专利名称：一种固定化漆酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种高稳定性的氧化还原酶——固定化漆酶及其制备方法。
背景技术：
漆酶是一种酚氧化酶(p-diphenol oxidase EC.1.10.3.2)，最早是从漆树的分泌物中发现，后来人们发现许多生物，包括植物，微生物(主要是真菌)，甚至昆虫体内皆存在漆酶。纸浆漂白也就是去除纸浆中的残余木素，我国传统的纸浆漂白都是采用氯气漂白的方法，这种方法带来了严重的环境污染，氯漂废水通常不能循环使用，而且氯漂废水中含有大量的剧毒物质。近些年来研究发现漆酶可以通过破坏芳香环和Cα-Cβ键催化木素脱甲基这一降解木素最初的步骤，最终导致木素大分子的破坏分解，去除残余木素，这样就可能使这种生物漂白技术代替原有的造成严重环境污染的氯漂。漆酶的研究已经越来越引起生物学，环境学，造纸工业的重视。但是漆酶的固定化研究相对少得多，在中国更是一项空白，这在一定程度上制约了漆酶的工业化利用。固定化酶的主要优势就在于其可以反复使用并且稳定性较自由酶有很大的提高。将漆酶固定化后，可以制成各种形式的反应器，用于纸浆的漂白，污水的处理，甚至有机或高分子合成反应，这样既同样达到生物催化的效果，又可以反复使用酶，降低酶纯化的成本，方便酶与反应物的分离。国外采用的技术有物理包埋，但这种方法生物酶和载体物理接触，容易从载体中渗出。使用化学方法固定漆酶的有意大利的D’Annibale A，其利用环氧活化的聚丙烯酸载体EupergitC固定化漆酶，并将这种固定化酶用于污水处理，有效的去除废水中的酚类有害物质，但该固定化漆酶价格较昂贵。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的稳定性高、活性高，而价格相对低廉的固定化漆酶。
本发明的另一个目的是提供该固定化漆酶的制备方法，该制备方法条件温和，简单易行。
本发明提供的高稳定性固定化漆酶是以具有活性酯基的聚乙烯醇为载体，将漆酶通过化学键合固定在该载体上。
该固定化漆酶的制备方法包括两个步骤载体的合成及对漆酶的固定；载体的合成步骤包括(1)将聚合度为1450～2600的聚乙烯醇粉末溶于热水中，加入双官能团交联剂及强酸，调节pH＝1～3，均匀混合后搅拌4小时以上得交联聚乙烯醇凝胶，其中双官能团交联剂用量为聚乙烯醇重量的34％～57％；(2)将交联聚乙烯醇凝胶打散后，洗涤，抽滤，60-80℃烘干，研磨成60～120目的颗粒；(3)向上述制得的颗粒中按1～5mmol/克交联聚乙烯醇加入羧酸衍生物及其溶剂，在路易士酸催化剂作用下，在溶剂的沸点下搅拌回流反应12～36小时，将反应后的颗粒分别用丙酮和水洗涤后，干燥，制得的羧基化载体酸价为0.5～2.0mmol/克载体；(4)向经(3)制得羧基化载体的颗粒中按0.7～3.5mmol/克羧基化载体加入含N-琥珀酰亚胺基的化合物及其溶剂，在碳二亚胺类催化剂和/或4-二甲氨基吡啶的共同作用下，在冰浴中搅拌反应4～12小时，再将反应后的颗粒用非反应性的有机溶剂洗涤，自然干燥即得载体成品。
对漆酶的固定步骤包括将经载体的合成步骤制得的载体成品与漆酶混合，在6～40℃，pH＝2.0～10.0，缓冲溶液浓度0.05～1.5mol/L条件下摇动反应6～72小时得固定化漆酶，再先后用pH＝2.0～10.0的1～2mol/L的无机盐溶液和与无机盐溶液相同pH值的缓冲溶液洗涤，直到没有游离酶被洗出，再经真空干燥制成固定化漆酶成品。
在上述过程中，载体的合成步骤(1)中将聚乙烯醇粉末溶于热水中，优选水的重量是聚乙烯醇的7-20倍。
所述的双官能团交联剂选自双醛类、醛酸类等水溶性双官能团物质，如戊二醛、乙醛酸等。
所述的强酸为盐酸，硫酸，硝酸等一种或多种的混合物。
载体的合成步骤(3)中所述的羧酸衍生物为酸酐、卤代羧酸、羟基羧酸，如丁二酸酐，邻苯二甲酸酐，顺丁烯二酸酐，3-碘代丁酸，α、β羟基酸等。
所述的羧酸衍生物的溶剂一般选自二氧六环，环己烷、正己烷，苯，四氢呋喃等弱极性溶剂。
所述的路易士酸催化剂为吡啶，磷酸，氯化锌等路易士酸。
载体的合成步骤(4)中所述的含N-琥珀酰亚胺基的化合物为N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基-5-降冰片稀-2，3-酰亚胺等。
所述的含N-琥珀酰亚胺基的化合物的溶剂一般为乙酸乙酯，丙酮等极性溶剂。
所述的的碳二亚胺类催化剂为N，N’-二环己基碳二亚胺，N，N′-二异丙基碳二亚胺，3，3-二甲氨基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺。
对漆酶的固定步骤中，载体成品和漆酶的加入比例优选1克载体成品∶1～10IU的漆酶。
所使用的漆酶是本技术领域人员所熟悉的，其获得也是通过较常规的微生物发酵，如可以取自佛罗里达侧耳(Pleurotus.florida)、香菇(Lentinus edodes)、漏斗状侧耳(Pleurotussaju-caju)、杂色云芝(Polystictus versicoloy)等微生物的分泌物。漆酶还可以通过供应商获得。
所述的非反应性的有机溶剂为无亲核反应能力，不能发生酯交换反应的溶剂，如丙酮，乙醚，乙酸乙酯等。
所述的缓冲溶液为醋酸缓冲溶液，柠檬酸缓冲溶液，磷酸缓冲溶液等。
本发明通过化学键合的方法固定漆酶，采用聚乙烯醇这种较廉价，反应基团多的材料，使之交联形成不溶于水及任何有机溶剂的颗粒，通过羧基化，在碳二亚胺类化合物和/或4-二甲氨基吡啶的共同催化下，与含N-琥珀酰亚胺基的化合物反应形成具有活性酯基的聚乙烯醇载体，酶的固定化就可以在很温和的条件下进行，避免了因反应条件较高而导致的酶的失活，所制得的固定化酶稳定性高，尤其在强酸强碱条件下稳定性大大提高。该固定化漆酶一般为以ABTS为底物，酶活指标在0.5～5酶活单位(IU)/克载体的范围。酶活指标是在室温下取0.2克的固定化酶与3毫升0.5毫摩尔/升的ABTS混合，在pH值3.2下反应，离心分离取清液测定420纳米处的吸光度。每分钟使1微摩尔的ABTS氧化所需的酶量为一个酶活单位IU。
本发明的固定化酶的优良效果在于一、采用化学键结合固定化方法，酶不易从载体上渗出，固定化酶稳定，可反复使用多次，在经过17次重复反应后，酶活还可保留50％。二、固定化酶对强酸强碱环境的抵抗能力较游离酶大大增强固定化漆酶在pH＝2.0的环境中经45小时活力还保留50％以上，而游离酶在同样条件下5小时就全部失活了；固定化酶在pH＝13.0的环境中经5小时活力还保留70％以上，而游离酶在同样的条件下1小时就全部失活了。而且这种固定化酶可制成固定化酶反应器，用于实际生产中。
具体实施例方式
下面给出实施例，并通过实施例作出进一步的说明。
实施例1(1)在250毫升园底烧瓶中加入质量百分比浓度为10％的聚乙烯醇溶液300克，质量百分比浓度为5％的戊二醛溶液227克，滴加盐酸使pH＝1-2，剧烈搅拌反应5小时，洗涤，烘干，研磨成60-120目的颗粒。
(2)在装有磁力搅拌器，球型冷凝管，温度计的250毫升三口烧瓶中，加入5克上述制得的颗粒。将2.5克丁二酸酐(羧基化物)溶于80毫升环己烷与二氧六环体积比为10∶1的混合溶剂中，倒入上述三口烧瓶中，再加入吡啶0.25毫升，回流搅拌反应，反应温度为82℃。反应24小时后倒出并分别用40毫升的丙酮，水，丙酮连续洗涤，自然干燥至恒重。制得酸价为1.78的羧基化聚乙烯醇颗粒。
(3)将1.1克N-羟基琥珀酰亚胺溶解于乙酸乙酯，和制得的小球颗粒加入带有温度计，滴液漏斗的250毫升园底烧瓶中，将2.1克二环己基碳二亚胺溶于乙酸乙酯中滴加进入，在5℃下磁力搅拌反应4小时，用浮选法倾出反应产生的细小颗粒，剩余颗粒用丙酮洗涤，自然干燥至恒重。
(4)0.2克制得的固定化载体在25℃下与1毫升漆酶(酶活1IU，)混合，加入4毫升pH＝3.2，0.05M的醋酸缓冲溶液，搅拌固定化反应24小时。
(5)用0.05M、pH＝5.0的醋酸缓冲溶液配制的2M氯化钠溶液，水，0.05M、pH＝5.0的醋酸缓冲溶液分别洗涤固定化漆酶，直到没有漆酶被洗出。真空干燥。其酶活为2.1IU/克载体。
(2)在同实施例1(2)的三口烧瓶中，加入5克上述制得的颗粒，3.7克邻苯二甲酸酐(羧基化物)，80毫升正己烷∶二氧六环为8∶2的混合溶剂，磷酸0.3毫升，回流搅拌反应。反应36小时后倒出并分别用40毫升的丙酮，水，丙酮连续洗涤，干燥至恒重。制得酸价为1.50的羧基化聚乙烯醇颗粒。
(3)将0.9克N-羟基琥珀酰亚胺，0.03克4-二甲氨基吡啶溶解于乙酸乙酯，和制得的小球颗粒加入同实施例1(3)的圆底烧瓶中，将0.9克N，N′-二异丙基碳二亚胺溶于乙酸乙酯中滴加进入，在2℃下磁力搅拌反应8小时，用浮选法倾出反应产生的细小颗粒，剩余颗粒用丙酮洗涤，自然干燥至恒重。
(4)0.2克制得的固定化载体在40℃下与1毫升漆酶(酶活1.6IU)混合，加入4毫升pH＝3.2，0.05M的柠檬酸钠-磷酸氢二钠的缓冲溶液，搅拌固定化反应12小时。
(5)同实施例1(5)。其酶活为3.3IU/克载体。
实施例3(1)同实施例1(1)。
(2)在同实施例1(2)的三口烧瓶中，加入5克上述制得的颗粒，3克丁二酸酐(羧基化物)，80毫升环己烷与二氧六环体积比为8∶2的混合溶剂，吡啶0.3毫升，回流搅拌反应。反应36小时后倒出并分别用40毫升的丙酮，水，丙酮连续洗涤，干燥至恒重。制得酸价为2.12的羧基化聚乙烯醇颗粒。
(3)同实施例2(3)。
(4)0.2克制得的固定化载体在40℃下与1毫升漆酶(酶活0.5IU)混合，加入4毫升pH＝4.0，0.10M的柠檬酸钠-磷酸氢二钠的缓冲溶液，搅拌固定化反应12小时。
(5)同实施例1(5)。其酶活为0.8IU/克载体。
权利要求
1.一种高稳定性固定化漆酶，是以具有活性酯基的聚乙烯醇为载体，将漆酶通过化学键合固定在该载体上。
2.一种制备权利要求1中所述固定化漆酶的方法，该方法包括两个步骤载体的合成及对漆酶的固定；其中载体的合成步骤包括(1)将聚合度为1450～2600的聚乙烯醇粉末溶于热水中，加入双官能团交联剂及强酸，调节pH＝1～3，均匀混合后搅拌4小时以上得交联聚乙烯醇凝胶，其中双官能团交联剂用量为聚乙烯醇重量的34％～57％；(2)将交联聚乙烯醇凝胶打散后，洗涤，抽滤，60-80℃烘干，研磨成60～120目的颗粒；(3)向上述制得的颗粒中按1～5mmol/克交联聚乙烯醇加入羧酸衍生物及其溶剂，在路易士酸催化剂作用下，在溶剂的沸点下搅拌回流反应12～36小时，将反应后的颗粒分别用丙酮和水洗涤后，干燥，制得的羧基化载体酸价为0.5～2.0mmol/克载体；(4)向经(3)制得羧基化载体的颗粒中按0.7～3.5mmol/克羧基化载体加入含N-琥珀酰亚胺基的化合物及其溶剂，在碳二亚胺类催化剂和/或4-二甲氨基吡啶的共同作用下，在冰浴中搅拌反应4～12小时，再将反应后的颗粒用非反应性的有机溶剂洗涤，自然干燥即得载体成品；对漆酶的固定步骤包括将经载体的合成步骤制得的载体成品与漆酶混合，在6～40℃，pH＝2.0～10.0，缓冲溶液浓度0.05～1.5mol/L条件下摇动反应6～72小时得固定化漆酶，再先后用pH＝2.0～10.0的1～2mol/L的无机盐溶液和与无机盐溶液相同pH值的缓冲溶液洗涤，直到没有游离酶被洗出，再经真空干燥制成固定化漆酶成品。
3.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于载体的合成步骤(1)中所述的双官能团交联剂选自双醛类、醛酸类双官能团物质。
4.根据权利要求2或3中所述的方法，其特征在于所述双官能团交联剂为戊二醛或乙醛酸。
5.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于载体的合成步骤(3)中所述的羧酸衍生物选自酸酐、卤代羧酸、羟基羧酸。
6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于所述的羧酸衍生物选自如丁二酸酐，邻苯二甲酸酐，顺丁烯二酸酐，3-碘代丁酸，α、β羟基酸。
7.根据权利要求2或3中所述的方法，其特征在于载体的合成步骤(4)中所述的含N-琥珀酰亚胺基的化合物为N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基-5-降冰片稀-2，3-酰亚胺。
8.根据权利要求2或3中所述的方法，其特征在于载体的合成步骤(4)中所述的的碳二亚胺类催化剂为N，N’-二环己基碳二亚胺，N，N′-二异丙基碳二亚胺，3，3-二甲氨基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺。
9.根据权利要求2或3中所述的方法，其特征在于对漆酶的固定步骤中，载体成品和漆酶的加入比例为1克载体成品∶1～10IU的漆酶。
全文摘要
本发明涉及一种高稳定性的氧化还原酶——固定化漆酶及其制备方法。该固定化漆酶是以具有活性酯基的聚乙烯醇为载体,将漆酶通过化学键合固定在该载体上。其制备方法包括两个步骤:载体的合成及对漆酶的固定;载体的合成是聚乙烯醇交联后,打散,洗涤,研磨;再经与羧酸衍生物、含N－琥珀酰亚胺基的化合物反应制得载体成品。对漆酶的固定是将载体成品与漆酶混合,在6～40℃,pH=2.0～10.0的缓冲溶液中摇动反应得固定化漆酶,洗涤,干燥得固定化漆酶成品。本发明提供了一种新型的使用化学方法制备的固定化漆酶,该酶稳定性高、活性高,而价格相对低廉。
文档编号C12N11/00GK1374403SQ0211512
公开日2002年10月16日 申请日期2002年4月22日 优先权日2002年4月22日
发明者刁颖辉, 付时雨 申请人:中国科学院广州化学研究所