文中。
[0005] 领域
[0006] 本公开设及转基因玉米事件M0N87403W及包含该事件的植物，该植物表现出增加 的产量。本公开还提供了与该事件相关的细胞、植物部分、种子、植物、商业产品W及对于该 事件是独特的并通过将转基因 DNA插入玉米植物的基因组而产生的DNA分子。本公开进一步 提供了用于检测样品中所述玉米事件核巧酸序列的存在的方法，用于检测诊断所述玉米事 件的存在的核巧酸序列的探针和引物。
[0007] 背景
[000引玉米是一种重要的作物，并且是世界上许多地区的主要食物来源。生物技术的方 法已经应用于玉米W改进产品的农学性状和品质。一种运样的农学性状是增加的产量。 [0009]增加的产量可W在转基因植物中通过表达能够提供运样的增产的转基因来实现。 转基因在植物中的表达可W受许多因素的影响，例如转基因盒中使用的调节元件、转基因 插入物的染色体位置、靠近转基因插入位点的任何内源性调节元件的接近性W及环境因素 例如光和溫度。例如，在W类似方式产生的事件之间，转基因表达的总体水平或转基因表达 的空间或时间模式存在广泛的变化。出于运个原因，单一的特定转化事件的表现可W变化。 因此，赋予有益特性的转化事件的鉴定可W代表重要的任务。
[0010] 概要
[0011] 在一个方面，本发明提供一种重组DNA分子，其包含选自由SEQ ID NO: 1-8、SEQ ID NO: 10和其完全互补物组成的组的核巧酸序列。在一个实施方案中，重组DNA分子是由插入 的异源核酸分子和玉米植物、植物细胞或种子的基因组DNA的接合形成。在另一个实施方案 中，重组DNA分子来自包含事件M0N87403的转基因玉米植物，一种包含所述事件的种子的代 表性样品，其已WATCC保藏号PTA-13584保藏。在另一个实施方案中，重组DNA分子是诊断来 自转基因玉米事件M0N87403的DNA的存在的扩增子。在另一个实施方案中，重组DNA分子是 在玉米植物、植物细胞、种子、后代植物、植物部分或商业产品中。在另一个实施方案中，本 发明提供包含重组DNA分子的转基因玉米植物、种子、细胞或其植物部分。在其它实施方案 中，包含重组DNA分子的转基因玉米植物、种子、细胞或其植物部分具有增加的产量，且/或 此玉米植物、种子、细胞或其植物部分的基因组当在DNA扩增方法中进行测试时产生包含选 自由SEQ ID NO: 1-8和SEQ ID NO: 10的连续核巧酸组成的组的DNA分子的扩增子。在另一个 实施方案中，本发明提供包含重组DNA分子的无生命植物材料和/或微生物。在另一个实施 方案中，包含重组DNA分子的微生物是植物细胞。
[0012]在另一个方面，本发明提供一种DNA探针，其包含具有SEQ ID NO: 10的足够长度的 连续核巧酸的核巧酸序列或其完全互补物作为DNA探针，该DNA探针在严格杂交条件下与包 含选自由SEQ ID NO: 1-8和SEQ ID NO: 10组成的组的核巧酸序列的DNA分子杂交，并且在严 格杂交条件下不与不含选自由SEQ ID NO: 1-8和SEQ ID NO: 10组成的组的核巧酸序列的 DNA分子杂交。
[0013] 在另一个方面，本发明提供DNA分子对，其包含第一 DNA分子和不同于第一 DNA分子 的第二DNA分子，其中所述第一DNA分子和第二DNA分子各自包含具有SEQ ID NO: 10的足够 长度的连续核巧酸的核巧酸序列或其完全互补物作为DNA引物，当与来自事件M0N87403的 DNA在扩增反应中一起使用时，产生用于诊断样品中的转基因玉米事件M0N87403 DNA的扩 增子。
[0014] 在另一个方面，本发明提供一种检测样品中来自包含事件M0N87403的转基因玉米 植物的DNA分子的存在的方法，所述方法包括：（a)使所述样品与权利要求6的DNA探针接触； (b)使所述样品和所述DNA探针接受严格杂交条件;和(C)检测所述DNA探针与所述样品中的 DNA分子的杂交，其中所述DNA探针与所述DNA分子的杂交表明所述样品中存在来自包含事 件M0N87403的转基因玉米植物的DNA分子。
[0015] 本发明的另一个方面提供一种检测样品中来自包含事件M0N87403的转基因玉米 植物的DNA分子的存在的方法，所述方法包括：（a)使所述样品与权利要求7的DNA分子对接 触；（b)进行足W产生包含选自由SEQ ID NO: 1-8和SEQ ID NO: 10的连续核巧酸组成的组的 序列的DNA扩增子的扩增反应;和(C)检测所述反应中的所述DNA扩增子的存在，其中所述反 应中存在所述DNA扩增子表明所述样品中存在来自包含事件M0N87403的转基因玉米植物的 DNA分子。
[0016] 在另一个方面，本发明提供一种DNA检测试剂盒，其包括：（a)DNA分子对，其包含第 一 DNA分子和不同于第一 DNA分子的第二DNA分子，其中所述第一 DNA分子和第二DNA分子各 自包含具有SEQ ID NO: 10的足够长度的连续核巧酸的核巧酸序列或其完全互补物作为DNA 引物，当与来自事件M0N87403的DNA在扩增反应中一起使用时，产生用于诊断转基因玉米事 件M0N87403 DNA的扩增子;和(b)DNA探针，其包含具有SEQIDN0:10的足够长度的连续核 巧酸的核巧酸序列或其完全互补物作为DNA探针，该DNA探针在严格杂交条件下与包含选自 由SEQ ID NO: 1-8和SEQ ID NO: 10组成的组的核巧酸序列的DNA分子杂交，并且在严格杂交 条件下不与不含选自由SEQ ID NO: 1-8和SEQ ID NO: 10组成的组的核巧酸序列的DNA分子 杂交。
[0017] 本发明的另一个方面提供包含事件M0N87403的玉米植物或种子，一种包含所述事 件的种子的代表性样品，其已WATCC保藏号PTA-13584保藏。在一个实施方案中，玉米植物 或种子是具有至少一个包含事件M0N87403的亲本的杂交种。
[0018] 在另一个方面，本发明提供一种由包含事件M0N87403且包含根据权利要求1所述 的重组DNA分子的转基因玉米植物产生的商业产品，其中在源自所述商业产品的样品中检 测到所述核巧酸序列可确定所述商业产品是由所述包含事件M0N87403的转基因玉米植物 产生。在一个实施方案中，商业产品选自由完整或加工的种子、动物饲料、油、膳食、面粉、薄 片、慷、生物质和燃料产品组成的组。本发明的其它实施例提供一种生产商业产品的方法， 其包括：（a)获得包含转基因玉米事件M0N87403的玉米植物或其部分;和(b)从该玉米植物 或其部分生产玉米商业产品。
[0019] 本发明的另一个方面提供一种提高作物的产量的方法，其包括：（a)种植包含事件 M0N87403的作物植物或种子;和(b)使所述作物植物或种子生长。在一个实施例中，作物植 物或种子是玉米植物或玉米种子。
[0020] 在另一个方面，本发明提供一种产生具有增加的产量的玉米植物的方法，其包括： (a)将包含事件M0N87403的转基因玉米植物与第二玉米植物有性杂交，从而产生种子，该转 基因玉米植物包含含有选自由SEQ ID NO: 1-8、SEQ ID NO: 10的连续核巧酸和其完全互补 物组成的组的核巧酸序列的核酸分子；（b)收集由所述杂交产生的所述种子；（C)使所述种 子生长W产生多个后代植物;和(d)选择具有增加的产量的后代植物。
[0021] 在另一个方面，本发明提供一种产生具有增加的产量的玉米植物的方法，其包括： (a)将包含事件M0N87403的转基因玉米植物自交，从而产生种子，该转基因玉米植物包含含 有选自由SEQ ID NO: 1-8和SEQ ID NO: 10的连续核巧酸组成的组的核巧酸序列的核酸分 子；（b)收集由所述自交产生的所述种子；（C)使所述种子生长W产生多个后代植物;和(d) 选择具有增加的产量的后代植物。
[0022] 本发明的另一个方面提供一种产生杂交玉米种子的方法，其包括：（a)在区域内种 植包含事件M0N87403的转基因玉米种子；（b)由所述种子生长玉米植物；（C)用来自第二亲 本玉米植物的花粉对所述玉米植物授粉;和(d)从所述玉米植物收获种子，其中所述种子是 由包含事件M0N87403的转基因玉米植物与第二亲本植物杂交产生的杂交玉米种子。在一个 实施方案中，该方法进一步包括在所述区域内种植第二亲本玉米植物种子和由所述第二亲 本玉米植物生长玉米植物。在另一个实施方案中，所述第二亲本玉米植物具有增加的产量。
[0023] 在另一个方面，本发明提供一种确定样品中包含玉米事件M0N87403 DNA的玉米植 物基因组的接合性的方法，其包括：（a)将该样品与第一对DNA分子和第二对不同的DNA分子 接触，该DNA分子：（i)当与玉米事件M0N87403 DNA在核酸扩增反应中一起使用时，产生用于 诊断玉米事件M0N87403的第一扩增子;和（ii)当与非M0N87403 DNA的玉米基因组DNA在核 酸扩增反应中一起使用时，产生用于诊断非事件M0N87403 DNA的玉米野生型基因组DNA的 第二扩增子；（b)进行核酸扩增反应；W及(C)检测所述第一扩增子和所述第二扩增子;其中 所述第一扩增子和第二扩增子的存在诊断所述样品中的基因组是杂合的，且其中仅存在所 述第一扩增子诊断基因组对于所述样品中的玉米事件M0N87403而言为纯合的。在一个实施 方案中，第一组DNA分子包含SEQ ID NO: 11和沈Q ID NO: 12,且第二组DNA分子包含沈Q ID NO: 14和沈Q ID NO: 15。
[0024] 附图简述
[0025] 图1-示出了包含事件M0N87403的玉米的基因组中的转基因插入物的图解表示； [A]对应于SEQ ID NO: 1、3和5的相对位置，它们全部形成转基因插入物的5'部分与侧翼基 因组DNA的3 '部分之间的接合点；[B]对应于SEQ ID NO: 2、4和6的相对位置，它们全部形成 转基因插入物的5 '部分与侧翼基因组DNA的3 '部分之间的接合点；[C]对应于SEQ ID NO: 7 的相对位置，其包含玉米基因组侧翼区域和转基因 DNA插入物的任意指定的5'端的一部分； [D]对应于SEQ ID N0:8的相对位置，其包含玉米基因组侧翼区域和转基因 DNA插入物的任 意指定的3'端的一部分；[E]代表SEQ ID N0:9,其为整合入包含事件M0N87403的玉米植物 的基因组中的包括AT皿17表达盒的转基因 DNA插入物的序列；[F]代表SEQ ID NO: 10,其为 包含5'侧翼基因组序列、转基因插入物和3'侧翼基因组序列的连续序列，如图中从左至右 所示包含SEQ ID NO:7、沈Q ID NO:9和沈Q ID N0:8,其中如上所述并入了沈Q ID NO: 1、3 和5W及沈Q ID N0:2、4和6,运些序列存在于包含事件M0N87403的植物的基因组中。
[0026] 图2-示出了 2009年的推进到田间试验的14个个别事件的比较数据。所示的数据来 自从11个地点获取的2009年多重测试试验，且总共重复22次。星号表示前5名的事件。
[0027] 图3 -示出了转化载体PM0N97046的质粒图谱。
[00%]图4-示出了历年来包含基于转化种质的杂交种中的M0N87403事件的植物的增强 的产量表现。
[0029] 序列简述
[0030] SEQ ID NO: 1是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒的5'接合区的20个核 巧酸的序列（SEQ ID NO: 10的位置1336至1355)。
[0031] SEQ ID N0:2是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒的3'接合区的20个核 巧酸的序列（SEQ ID NO: 10的位置4468至4487)。
[0032] SEQ ID N0:3是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒的5'接合区的60个核 巧酸的序列（SEQ ID NO: 10的位置1316至1375)。
[0033] SEQ ID N0:4是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒的3'接合区的60个核 巧酸的序列（SEQ ID NO: 10的位置4448至4507)。
[0034] SEQ ID NO:5是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒的5'接合区的100个核 巧酸的序列（SEQ ID NO: 10的位置1296至1395)。
[0035] SEQ ID NO:6是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒的3'接合区的100个核 巧酸的序列（SEQ ID NO: 10的位置4428至4527)。
[0036] 沈Q ID NO:7是位于M0N87403的插入DNA侧翼，直到并包括转基因 DNA插入的区域 的3000个核巧酸的5'序列（SEQ ID NO: 10的位置1至3000)。
[0037] 沈Q ID NO:8是位于M0N87403的插入DNA侧翼，直到并包括转基因 DNA插入的区域 的2624个核巧酸的3'序列（SEQ ID NO: 10的位置3121至5744)。
[003引 SEQ ID NO: 9是完全整合入玉米基因组DNA中并包含表达盒DNA的序列（SEQ ID NO: 10 的位置 1346 至4477)。
[0039] SEQ ID N0:10是代表位于M0N87403的插入DNA侧翼的5'序列（SEQ ID N0:7)、完全 整合入玉米基因组DNA中并包含表达盒的序列（SEQ ID NO:9)和位于M0N87403的插入DNA侧 翼的3'序列（SEQ ID N0:8)的叠连群的核巧酸序列，并且包括SEQ ID NO: 1-6。
[0040] SEQ ID肋：11是用于鉴定事件1(^87403的转基因特异性测试引物5923846。由 TAQMAN?(阳 Applied Biosystems,Foster City,CA)测试（使用引物沈Q ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12的组合)产生的PCR扩增子对于事件M0N87403的存在是阳性结果。
[0041 ] 沈Q ID N0:12是用于鉴定事件M0N87403的转基因特异性测试引物SQ4603。
[0042] SEQ ID NO: 13是用于鉴定M0N87403的转基因特异性测试6-FAM标记型探针 PB10644。该探针是6FAM?标记的合成寡核巧酸。在TAQMAN⑥测试中，在扩增反应(使用 引物SEQ ID N0:ll-12结合使用6FAM?标记的探针）中释放出巧光信号用于诊断事件 M0N87403的存在。
[00创 SEQ ID NO: