增加生物量"指的是增加利用本发明方法和组合物处理的植物的生物量，其 中生物量的增加数量大于在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照组 的生物量数量。
[0049]生物量增加可为在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照组 植物生物量的2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相 同条件下生长的野生型植物，生物量增加的植物具有比相应对照植物多出IO %，15 %， 20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更大的生物量。
[0050] E.提高耐病性和/或抗病性的方法
[0051 ]仍在另一个方面中，本发明涉及提高植物的耐病性和/或抗病性的方法。该方法包 括为植物施加有效量的含肠杆菌638分离培养物的组合物。虽然不局限于任何特定理论，但 由于肠杆菌638产生乙偶姻和2,3_ 丁二醇或由于产生抗菌化合物2-苯乙醇和4-羟基苯甲酸 酯，或通过凭借铁载体（siderophore)肠杆菌素合成的必须营养物质的直接竞争，和/或通 过由肠杆菌638对异源产生的铁-铁载体复合物的摄入，所以肠杆菌638可提高植物的耐病 性和/或抗病性。
[0052] 术语"耐病性"指的是植物忍耐或抵抗疾病的能力并在疾病存在时保持功能和生 产的能力。疾病包括，例如，对植物生存能力产生不利影响的病理状态，如，植物中和/或植 物上的病原体(如真菌、病毒或细菌)感染。
[0053] 术语"抗病性"指的是植物得病后，在相同条件和相同疾病下生长，相比相应的不 显示抗病性的对照植物，植物产生较少疾病症状的能力。抗病性包括对疾病的完全抗性和/ 或表现为症状减轻、较长生存或其他疾病特征如较高的产量、增加生长、增加生物量、加速 果实成熟等的不同程度的抗性。
[0054] 疾病可以是，例如，真菌感染如壳针孢属（Septoria)、无柄锈属(Melampsora)或 septotina，病毒感染如白杨花叶病毒和/或细菌感染如土壤杆菌感染、立克次氏体感染或 棒状杆菌感染。
[0055] 术语"提高"耐病性和/或抗病性指的是提高有病害的借助本发明的方法或组合物 处理的植物的耐病性和/或抗病性，其中在相同条件和相同疾病下生长时，该耐病性和/或 抗病性大于相应对照植物的耐病性和/或抗病性。
[0056] 在相同条件和相同疾病下生长时，耐病性和/或抗病性的提高可为相应对照植物 的耐病性和/或抗病性的2、4、5、6、8、10、20 (或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和 组合物的相同条件下生长的野生型植物，耐病性和/或抗病性提高的植物具有比相应对照 植物高出 10%，15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更 大的耐病性和/或抗病性。
[0057]耐病性和/或抗病性的评估方法是本领域内所熟知的。例如，这些方法可包括对比 对照植株，观察和评定物理表现的疾病症状、植物活力的减少或死亡以及特定疾病响应基 因的活化。
[0058] F.提高果实和/或种子生产力的方法
[0059] 仍在进一步实施例中，本发明涉及提高植物果实和/或种子生产力的方法。该方法 包括为植物施加有效量的含肠杆菌6 38分离培养物的组合物。
[0060] "提高生产力"指的是提高利用本发明的方法或组合物处理的植物的果实和/或种 子的质量或数量，其中生产力的提高量大于在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生 长的相应对照植物的生产力的量。
[0061] 评估生产力提高的方法可包括，例如，测定植物所结果实的数量、植物所结的单个 果实的重量、植物的开花时间、植物果实的成熟时间和/或植物的单个果实或花产生的种子 数量。
[0062] 例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物，如 果植物所结果实的数量增加，植物所结的单个果实的重量增加，植物的开花时间缩短、植物 果实的成熟时间缩短和/或植物的单个果实或花所产生的种子数量增加，那么植物的生产 力得到提高。
[0063] 植物生产力的提高或降低分别比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生 长的相应对照植物多或少2、4、5、6、8、10、20 (或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和 组合物的相同条件下生长的对照植物，生产力提高的植物具有比相应对照植物高出10%， 15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更大的生产力。 [0064] G.提高耐旱性和/或抗旱性的方法
[0065] 在另一方面，本发明涉及提高植物耐旱性和/或抗旱性的方法。该方法包括利用含 肠杆菌638分离培养物的组合物处理植物。虽然不局限于任何特定理论，但由于肠杆菌638 产生乙偶姻和2,3_ 丁二醇，所以肠杆菌638可提高植物的耐旱性和/或抗旱性。
[0066] 术语"耐旱性"指植物忍耐或抵抗干旱条件的能力。"干旱"指的是植物在其中经受 渗透胁迫或减少的水势的环境。例如，一段时间缺乏可利用水分可导致干旱。可通过植物生 长或成熟所需的水分量与植物可利用的水分量的比较评估干旱条件。例如，相对于植物内 部利用或蒸发的水分量，缺乏降雨或灌溉可导致干旱条件。
[0067] 术语"抗旱性"指当在相同水胁迫的条件下生长时，相比相应的对照植物，植物产 生较少水胁迫症状的能力。抗旱性包括对干旱效应的完全抗性(不损失生产力)或表现为下 降症状、较长生存的不同程度的抗性。
[0068] 症状的表型评估可用于测定植物是否遭受干旱以及遭受何种程度的干旱。例如， 通过观察和评定(评级，rating)植物的萎蔫、生长停滞、死亡、生产力、叶片损失(如，叶片卷 曲、叶片扭曲、叶片脱落、叶片枯萎）、茎或枝条顶梢枯死、光合效率、开花、和产量水平，评估 耐旱性和/或抗旱性。另外，例如可通过生化或核酸检测来测定植物中的特定响应基因的表 达或活化，评估植物的耐旱性和/或抗旱性。
[0069] 如果植物表现出不太严重的干旱胁迫症状，那么植物的耐旱性和/或抗旱性得到 提高。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物，如果植 物的萎蔫、生长停滞、死亡、生产力、叶片损失（如，叶片卷曲、叶片扭曲、叶片脱落、叶片枯 萎）、和/或茎或枝条的顶梢枯死减少，那么植物的耐旱性和/或抗旱性得到提高。其他的耐 旱性和/或抗旱性提高的示例包括相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的 相应对照植物，植物的生产力、植物活力、光合效率、开花和/或产量的提高。
[0070]相应地，术语"提高"耐旱性和/或抗旱性指的是提高利用本发明方法或组合物处 理的植物的耐旱性和/或抗旱性，其中当在相同的条件和水胁迫下生长时，该耐性和/或抗 性大于相应对照植物的耐旱性和/或抗旱性。
[0071]在相同的环境和水胁迫下生长时，耐旱性和/或抗旱性的提高可为相应对照植物 的耐旱性和/或抗旱性的2、4、5、6、8、10、20 (或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和 组合物的相同条件下生长的对照植物，耐旱性和/或抗旱性提高的植物具有比相应对照植 物高出 10%，15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更大 的耐旱性和/或抗旱性。
[0072] Η. -般方法
[0073] 任何为植物施加组合物的方法可用于本发明方法中。在植物上和/或植物中施加 组合物的方法是本领域内所熟知的。在一个实施例中，该组合物可接种至植物的土壤中。在 另一个实施例中，通过在溶液培养基(hydroponic medium)中生长可将本发明组合物引入 植物的根或将其喷洒在植物的叶片上。
[0074]本发明组合物可施加至植物的任何部分，包括通过利用合适的涂层机制(coating mechanism)或粘合剂将其施加至植物的种子。本发明组合物既可在种植前施加至植物，亦 可在种植期间引入植物的犁沟(furrow)。如另一个示例所示，本发明组合物可施加至植物 的根。本发明组合物可借助或不借助载体制备，其作为直接插入种植植物的犁沟中的单独 接种物出售。
[0075]按照本发明的方法，发明组合物的有效量指足以建立足够细菌生长的量，使得处 理过的植物达到所需结果。本发明组合物的有效量可通过本领域内针对特定植物物种的已 知方法进行测定。例如，接种本发明组合物可水培6天进行，并在接种三天后更新细菌悬液。
[0076] 在一个实施例中，例如有效量可为每棵植物约IO1至约IO12个细胞间的任何量。在 另一个实施例中，有效量为细胞浓度约IO5至约1〇1() CFU/ml接种物，较优选地为约IO6至IO8 CFU/ml之间，且最优选地约为IO8 CFU/ml。仍在另一个实施例中，本发明组合物可与土壤混 合，其量为每克土壤约IO5至IO1t3个细胞。
[0077]实施例
[0078]实施例1:肠杆菌638的分离和鉴定
[0079] 根和芽样品采自10年（10-year-o Id)的在华盛顿州的实验场地于存在四氯化碳 (均匀地含12ppm)的环境下生长8年的杂交杨树Hll-Il(毛果杨美洲黑杨）。另外，原生柳树 (Salix gooddingii)材料采自5年的在存在三氯乙稀（18ppm)和四氯化碳（12ppm)的环境下 生长5年的原生植物。利用剪刀从植物上剪取插条，剪刀在切割时，需利用酒精进行清洗，并 将剪刀放置在丙酮漂洗的易挥发的有机分析瓶中，为了可从场地装运将分析瓶放置在冰 上。分别对根和芽进行处理。在蒸馏水中大力地清洗新鲜的根和芽样品5min，在每IOOrnl溶 液附加1滴吐温80的含1 % (重量/体积)活性氯化物(作为次氯酸钠 [NaOCl ]溶液）的溶液中 表面灭菌5min并在无菌的蒸馏水中漂洗三次。将取自第三次漂洗的100μ1的水样品平面接 种于869培养基（25)，以验证灭菌效率。灭菌后，利用Polytron PTl200均质器(Kinematica A6)将根和芽在IOml的IOmM MgSO4中浸软。然后进行连续稀释并将100μ1的样品平板接种在 非选择性的培养基上，以便检验内生菌的存在及其特性。
[0080] 在有氧条件下，从取自生长于其下含地下水并分别被四氯化碳或三氯乙烯和四氯 化碳污染的粉砂壤土中的杂交杨树Hl 1-11和原生柳树(Salix gooddingii)的表面灭菌的 根和茎样品中分离出肠杆菌638。提取其全基因组DNA并用于扩增16S rRNA基因。16S rRNA 基因利用标准6F-1392R引物组进行PCR扩增(Amann，1995)。
[0081 ]实施例2:针对杨树的植物生长促进特性的内生细菌的筛选 [0082]借助30°C旋转摇床上的1/10强度的869培养基(25)上生长的内生细菌制备接种物 (250ml培养），直到细胞浓度达到IO 9 CFU/ml(l光密度在660nm[0D660])。通过离心法收集 细胞，并利用IOmM MgSO4对其冲洗两遍，然后将其悬浮于1/10的原始体积(在IOmM MgSO4中） 中，从而获得细胞浓度为1〇1() CFU/ml的接种物。检测每个微生物菌株，对来自杨树(美洲黑 杨X欧亚黑杨)DN-34的大约30cm的七个插条进行称重并将其放置在其中含0.5L半强度无 菌Hoagland营养液(5)的IL烧杯中，该营养液每3天更新一次。插条经过约4周的生根后形成 根。随后，在半强度Hoagland营养液中的最终浓度为IO 8 CFU/ml时向每个杯子加入细菌接 种物。孵育3天后，对插条进行称重，将其种植在有菌的砂土中并放置于温度恒定在22°C且 进行Hh光照-IOh黑暗循环的光合有效辐射为165mmol/m2s的温室中。10周后，收获植物并 测定其总生物量、其增加的生物量和不同植物组织的生物量。同样收集未接种的对照植物 的数据。接种和未接种内生菌的植物生长10周后，其生长指数计算为(M t-Mo)/Mo,其中Mo表 示0周时植物的重量(g)且Mt表示10周后植物的重量(g)。利用Dunnett检验，结果的统计学 显著性证实在5%水平。为了测定内生细菌对杨树DN-34生根的影响，按上描述除第一天开 始加入内生菌接种物外，对插条进行处理。
[0083]检测分离自杨树的肠杆菌638提高其宿主植物生长的能力以及在杨树中发现的其 他内生γ变形菌纲（gammaproteobacteria)。将洋葱伯克霍尔德菌（BurkhoIderia cepacia)Bu72和耐金属亲铜菌（Cupriavidus metallidurans)CH34分别列为阳性和阴性对 照，洋葱伯克霍尔德菌Bu72是最初从黄色羽扇豆分离出的被发现可对杨树产生植物生长促 进影响的内生菌，耐金属亲铜菌CH34(也称为Ral stonia metal lidurans CH34)是没有已知 的植物生长促进影响的典型的土壤细菌。同样地，将未接种的插条用作对照。
[0084] 在水培条件(hydroponic condition)下形成根和随后的内生菌接种后，将杨树 DN-34插条种植于边缘砂土(marginal sandy soil)中，让其生长10周，然后收获植物并测