肠杆菌638及其应用方法
【专利说明】
[00011本申请是申请日为2011年3月10日的题为"肠杆菌638及其应用方法"的中国专利 申请No .201180023739.9的分案申请。
[0002]相关申请的参考
[0003] 本申请要求于2010年3月12日提交的美国临时专利申请NO. 61/313,415的权益，该 专利申请在此全部引用作为参考。
[0004] 本发明在政府的支持下完成，合同号DE-AC02-98CH10886，其由美国能源部颁发。 政府具有本发明中的某些权利。
技术领域
[0005] 本发明涉及一种新型肠杆菌物种，尤其涉及其与植物生长和发育相关的应用。
【背景技术】
[0006] 可以预料地球的气候变化会对农业生产力产生很大影响。例如，化石燃料燃烧造 成排放物增加，影响地球气候，这就更需要生产源自可再生资源的生物燃料。气候改变会影 响农业生产力的另一个方面是其造成温度升高并对降雨模式造成影响。
[0007] 虽然期望增加用于生产生物燃料的原料生产中的农业资源需求，但是该增加的需 求需与同时增加的用于养活仍在增长的世界人口的食物需求相平衡。
[0008] 因此，需要实现用于优化粮食生产和生物燃料原料生产的可持续发展。通过可持 续方式最佳地提高总植物生产力，提高植物的抗旱性，使得农作物和原料可承受较大波动 的降雨模式，并增加植物的耐病原体感染性。
【发明内容】
[0009] -方面，本发明涉及肠杆菌638(杨树内生菌，Enterobacter sp.638)的分离培养 物（isolated culture)。
[0010] 另一方面，本发明涉及用于植物的接种物。该接种物包括肠杆菌638的分离培养物 和生物学可接受的基质(medium) 〇
[0011] 仍在另一个方面，本发明涉及用于增加植物生长的方法。该方法包括为植物施加 (应用，apply)可有效增加植物生长的量的组合物，其中该组合物包括肠杆菌638的分离培 养物。
[0012] 在进一步方面，本发明涉及用于增加植物中的生物量(biomass)的方法。该方法包 括为植物施加可有效增加植物中生物量的量的组合物，其中该组合物包括肠杆菌638的分 离培养物。
[0013] 仍在进一步方面，本发明涉及用于提高植物的果实和/或种子生产力 (productivity)的方法。该方法包括为植物施加可有效提高植物的果实和/或种子生产力 的量的组合物。该组合物包括肠杆菌638的分离培养物。
[0014] 在其他方面，本发明涉及提高植物抗病性(耐病性，disease tolerance)的方法。 该方法包括为植物施加可有效提高植物抗病性的量的组合物。该组合物包括肠杆菌638的 分尚培养物。
[0015] 仍在其他方面，本发明涉及提高植物耐旱性的方法。该方法包括为植物施加可有 效提高植物抗病性的量的组合物。该组合物包括肠杆菌638的分离培养物。
[0016] 从以下详述和附图可了解本发明的其他优点和方面。
【附图说明】
[0017]图1表示关于接种不同内生细菌的杨树插条(cutting)的生长指数。在砂土中接种 和种植插条的10周后测定生长指数。每个条件使用7个植物。植物生长于温室中。未接种的 植物用作对照(参考）。棒表示标准误差。接种和未接种的植物生长10周后，其生长指数计算 为(Mt-Md/M^Mo表示0周时植物的重量(g) ;Mt表示10周后植物的重量(g)。利用Dunnett检 验，相比未接种的对照植物，接种植物中产生的增加生物量的统计学显著性证实在5%水平 (林)。
[0018] 图2示出肠杆菌638对杨树DN-34的芽（shoot)和根形成的影响。植物水培于不存在 株638(对照)或存在株638的半强度的Hoagland溶液中。在I(A)和10(B)周后出现芽和根的 生长。
[0019] 图3示出经4个月生长期收获的西红柿（番茄）的总重量。相比未接种的对照植物， 接种肠杆菌638的植物产量高出10 %。
[0020] 图4显示相比作为对照的未接种向日葵，接种肠杆菌638的向日葵植物接种后缩短 了开花时间。
[0021] 图5示出在不存在(顶部色谱)或存在(底部色谱)植物提取物时生长的肠杆菌638 提取物的色谱比较。当存在植物提取物时，注意乙偶姻和2,3_ 丁二醇的产生。结果从包含蔗 糖的确定培养基(definite medium)中获得。
[0022]图6示出来自根据其不同基因定位:染色体或质粒pENT638-l的特定COG类的基因 的百分比。C 〇 g类图例：D细胞周期控制，细胞分裂，染色体分离；M细胞壁/膜/包膜 (envelope)的生物合成;N细胞活动性;0翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣;T信号转导机制;U 细胞内运输、分泌和膜泡运输;V防御机制;W胞外结构;J翻译，核糖体结构和生物合成;K转 录;L复制，重组和修复;C能量的产生和转换;E氨基酸的运输和代谢;F核苷酸的运输和代 谢;G碳水化合物的运输和代谢;H辅酶的运输和代谢；I脂质的运输和代谢;P无机离子的运 输和代谢;Q次生代谢产物的生物合成，运输和分解代谢;R仅一般功能预测;S功能未知。 [0023]图7示出当接种肠杆菌638后烟草中产生的增加的生物量。为了比较，包括未接种 的对照植物和接种恶臭假单胞菌W619(Pseudomonas putida)的植物。接种肠杆菌638的烟 草植物不仅生长最多，而且和向日葵一样，其开花较早。
【具体实施方式】
[0024] 根据本发明的肠杆菌638于2011年3月4日生物保藏于ATCC专利保藏机构，10801 University Blvd.，马纳萨斯，VA 20110。
[0025] A ·肠杆菌638的培养
[0026] 一方面，本发明涉及肠杆菌638的分离培养物。肠杆菌638为非植物病原细菌菌株。 在有氧条件下，从表面灭菌的根和茎样品中分离出肠杆菌638菌株，所述根和茎样品取自生 长于其下含地下水并被四氯化碳或三氯乙烯污染的粉砂壤土(silty loam soil)中的杂交 杨树 Hl 1-11。
[0027] 肠杆菌638菌株包括4，518，712bp的单环染色体，其总G+C含量为52.98%，且其稳 定地包括157,749bp的质粒pENT638-l，其总G+C含量为50.57%。根据GC含量，pENT638-l质 粒至少显示四个不同区域。PENT638-1质粒与发现于其他肠杆菌科中的F质粒有关。该类质 粒涉及宿主的相互作用和毒性，例如，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的pFra质粒。然 而，在PENT638-1中，pFra致病岛被独特的23kb假定基因组岛（侧接整合酶基因且其GC含量 与其余质粒的GC含量显著不同）取代。
[0028] "分离培养物"指的是不包含其他物质的微生物培养物，其他物质包括（i)在微生 物生长的土壤中通常发现的物质，和/或（ii)在微生物从中分离的物质。另外，该培养物可 以是不包含其他的其数量足以干扰复制培养物或足以通过正规的细菌学、分子生物学和/ 或化学技术进行检测的生物、微生物和/或细菌物种的培养物。
[0029] B.植物接种物
[0030] 另一方面，本发明涉及植物接种物。接种物包括肠杆菌638的分离培养物和生物学 上可接受的基质。术语"微生物接种物"或"接种物"指的是包含肠杆菌638分离培养物的制 剂。
[0031] 为了促进肠杆菌638的培养物，例如可利用合适的培养基或载体对该培养物进行 稀释。"生物学上可接受的基质"指的是不干扰肠杆菌638生物活力有效性且对肠杆菌638没 有毒性的基质。
[0032] 示例性的生物学上可接受的基质包括含葡糖酸盐的最低盐基质和稀释的富集基 质（1/100 LB)。生物学上可接受的基质可包括碳源，如下面示例的化合物:D-甘露糖醇、乳 糖、蔗糖、熊果苷、水杨苷、海藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、葡糖酸 盐和葡萄糖。优选地，该基质包括葡萄糖，蔗糖，其他的植物中提取的糖和/或引起促进植物 生长的植物激素诱导的杨树提取物(乙偶姻，2，3-丁二醇，见图5)。
[0033]在一个实施例中，接种物进一步包括促植物生长微生物（plant-growth promoting microorganism)，例如包括促进植物生长的内生细菌、真菌、根际细菌 (rhizosphere bacterium)和/或菌根真菌。具体示例性的促植物生长微生物包括但不局限 于放线菌(Act inobacter)、产喊杆菌(Alcaligenes)、芽抱杆菌（Bacillus)、伯克氏菌 (Burkholderia)、布丘氏菌（Buttiauxella)、肠杆菌（Enterobacter)、克雷伯氏菌 (Klebsiella)、克吕沃尔氏菌(Kluyvera)、假单胞菌(Pseudomonas)、拉恩氏菌(Rahnella)、 青枯菌（Ralstonia)、根瘤菌（Rhizobium)、沙雷氏菌（Serratia)、寡养单胞菌 (Stenotrophomonas)属中的成员。
[0034] C.增加生长的方法
[0035] 另一方面，本发明涉及用于增加植物生长的方法。该方法包括为植物施加有效量 的含肠杆菌638分离培养物的组合物。
[0036] 这里使用的"植物"指的是任何类型的植物，例如树(乔木，tree)、灌木、花、草本植 物、藤本植物或草。术语"植物"还指植物的任何部分，例如，指整个植物、植物的部分、植物 细胞或植物细胞群如植物组织、或其后代。幼苗也可包含于"植物"含义中。植物包括，例如， 任何裸子植物和被子植物，单子叶植物和双子叶植物以及树。
[0037] 示例性的单子叶被子植物包括但不局限于芦笋、野生甜玉米（field and sweet corn)、大麦、小麦、大米(稻，rice)、高粱、洋葱、御谷(pearl millet)、黑麦和燕麦以及其他 的粮谷（cereal grain)、甘鹿、象草（elephant grass)、柳枝稷（switch grass)和芒草 (miscanthus)〇
[0038] 示例性的双子叶被子植物包括但不局限于西红柿、烟草、棉花、油菜籽、野生豆、大 豆（soybean )、辣椒、萬苣、豌豆、紫花苜蓿(alfalfa )、三叶草、油菜作物或甘蓝(Brassi ca oleracea)(如，卷心菜、花椰菜、菜花、球芽甘蓝）、萝卜、胡萝卜、甜菜、茄子、菠菜、黄瓜、南瓜、 甜瓜、哈密瓜、向日葵和各种观赏植物(ornamental)。在一个优选实施例中，该植物为西红 柿。在另一个优选实施例中，该植物为向日葵。仍在另一个优选实施例中，该植物为烟草。
[0039] 植物的示例性木本物种包括杨树、松树、红杉、雪松、栎树等。树种进一步包括，例 如，冷杉、松树、云杉、落叶松、雪松、铁杉、洋槐、赤杨、山杨、山毛榉、桦树、胶皮糖香树 (sweet gum)、楓树、杨树、柳树和诸如此类的。在一个优选实施例中，该植物为杨树。
[0040] 这里使用的术语"增加"生长指的是增加利用本发明的方法或组合物处理的植物 的生长特性，其中该生长特性的增加大于在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长 的相应对照植物的生长。"相应的"对照植物指的是与利用本发明的方法和组合物处理的植 物相同类型和物种的野生型植物。
[0041 ]生长增加可为植物特定部分的生长增加，例如根、芽、叶片、花、果实和/或种子，或 者生长可分布于整个植物。生长的测定方法是本领域内所熟知的。
[0042] 生长增加可包括，例如，植物和/或植物的部分的以下特性:高度、宽度、质量、放射 性碳的累积的一种或其组合的增加，干重的增加，鲜重的增加和/或特定时期的这些增加的 速率的提高。
[0043] 生长增加还可包括，例如，产生的果实数量的增加，开花时间的缩短和/或起有益 作用的营养器官的质量的增加，如植物的根或块茎，其中这些部分是食物来源。
[0044] 生长增加可为在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物 生长的2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件 下生长的对照植物，生长增加的植物具有比相应对照植物多出10 %，15 %，20 %，25 %， 30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更大的生长。
[0045] D.增加生物量的方法
[0046] 在进一步方面，本发明涉及增加植物生物量的方法。该方法包括为植物施加有效 量的含肠杆菌6 38分离培养物的组合物。
[0047] 术语"生物量"指的是植物的干重或鲜重。例如，生物量包括除另外规定之外的所 有植物的部分，如有关芽生物量(所有地面以上的植物部分）、叶生物量和根生物量。术语 "干重"指的是已除去大多数细胞水的干燥植物的重量。术语"鲜重"指的是未干燥至除去大 多数细胞水的植物的重量。生物量的测量方法是本领域所熟知的。
[0048]术语"