专利名称：碱性蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及比活高且耐氧化性强、并且作为加入到洗涤剂中具有优良洗涤性的酶的碱性蛋白酶。
背景技术：
蛋白酶常用于各种领域，例如包括洗衣用洗涤剂的各种洗涤剂、化妆品、沐浴剂、食品改良剂、以及例如助消化剂和抗炎剂的药物。其中，洗涤剂用蛋白酶在工业上已大量生产并且具有很大的市场规模。许多蛋白酶现已投放市场。
在大多数情况下，衣服上的污物不仅含有蛋白质，而且含有例如脂类和固体粒子的多种组分。因此要求洗涤剂具有足够高的洗涤性，以便除去这些实际的复合污物。从这一角度发现，碱性蛋白酶甚至在有高浓度脂肪酸的情况下能够保持酪蛋白水解活性，并且即使污物不是仅由蛋白质组分组成，而是由例如蛋白质和脂类的多种组分组成时能够呈现优良的洗涤性，并且其分子量为约43,000，本发明人对其申请了一专利(WO99/18218)。
然而，已需要在比活、耐氧化性和洗涤性方面优于上述碱性蛋白酶并且可以用于广泛组合物的洗涤剂的碱性蛋白酶。
发明内容
本发明人检索了这些主要来自酶变体的碱性蛋白酶。然而上述碱性蛋白酶在酶学性能方面与以枯草杆菌蛋白酶为代表的丝氨酸蛋白酶完全不同，以致枯草杆菌蛋白酶的改性位置没有提供有用信息。本发明人经过进一步研究发现，为了获得更好的比活、耐氧化稳定性和洗涤性，同时保持上述碱性蛋白酶的性能的新型碱性蛋白酶，它们必需在其氨基酸序列的预定位置具有一特定的氨基酸残基。
因此，本发明一方面提供了一种碱性蛋白酶，其中在SEQ ID NO1的(a)84位、(b)104位、(c)256位或(d)369位或其相应位置的氨基酸残基缺失或者选自在位置(a)精氨酸残基，在位置(b)脯氨酸残基，
在位置(c)丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸残基，和在位置(d)天冬氨酸残基。
本发明另一方面还提供了一种碱性蛋白酶，其中在SEQ ID NO1的(e)66或264位、(f)57、101-106各位、136、193或342位、(g)46或205位、(h)54、119、138、148或195位、(i)247位、(j)124位、(k)107位或(l)257位、或者在其相应位置的氨基酸残基缺失或者选自在位置(e)谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甘氨酸或异亮氨酸残基，在位置(f)赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸或丙氨酸残基，在位置(g)酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基，在位置(h)色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸或半胱氨酸残基，在位置(i)色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基，在位置(j)丙氨酸或赖氨酸残基，在位置(k)赖氨酸、精氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，和在位置(l)缬氨酸或异亮氨酸残基。
本发明又一方面还提供了一种编码该碱性蛋白酶的基因、含有该基因的重组载体和含有该载体的转化体。
本发明再一方面还提供了一种含有该碱性蛋白酶的洗涤剂组合物。
附图简述
图1为描述碱性蛋白酶变体的洗涤性的图；图2为描述各个碱性蛋白酶变体的相对比活的图；和图3为描述用氧化剂处理之后各个碱性蛋白酶变体的相对残余活性的图。
实施本发明的最佳方式如上所述，在本发明的碱性蛋白酶中，在SEQ ID NO1的(a)84位、(b)104位、(c)256位或(d)369位或者其相应位置的氨基酸残基缺失或选自在位置(a)精氨酸残基，在位置(b)脯氨酸残基，在位置(c)丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸残基，和在位置(d)天冬氨酸残基；或者在SEQ ID NO1的(e)66或264位、(f)57、101-106各位、136、193或342位、(g)46或205位、(h)54、119、138、148或195位、(i)247位、(j)124位、(k)107位或(l)257位或者在其相应位置的氨基酸残基缺失或者选自在位置(e)谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甘氨酸或异亮氨酸残基，在位置(f)赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸或丙氨酸残基，在位置(g)酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基，在位置(h)色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸或半胱氨酸残基，在位置(i)色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基，在位置(j)丙氨酸或赖氨酸残基，在位置(k)赖氨酸、精氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，和在位置(l)缬氨酸或异亮氨酸残基。
尤其是，本发明的碱性蛋白酶意思是具有SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列的碱性蛋白酶，其中在选自上述(a)-(d)和(e)-(l)的位置的氨基酸残基已缺失或预定，或者意思是另一碱性蛋白酶，其中在其相应位置的氨基酸残基已缺失或预定。它们可以是野生型酶、野生型变体或人工变体。
“另一碱性蛋白酶”可以是野生型酶或野生型变体。优选具有耐氧化性和通过SDS-PAGE测定的分子量为43,000±2,000的那种，其中更优选具有与SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少60％同源性的氨基酸序列的那种。特别优选的是具有与SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少60％同源性的氨基酸序列、具有耐氧化性的那种，在碱性范围(pH 8或更大)工作，在pH 10下甚至在50℃处理10分钟时稳定地具有至少80％残余活性，受氟磷酸二异丙酯(DFP)和苯甲烷磺酰氟(PMSF)抑制，并且通过SDS-PAGE测定的分子量为43,000±2,000。本文所用的术语“具有耐氧化性”意思是当它在50mM过氧化氢溶液(含5mM氯化钙)中在pH 10(20mMBritton-Robinson缓冲液)和20℃下处理20分钟时具有至少50％的残余活性(合成底物试验)。
“具有SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列的碱性蛋白酶”的例子包括KP43[源自芽孢杆菌菌株KSM-KP43(FERM BP-6532)，WO99/18218]，而“具有与SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少60％同源性的氨基酸序列的碱性蛋白酶”的例子包括具有SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列的蛋白酶KP9860[源自芽孢杆菌菌株KSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218]、具有SEQ ID NO3所代表的氨基酸序列的蛋白酶E-1[源自芽孢杆菌菌株号D-6(FERM P-1592)，JP740710]、具有SEQ ID NO4所代表的氨基酸序列的蛋白酶Ya[源自芽孢杆菌菌株Y(FERM BP-1029)，JP861210)、具有SEQ ID NO5所代表的氨基酸序列的蛋白酶SD521[源自芽孢杆菌菌株SD-521(FERM BP-11162)，JP910821]、具有SEQ IDNO6所代表的氨基酸序列的蛋白酶A-1(源自NCIB12289，WO8801293)和具有SEQ ID NO7所代表的氨基酸序列的蛋白酶A-2(源自NCIB12513，WO8801293)。其中，优选选自SEQ ID NOS.2-7的氨基酸序列或者与其有至少80％，更优选至少90％，特别是至少95％同源性的碱性蛋白酶。
氨基酸序列的同源性是由Lipman-Pearson法计算的(Science，227，1435(1985))。
“在相应位置的氨基酸残基”可以通过使用已知的算法，例如Lipman-Pearson算法比较氨基酸序列来鉴定。在各蛋白酶的序列中“相应位置的氨基酸残基”的位置可以这种方式通过对比该蛋白酶的氨基酸序列来确定。假定该相应位置存在于SEQ ID NO1的氨基酸序列中的三维相同位置，并且存在于该相同位置的氨基酸残基对该蛋白酶的特定功能带来相似效果。
具体地说，(a)在SEQ ID NO1的84位的氨基酸残基为赖氨酸残基。通过使用上述方法，在其相应位置的氨基酸残基可以确定为SEQ ID NO3的83位的赖氨酸残基。该氨基酸残基优选为精氨酸。
(b)尽管SEQ ID NO1的104位的氨基酸残基为亮氨酸残基，但是该氨基酸残基或其相应氨基酸残基优选为脯氨酸残基。
(c)尽管SEQ ID NO1的256位的氨基酸残基为甲硫氨酸残基，但是特别优选该氨基酸残基为丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸残基。
(d)尽管SEQ ID NO1的369位的氨基酸残基为天冬氨酸残基，但是该氨基酸残基或其相应的氨基酸残基优选为天冬酰胺残基。
(e)尽管SEQ ID NO1的66或264位的氨基酸残基为天冬酰胺残基，但是该氨基酸残基优选为谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甘氨酸或异亮氨酸残基，并且特别优选天冬氨酸、丝氨酸或谷氨酸残基。更优选的情况是在66位的氨基酸残基为天冬氨酸残基并且在264位的氨基酸残基为丝氨酸残基。
(f)尽管在SEQ ID NO1的57、101-106、136、193和342的各自位置的氨基酸残基为甘氨酸残基，但是该氨基酸残基优选为赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸或丙氨酸残基。特别优选的情况是在57、136、193或342位置的氨基酸残基为丙氨酸残基，或者在103位的氨基酸残基为精氨酸残基。
(g)尽管在SEQ ID NO1的46或205位的氨基酸残基为苯丙氨酸残基，但是该氨基酸残基优选为酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基。特别优选的情况是在46位的氨基酸为亮氨酸残基。
(h)尽管在SEQ ID NO1的54、119、138、148或195位的氨基酸残基为酪氨酸残基，但是该氨基酸残基优选为色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸或半胱氨酸残基。特别优选的情况是在195位的氨基酸残基为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、色氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺或组氨酸残基。
(i)尽管在SEQ ID NO1的247位的氨基酸残基为赖氨酸残基，但是该氨基酸残基优选为色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基。作为247位的该氨基酸残基，特别优选精氨酸或苏氨酸残基。
(j)尽管在SEQ ID NO1的124位的氨基酸残基为精氨酸残基，但是该氨基酸残基优选为丙氨酸或赖氨酸残基。
(k)尽管在SEQ ID NO1的107位的氨基酸残基为亮氨酸残基，但是该氨基酸残基优选为赖氨酸、精氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，并且特别优选赖氨酸残基。
(l)尽管在SEQ ID NO1的257位的氨基酸残基为丙氨酸残基，但是该氨基酸残基优选为缬氨酸或异亮氨酸残基，并且特别优选为缬氨酸残基。
关于上面例证中优选的“另一碱性蛋白酶”，下面显示了相应于蛋白酶KP43的氨基酸序列(SEQ ID NO1)的(a)-(d)和(e)-(1)的位置和氨基酸残基的特定例子(表1-a，表1-b)。
表1-a
表1-b
在本发明的碱性蛋白酶中，可以同时在两个或多个位置进行(a)-(d)或(e)-(l)中氨基酸残基的缺失或选择。
当本发明的碱性蛋白酶为一变体时，“具有SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列的蛋白酶”或者上面所例举的“另一碱性蛋白酶”被用作突变之前的碱性蛋白酶(可以将其称之为“母体碱性蛋白酶”)。通过在该母体碱性蛋白酶的所需位置引入突变，可以获得本发明的碱性蛋白酶。例如，它可以通过缺失或者用另一氨基酸残基替代选自上述蛋白酶KP43的SEQ ID NO1的氨基酸序列的(a)-(d)和(e)-(l)的位置或者另一碱性蛋白酶氨基酸序列的相应位置，更具体地说是SEQ IDNOS2-7所代表的氨基酸序列的相应位置的氨基酸残基来获得。
本发明的碱性蛋白酶例如可以通过向克隆基因编码的母体碱性蛋白酶引入突变，使用所得突变基因转化适宜宿主，然后培养该重组宿主获得。可以使用常规基因重组技术，例如根据WO99/18218、JP901128或WO98/56927中所述的方法进行编码母体碱性蛋白酶用的基因的克隆。
为了编码母体碱性蛋白酶的基因突变，现在可以采用流行的随机突变或位置特异性突变中任意一种。更具体地说，可以使用例如TakaraShuzo Co.，Ltd.的“Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kit”通过使用如“PCR protocols”(Academic Press，NewYork，1990)中所述的重组PCR(聚合酶链反应)进行突变，基因的所需序列可以用相应于所需序列的另一基因的序列代替。
为了通过使用所得突变基因生产本发明的蛋白酶变体，例如可以使用以下方法。通过将该突变基因与能够稳定地将其扩增的DNA载体结合或者通过将该突变基因引入到能够稳定地保持它的染色体DNA上来将编码本发明的蛋白酶变体的DNA稳定地扩增，然后将该基因引入能够稳定且有效地表达该基因的宿主中，由此生产该变体蛋白酶。满足上述条件的宿主包括属于芽孢杆菌、大肠杆菌、霉菌、酵母和放线菌属的微生物。
由此获得的本发明的碱性蛋白酶在碱性区域中具有稳定的蛋白酶活性，酪蛋白水解活性不受较高级的脂肪酸抑制，并且通过SDS-PAGE测定的分子量为43,000±2,000。例如，可以从作为母体菌株的具有SEQID NO1的氨基酸序列的蛋白酶获得的蛋白酶变体具有下述物理化学活性。(i)起作用的pH范围它在4-13的宽pH范围内起作用并且在pH 6-12下具有至少80％的最佳pH活性值。(ii)稳定的pH范围它在40℃的处理条件下在pH为6-11时能够稳定30分钟。(iii)脂肪酸的影响其酪蛋白水解活性不受油酸抑制。
本发明的这些蛋白酶具有优良的比活、耐氧化性和洗涤性，由此可用作加入各种洗涤剂组合物中的酶。特别是在SEQ ID NO1的位置(a)-(d)或其相应位置的氨基酸残基已缺失或指定的蛋白酶具有优良的洗涤性。其中，在(c)256位或其相应位置的氨基酸残基为丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸残基的那些蛋白酶既具有高的比活又具有强的耐氧化性。在SEQ ID NO1的位置(e)-(l)或其相应位置的氨基酸残基已缺失或指定的蛋白酶具有特别优良的比活。
上述蛋白酶可以足够呈现其活性的量加入到本发明的洗涤剂组合物中。尽管每1kg洗涤剂组合物中可以加入0.1-5000P.U.，但是从经济方面考虑加入1000P.U.或更少，优选500P.U.。
可以将各种酶与本发明的碱性蛋白酶组合用于本发明的洗涤剂组合物中。例子包括水解酶、氧化酶、还原酶、转移酶、裂合酶、异构酶、连接酶和合成酶。其中蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、角蛋白酶、酯酶、角质酶、淀粉酶、支链淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶、葡萄糖甙酶、葡聚糖酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、漆酶和除了用于本发明的该碱性蛋白酶之外的蛋白酶是优选的。
蛋白酶包括可商购获得的Alcalase、Esperase、Savinase和Everlase(各自为Novo Nordisk的产品)、Properase和Purafect(各自为Genencor International Inc.的产品)和KAP(Kao Corp)。纤维素酶包括Cellzyme和Carezyme(各自为Novo Nordisk的产品)、KAC(KaoCorp.)和如日本专利申请特开平10-313859中所述通过芽孢杆菌菌株KSM-S237生产的碱性纤维素酶。淀粉酶包括Termamyl和Duramyl(各自为Novo Nordiek的产品)、Purastar(Genencor International Inc.)和KAM(Kao Corp.)。脂肪酶包括Lipolase和Liporase Ultra(各自为Novo Nordisk的产品)。上面所例举的酶可以0.001-10％，优选0.03-5％的量加入。
可以0.5-60wt.％(本文后面将简称为“％”)的量将表面活性剂加入到洗涤剂组合物中。优选分别向粉末状洗涤剂组合物和液体洗涤剂组合物中加入10-45％和20-50％。当本发明的洗涤剂组合物为漂白洗涤剂或自动洗碗机洗涤剂时，经常可以1-10％，优选1-5％的量加入表面活性剂。
可以0.01-50％的量加入二价金属离子清除剂，优选为5-40％。
可以0.01-80％，优选1-40％的量加入碱性试剂和无机盐。
可以0.001-10％，优选1-5％的量加入抗污物再沉积剂。
优选以1-10％的量加入漂白剂(例如过氧化氢或过碳酸盐)，使用漂白剂时，可以加入0.01-10％的漂白活化剂。
作为荧光增白剂，可以使用联苯型(如“Tinopal CBS-X”)和茋型(如DM荧光染料)。优选加入量为0.001-2％。
可按常规方式通过使用上述方法获得的碱性蛋白酶和上述已知的洗涤剂组分制备本发明的洗涤剂组合物。可以根据使用目的选择洗涤剂形式。例子包括液体、粉末和颗粒。
当将本发明的碱性蛋白酶加入到粉末状洗涤剂组合物中时，优选提前制备洗涤剂颗粒，然后根据日本专利申请特开昭62-25790中所述的方法将碱性蛋白酶颗粒混入其中，以免工人和最终使用者通过制备或使用该洗涤剂而与该酶接触或者防止该酶热诱导失活或分解。
由此获得的本发明洗涤剂组合物可以用作洗衣洗涤剂、漂白洗涤剂、自动洗碗机洗涤剂、管道清洗剂和人造牙齿清洁剂。特别优选用作洗衣洗涤剂、漂白洗涤剂或自动洗碗机洗涤剂。
使用Takara Shuzo Co.，Ltd.生产的“LATaq”通过聚合酶反应将该扩增的DNA片段整合到一载体中。具体地说，在向35μL该提纯的洗脱液中加入5μL LATaq用缓冲液(10倍浓度)、8μL的一种dNTP溶液和0.5μL LATaq DNA聚合酶、以及作为模板的20ng质粒pHA64TS(具有与表达载体pHA64结合的蛋白酶结构基因)之后，将其总量调整至50μL。将所得液体的PCR反应进行30次循环，每次循环由在94℃下处理1分钟、在55℃下处理1分钟和在72℃下处理4分钟组成。通过接着的乙醇沉淀，收集该PCR产物。该PCR产物具有在引物的5’引物端具有一切口的质粒形状。通过T4连接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.的产品)的连接酶反应连接该切口部分。
通过使用10μL该连接酶反应混合物，进行枯草杆菌菌株ISW1214的转化，由此获得约4×105转化体。将所得的该菌株ISW1214的转化体在含脱脂乳的培养基(含有1％脱脂乳、1％细菌用胰蛋白胨、1％氯化钠、0.5％酵母浸膏、1.5％琼脂和7.5μg/ml四环素)上培养并观察盐的形成，该盐的形成假定反映了蛋白酶的分泌量。
然后，在加热到70℃下将15重量份的非离子表面活性剂、15重量份的50wt.％十二烷基苯磺酸钠水溶液和1重量份的聚乙二醇混合，由此获得一混合物。在Loedige混合器(Matsuzaka Giken Co.，Ltd.的产品，容积20L，配备有一夹套)中倒入100份重量从上面获得的基本颗粒，通过主轴(150rpm)搅拌并开动切碎机(4000rpm)。使75℃的温水在夹套中以10L/min流动，在3分钟内将该混合物倒入其中，然后搅拌5分钟。用10份重量的结晶硅铝酸盐将洗涤剂颗粒的表面覆盖，由此获得颗粒洗涤剂最终产品。[所用原料]十二烷基苯磺酸钠水溶液“Neopelex F65”(Kao Corp.的产品)非离子表面活性剂“Emulgen 108KM”(Kao的产品)，平均加入有8.5mol的氧化乙烯聚丙烯酸钠水溶液平均分子量为10000(按照日本专利
发明者秦田勇二, 小川晃范, 影山泰, 佐藤刚, 荒木裕行, 住友伸行, 奥田光美, 佐伯胜久 申请人:花王株式会社