专利名称：携带抗血管和抗内皮细胞因子融合基因的重组疱疹病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，尤其是指一种携带抗血管和抗内皮细胞因子融合基因的重组疱疹病毒。
背景技术：
单纯疱疹一型病毒，简称HSV-1，可以感染许多不同类型的人和动物细胞，包括上皮细胞和内皮细胞。野生型病毒在体内感染非神经细胞后通常在细胞内大量复制并造成细胞裂解，而在它感染神经细胞时，则通常仅有限的复制或不复制而很快进入潜伏期。由于HSV-1对神经细胞的损伤在通常情况下要小于非神经细胞，早在60年代就有人试图用它来治疗恶性脑胶质细胞瘤。由于野生型HSV-1毕竟毒性较大，该项实验未能实施下去。
到了1991年，国外首次用缺失tk基因的重组HSV-1病毒tk(-)HSV-1在免疫缺陷动物裸鼠的脑胶质细胞瘤模型上证明，tk(-)HSV-1病毒可以选择性地杀伤肿瘤细胞而不造成严重的脑神经组织损害，由于tk(-)HSV-1病毒裂解肿瘤的能力有限，不能在瘤体上产生生物扩散效应，影响了临床的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于寻求一种携带抗血管和抗内皮细胞因子融合基因的重组疱疹病毒，由于在这种HSV-1病毒中部分地去除了有害的ICP6基因，插入了人的Endostatin和Angiostatin的融合基因，使这种病毒可有效地用来治疗恶性胶质瘤肿瘤。
其主要技术方案是原病毒为HSV-1病毒，其结构包含一个长非重复区(UL)和一个短非重复区(US)，这两个非重复区的两端各有一对重复区(ab-a’b’和c-c’)，本发明的特征是将位于长非重复区内的ICP6基因部分地去除后，再插入人的Endostatin和Angiostatin的融合基因。
位于重复区内的ICP34.5基因的两个拷贝均被部分地去除；位于重复区内的两个ICP4基因拷贝属温度敏感型基因，在摄氏39度时失去活性。
原有的HSV-1用于肿瘤的基因治疗具有下列优点，其中有些是其它的病毒载体所没有的。
HSV-1的基因组较大，并有许多空问用于插入外源基因用于治疗，据估计，HSV-1可插入至少30kb的外源基因不会影响病毒的组装，目前还没有一个其它病毒有如此大的装载能力。
HSV-1具有很好的遗传稳定性，大多数重组HSV-1病毒在多次感染动物，再在体外大量繁殖之后，仍然保持其原来的遗传及表象特征，而其它有些病毒，尤其是RNA病毒容易产生遗传变异，从而影响其安全性。
HSV-1具有很强的感染力，并有广泛的细胞宿主，HSV-1的感染能力可与腺病毒相当，比逆转录病毒要强几乎一千倍以上，HSV-1可以感染从神经细胞、肝细胞到淋巴细胞等许多细胞种类。
HSV-1感染细胞后，并不将其基因组整合进宿主细胞的染色体，因此不具有造成宿主细胞遗传突变的可能。在这个意义上，它比逆转录病毒安全。
我们对HSV-1感染人类后的病理学已有较深入地了解，并有不少相应的动物模型可供进一步研究，比较其它新的被建议用来基因治疗的病毒，如Reovirs，我们对HSV-1的了解要成熟得多，因此临床使用也比较安全。
针对HSV-1感染的特效药Acyclovir(ACV)or Ganciclovir(GCV)已在临床使用多年，并对疱疹性脑炎有显著疗效。由于近来发展的HSV-1重组病毒多为tk(+)，在临床基因治疗时万一失控，上述药物仍可用来抑制病毒生长，从而提供了进一步的安全防护。
重组HSV-1独特的肿瘤裂解型特性是大部分其它病毒所不具备的，即使是新一代的腺病毒虽能有条件复制也适合部分肿瘤细胞，如P53缺陷，而HSV-1只要细胞分裂活跃，就能复制。由于病毒在肿瘤中复制的能力已被广泛认为是用病毒作为载体基因治疗的关键，重组HSV-1的这一特点非常重要。
HSV-1的免疫刺激作用较弱，与腺病毒不同，HSV-1病毒具有掩蔽被感染的宿主细胞，使之不受机体免疫系统攻击的能力，动物实验也证实HSV-1脑内感染所引起的免疫反应十分有限。基于上述HSV-1病毒作为转基因载体的潜在优点，我们对目前已用于临床的HSV-1重组病毒的设计作了改良，构建了一种携带抗血管和抗内皮细胞因子融合基因的重组疱疹病毒，我们称之为VAE，制剂名为BRAINWEL，使之既保留了现有病毒的安全性，又增加了新的基因治疗功能。
野生型HSV感染人体后首先侵入皮肤上皮细胞，并在感染部位进行裂解性繁殖，同时，通过侵入感觉神经末梢感染背根感觉神经节的感觉神经元。通常在感觉神经元内，HSV-1病毒很快进入潜伏状态，但在严重的情况下，病毒会处于裂解性繁殖，有可能会扩散到中枢神经系统，引起病毒性脑炎。在设计治疗性HSV-1载体时，必须使HSV-1的一些特性受到控制，以保证其临床使用的安全性。作为第一个在国内用于临床的裂解型病毒，VAE的设计思想以临床安全性为第一要求，在此基础上追求其有效性。上述设计思想表现在VAE的主要生物学特性与较安全的G207相同，同时，针对恶性胶质瘤肿瘤对血管增生的依赖性，VAE还插入了抗血管生成因子的融合基因，使之不但具有选择性的裂解正增殖的肿瘤细胞的功能，还能阻断供应肿瘤血管的生成，从而比现有的任何临床上正在试用的HSV-1重组病毒具有更好多预期疗效。
图1为HSV-1的基因结构图。
图2为G207病毒基因结构图。
图3为本发明所提供的VAE病毒基因结构图。
具体实施例方式
VAE是由野生的HSV-1病毒F(见图1)经基因工程改造而来，该野生株病毒最早于1922年在纽约由感染了HSV-1病毒的病人身上分离获得。VAE的遗传特征为1、位于重复基因区内的ICP34.5基因的两个拷贝均已部分的去除而失去功能；2、位于长非重复基因区内的ICP6基因也被部分地去除，并插入了人的Endostatin(Cirri，Donnini et al.1999)和Angiostatin(O’Reilly，Holmgrenet al.1994；O’Reilly 1997)的融合基因(Endoangio)；3、位于重复取的两个ICP4基因拷贝属温度敏感型，在摄氏39度时失去活性。上述特征除了ICP6基因区所携带的基因不同外，与G207相同，只是G207在ICP6基因区中所插入的是大肠杆菌的β-半乳糖苷酶。因此，VAE和G207基本相同，即都为ICP34.5和ICP6双重缺失型HSV-1重组病毒见图2、4，而VAE比之G207更多出一个表达EndoAngio融合蛋白酶的功能。
VAE的基本功能如下1、选择性地在肿瘤细胞内复制及细胞裂解功能。如上所述，由于在ICP34.5和ICP6双基因缺失，VAE毒株丧失了在不分裂或缓慢分裂的细胞中高萧复制的能力。由于体内，尤其是脑内组织中的正常细胞是不分裂或缓慢分裂的，而惟有恶性脑胶质瘤细胞分裂旺盛。这一正常组织和肿瘤组织细胞在分裂状态上的明显区别，提供VAE病毒的肿瘤特异性复制的有利条件。病毒在细胞内的大量复制必然导致细胞的裂解，从而达到杀死肿瘤的目的，VAE的上一选择性地裂解肿瘤细胞的功能，使之与其它目前用于基因治疗的病毒载体明显不同。大部分其它常用的病毒如逆转录病毒和腺病毒是依靠病毒所携带的基因达到杀伤肿瘤细胞的作用。由于这些基因是否有效在很大程度上有赖于除了基因本身之外的许多条件，例如，基因在细胞内的表达水平，细胞本身对该基因的毒性的敏感度，等等。所以这些病毒携带了外源性基因感染了肿瘤细胞，但并不一定能杀死该细胞。而VAE则既可以用其所携带的外源性基因达到治疗的作用，也可以依靠其本身的细胞裂解功能直接杀死分裂旺盛的肿瘤细胞，从而具有双重作用。
2、选择性地在肿瘤内有效扩散的功能。VAE有选择地在肿瘤细胞内复制，除了达到裂解被感染的肿瘤细胞的目的外，在裂解细胞的同时释放出复制后代第2代病毒，从而为病毒在肿瘤实体内的有效扩散提供了前提条件/虽然复制出的第2代病毒对正常组织细胞有同样的感染力，但由于它在正常细胞内无法高效地复制，所以其在正常组织内的扩散是很有限的。因此，VAE在体内的扩散具有高度的肿瘤选择性。早先以及目前正在进行的大量的基因治疗实践业已证明，选择性地在肿瘤内有效扩散的功能，对于基因治疗是至关重要的。这主要是因为和其它要区不同，病毒本身不仅体积较大，一般直径在100毫微米左右，而且表面布满了带有电荷的糖蛋白(Barker，Roizman et al.1992)。因此，病毒在组织内的物理扩散能力是很差的。早期的逆转录病毒由于当时无法做到使之有选择性地在肿瘤内复制，在构建病毒载体时只能将其复制功能去除。由于这类病毒失去了赖以生存的生物扩散能力，注射入肿瘤实体内后，只能依靠极其有限的物理扩散，因而只能感染很少量的细胞，大大地局限了其治疗功能，VAE的在肿瘤内选择性地扩散的能力无疑使之优于目前所有的用于基因治疗的其它病毒。
3、抗肿瘤功能。Martuza博士近几年来的工作表明，基因改造后的HSV-1病毒如G207，在静脉注射后，可对已形成的脑内或脑外肿瘤产生抑制作用，其作用机理尚不明确(Toda，Rabkin et al.1999；Todo，Rabkin et al.1999)。但由于用病毒在一侧皮下的肿瘤内注射之后，体内可检测出肿瘤特异性T细胞反应，并使另一侧的未经病毒注射肿瘤的生长受到抑制。据此，瘤内注射的病毒在杀伤肿瘤的同时，可能又有刺激细胞免疫功能的作用。虽然对BRAINWEL的抗肿瘤免疫功能尚未进行过检测，但由于和G207结构上的相似性，相信也应有同样的效果。
4、分泌抗血管生长因子的功能。VAE病毒携带有人类Endostatin和Angiostatin的融合基因，在感染细胞之后可以生成该融合基因的融合蛋白，具有Endostatin和Angiostatin的双重功能，Endostatin(Cirri，Donnini etal.1999)和Angiostatin(O’Reilly，Holmgrenet al.1994)是近年来发现的机体自身生成的物质，具有很强的抑制血管生成的作用，从而造成肿瘤的凋亡，是近年来肿瘤治疗方面被认为最希望的方法之一(Bussolino，Mantovani et al.1997；O’Reilly 1997；Cao1999；Gasparini 1999；Hayes，Li et al.1999；Keshet and Ben-S asson 1999；Hagedom and Bikfalvi 2000)。由于这两种蛋白分别是以不同的机制作用于血管内皮细胞抑制血管生长的，在人乳巢癌模型上证明，同时与这两种蛋白产生协同作用(Yokoyama，Dhanabal et al.2000)，从而更有效地抑制血管在肿瘤内的生成。
权利要求
1.携带抗血管和抗内皮细胞因子融合基因的重组疱疹病毒，原病毒为HSV-1病毒，其结构包含一个长非重复区(UL)和一个短非重复区(US)，这两个非重复区的两端各有一对重复区(ab-a’b’和c-c’)，本发明的特征是将位于长非重复区内的ICP6基因被部分地去除后，再插入人的Endostatin和Angiostatin的融合基因。
全文摘要
本发明涉及生物技术，尤其是指一种携带抗血管和抗内皮细胞因子融合基因的重组疱疹病毒。其主要技术方案是原病毒为HSV－1病毒，其结构包含一个长非重复区(UL)和一个短非重复区(US)，这两个非重复区的两端各有一对重复区(ab－a’b’和c－c’)，本发明的特征是将位于长非重复区内的ICP6基因部分地去除后，再插入人的Endostatin和Angiostatin的融合基因。利用这种病毒可有效地用来治疗恶性胶质瘤肿瘤。
文档编号C12N15/62GK1397642SQ0213813
公开日2003年2月19日 申请日期2002年8月16日 优先权日2002年8月16日
发明者瞿伯荣 申请人:无锡博生医用生物技术开发有限公司