14是转基因特异性测试内部对照引物SQ25061。
[0044] SEQ ID NO: 15是转基因特异性测试内部对照引物SQ25062。
[0045] SEQ ID備:16是转基因特异性测试内部对照￥1〔了叫示记的口810866。
[0046] SEQ ID N0:17是用于鉴定M0N87403的PCR的转基因特异性正向引物AS349。
[0047] SEQ ID N0:18是用于鉴定M0N87403的PCR的转基因特异性反向引物AS350。
[004引 SEQ ID N0:19是用于检测事件M0N87403的5'（左侦U)接合区的引物SQ6164。
[0049] SEQ ID N0:20是在PCR中用于检测事件M0N87403的5'（左侦O接合区的引物 SQ13205。
[(K)加 ]SEQ ID N0:21是用于检测事件M0N87403的5'（左侦U)接合区的引物SQ6165。
[0化1] SEQ ID N0:22是用于检测事件M0N87403的5'（左侦U)接合区的引物SQ22458。
[0化2] SEQ ID N0:23是用于检测事件M0N87403的5'（左侦U)接合区的引物SQ22459。
[0053] SEQ ID N0:24是用于检测事件M0N87403的3'（右侦U)接合区的引物SQ21173。
[0化4] 沈Q ID N0:25是用于检测事件M0N87403的3'（右侧)接合区的引物SQ22464。
[0化日]沈Q ID N0:26是用于检测事件M0N87403的3'（右侧)接合区的引物SQ22460。
[0化6] 沈Q ID N0:27是用于检测事件M0N87403的3'（右侧)接合区的引物SQ22465。
[0化7] 沈Q ID N0:28是用于检测事件M0N87403的3'（右侧)接合区的引物SQ22461。
[0化引沈Q ID N0:29是用于检测事件M0N87403的3'（右侧)接合区的引物SQ22471。
[0059] 详述
[0060] 提供W下定义和方法W更好地定义本公开并指导本领域一般技术人员实施本公 开。除非另有说明，否则可W根据本领域普通技术人员的常规用法来理解术语。分子生物学 中的常用术语的定义还可W见于Rieger等人，Glossary of Genetics = Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag:New York,1991;和Lewin,Genes V, Oxford University Press:New York,1994中
[0061 ] 本公开提供了转基因玉米事件M0N87403 (在本文中也称为M0N87403)。如本文所使 用的术语"事件"是指由将转基因 DNA插入植物的基因组中的染色体上的特定位置而产生的 DNA分子。事件M0N87403是指通过将具有本文所提供的SEQ ID NO:9序列的转基因 DNA插入 玉蜀泰(Zea mays)基因组中的特定染色体位置而产生的DNA分子。在本公开中还提供了包 含事件M0N87403的植物、种子、后代、细胞和其植物部分。包括M0N87403的植物表现出增加 的粮食产量。
[0062] 如本文所使用，术语"玉米(corn)"或"玉米(maize)"是指玉蜀泰且包括可W与玉 米繁殖的所有植物品种，包括野生玉米物种W及那些允许物种间繁殖的玉蜀泰属。
[0063] 转基因"事件"是通过W下产生：用异源DNA(即，包含感兴趣的转基因的核酸构建 体)转化植物细胞;使通过将转基因插入植物的基因组中所得到的独立转化的转基因植物 群体再生；W及选择具有期望的分子特性(例如，转基因的单拷贝插入特定的基因组位置、 转基因 DNA的完整性和增强的性状例如增加的粮食产量)的特定植物。包含该事件的植物可 W指包括插入到该植物的基因组中的特定位置上的转基因的原始转化体。包含该事件的植 物还可W指将转基因保留在该植物的基因组中的相同特定位置上的原始转化体的后代。运 样的后代可W通过自交产生，或通过与包含相同事件的不同植株或其后代用W及另一种植 物有性异型杂交而产生。该另一种植物可W是包含相同或不同转基因的转基因植物;或者 可W是非转基因植物，例如来自不同品种的植物。所得后代就事件M0N87403 DNA而言可W 是纯合或杂合的（插入DNA和侧翼DM)。即使在重复回交至轮回亲本后，来自转化亲本的事 件DNA仍存在于杂交后代的相同基因组位置处。
[0064] 包含事件M0N87403的DNA分子是指包含插入转基因 DNA(提供为沈Q ID N0:9)的至 少一部分和紧邻插入DNA的侧翼基因组DNA的至少一部分的DNA分子。正因为如此，包含事件 M0N87403的DNA分子具有代表转基因 DNA插入物的至少一部分和被插入转基因 DNA的植物基 因组的特定区域的至少一部分的核巧酸序列。相对于周围的植物基因组中的事件M0N87403 插入的DNA的排列是特异和独特的事件M0N87403和作为运种DNA分子的运样的核巧酸序列 是诊断和识别为事件M0N87403。本文中提供了运种DNA分子的序列的实例SEQ ID NO: 1-8和 沈Q ID NO: 10。运种DNA分子还是包含事件M0N87403的植物的染色体的组成部分并且可W 传递至该植物的后代。
[0065] 如本文所使用，"重组DNA分子"是包含不会天然地共同存在并且是人类干预的结 果的DNA分子组合的DNA分子，例如，由至少两种彼此异源的DNA分子组成的DNA分子，和/或 人工合成并且包含与自然中通常会存在的多核巧酸序列有所偏差的多核巧酸序列的DNA分 子，和/或包含并入宿主细胞的基因组DNA的转基因和宿主基因组的相关侧翼DNA的DNA分 子。重组DNA分子的一个实例是由将转基因插入玉蜀泰基因组中所产生的本文描述的DNA分 子，运可能最终导致在该生物体中表达重组RNA和/或蛋白质分子。如果DNA分子可W从来自 植物或种子或植物组织的细胞或组织或匀浆中提取;或可W作为扩增子从来自植物或种子 或植物组织的细胞或组织或匀浆的提取DNA或RNA产生（其中任何一个源自源自包含事件 M0N87403的植物的运类材料），则核巧酸序列或由其衍生的任何片段也将被认为是重组DNA 分子。就此而言，如SEQ ID NO: 1-6中所述的接合序列和源自事件M0N87403的同样含有运些 接合序列的核巧酸序列在本文中被定义为重组DNA，无论运些序列存在于包含事件 M0N87403的细胞的基因组内，还是W可检测量存在于源自包含事件M0N87403的植物的组 织、后代、生物样品或商业产品中。如本文所使用，术语"转基因"是指并入宿主细胞的基因 组中的多核巧酸分子。运种转基因对于宿主可W是异源的。术语"转基因植物"是指包括运 种转基因的植物。"转基因植物"包括基因组已经通过重组DNA的稳定整合而改变的植物、植 物部分、植物细胞或种子。转基因植物包括由原始转化植物细胞再生的植物W及来自转化 植物的后代或杂交的后代转基因植物。由于运样的基因组改变，转基因植物与相关的野生 型植物明显不同。转基因植物的一个实例是本文描述的包含事件M0N87403的植物。
[0066] 如本文所使用，术语"异源的"是指运样的序列，其在目前发现该序列的遗传背景 下通常不存在于给定的宿主基因组中。就此而言，该序列对于宿主基因组而言可W是天然 的，但可W相对于宿主序列内的其它基因序列进行重新排列。
[0067] 本公开提供了DNA分子及其对应的核巧酸序列。如本文所使用，术语"DNA序列"、 "核巧酸序列"和"多核巧酸序列"是指DNA分子的核巧酸的序列，通常是从5'（上游或左侧） 端呈现至3'端（下游或右侧）。本文所用的命名法是美国联邦法规化nited S化tes Code Of Federal Regulat ions) §1.822的第37条所要求的命名法，并且记述于WIPO标准ST. 25 (1998)的附录2的表1和表3中。本公开仅参照在转基因事件M0N87403中提供的两条核巧酸 序列链中的一条链来公开。因此，通过暗示和推导，互补序列（在本领域中也称为完整互补 物或反向互补序列)是在本发明的范围内，且因此也意图落在要求保护的主题的范围内。
[0068] 对应于插入转基因 DNA的完整核巧酸序列和在插入转基因 DNA的任一端的侧翼的 玉蜀泰基因组DNA的大部分片段的核巧酸序列在本文中作为SEQ ID NO: 10提供。运当中的 一个分段是作为SEQ ID NO:9提供的插入转基因 DNA。位于插入转基因 DNA的5'端侧翼的基 因组DNA的核巧酸序列和插入DNA的5'端的一部分在本文中作为SEQ ID N0:7提供。位于插 入转基因 DNA的3 '端侧翼的基因组DNA的核巧酸序列和插入DNA的3 '端的一部分在本文中作 为SEQ ID NO:8提供。跨越其中转基因 DNA连接和链接到基因组DNA的位置的区域在本文中 称为接合点。"接合序列"或"接合区"是指跨越插入转基因 DNA和相邻的侧翼基因组DNA的 DNA序列和/或相应的DNA分子。事件M0N87403的接合序列的实例在本文中作为SEQ ID NO: 1-6提供。在源自玉米植物或种子的核巧酸分子中鉴定到运些接合序列中的一个可W确定 DNA是从事件M0N87403获得的，并且诊断出来自事件M0N87403的DNA的存在。SEQ ID NO: 1是 跨越基因组DNA与插入DNA的5'端之间的接合点的20bp核巧酸序列。沈Q ID N0:3是跨越基 因组DNA与插入DNA的5 '端之间的接合点的60bp核巧酸序列。SEQ ID NO: 5是跨越基因组DNA 与插入DNA的5 '端之间的接合点的10化P核巧酸序列。沈Q ID NO: 2是跨越基因组DNA与插入 DNA的3'端之间的接合点的20bp核巧酸序列。SEQ ID NO:4是跨越基因组DNA与插入DNA的3' 端之间的接合点的60bp核巧酸序列。沈Q ID NO:6是跨越基因组DNA与插入DNA的3'端之间 的接合点的l(K)bp核巧酸序列。源自转基因事件M0N87403的包括SEQ ID NO: 1的至少19个连 续核巧酸或SEQ ID N0:3的31、32、33、34、35、40、45、50、55个或所有连续核巧酸或沈0 1〇 側:5的51、52、53、54、55、60、65、70、75、80、85、90、95个或所有连续核巧酸的任何0臟片段是 在本公开的范围内。源自转基因事件M0N87403的包括SEQ ID NO:2的至少18个连续核巧酸 或沈Q ID N0:4的31、32、33、34、35、40、45、50、55个或所有连续核巧酸或沈9 10側:6的51、 52、53、54、55、60、65、70、75、80、85、90、95个或所有连续核巧酸的任何0魁片段是在本公开 的范围内。另外，包含与本段中所述的任何序列互补的序列的任何多核巧酸分子是在本公 开的范围内。图1是包含事件M0N87403的玉米植物的基因组中的转基因 DNA插入物W及从5 ' 至3'排列的SEQ ID NO: 1-10的相对位置的图解。本公开还提供了包含具有与SEQ ID NO: 10 的全长至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列的多核 巧酸的核酸分子。
[0069] 本公开进一步提供了可W作为引物或探针用于诊断样品中源自事件M0N87403的 DNA的存在的示例性DNA分子。运样的引物或探针对于祀核酸序列是特异性的，且因此可用 于通过本文所述的本公开的方法鉴定事件M0N87403核酸序列。
[0070] "探针"是分离的核酸，其上连接有可检测的标记或报道分子，例如放射性同位素、 配体、化学发光剂或酶。运种探针与祀核酸的链互补。在本公开的情况下，运种探针与源自 包含事件M0N87403的玉米的基因组DNA的链互补，无论该链来自玉米植物还是来自包含源 于该事件的DNA的样品。根据本公开的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括 聚酷胺和特异性结合祀DNA序列的其它探针材料。运种结合的检测可W用于诊断/确定/确 认特定样品中祀DNA序列的存在。
[0071] "引物"通常是分离的多核巧酸，其被设计成在特定的退火或杂交方法中用于与互 补的祀DNA链杂交形成该引物与祀DNA链之间的杂交体，且然后通过聚合酶例如DNA聚合酶 沿祀DNA链延伸。在热或等溫扩增(例如聚合酶链式反应(PCR))或其它核酸扩增方法中可W 使用一对引物和模板DNA(例如玉蜀泰基因组DNA的样品）W产生扩增子，其中由运种反应产 生的扩增子将具有对应于位于引物与模板杂交的两个位点之间的模板DNA的序列的DNA序 列。如本文所使用，"扩增子"是已经使用扩增技术合成的DNA的一段或片段，即扩增反应的 产物。在本公开的一个实施方案中，用于诊断事件MO N87403的扩增子包含未在玉蜀泰基因 组中天然发现的序列。如本公开中所使用的引物对意指使用结合双链核巧酸片段的相反链 的两个引物，其目的是通常在热或等溫扩增反应或其它核酸扩增方法中线性扩增位于将被 引物对的个别成员结合的位置之间的多核巧酸片段。在实施方案中，可用作引物的示例性 DNA分子作为SEQ ID N0:ll-12、14-15、17-18和19-29提供。例如，在PCR中用于鉴定事件 M0N87403的示例性事件特异性引物作为SEQ ID NO: 17-18提供。可W用于分析5 '（左)接合 区的示例性引物被提供为SEQ ID NO: 19-23,且可W用于分析3'（右)接合区的示例性引物 被提供为SEQ ID NO: 24-29。可W用于事件M0N87403的接合性测试的示例性引物被提供为 SEQ ID NO: 11-12和沈Q ID NO: 14-15。术语"扩增子'的使用明确排除了可W在DNA扩增反 应中形成的引物二聚体。
[0072]根据本公开的探针和引物可W具有与祀序列的完全序列一致性，然而可W通过常 规方法设计不同于祀序列而保留优先与祀序列杂交的能力的引物和探针为了使核酸分子 用作引物或探针，只需要它们在序列上充分互补W能够在所采用的特定的溶剂和盐浓度下 形成稳定的双链结构。任何核酸杂交或扩增方法都可W用于鉴定样品中来自事件M0N87403 的转基因 DNA的存在。探针和引物的长度通常为至少约11个核巧酸、至少约18个核巧酸、至 少约24个核巧酸W及至少约30个核巧酸或更长。运样的探针和引物在高严格杂交条件下特 异性地与祀序列杂交。
[007引用于制备和使用探针和引物的方法描述于例如Mo 1 ecu Iar Cl on ing : A Laboratory Manual,第2 版，第1-3 卷，Sambrook 等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring 化rbor,NY,1989(下文中为"Sambrook等人，1989"); Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编车茸，Greene Publishing and Wiley-Interscience ,New York, 1992(定期更新）；W及Innis等人，PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications,Academic Press:San D