专利名称：人睾丸泛蛋白相关基因编码蛋白特异性抗体及基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于人类基因组技术领域。
本发明所述睾丸特异表达的泛蛋白相关基因(Ubiquitin-like fusingprotein,ULFP)基因是发明人在南京医科大学生殖医学江苏省重点实验室用基因芯片方法筛选获得，首先制备人睾丸功能基因表达芯片，通过比较胚胎和成年人睾丸功能基因的表达，获得差异表达克隆，经序列测定证明为全长cDNA，为3256bp；其开放阅读框架为2184bp，其编码728个氨基酸。查阅基因库，其编码氨基酸序列与爪蟾同源性达95％，但在人类和其它物种中未发现同源序列。经RT-PCR显示ULFP基因在人睾丸内特异表达，为睾丸功能特异基因，制备成融合蛋白，并用该蛋白免疫家兔，制备成单克隆和多克隆抗体，同时该基因已用于制备睾丸功能基因表达芯片。
由于ULFP基因序列在Genbank数据库中尚无同源序列，本发明人对于ULFP基因的结构和功能研究成果全都是开创性的。美国国家生物技术情报中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)已正式接受ULFP基因为Genbank的新成员，该基因的接受号为AF311324。
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②制备特异性抗体基因编码蛋白的特异性抗体是研究基因结构和功能的不可缺少的重要工具，ULFP基因编码蛋白多克隆和单克隆抗体，可用作免疫组织化学染色、ELISA、免疫电镜、免疫共沉淀等多种根据免疫学原理设计的检测方法，可用于该基因编码蛋白在组织细胞中的定位和定量研究。在各种生物样本(如血液、精液、尿液等)中的含量变化研究以及蛋白质-蛋白质相互作用研究等。因此，该抗体有可能用于制备与ULFP基因表达异常相关疾病诊断试剂盒制备，并有可能用于制备抗生育药物。
③制备基因芯片将功能基因用于制备基因芯片是基因开发研究的一个重要方面，在疾病诊断和药物筛选等方面均具有重要意义。本发明人已将ULFP基因用于睾丸功能基因芯片的制备，在今后睾丸功能研究、睾丸相关疾病(如男性不育、性功能低下)的诊断及治疗和药物筛选中将发挥重要作用。本发明技术方案1．ULFP基因融合蛋白的制备以ULFP基因开放阅读框的核苷酸序列与质粒pDESTTM15制备成GST-ULFP-pDEST15表达质粒，在无NaCl的LB中30℃培养到0.5 OD600，经0.3M NaCl诱导后，超声粉碎后经GST亲和层析柱纯化，得到纯化的GST-ULFP融合蛋白。2．ULFP基因编码蛋白特异性多克隆抗体取融合蛋白与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西兰兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激发注射一次，共三次，于三个月后取血分离血清。以免疫前动物血清作为对照做ELISA，测定各免疫兔血清中抗体滴度。筛选高滴度血清，进一步用抗原作竞争抑制免疫试验确定抗体的特异性。根据ELISA结果确定其用于免疫组织化学染色的稀释倍增数为1∶200～500。3．ULFP基因编码蛋白特异性单克隆抗体取融合蛋白与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔内注射)，隔周一次，连续2-3次，融合前静脉加强一次，用ELISA方法证实抗体的产生后，取脾脏分离脾细胞，然后与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞。阳性克隆经多次亚克隆，直至获得分泌抗ULFP的单克隆杂交瘤细胞株。4．ULFP基因用于制备睾丸功能基因表达芯片(1)以获取ULFP基因的核苷酸序列设计引物，扩增全长的ULFP序列，100ul PCR加入80μL异丙醇混匀，-20℃冰箱中放置60分钟，4℃4000rpm离心30分钟，。弃去上清，室温干燥。每孔加10μL变性液，转移至384孔板，4℃保存，用作点膜的样品。(2)用英国BioRobotics自动点膜仪将标本点在8×12cm尼龙膜上，每一标本点2个点，每点的DNA量约几ng。；阳性对照8个housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h.ubiquitin carboxyⅠ-ferminal esterase LⅠ)。阴性对照加λ噬菌体DNA和P-blue质粒。(3)将含有该基因的芯片用于ULFP缺失的诊断和药物筛选33P标记抽提待检标本mRNA或DNA，用Random Primer标记法标记待检标本mRNA或DNA，作为杂交的探针。杂交将点制好的尼龙膜68℃预杂交3小时，倒去预杂交液，加入2ml已高温变性过的探针杂交液，68℃杂交约20小时。将膜置于一个盛有250ml 2×SSC和0.5％SDS的白瓷盘内，室温浸泡15分钟。换新的洗脱液，37℃振荡l小时。再换新的洗脱液在65℃时振荡1小时。将尼龙膜转移到一个盛有250ml蒸馏水的托盘中，室温漂洗片刻。杂交炉(68℃)内烘干，用磷屏压片。信号扫描和分析实验室使用FIJIFILM公司的FLA-3000信号记录仪分析杂交信号。根据杂交信号的强弱分析影响ULFP蛋白表达水平或ULFP基因的缺失。
权利要求
1．一种睾丸功能特异基因(ULFP)克隆制备的融合蛋白，其特征是ULFP基因全部开放阅读框氨基酸，序列为MDNRKEPPFFNDDNMGPFYYRLHFCDTMELFIETLTGTCFELRVSPFETVISVKAKIRRLEGIPICRQHLIWNNMELENDYCLNDYNISEGCTLKLVLAMRGGPINTRRVPTDDPLRKMAEYLDSSRVEVWEKTSCSKQVTFLVYREGDQLNFFPAVDRGDGTLTPLSDSSKKIDFHLHVLRRKGEHRMSGGSMYNSDTDEDEETEPSSSGQQIIENSITMNKMKLLKAKMKNMNLSKKPKKAVKIKPHPPVAPRPSSGSTAPSRHRLLRVLPNIGQSCSPAFGNAYPPEISRNGISSLATQLSAERYISSITGEFLKEDNSWENNTLSHFSSNVKLPPQIPHLELGNDQELADSVLHLGSSLPRQTKHFLGNLPSSNGNIVLPSEECVTEQSLLPKVGSPASFAEGNADEQSSGLEGACKVNLELLLTNADKGLKAPEQHLKHVAGVLNGESVETSVLNYRELSPHKNRLLSPLRCSASMSLHNSLVKPERQSKCFEFGKLQPSSSQSLDVQNITDSSFSRTTCFQGVKVDSLGKRSDVISKVEARDITEMTNKASKEPVGCVNNISFLASLAGSTSRNRLQSTRGAGRLQNSGTGLSTNLQHFQEENFRKSSPQLEHTGVFLSTHGVGMNGNNAAAGKSVGECTTHHLPPVKAPLQTKKKTTNHCFLCGKKTGLASSYECRCGNNFCASHRYAETHGCTYDYKSAGRRYLHEANPVVNAPKLPKI
2．根据权利要求1所述针对ULFP基因开放阅读框氨基酸序列制备的多克隆抗体，其特征是融合蛋白与完全和不完全佐剂混合后，免疫新西兰兔制备多克隆抗体。
3．根据权利要求1所述针对ULFP基因开放读框氨基酸序列制备的单克隆抗体，其特征是融合蛋白与完全和不完全佐剂混合，免疫Balb/C小鼠，分离脾脏B淋巴细胞并和骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，进一步用亚克隆方法、ELISA和抗体分型方法筛选分泌IgG抗体的单克隆，制备单克隆抗体。
4．根据权利要求1所述针对将ULFP基因开放读框氨基酸序列用于制备睾丸功能基因表达芯片，其特征是PCR扩增ULFP基因cDNA，点于芯片用于芯片制备。
全文摘要
本发明属于人类基因组技术领域,所述的睾丸特异表达泛蛋白(Ubiquitin－like fusing protein,ULFP)基因全长cDNA序列为3256bp,其开放阅读框序列为2184bp,其编码728个氨基酸,该基因在基因库(Genbank)中的编号为AF311324。本发明利用ULFP基因克隆制备融合蛋白,并用该蛋白免疫动物制备单克隆和多克隆抗体,同时将基因克隆用于睾丸特异功能基因表达芯片的制备。
文档编号C12Q1/68GK1309136SQ0110825
公开日2001年8月22日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者沙家豪, 周作民, 李建民 申请人:南京医科大学