检测病毒逆转录酶活性的制作方法

专利名称：检测病毒逆转录酶活性的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及逆转录酶活性检测，更具体来说，本发明涉及在药物筛选和临床环境下实时定量检测病毒逆转录酶。
背景技术：
Silver等，Nucleic Acids Res.213593(1993)公开了通过PCR扩增病毒逆转录酶(RT)的cDNA产物来检测生物样品中的逆转录病毒的方法。具有当存在病毒RT时，才用这种方法合成cDNA产物，然后通过鉴定DNA存在情况的常规技术检测所述cDNA。用于这一目的的技术包括例如，DNA印迹杂交、通过溴化乙锭染色显示、测定掺入的放射标记核苷酸以及用于与扩增DNA结合的可检测部分的免疫测定法。
产物-增强逆转录酶测定(PERT，a/k/a″Amp-RT″)以及基于聚合酶链式反应的逆转录酶测定(PBRT)的技术也已经用于检测逆转录病毒污染，使得相对于常规RT测定增强检测灵敏度106倍。因此，FDA生物评价和研究中心建议PERT测定用于筛选存在RT的患者，以及另外用于筛选病毒疫苗和基因治疗制剂是否存在RT污染。美国专利号5,849,494也描述了应用这些方法检测生物样品中存在的人类免疫缺陷病毒(HIV)。另一方面，PERT和PBRT在临床应用中存在明显缺点，因为这些方法操作繁复而不能实时实施。
TaqMan技术(PE Biosystems)结合检测RT的标准PCR-RT方法用于定量测定逆转录酶是非常明确的。参见Ringel等，J.Clin.Endocrinol.& Metabolism 844037(1999)。用TaqMan技术检测RT活性可以快速并相对安全地完成。所述TaqMan技术还优于以前的方法，因为它相对于常规RT测定显著增强检测灵敏度、可将测量时间缩短在6小时以内，同时不需要毒性化学物质如放射性同位素和溴化乙锭。
Lovatt等，J.Virological Methods 82185(1999)报道，在实验室中应用TaqManPCR技术检测并定量未知样品的病毒污染。尽管在实验室条件下应用TaqMan技术，但显然没有用它检测HIV逆转录酶。此外，尽管已知许多药物可以抑制逆转录酶，但是在临床水平缺少通过测定RT来监测所述药物的效力的方法。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供临床容易应用的检测病毒RT的方法。
本发明的另一个目的是通过特别适合例如在高通量筛选环境下测试药物影响RT活性的方法实时监测RT扩增产物。
本发明的进一步目的是通过监测病毒RT活性来评定抗-HIV或其他抗病毒药物或推定治疗药物的功效。
本发明的一个类似目的是提供可以在临床环境下快速安全地鉴定常见医学疾患各种病原体的诊断技术。
本发明的再一个目的是检测RT对已知RT抑制剂是否存在抗性或者其抗性水平。
在实现这些目的和其他目的的情况下，根据本发明的一个方面提供测量样品中存在的RT的方法。在优选低于RT失活温度的大致温度(HIV RT通常大约为37℃)下，使试样与(i)RNA模板，例如聚腺苷酸化RNA，(ii)与RNA模板互补的引物，例如寡聚-dT，以及(iii)多种寡核苷酸特异性引物接触，从而检测样品中存在的RT。如果在样品中存在RT，那么就会产生cDNA，并因此可以进行检测。
在本发明的另一个实施方案中，提供一种用于检测受试药物对样品中的RT活性的作用的方法。使可能含有RT的样品与RNA模板(优选人类)、互补引物以及多种寡核苷酸-特异性引物接触，使得只有在样品中存在RT才形成cDNA，cDNA形成量与与所述受试药物的作用成反比。所述样品优选取自人类患者，在临床环境下实时检测所述样品中的HIV RT存在情况。
关于这个方面，本领域的技术人员知道，可以检测样品(优选取自患者)中的RT以确定样品中的RT是否已经对已知RT抑制性受试药物产生了抗性。可以如下达到此目的测定已知RT抑制性受试药物对样品中的RT的活性的作用，比较所述活性与没有所述已知RT抑制剂的RT活性和/或在有已知完全抑制样品RT活性的RT抑制剂的情况下的RT活性。
通过考察详细描述的优选实施方案可以了解本发明的其他目的和优点。
附图简述

图1图示cDNA校准曲线。
图2图示浓度不断增加的受试药物对rHIV RT的抑制作用。
图3同样描绘了浓度不断增加的受试药物对rHIV RT的抑制作用。
优选实施方案详述在本发明的一个优选实施方案中，测定样品例如来自患者的生物样品中的RT存在情况必须将样品加入反应混合物中，所述反应混合物含有人类心脏总聚腺苷酸化RNA、寡聚-dT引物和dNTPs。如果样品中存在RT，那么可以转录与人类心脏总多聚A-RNA相应的cDNA。反之，如果样品中没有RT，则没有cDNA产物形成。全部cDNA的形成都与样品中存在的所有活化RT的浓度成正比。
按照本发明，首先由于样品中存在RT而形成cDNA，接着优选利用本领域公知的Taqman技术扩增和检测cDNA。也可以应用本领域公知的其他技术检测扩增的cDNA产物，其他技术包括但也不限于DNA印迹杂交法、溴化乙锭染色、测定掺入的放射标记的核苷酸、用于与扩增DNA结合的可检测部分的免疫测定法和荧光测定。
本发明适用于测定各种各样的病原体RT酶。因此所述方法可用于有关的所有RNA病毒，包括但不限于逆转录病毒、黄病毒属病毒(flaviviruses)以及黄热病病毒。这方面的黄病毒属病毒实例有西尼罗病毒和脑炎病毒，例如与圣路易型脑炎、西方马脑炎、日本马脑炎以及蜱传脑炎相关的病毒株。
因为Taqman测定灵敏度低至10个拷贝DNA，所以它比常规PCR方法(包括凝胶分离PCR扩增子)更灵敏数个对数倍。此外，Taqman测定适合于快速通量(rapid throughput)，并且如下所述可以用于测定RT活性和对RT活性的抑制作用。
Taqman测定的基础是taq聚合酶具有核酸内切酶活性和聚合酶活性。通过RT作用形成cDNA后，那么寡核苷酸-特异性引物就用于PCR扩增方面。在cDNA上的引物之间杂交，Taqman探针在所述寡核苷酸的5′末端包含信号氟(可以是FAM)，而在所述探针的3′末端含有猝灭染料(可以是TAMRA)。由于分子内荧光猝灭，所述探针本身不是荧光性的。因此，当所述探针是完整的时候，所述信号氟邻近猝灭染料导致主要通过Frster型能量传递抑制荧光信号。进行PCR时，对靶cDNA进行扩增，在延伸引物序列时DNA聚合酶实现对探针信号的5′切割，从而逆转猝灭的荧光信号，因此可测量cDNA产生的荧光信号。
PCR反应的荧光发射超过背景荧光水平时的循环数称为(CT)，并实时计算循环阈值。CT值取决于PCR模板量和在反应混合物中存在的cDNA。因此，可以通过比较在相同条件下进行的未知的检测样品的CT值和具有已知cDNA量的样品的CT值来定量检测样品中的RT活性。
在一个优选实施方案中，Taqman方法用来检测重组HIV(rHIV)RT的存在情况。在这一方面，寡聚-dT用作rHIV RT的模板。寡聚-dT与反应混合物中存在的人类心脏总RNA的聚腺苷酸化RNA组分互补。rHIV RT在有dNTP核苷酸时由寡聚-dT/RNA复合体形成cDNA。如果准备检测患者样品中的HIV RT存在情况，那么加入由患者样品制备的提取物代替rHIV-RT。
某些RT往往是热敏感性的，所以上述反应必须在不破坏RT活性的循环条件下进行，例如对于rHIV RT在大约37℃下进行。因此，对于rHIV RT的温度循环条件是大约25℃10分钟，接着大约37℃60分钟，最后95℃5分钟。95℃时rHIV RT活性被破坏。注意标准Taqman温度循环条件也会破坏rHIV RT的活性。一般本方法的这种情况是在程序化PCR热循环仪上的Taqman装置以外进行。
接着，将以上RT步骤形成的cDNA等份导入Taqman装置(PEModel 7700)中并加入到含有Taqman通用主混合物(taq聚合酶缓冲液)、β肌动蛋白-特异性正向引物、β肌动蛋白-特异性反向引物以及β肌动蛋白Taqman探针的反应混合物中。所述PCR步骤在标准TaqmanPCR条件下于所述装置中进行。尽管如上所述本发明方法描述为两个试管反应，但是本领域的技术人员知道这些步骤可以组合在一个反应容器中。
在本发明的另一个实施方案中，确定可抑制RT活性的受试药物的功效。在这种情况下，最好在存在所述样品的情况下混合模板RNA、与模板RNA互补的引物以及dNTPs时加入所述受试药物。因此，尽管所述样品可能含有活性RT，但是反应混合物中存在的受试药物可以抑制通过RT转录cDNA。
包含受试药物的样品的CT值增加说明了所述受试药物的抑制特性。所述受试药物抑制RT活性的作用越强，相对于不含受试药物的对照反应测得的Taqman测定CT值越高。因为RT抑制作用可以实时监测，所以本发明最适合于可能具有潜在RT抑制特性的受试药物的实时药物筛选。此外，可以利用来自患者的生物样品和不同的已知RT抑制剂例如核苷和核苷酸类似物以及非核苷逆转录酶抑制剂或其组合物进行本发明方法，以便实时筛选和测量所述患者RT对这些RT抑制药物的抗性，从而更多了解药物剂量和调剂药物。
在临床环境下，现场检测受试药物的效力使样品通量提高以及随后寻找具有抑制活性的具有前景的药物的效率提高。因此，除了测定和定量所述抑制剂的比活外，还可以跟踪抑制剂的纯化。同样，可以分析对特定药物可能已经产生抗性的患者的药物选择，而不会丧失由于进行药物实验以确定所述患者是否具有抗性可能丧失的治疗时间。进一步能够限制药物对患者产生的毒性和副作用，因为可以测试抑制剂的剂量以确定抑制药物的最佳剂量。
此外，可以在临床环境下在体外对人类患者实施本发明。因为本发明可以在体外进行，所以可以以对患者无毒性的方式测定RT活性和受试药物的效力。如上所述，因为本发明实时测量RT活性或其抑制作用，所以可以非常及时地(一般少于1小时)分析患者样品中特定病原体的存在情况。
以下非限制性实施例进一步阐明了本发明的优点。在以下方法中应用以下溶液1.TaqmanRT试剂盒，它含有10X反应缓冲液、氯化镁储液以及RNA酶抑制剂--Perkin Elmer目录号N808-0234；2.rHIV RT--Worthington Biochemical目录号5006(500U，12.5U/μl)；3.人类心脏总RNA--Ambion目录号7966(100μg，1mg/ml)；4.100mM dNTP混合物(每种NTP 25mM)--Perkin Elmer目录号N808-0261；5.寡聚dT(17-mer)；6.随机六聚体(寡聚(dNTP)6)；7.2X TaqMan通用主混合物--Perkin Elmer目录号PE 4304437；8.TaqManβ肌动蛋白试剂，它包括β肌动蛋白特异性正向和反向寡核苷酸引物以及β肌动蛋白的TaqMan探针--Perkin Elmer
目录号401846；以及9.β肌动蛋白质粒DNA(美国典型组织培养物(American TypeTissue Culture)目录号769559 R)。如下制备10mM dNTP溶液用水作稀释剂将100mM dNTP溶液稀释10倍。同时制备50μM寡聚dT水储液。
制备rHIV RT溶液(主混合物溶液)，它包含5μL 10X RT反应缓冲液、11μL 25mM MgCl2，10μL 10mM dNTP工作储液、2.5μL 50μM寡聚dT、1μL RNA酶抑制剂和1.25μL rHIV RT。所述主混合物溶液的总量是30.75μL。或者，可以加入随机六聚体替代寡聚dT。但是寡聚dT是优选引物。
水+受试药物(总共18.25μL)+1μL人类心脏总RNA，例如1μL受试药物+17.25μL水+1μL人类心脏总RNA；2μL受试药物+16.25μL水+1μL人类心脏总RNA；5μL受试药物+13.25μL水+1μL人类心脏总RNA；10μL受试药物+8.25μL水+1μL人类心脏总RNA；15μL受试药物+3.25μL水+1μL人类心脏总RNA；将它们加到30.75μL的主混合物溶液中。因此，所述反应混合物包含50μL总溶液量。
本实施例的对照包括一个含有18.25μL水+1μLRNA的阳性对照，以及一个含有19.25μL水的阴性对照。
如下启动转录酶反应将反应混合物放置在MWG温度循环仪中，或在相同的温度循环条件下25℃10分钟，接着37℃60分钟，最后95℃5分钟。最后温度循环步骤使rHIV RT失活。接着向45μL的主混合物溶液中加入5μL可能含有cDNA的温度循环后的RT反应混合物。所述主混合溶液含有25μL 2X Taqman通用主混合物、5μLβ肌动蛋白正向引物、5μLβ肌动蛋白反向引物和5μL水。因此，PCR反应混合物总共含有50μL。
所述PCR反应在Perkin Elmer 7700 TaqMan仪器中按照生产商的建议在以下条件下进行在50℃2分钟，然后在95℃10分钟。在95℃15秒进行40个循环后，60℃1分钟。完成后，按Perkin Elmer 7700TaqMan仪器说明书将数据作图并进行目测。
监测荧光增加，荧光增加是循环数的函数。数据表示为相对荧光与CT值。CT值和DNA的拷贝数之间的关系根据应用已知DNA的量制备的校准曲线测定。在PCR反应步骤中该测定用β肌动蛋白代替RT反应混合物。用来制备校准曲线的β肌动蛋白DNA的有用范围是5ag(渺克(atogram))(相当于大约一个DNA拷贝)到500fg(飞母托克(femtogram))(相当于9.5×104个DNA拷贝)。
DNA的拷贝数是以下面的观测结果为基础的1微克(1μg)PBR322质粒DNA等同于36pmol PBR 322质粒DNA(2.2×1011个DNA拷贝)。PBR322质粒DNA包含4360bp。β肌动蛋白质粒DNA包含5000bp。
所述TaqMan校准曲线示于图1。图1中，已知量(已知拷贝数)β-肌动蛋白DNA用作所述测定方法的PCR组分并记录观测到的阈值(CT)。注意随着拷贝数的降低，CT值升高。所述校准曲线测定下降至至少1个DNA拷贝，延伸到至少100,000个DNA拷贝。所述曲线拟合为表观线性回归曲线(即线性/对数图)，回归拟合系数(regressionfit)为0.99。直线方程是Y＝-3.12(X)+36，其中X是DNA拷贝数，36是在无限低(低于1)的DNA拷贝时的CT值。
在下面的实施例中应用上述方法，只对其进行了对于本领域技术人员显而易见的微小改进。
实施例I实施例I应用受试药物最终浓度不断增加的0、1％、5％、10％(v/v)说明荧光是循环数的函数。用水平黑色线表示阳性对照的CT值。该CT值是背景以上的荧光增强的中间值。如图2所示，所述阳性对照样品表示24个循环的CT值。图2的其他曲线证实在申请人有产权的受试药物存在情况下对rHIV RT的抑制作用。受试药物的浓度越高，CT值增加越多，表明rHIV RT活性被进行性抑制。
实施例II在申请人有产权的第二个抗病毒受试药物存在的情况下抑制rHIV RT的另一个实施例。如图3所示，与阈值CT26交叉的样品是RT PCR对照(没有受试药物)和1％(v/v)受试药物(在RT反应混合物中的最终浓度)。5％(v/v)受试药物样品在33个循环的阈值交叉，10％(v/v)受试药物不与阈值交叉，表明100％抑制rHIV RT活性。
受试药物产生的抑制作用可以表示为PCR反应混合物中存在的DNA的拷贝数。因此
实施例III下面的实施例说明AZT对包含rHIV RT的样品的抑制效力。
用250μM-1.25mM范围内的AZT(dT的核苷酸类似物)代替dT加入到rHIV RT反应混合物中。当加入AZT时，在PCR步骤后没观察到cDNA的扩增。同样，当在PCR反应混合物中包含代替dT的AZT时，在PCR步骤后没见到cDNA的扩增。
最后，在有固定浓度的dT存在的RT反应混合物中加入浓度逐渐降低的AZT。AZT终浓度范围由1.25mM降到250μM。在所有浓度的AZT观察到的CT大于40个循环，表明100％抑制活性。
虽然已经阐明并描述了优选实施方案，但是应该知道，本领域的一般技术人员在不偏离以下权利要求书定义的更宽范围的本发明的情况可以对本发明进行改变和改进。
权利要求
1.一种用于检测药物对逆转录酶的作用的方法，所述药物影响可能含有逆转录酶的样品，所述方法包括(a)使所述样品与模板RNA、与所述模板RNA互补的引物以及多种寡核苷酸-特异性引物在一定条件下接触，使得它们在有逆转录酶存在的情况下反应形成与所述药物作用成反比的cDNA产物，以及(b)测量所述cDNA产物量。
2.权利要求1的方法，其中所述模板RNA是聚腺苷酸化RNA，与所述模板RNA互补的引物是寡聚-dT引物。
3.权利要求1的方法，其中步骤(b)包括扩增所述cDNA产物，然后检测相对于没有所述药物存在时获得的cDNA产物的量。
4.权利要求2的方法，其中所述聚腺苷酸化RNA是人类RNA。
5.权利要求2的方法，其中所述条件包括37℃或低于37℃的反应温度。
6.权利要求3的方法，其中所述逆转录酶是HIV逆转录酶。
7.权利要求3的方法，其中所述逆转录酶是重组HIV逆转录酶。
8.权利要求3的方法，其中所述样品包括HIV感染的生物材料。
9.权利要求2的方法，其中在步骤(a)之前从患者获取所述样品。
10.权利要求3的方法，其中在步骤(a)之前从患者获取所述样品。
11.一种用于检测可能含有HIV逆转录酶的样品中的逆转录酶的方法，该方法包括(a)使所述样品与模板RNA、与所述模板RNA互补的引物以及多种寡核苷酸-特异性引物在一定条件下接触，使得它们在有逆转录酶存在的情况下反应形成cDNA产物，其中所述条件包括低于所述逆转录酶大致失活温度的反应温度，以及(b)检测存在的cDNA产物。
12.权利要求10的方法，其中所述模板RNA是聚腺苷酸化RNA，与所述模板RNA互补的引物是寡聚-dT引物。
13.权利要求11的方法，其中所述反应温度低于大约37℃。
14.权利要求10的方法，其中步骤(b)包括扩增然后测量所述cDNA产物。
全文摘要
在临床环境和药物发现情况下，可以如下检测甚至定量可能影响逆转录酶(RT)的药物的作用通过将可能含有RT的样品与RNA模板、与RNA模板互补的引物以及适当的寡核苷酸－特异性引物在一定条件下接触，使得它们在有RT存在下形成与所述药物成反比的cDNA产物。然后可以测量产生的cDNA产物量。该方法作为检测RT活性的实时、定量动态测定法容易实施。
文档编号C12Q1/70GK1451051SQ01802418
公开日2003年10月22日 申请日期2001年6月21日 优先权日2000年6月21日
发明者罗伯特B·哈里斯, T·R·雷诺 申请人:维珍实验室公司