重组fl蛋白在毕赤氏酵母中的表达的制作方法

专利名称：重组fl蛋白在毕赤氏酵母中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的多核苷酸，和包含该多核苷酸的质粒、宿主以及表达这种多核苷酸的方法。更具体的说，该多核苷酸是根据酵母偏爱密码子重组的FL胞外区基因序列，该序列编码FL蛋白。
背景技术：
FLT-3配基(fms-like tyrosine kinase receptor-3 ligand，FLT-3 ligand，FL)是一种与造血调控密切相关的、具有促进早期造血功能的细胞因子。在二十世纪的最后十年间，从FL基因的发现到其体内生理、病理过程的研究及至临床前实验等方面，不断取得日新月异的进展，成为肿瘤与免疫学界关注的焦点之一。目前研究证明，FL是协同造血因子的一员，其受体FLT-3(fms-like tyrosine kinasereceptor-3，FLT-3)属于酪氨酸激酶受体第三家族，是一种新发现的受体型酪氨酸激酶，与其配体FL特异性结合启动细胞内的信号传导，从而促进细胞增殖。FL主要调节原始的造血干/祖细胞的增殖，对定向的、成熟的造血细胞没有刺激作用[1]。
1991年Rosnet等人首次报道克隆到鼠FLT-3基因，认为是一种主要表达于造血干/祖细胞及胎盘、脑和睾丸等组织的III型酪氨酸激酶受体。因该受体在结构上与另一个称为c-fms的酪氨酸激酶受体相似而被命名[2]。该受体也被称为胎儿肝激酶2(flk-2)[3]或干细胞激酶-1(Stk-1)[4]。FLT-3和血小板衍生生长因子、集落刺激因子同属酪氨酸激酶受体III家族成员。FLT-3是FL的特异型结合受体，FL与FLT-3特异性结合后，激活后者自身酪氨酸激酶活性，催化细胞内一系列蛋白的酪氨酸残基磷酸化，发挥信号传导和促进细胞有丝分裂的功能。1993年Lyman小组利用FLT-3的可溶性异构体克隆到了鼠的FL基因[5]；1994年Hannum等人得到了人类的FL基因序列[6]。完整的FL基因包括信号肽、胞外区、跨膜区和胞浆区的编码序列。进一步研究发现，人的FL基因表达产物为膜蛋白，其分子量为23KD，共由235个氨基酸残基构成其中信号肽由26个残基构成，胞外区包括156个残基(包含两个N-糖基化位点)，跨膜区23个氨基酸残基，另外30个氨基酸残基组成胞浆区。关于FL的生物学活性，目前研究结果未见种属间特异性限制。鼠和人类的FL蛋白在氨基酸水平上有72％的同源性。鼠和人FL蛋白对携带鼠或人类FLT-3受体的细胞均具有完全的生物活性[7]。研究人员通过cDNA分析及聚合酶链反应确定了鼠和人体FL的多个异构型，人体FL的主要异构型是一种在细胞表面具有生物学活性的跨膜蛋白及其可溶形式[8]，二者表现同样的生物活性。
FL可单独或协同其他细胞因子扩增体外长期培养的干细胞，亦可促进体内树突状细胞、NK细胞、细胞毒T细胞的增殖和分化成熟[9，10]，从而具有重要的抗肿瘤免疫作用[11，12]。该因子通过与受体FLT-3结合，刺激造血干细胞的增殖和分化，增加淋巴细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞及体外长期培养的干细胞等的数量。在临床应用上，适合用作造血干细胞动员剂、免疫佐剂及肿瘤的免疫治疗。
目前重组FL蛋白虽然已成为正式商品，但在临床试验与基础研究中使用的重组FL蛋白均为大肠杆菌表达产物，且价格昂贵，难以满足国内临床和科研工作发展的需求。因而，建立高效表达重组FL蛋白的基因工程菌株，并进一步获取大量的FL重组蛋白，具有重要的科研价值和临床应用意义。
目前，外源基因的表达系统有真核和原核两大系统。其中真核表达系统可以对翻译的蛋白质进行一系列的翻译后修饰，从而具有后者不可比拟的优势。在真核表达系统中，酵母表达系统是研究较早、技术较为成熟，而且也被广泛接受的表达系统之一。酵母菌是一类低等的、主要以单细胞形式生存的真核生物，也是重要的工业微生物。酵母菌容易培养、无毒害，是生物特性研究比较清楚的真核模型之一[29]。加之其所具有的接近人体的蛋白翻译后修饰能力、毒性小、表达产物的后处理容易和遗传背景清楚等优势，适合用于中等复杂程度的蛋白生产，成为生物医药领域倍受关注的外源蛋白表达系统[30，31，32]。目前，采用酵母表达系统生产的药物如胰岛素和乙型肝炎疫苗，已经安全地施用于人体。
酿酒酵母(S.Cerevisiae)作为一种研究最早的酵母表达系统尚存在应用局限性，主要表现在①酿酒酵母是一种以发酵为主的酵母，在采用常规的通气发酵条件下，酿酒酵母所能达到的生长速度和密度并不高。②外源基因不稳定，容易丢失。③蛋白质过度糖基化。④蛋白质翻译后的加工与高等真核生物有所不同[33]。因而，人们始终在寻找和构建更加优异的载体-宿主系统。直至1969年，Koichi Ogata等人首次报道了发现以甲醇为单一碳源的巴斯德毕赤氏酵母(Pichia Pastoris，P.pastoris)。其后的十余年间，醇氧化酶基因(AOX1和AOX2)被成功分离，构建了新的表达载体，建立了酵母品系和实验操作方案[34，35]。此后，这一先进的酵母表达系统在生物工程领域得到广泛应用，并且不断有高表达工程菌株问世[36，37]。生化研究发现，甲醇代谢是通过毕赤氏酵母一种特殊的代谢途径进行的。从表达系统的角度看，最吸引人的是甲醇代谢的第一个调控酶—甲醇氧化酶(AOX)。AOX是一个诱导酶，在含有葡萄糖、甘油或乙醇的培养基中AOX没有表达；但是在以甲醇为单一碳源的培养基中它可以达到细胞干重的30％。根据这个特点，人们已经把高诱导及严密调控的甲醇氧化酶基因的启动子(PAOX1)用于构建表达外源蛋白的载体。
外源基因的分泌表达，不仅极大的方便了表达产物的分离纯化，同时也和表达产物的翻译后正确加工有关。外源蛋白分泌时利用分泌信号表达蛋白，并沿一定的细胞内途径分泌到细胞外。研究人员利用外源基因本身的分泌信号或酵母的分泌信号都成功表达了大量外源基因[38，39]。在构建表达载体时，一般利用酵母本身的分泌信号，如把酿酒酵母(S.cerevisiae)的α-mating factor(α-MF)信号序列导入表达载体。它虽然是含有89个氨基酸的短肽，却能有效地介导外源蛋白的分泌。研究中发现，P.Pastoris菌株在分泌外源蛋白的过程中，可以对外源蛋白进行的一系列切割、糖基化、形成二硫键等加工过程使此表达系统具有极为良好的应用价值[40，41]。目前所有使用的P.Pastoris表达菌株均来源于NRRL-Y 11430，大多数是组氨酸脱氢酶基因(HIS4)缺陷型，这些细胞在基本培养基上必须添加组氨酸才能生长，这样可以很方便地利用回复突变体进行转化菌的筛选，极大的简化了实验过程。菌株中的一个或两个AOX基因缺失可以造成利用甲醇的能力不同，人们根据P.Pastoris利用甲醇的不同能力，大致将其分为三类，即甲醇利用正表型、甲醇利用慢表型和甲醇利用负表型(即Mut+、Muts和Mut-)。P.Pastoris KM71菌株(其基因型为his4 arg4 aox1Δ∷ARG4)是Muts基因型的典型代表，由于它的AOX1基因被部分删除而代之以酿酒酵母的ARG4基因，对甲醇的利用只能依赖相对较弱的2基因，所以其利用甲醇的速度较慢。通常认为，删掉AOX1基因的酵母可能更好地表达外源蛋白[42，43，44]。

发明内容
综上所述，本申请采用P.Pastoris所偏爱的密码子，人工合成了FL胞外区的编码序列。以酵母分泌型表达质粒pPIC9K为载体，通过5’AOX和3’AOX置换的方法整合到宿主菌P.Pastoris KM71的基因组中，构建了高效分泌表达FL胞外区蛋白的基因工程菌株。而后分别以Southern，Northern和Westerns方法检测了外源目的基因的整合、转录以及目的蛋白的分泌表达，并以检测刺激CD34+细胞增殖的方法初步验证了重组FL的生物活性。
在酵母表达系统中，外源基因选用酵母偏爱的密码子，可以明显提高外源基因的转录水平，是提高目的蛋白表达产量的有效手段之一。本申请以FL胞外区156个氨基酸残基为目的蛋白，依照酵母偏爱密码子将其重新编码，人工合成重组FL基因。我们选用毕赤氏酵母整和型分泌表达质粒pPIC9K为重组FL基因的表达载体。pPIC9K质粒中含有野生型HIS4基因，能使由于组氨酸脱氢酶缺失引起的组氨酸代谢缺陷型毕赤氏酵母回复成非组氨酸代谢依赖型。这样可以通过对组氨酸依赖的性状筛选阳性转基因酵母。pPIC9K质粒中含有卡那抗性基因，可以利用G418抗性梯度筛选实验，简捷地获得外源基因多拷贝菌株。
外源蛋白分泌时利用分泌信号表达蛋白并沿一定的途径分泌到细胞外。毕赤氏酵母在分泌外源蛋白的过程中，对外源蛋白的一系列切割、糖基化、形成二硫键的过程使毕赤氏表达系统极有价值。分泌型表达比组成型表达在纯化方面更具优势[81，82，83]。外源基因的分泌表达，不仅方便了表达产物的分离纯化，同时也和表达产物的翻译后正确加工有关。利用外源基因本身的分泌信号或酵母的分泌信号都已成功表达了大量外源基因[84，85，86]。但是利用外源蛋白的天然信号肽分泌表达外源基因时有可能表达量低，表达产物也极有可能不能正确加工。例如在转位酶(invertase)的表达中就遇到这种情况。
α-mating factor是酵母表达系统中常用的分泌信号之一，可有效地介导外源蛋白的分泌表达[87，88]。通过DNAsist分析目的基因的表达产物，发现FL胞外区蛋白的等电点在pH8.0左右，目的基因的表达产物中没有与酵母α-matingfactor分泌信号形成高级结构从而阻断蛋白酶Kex2的片段。因此，我们选用α-mating factor分泌信号介导FL蛋白的分泌。在分泌信号与目的基因之间保留两个Glu-Ala二肽，以确保高效分泌。在蛋白从内质网到细胞外的分泌过程中，Glu-Ala二肽被二肽酶(DAP)切掉。综上所述，我们在pPIC9K质粒中选用EcoRI和NotI两个内切酶位点克隆目的基因，构建了pPIC9K-FL。重组质粒经过测序，证明插入序列和插入位点完全正确。
所有毕赤氏酵母的表达菌株均来源于NRRL-Y 11430(Northern RegionalResearch Laboratories，Peoria，IL)，大多数是组氨醇脱氢酶基因(HIS4)缺陷型。这些细胞在基本培养基上必须添加组氨酸才能生长，这样就可以很方便地利用回复突变体进行转化菌的筛选。人们根据它们利用甲醇的能力不同可以将有毕赤氏酵母的表达菌株分为三类甲醇利用正表型、甲醇利用慢表型和甲醇利用负表型(即Mut+、Muts和Mut-)。通常删掉AOX1基因的酵母能更好地表达外源蛋白[89，90]。Mut+基因型的典型代表是GS115，其AOX1和AOX2两个基因与野生型一致，对甲醇利用较快。我们选取的宿主菌KM71是Muts基因型的典型代表，由于它的AOX1基因被部分删除而代之以酿酒酵母的ARG4基因，因此，其基因型为his4 arg4 aoxlΔ∷ARG4。由于该酵母株只能依赖相对较弱的AOX2基因，其利用甲醇的速度较慢[91，92]。本发明中所用的毕赤氏酵母已提供保藏，保藏号为CGMCC NO.0721。
线性载体DNA通过其两端和毕赤氏酵母共有序列的同源重组能产生稳定的转化酵母株，有利于外源蛋白的稳定表达[93，94]。实际上，所有的毕赤氏酵母表达载体至少含有一个毕赤氏酵母DNA的片段(如AOX1或GAP启动子)，其内部至少有一个酶切位点，用于整合入酵母基因组。有些载体包含毕赤氏酵母的HIS4基因，也可用于整合酵母基因组HIS4位点(如图28)。含有3’AOX1序列的表达载体即可以通过单点交叉方式整合入毕赤氏酵母基因组的AOX1位点或HIS4位点，也可以以基因置换的方式整合入AOX1位点(如图29)。后者将引起AOX1基因的删除，所以其表型是His+/Murs。
我们采用内切酶Bgl II将重组质粒pPIC9K-FL线性化，产生以5’AOX1和3’AOX1序列为侧翼的包含FL胞外区基因的表达盒，通过电转化法将目的基因片段转入宿主酵母株KM71中。以基因置换的方式整合入AOX1位点，引起AOX1基因的删除(如图30)。通过AOX1序列的重复整和形成外源基因在宿主基因组内的多拷贝插入(如图31、32)。
质粒pPIC9K-FL中含有野生型HIS4基因，能使由于组氨酸脱氢酶缺失引起的组氨酸代谢缺陷型毕赤氏酵母KM71回复成非组氨酸代谢依赖型。这样可以通过MD培养基对组氨酸依赖的性状筛选阳性转基因酵母。我们通过组氨酸营养代谢筛选，共获得36株回复突变阳性酵母。再进行G418梯度筛选，筛选到抗性最强的一株。


图1是实验流程示意图。
图2是重组FL胞外区cDNA合成策略。
图3是重组FL胞外区cDNA合成(1)。Lane1引物3，4扩增出220bp产物；M为100bp ladder。
图4是重组FL胞外区cDNA合成(2)。Lane1引物5，6扩增出320bp产物；M为100bp ladder。
图5是重组FL胞外区cDNA合成(3)。Lane1引物7，8扩增出429bp产物；M为100bp ladder。
图6是重组FL胞外区cDNA合成(4)。Lane1引物7，9扩增出492bp产物；M为100bp ladder。
图7是pMD18T-FL质粒阳性克隆PCR鉴定。Lane1FL上游引物和FL下游引物引物扩增出492bp产物；Lane2pMD18-T质粒阴性对照，无目的片段的扩增。M为100bp ladder。
图8是pMD18T-FL质粒酶切鉴定。Lane1pMD18-T-FL质粒经EcoR I和Not I双酶切后释放出492bp片段；M为100bp ladder。
图9是pMD18T-FL质粒测序报告。
图10是pPIC9K-FL质粒构建示意图。图示pPIC9K质粒经EcoR I和Not I双酶切后与重组FL胞外区cDNA以粘性末端连接。
图11pPIC9K质粒多克隆位点.
图12是pPIC9K质粒多克隆位点序列。
图13是pPIC9K-FL质粒阳性克隆的PCR鉴定。Lane1FL上游+FL下游引物扩增pPIC9K空质粒的阴性对照；Lane2FL上游引物+3’AOX引物，扩增出590bp片段。Lane35’AOX引物+FL下游引物，扩增片段为860bp。Lane4FL上游引物+FL下游引物，扩增片段为492bp。M为100bp ladder。
图14是pPIC9K-FL质粒酶切鉴定。lane1pMD18-FL质粒EcoR I和Not I双酶切；lane2pPIC9K-FL质粒EcoR I和Not I双酶切。M为200bp ladder。
图15是pPIC9K-FL质粒测序报告。
图16是KM71pPIC9K-FL转基因酵母株的PCR鉴定。Lane1FL上游引物+FL下游引物扩增pPIC9K-FL质粒的阳性对照；Lane2FL上游引物+FL下游引物扩增KM71pPIC9K的阴性对照；Lane35’AOX引物+FL下游引物，扩增片段为860bp。Lane4为FL上游引物+3’AOX引物，扩增出590bp片段。Lane 5FL上游引物+FL下游引物扩增片段为492bp。M为100bp ladder。
图17是KM71pPIC9K-FL菌株的Southern杂交。Lane1为KM71pPIC9K菌株基因组DNA经Not I，EcoR I双酶切产物；Lane2为质粒pPIC9K-FL经Not I，EcoRI双酶切产物；Lane 3为KM71pPIC9K-FL菌株基因组DNA经Not I酶切产物；Lane4为KM71pPIC9K-FL菌株基因组DNA经EcoR I酶切产物；Lane5为KM71pPIC9K-FL菌株基因组DNA经Not I，EcoR I双酶切产物。
图18是KM71pPIC9K-FL菌株的Northern检测(1)。Lane1KM71pPIC9K-FL诱导培养前的RNA样品；Lane2甲醇诱导培养24小时后提取KM71pPIC9K-FL菌株的总RNA样品；Lane3pPIC9K-FL质粒经EcoR I和Not I双酶切后样品；Lane4KM71pPIC9K阴性对照菌诱导培养24小时后提取菌株的总RNA样品。
图19是KM71pPIC9K-FL菌株的Northern检测(2)。Lane1KM71pPIC9K-FL甲醇诱导48小时后的RNA样品；Lane2KM71pPIC9K-FL甲醇诱导96小时的总RNA样品；Lane3KM71pPIC9K阴性对照菌株诱导培养48小时后的总RNA样品。
图20是KM71pPIC9K-FL培养液上清的SDS-PAGE电泳。Lane1KM71pPIC9K-FL诱导前培养液上清；Lane2KM71pPIC9K-FL经0.5％甲醇诱导24小时培养液上清；Lane3原核表达的rhFL样品；Lane4KM71pPIC9K-FL经0.5％甲醇诱导48小时培养液上清；Lane5KM71pPIC9K-FL经0.5％甲醇诱导96小时培养液上清；Lane6低分子量蛋白Marker；Lane7KM71pPIC9K诱导前培养液上清；Lane8KM71pPIC9K经0.5％甲醇诱导48小时培养液上清。(图中箭头所指为目的蛋白)图21是KM71pPIC9K-FL培养液上清的Western杂交。Lane1KM71pPIC9K-FL经0.5％甲醇诱导48小时培养液上清；Lane2原核表达的rhFL样品；Lane3KM71pPIC9K经0.5％甲醇诱导48小时培养液上清。
图22是不同诱导时间KM71pPIC9K-FL培养液上清的SDS-PAGE电泳。Lane1KM71pPIC9K-FL经0.5％甲醇诱导24小时培养液上清；Lane2KM71pPIC9K-FL经0.5％甲醇诱导48小时培养液上清；Lane3KM71pPIC9K-FL经0.5％甲醇诱导72小时培养液上清；Lane4KM71pPIC9K-FL经0.5％甲醇诱导96小时培养液上清；Lane6低分子量蛋白Marker。(图中箭头所指为目的蛋白)图23是SDS-PAGE电泳凝胶扫描半定量分析。图中箭头所指为目的蛋白峰。
图24是KM71pPIC9K-FL培养液上清脱糖基处理后SDS-PAGE电泳。Lane1低分子量蛋白Marker；Lane2经脱糖基酶PNGase F不完全酶切处理的KM71pPIC9K-FL培养液上清；Lane3KM71pPIC9K-FL培养液上清；Lane4原核表达的rhFL样品。(图中箭头所指为目的蛋白)图25是KM71pPIC9K-FL培养液上清脱糖基处理后的Western杂交。Lane1经脱糖基酶PNGase F不完全酶切处理的KM71pPIC9K-FL培养液上清；Lane2KM71pPIC9K-FL培养液上清；Lane3原核表达的rhFL样品。(图中箭头所指为目的蛋白)图26是培养7天CD34+细胞扩增倍数。
图27是细胞培养7天后有核细胞扩增倍数。①组细胞因子组合SCF(50ng/ml)+IL-3(200u/ml)+空白对照*(10μl)；②组细胞因子组合SCF(50ng/ml)+IL-3(200u/ml)+FL(10μl)*空白对照为KM71pPIC9K培养液上清。
图28是单点交叉整合入his4位点。
图29是载体部分与AOX1之间的基因置换。
图30是pPIC9K-FL的线性化与整合。
图31是pPIC9K-FL单点交叉整合入AOX位点。
图32是pPIC9K-FL多拷贝整合示意图。
具体实施例方式
1、试剂与仪器酒石酸钠(国产，分析纯)血清培养基Opti-MEM1硫酸铜(国产，分析纯) (Gibco)考马斯亮蓝R250(国产，分析 医用X光片(kodak)
纯) 尼龙膜(Boeringer Manheim)甘氨酸(国产，分析纯)恒温水浴锅(德国，Heraeus)巯基乙醇(国产，分析纯) 恒温震荡培养箱(国产)丙烯酰胺(国产，分析纯) 电泳仪(美国，BIORAD)重组人干细胞因子(rhSCF)(美 无菌操作台(国产)国，Immunex)恒温培养箱(国产)重组人白细胞介素3(rhIL-3)(德低温高速离心机(德国，Heraeus)国，Boehringer Mannheim)PCR仪(美国，PE9600)rhG-CSF(哈尔滨里亚哈尔生物 长波长紫外灯(国产)制品有限公司) 数码照相机(日本，KODAK)rhGM-CSF(哈尔滨里亚哈尔生 制冰机(日本，SANYO)物制品有限公司) 电转化仪(美国，BIORAD)抗CD34单抗(DaKo)杂交炉(美国，BIORAD)IMDM培养液(Gibco) 全自动发酵罐(瑞士，Bio-胎牛血清(Gibco) engineering)氢化可的松(Gibco) 电泳凝胶扫描仪GS-71(美国，富集血样本来自8正常人志愿者 BIORAD)经GM-CSF和G-CSF动员后(年CO2培养箱(德国，Heraeus)龄中位数36岁，男性6名， 常温离心机(Heraeus speatech)女性2名) CS-3000plus血细胞分离仪(美原核表达的rhFL样品(美国， 国，Baxter)PeproTe)倒置显微镜(日本，Olympus)rhFL抗体(美国，Immunix) 流式细胞仪(美国，Coulter X-细胞培养液RPMI 1640(Gibco) 100)淋巴细胞分离液(天津生物技术 GMP层流室(卫生部验收合格)研究所) 细胞培养板、培养皿(丹麦，NUNC)2、人工合成FL胞外区基因根据FL胞外区的氨基酸序列和毕赤氏酵母偏爱密码子，我们重新设计了FL胞外区的cDNA序列。目的蛋白为FL胞外区段的156个氨基酸残基。根据所选目的载体pPIC9K的多克隆位点，设计序列上游酶切位点为EcoR I，下游酶切位点为Not I。包括保护碱基共计492bp，重组cDNA序列Seq ID NO 1。
根据重组cDNA序列，我们合成了引物1-9，cDNA合成策略见图2示意。首先在反应体系中加入引物1、2，使其在72℃延伸为120bp模板。再加入引物3、4，进行目的片段的PCR扩增(PCR结果见图3)，Lane 1可见扩增出了220bp的片段。以此为模板再加入引物5、6，进行目的片段PCR扩增(PCR结果见图4)，Lane 1扩增出320bp片段。然后再以引物7、8进行PCR扩增，扩增出429bp目的片段(PCR结果见图5)。最后以引物7、9，Lane 1扩增出完整的492bp目的片段(PCR结果见图6)。
当产物与pMD18-T连接后，连接液全量转化E.coli DH5α感受态，我们对阳性克隆进行了PCR检测。以FL上游引物和FL下游引物扩增待测菌株(PCR结果见图7)，Lane 1扩增出492bp条带。阳性菌经摇菌扩增后，小量提取质粒进行下一步酶切鉴定。pMD18-T-FL质粒经EcoR I和Not I双酶切后释放出492bp片段(酶切结果见图8)。此质粒经测序，插入片段的序列完全正确(测序报告见图9)。
3.毕赤氏酵母表达载体pPIC9K-FL载体的构建本实验选用酵母整和型分泌表达载体pPIC9K，pPIC9K-FL载体的构建策略如图10所示。插入片段以EcoR I和Not I双酶切后，由pMD18T-FL质粒中释放。重组FL胞外区cDNA以粘性末段连接方式定向克隆至EcoR I和Not I双酶切后的pPIC9K质粒，插入到质粒中的α-MF分泌信号后。质粒多克隆位点如图11所示。pPIC9K质粒PAOX1启动子、α-MF分泌信号和多克隆位点序列见图12。
重组质粒转化E.coli DH5α感受态后，分别以5′AOX引物，3′AOX引物，FL上游引物和FL下游引物对阳性克隆进行了PCR检测(结果见图13)。以FL上游引物+FL下游引物扩增pPIC9K空质粒转化菌为阴性对照。FL上游引物+3′AOX引物，扩增出590bp片段；5′AOX引物+FL下游引物，扩增片段为860bp；FL上游引物和FL下游引物扩增出492bp片段，以上结果与理论数值相符。结果表明，重组FL cDNA片段已正确插入载体中。小量提取重组质粒后，以EcoRI和Not I双酶切方法进一步验证目的基因片段的插入(电泳结果见图14)。pMD18-FL质粒作为阳性对照，经过EcoR I和Not I双酶切后释放出492bp的重组FL cDNA片段。pPIC9K-FL质粒以EcoR I和Not I双酶切后出现与阳性对照大小相当的492bp目的条带，证实了重组FL cDNA片段已正确插入载体中。重组质粒pPIC9K-FL经测序，插入片段大小、位置完全正确。pPIC9K-FL质粒测序报告见图15。
4.重组质粒pPIC9K-FL转化酵母KM71根据载体内部的酶切位点，我们将pPIC9K-FL质粒采用Bgl II酶切线性化，电激转化毕赤氏酵母KM71感受态。转化酵母接种于MD平板，获得his+回复突变菌株共36株。挑取回复突变菌株接种于G418YPD平板上，挑取最高抗性阳性菌落，命名为KM71pPIC9K-FL。同法，以空质粒pPIC9K转化KM71酵母菌为阴性对照菌株，命名为KM71pPIC9K。
我们采用PCR反应初步鉴定了阳性菌株，KM71pPIC9K菌株为阴性对照，pPIC9K-FL质粒为阳性对照(结果见图16)。以KM71pPIC9K-FL转基因酵母基因组DNA为模板，5′AOX引物+FL下游引物扩增出860bp片段；FL上游+3′AOX引物扩增出590bp片段；FL上游+FL下游引物扩增出492bp条带。结果表明我们的表达载体已经整和到酵母的基因组内，目的基因大小与位置和设计相符。
我们提取了KM71pPIC9K-FL转化菌株的基因组DNA，以32P标记的重组FL片段为探针，空质粒转化菌KM71pPIC9K为阴性对照，重组质粒pPIC9K-FL为阳性对照，进行Southern杂交实验，验证目的基因的插入(结果见图17)。KM71pPIC9K阴性对照菌基因组DNA酶切产物，无杂交带出现；pPIC9K-FL质粒阳性对照，出现1条明显的目的带。KM71pPIC9K-FL转化菌株基因组DNA经Not I单酶切后出现明显的杂交带；KM71pPIC9K-FL转化菌株基因组DNA经EcoR I单酶切后，结果显示目的基因的插入；KM71pPIC9K-FL转化菌株基因组DNA经EcoR I和Not I双酶切后，结果显示转化菌株基因组释放出与重组质粒酶切后的阳性对照大小完全一致的杂交带。Southern杂交证实了目的基因已整和插入到宿主菌的基因组内，酶切位点正确保留。
KM71pPIC9K-FL菌株小量培养后，提取KM71pPIC9K-FL菌株的总RNA，在3V/cm的电压降下甲醛变性胶电泳3小时，转膜。用32P标记的重组FL片段为探针，进行Northern检测，验证目的基因在KM71pPIC9K-FL菌株中的表达(结果见图16)。阳性对照为pPIC9K-FL质粒。KM71pPIC9K-FL菌株诱导培养前(BMGY培养基培养)提取RNA分析，无FL RNA的表达。甲醇诱导培养24小时后提取KM71pPIC9K-FL菌株的总RNA(BMMY培养基培养)，可见目的基因的表达。Lane 4为KM71pPIC9K阴性对照菌诱导培养(BMMY培养基培养)24小时后提取菌株的总RNA杂交，无杂交带出现。以上结果表明rhFL基因经甲醇诱导后，已在KM71pPIC9K-FL菌株中成功表达。
图19所示为KM71pPIC9K-FL菌株随甲醇诱导时间延长，目的基因表达水平呈升高趋势。甲醇诱导48小时和96小时后分别提取RNA分析，可见随诱导时间延长杂交带亮度升高，提示目的基因表达量随诱导时间延长而增加。5.重组毕赤氏酵母KM71pPIC9K-FL分泌表达产物鉴定重组毕赤氏酵母KM71pPIC9K-FL经甲醇诱导发酵罐大量培养后，SDS-PAGE电泳分析培养液上清(结果见图20)。通过与KM71pPIC9K-FL甲醇诱导表达前样品和KM71pPIC9K阴性对照菌诱导后样品相比较，发现KM71pPIC9K-FL诱导后培养液样品在20KD处出现新的电泳条带，其分子量稍大于原核表达的rhFL，与理论推测值相符，可以认为是KM71pPIC9K-FL分泌表达了目的蛋白。菌株表达产物经Western印迹分析，在相对分子量位置(约20KD)可检测到rhFL蛋白，结果表明重组毕赤氏酵母KM71pPIC9K-FL分泌表达出rhFL蛋白(结果见图21)。
随后，我们采用SDS-PAGE电泳分析了不同诱导时间蛋白表达量的差异情况，结果见图22(图中箭头所指为目的蛋白)。经0.5％甲醇诱导24小时后(Lane1)，SDS-PAGE电泳中可观察到在相对分子量位置有目的蛋白的表达。此后，诱导48小时、诱导72小时和诱导96小时目的蛋白表达量呈升高趋势。甲醇诱导96小时后，KM71pPIC9K-FL分泌表达量达到高峰。Lowry法检测结果表明甲醇诱导96小时后KM71pPIC9K-FL培养液上清中总蛋白含量约为1.54g/L。采用SDS-PAGE电泳凝胶扫描半定量分析了目的蛋白的表达量(结果见图23)，从图中可以看出目的蛋白占培养液上清总蛋白量的7％。因此，我们推算KM71pPIC9K-FL菌株分泌表达重组FL蛋白的表达量约为108mg/L。
为了检测KM71pPIC9K-FL分泌表达产物的糖基化水平，我们将培养液上清采用脱糖基酶PNGase F不完全酶切处理后，分别进行了SDS-PAGE电泳和Western印记分析(结果见图24、图25)。SDS-PAGE电泳结果显示，未经酶切处理的培养液上清，于20KD处可见重组FL蛋白的清晰条带(图中箭头所示)。经脱糖基酶PNGase F不完全酶切处理的KM71pPIC9K-FL培养液上清，于19KD，18KD处出现了新的条带(图中箭头所示)。推测为重组FL蛋白糖基被切除后，分子量减小的条带。然后以此为对象，转膜后进行Western印记分析(图24)，与图21比较，出现了3条杂交带，与图24中Lane2箭头所示位置相当，结果显示经脱糖基酶PNGase F不完全酶切处理后，重组FL蛋白依次脱除1至2个糖基，和未脱糖基产物共形成三个杂交带，各个杂交带之间分子量相差大约1KD，提示每个糖基化位点上大约有6-9个糖基。从图24、25可以看出，重组FL蛋白彻底脱糖基后，分子量与原核表达产物大小相当。未经过处理的蛋白样品经过杂交后在相应的分子量位置上可检测到一条杂交带，分子量比来自大肠杆菌的rhFL大。因此，证明毕赤氏酵母分泌表达的重组FL蛋白是经过糖基化修饰的。此结果表明毕赤氏酵母表达的重组FL蛋白经过PNGase F不完全酶切后SDS-PAGE电泳和Western杂交可检测到三条杂交带，分子量分别为20KD、19KD和18KD，推测KM71pPIC9K-FL表达的重组蛋白可能存在两个糖基化位点，与天然蛋白的糖基化位点数量相同。
为了更全面的了解本发明，给出以下优选实施例。这些实施例目的在于说明而非旨在以任何方式限定本发明的范围。
实施例1人工合成FL胞外区基因1.1合成FL胞外区基因(1)在Microtube管中配制以下反应体系引物1(1pmol/μl) 1μl引物2(1pmol/μl) 1μl10×LA Buffer 10μlDntp 16μlD.D.W 72μl100μl，混匀置于94℃，5分钟。
(2)急速冷却至55℃，加入LA Taq酶2μl后，保温5分钟。
(3)72℃保温5分钟，得到120bp的片断。
(4)以此溶液为模板，在Microtube管中构建如下反应体系引物3(1pmol/μl)1μl引物4(1pmol/μl)1μl模板2μlEx Taq酶1μl10×Ex Buffer 10μlDNTP10μlD.D.W 75μl100μl混匀反应过程 (5)PCR产物0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到220bp的片断。
(6)以此溶液为模板，在Microube管中构建如下反应体系引物5(1pmol/μl) 1μl引物6(1pmol/μl) 1μl模板 2μlEx Taq酶 1μl10×Ex Buffer 10μlDNTP 10μlD.D.W 75μl100μl混匀反应过程 (7)PCR产物0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到320bp的片断。
(8)以此溶液为模板，在Microtube管中构建如下反应体系引物7(1pmol/μl) 1μl引物8(1pmol/μl) 1μl模板 2μlEx Taq酶 1μl10×Ex Buffer 10μlDNTP 10μlD.D.W 75μl100μl混匀反应过程 (9)PCR产物0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到429bp的片断。
(10)以此溶液为模板，在Microtube管中构建如下反应体系引物7(1pmol/μl) 1μl引物9(1pmol/μl) 1μl模板 2μlEx Taq酶 1μl10×Ex Buffer 10μlDNTP 10μlD.D.W 75μl100μl混匀反应过程 (11)PCR产物0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到492bp的目的片断。
1.2 FL胞外区基因克隆到pMD18-T载体(1)在Microtube管中构建如下连接体系PCR产物 10μlpMD18-T 5μlLigation solution5μlD.D.W10μl30μl混匀后置于16℃，16小时(2)挑取DH5α单菌落接种到1ml液体LB培养基中，37℃振荡过夜。
(3)在20ml新鲜液体LB培养基中接种过夜培养物20μl，37℃振荡2小时后(OD600≈0.4)将三角瓶置冰上放置10分钟。
(4)取1.5ml菌液4℃、5,000g离心10分钟，弃上清。
(5)加入预冷的100mM CaCl2溶液1ml，重悬菌体，冰浴20分钟。
(6)菌液4℃、5,000g离心5分钟，弃上清。
(7)加入预冷的CaCl2溶液0.1ml，重悬菌体。
(8)取连接产物全量加入0.1ml新鲜感受态细胞混匀，于4℃放置30分钟。
(9)42℃热激90秒，冰上放置5分钟。
(10)加入1ml LB培养基，37℃培养30分钟。
(11)取50μl转化菌铺Amp LB平板，37℃培养过夜。
1.3 pMD18-FL质粒阳性克隆PCR鉴定(1)模板制备挑取阳性菌落，加入1ml D.D.W.煮沸30分钟。5,000g离心10分钟，上清作为PCR反应模板。
(2)在Microtube管中构建如下PCR反应体系
FL上游引物(1pmol/μl) 1μlFL下游引物(1pmol/μl) 1μl模板 2μlPfu聚合酶(1U/μl) 1μl10X PCR缓冲液 2μldNTP 4μl25mmol/L Mg2+3μlD.D.W. 6μl20μl混匀反应过程 (3)PCR产物0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到492bp的片断。
1.4 pMD18-FL质粒酶切鉴定(1)氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中接种单菌落，37℃振荡18小时。
(2)配制溶液溶液I50mmol/L葡萄糖，20mmol/L Tris-Hcl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，溶菌酶10mg/ml；溶液II0.2mol/LNaOH，1％SDS；溶液III3mol/L Kac，2mol/L Hac。
(3)在1.5ml离心管中加入菌液，5,000g离心5分钟。
(4)控干液体后，取沉淀加入100μl溶液I重悬菌体，冰上放置1分钟。
(5)加入200μl新配制溶液II迅速上下颠倒5次，注意管底部分与溶液II充分混匀，之后放置冰上。
(6)加入150μl冰预冷的溶液III充分混匀10秒，于冰上放置3-5分钟。
(7)4℃、12,000g离心5分钟，将上清转移到另一离心管中并加入2μg RNA酶，室温放置15分钟。
(8)加入500μl Tris饱和苯酚∶氯仿(1∶1)，充分混匀后4℃、12,000g离心5分钟。
(9)上清加入500μl氯仿，混匀后4℃、12000g离心5分钟。
(10)上清中加入2倍体积予冷的无水乙醇，充分混匀后4℃、12,000g离心5分钟。
(11)弃上清，加入1ml予冷的75％乙醇，将沉淀充分悬起，4℃、12,000g离心5分钟。
(12)沉淀干燥后溶于50μl双蒸水中。
(13)构建如下酶切体系质粒 10μlNot I 5μlEcoR I 5μlD.Buffer 10μlD.D.W 70μl100μl，混匀置于37℃，90分钟。
(14)酶切产物0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到492bp的片断。
(15)提取重组质粒测序(测序报告见图9)。
实施例2pPIC9K-FL载体的构建2.1 pMD18-FL和pPIC9K质粒的小量提取(1)含氨苄青霉素(50g/ml)的LB液体培养基中接种单菌落，37℃振荡18小时。
(2)在1.5ml离心管中加入菌液，5,000g离心5分钟。
(3)控干液体后，取沉淀加入100μl溶液I重悬菌体，冰上放置一分钟。
(4)加入200μl新配制溶液II迅速上下颠倒5次，注意管底部分与溶液II充分混匀，之后放置冰上。
(5)加入150μl冰预冷的溶液III充分混匀10秒，于冰上放置3-5分钟。
(6)4℃、12,000g离心5分钟，将上清转移到另一离心管中并加入2μg RNA酶，室温放置15分钟。
(7)上清加入0.8ml DNA purification Resin震荡混匀，过吸附柱。
(8)70％乙醇2ml过吸附柱。
(9)4℃，12,000g离心5分钟，除净乙醇。
(10)70％乙醇2ml过吸附柱。
(11)4℃，12,000g离心5分钟，除净乙醇。
(12)吸附柱加入80℃D.D.W 80μl，12,000g离心10分钟，取离心溶液。
2.2质粒的连接、转化(1)构建如下酶切体系质粒(pPIC9K或pMD18-FL) 50μlEcoR I 10μlD.Buffer 20μlD.D.W120μl200μl，混匀置于37℃，90分钟。
(2)酶切产物中加入0.8ml DNA purification Resin震荡混匀，过吸附柱。
(3)70％乙醇2ml过吸附柱。
(4)4℃，12,000g离心5分钟，除净乙醇。
(5)70％乙醇2ml过吸附柱。
(6)4℃，12,000g离心5分钟，除净乙醇。
(7)吸附柱加入80℃D.D.W 80μl，12,000g离心10分钟。
(8)取离心溶液50μl，构建如下酶切体系EcoR I酶切产物 50μlNot I 10μlH.Buffer 20μlD.D.W 120μl200μl，混匀置于37℃，90分钟。
(9)0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳。
(10)长波长紫外灯(365nm)下切取目的条带。
(11)70℃水浴熔解含目的条带低熔点琼脂糖凝胶。
(12)回收产物按1∶2加入DNA purification Resin震荡混匀，过吸附柱。
(13)70％乙醇2ml过吸附柱。
(14)4℃，12,000g离心5分钟，除净乙醇。
(15)吸附柱加入80℃ D.D.W 50μl，12,000g离心10分钟。
(16)取离心溶液各20μl，构建如下连接体系pPIC9K双酶切产物 20μlFL cDNA片段 5μlT4 DNALigase 5μl10X Ligase Buffer10μlD.D.W60μl100μl，混匀置于16℃，16小时(15)取连接产物如1.3.2(6)-(15)操作转化DH5α感受态。
2.3 pPIC9K-FL质粒阳性克隆PCR鉴定(1)模板制备挑取阳性菌落，加入1ml D.D.W.煮沸30分钟。5,000g离心10分钟，取上清液作为PCR反应模板。(以pMD18-FL质粒为阳性对照，以pPIC9K质粒为阴性对照。)(2)在Microtube管中构建如下PCR反应体系上游引物(1pmol/μl) 1μl下游引物(1pmol/μl) 1μl模板5μlPfu聚合酶(1U/μl) 1μl10 X PCR缓冲液 2μldNTP4μl25mmol/L Mg2+3μlD.D.W. 3μl20μl混匀反应过程 (3)PCR产物0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到492bp的片断。
2.4 pPIC9K-FL质粒酶切鉴定(1)按照1.1.2方法从阳性菌落中小量提取质粒。
(2)构建如下酶切体系(以pMD18-FL质粒为阳性对照)pPIC9K-FL质粒 10μlNot I 5μlEcoR I 5μlD.Buffer 10μlD.D.W 70μl100μl，混匀置于37℃，90分钟。
(3)酶切产物0.7％琼脂糖凝胶电泳。
(4)小量提取质粒测序。
实施例3重组毕赤氏酵母的转化3.1外源DNA的准备(1)按照3.1.2方法提取重组pPIC9K-FL质粒。
(2)取pPIC9K-FL质粒50μl，构建如下酶切体系pPIC9K-FL质粒50μlBgl II 10μlH.Buffer 20μlD.D.W120μl200μl，混匀置于37℃，90分钟。
(3)酶切产物0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳，长波长紫外灯(365nm)下切取目的条带。
(4)70℃水浴熔解含目的条带低熔点琼脂糖凝胶。
(5)产物按1∶2加入DNA purification Resin震荡混匀，过吸附柱。
(6)70％乙醇2ml过吸附柱。
(7)4℃，12,000g离心5分钟，除净乙醇。
(8)吸附柱加入80℃D.D.W50μl，12,000g离心10分钟。
3.2毕赤氏酵母KM71感受态的制备(1)挑取毕赤氏酵母KM71单菌落，接种于10ml YPD培养基中，28℃振荡培养48小时。
(2)取1ml培养物接种到200mlYPD培养基中，28℃振荡培养4小时。
(3)30ml菌液放冰上10分钟后，4℃、5,000g离心5分钟，弃去上清，控干离心管中残留培养基。
(4)用冰预冷的纯水30ml重悬菌体，4℃、5000g离心5分钟。弃上清。
(5)用冰预冷的纯水30ml重悬菌体，4℃、5000g离心5分钟。弃上清。
(6)用冰预冷的1mol/L的山梨醇10ml重悬菌体，4℃、5000g离心5分钟，弃上清。
(7)用冰预冷的2ml 1mol/L的山梨醇重悬菌体，4℃、5,000g离心5分钟，弃上清。
(8)菌体沉淀重悬在500μl 1mol/L的山梨醇中，放于4℃待用。
3.3电转化毕赤氏酵母KM71(1)200μl感受态毕赤氏酵母中加入5μg DNA，混匀，转入2mm电转化池，在冰上放置30min。
(2)将电转化仪(Biorad)调至毕赤氏酵母档，电激。
(3)转化物中加入1ml 1mol/L的山梨醇，混匀，取200μl的山梨醇重悬液体铺MD平板，28℃培养72小时。
(4)挑取回复突变菌株接种于G418YPD平板上，28℃培养。(G41g浓度梯度为0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml，8mg/ml)3.4用pPIC9K空质粒同上5.1-5.3操作，构建KM71PIC9K转化菌作为阴性对照菌株。
实施例4重组毕赤氏酵母的鉴定4.1毕赤氏酵母染色体DNA的提取(1)挑取酵母单克隆，接种于50mlYPD培养基中，28℃振荡摇菌36小时(2OD600)。
(2)取20ml 4℃、2,500g离心5分钟。
(3)弃上清，用10ml纯水重悬沉淀。
(4)4℃、2500g离心5分钟。
(5)弃上清，用0.4ml新配制的SZB溶液重悬菌体，并转入1.5ml离心管，37℃水浴40分钟。
(6)加入0.4ml 1％SDS，轻轻混匀，在冰上放置5分钟。
(7)加入0.3ml 5M KAc(pH8.9)，轻轻混匀。
(8)12,000g，4℃离心10分钟，将上清转到另一离心管。
(9)加入2倍体积的予冷无水乙醇，充分混匀，12,000g、4℃离心10分钟。
(10)弃上清，沉淀干燥后，溶解在0.7mlTE buffer中，加入1mgRNA酶，室温放20分钟。
(11)加入0.3mlTris饱和酚，混匀，再加入0.3ml氯仿，混匀。12,000g、4℃离心10分钟。
(12)取上清加入等体积氯仿，混匀，12,000g、4℃离心5分钟。
(13)取上清加入0.1倍体积5MKAc(pH8.9)，再加入2倍体积予冷无水乙醇，混匀。12,000g、4℃离心10分钟。
(14)沉淀用75％乙醇重悬，12,000g、4℃离心5分钟，弃上清。
(15)沉淀干燥后，保存于-70℃。
4.2毕赤氏酵母总RNA的提取(1)取20ml菌液于4℃、2,000g离心10分钟，弃上清。
(2)加入20ml纯水，重悬菌体，于4℃、2,000g离心10分钟。
(3)菌体重悬于1ml纯水中，转入1.5ml离心管，在4℃、2,000g离心10分钟，弃上清。
(4)加入1ml Trizol混匀，放于65℃、2分钟。立即转入-70℃，放置5分钟。
(5)加入0.2ml氯仿，混匀，4℃、12,000g离心5分钟。
(6)上清转入另一离心管，加入2倍体积予冷无水乙醇，-70℃放置20分钟。
(7)12,000g、4℃离心5分钟，弃上清。
(8)沉淀用75％乙醇重悬，保存于-70℃。用前12,000g、4℃离心5分钟，弃上清。
(9)沉淀干燥后，溶解于无RNA酶的双蒸水中。
4.3 Southern杂交4.3.1 DNA的酶切，电泳及向尼龙膜转移(1)取DNA样品，稀释到约0.2μg/μl，分别构建如下酶切体系
KM71pPIC9K-FL 10μlEcoR I 5μlD.Buffer10μlD.D.W 75μl100μl，混匀置于37℃，90分钟。
KM71pPIC9K-FL 10μlNot I 5μlH.Buffer10μlD.D.W 75μl100μl，混匀置于37℃，90分钟。
KM71pPIC9K-FL 10μlNot I 5μlEcoR I 5μlD.Buffer10μlD.D.W 70μl100μl，混匀置于37℃，90分钟。
KM71pPIC9K 10μlNot I 5μlEcoR I 5μlD.Buffer10μlD.D.W 70μl100μl，混匀置于37℃，90分钟。
pPIC9K-FL质粒 10μlNot I 5μlEcoR I 5μlD.Buffer10μlD.D.W 70μl100μl，混匀置于37℃，90分钟。
(2)将酶切的DNA样品在1.0％的琼脂糖凝胶上在1V/cm的电压下电泳过夜。
(3)将凝胶在0.2mol/L HCl中处理2×15分钟部分脱嘌呤。
(4)在0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl的变性液中处理2×30分钟。
(5)在0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，1.5mol/L NaCl中和液中处理2×30分钟。
(6)将凝胶用毛细管法在20×SSC的转移缓冲液中向经2×SSC预处理10分钟的尼龙膜转膜24小时。
(7)转膜结束后，用6×SSC冲洗尼龙膜10分钟，干燥半小时后于120℃烘烤30分钟。
4.3.2放射性探针的标记(该方法参考Promega公司的Prim-a-gene试剂盒的使用说明)(1)将50ng经低熔点琼脂糖凝胶纯化后的FL片段稀释到30μl，沸水浴10分钟，迅速置于冰上。
(2)加入10μl 5×标记缓冲液，2μl dATP，dGTP，dTTP的混合物，每种2mmol/L，2μl BSA，5u Klenow Fragment(1μl)，5μlα-32P-dCTP(50μCi)，置于室温下1小时。
(3)反应结束后，将其置于沸水浴中10分钟变性，然后置于冰上待用。
4.3.3杂交程序(1)用6×SSC浸泡尼龙膜10分钟，移入杂交管中，加入20ml杂交液，10％PEG(6000)，10mmol/LEDTA，20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4pH7.0，7％SDS)在42℃预杂交1-2小时。之后将杂交管中的液体倒掉。
(2)将变性的放射性标记探针与适量杂交液混匀，加入到杂交管中，42℃杂交过夜。
(3)2×SSC，0.5％SDS、42℃洗膜2×15分钟。
(4)0.1×SSC，0.5％SDS、65℃洗膜2×15分钟。
(5)用保鲜膜将尼龙膜包好后，压在X光片下曝光72小时。
4.4 Northern杂交4.4.1 RNA电泳，转膜(1)配制1％甲醛变性胶(Sambrook，et al.1989)，将RNA与点样缓冲液混匀后点样，在3V/cm的电压降下电泳3小时。
(2)电泳结束后，将甲醛变性胶用DEPC处理过的双蒸水浸泡2×15分钟，然后参照6.3.1的方法转膜。
(3)转膜结束后，用0.5mol/L乙酸钠将尼龙膜冲洗10分钟，凉干后80℃烘烤2小时。
4.4.2 Northern杂交程序(1)将尼龙膜用6×SSC浸泡10分钟后，装入杂交管中。
(2)向杂交管中加入20ml杂交液在65℃预杂交2小时。(5×SSC，5×Denhart′s reagent，20mmol/L EDTA，50μg/ml鲑鱼精DNA)(3)将用6.3.3的方法标记的探针与适量的杂交液混合好，更换杂交液后于65℃杂交过夜，56℃退火3小时。
(4)用0.5×SSC，0.5％SDS，0.1×SSC和0.5％SDS洗膜液各洗2×15分钟，将尼龙膜用保鲜膜包好后，压在X光片下曝光72小时。
实施例5重组毕赤氏酵母KM71pPIC9K-FL的培养和产物鉴定5.1贮存液的配制(1)10X YNB(13.4％YNB)134g YNB溶于1000ml蒸馏水中，0.2μm过滤除菌，贮藏于+4℃。
(2)500X B(0.02％Biotin)20mg生物素溶于100ml蒸馏水中，0.2μm过滤除菌，贮藏于+4℃。
(3)10X D(20％Dextrose)将200g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，0.2μm过滤除菌，贮藏于+4℃。
(4)10X M(5％Methanol)将5ml甲醇与95ml蒸馏水相混合，0.2μm过滤除菌，贮藏于+4℃。
(5)10X GY(10％Glycerol)将100ml甘油与900ml蒸馏水相混合，0.2μm过滤除菌，贮藏于+4℃。
(6)1M磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(potassium phosphge buffr，pH6.0)将132ml的1M磷酸氢二钾和868ml的1M磷酸二氢钾相混合，调节pH至6.0±0.1，121℃，20分钟灭菌。
(7)YPD平板培养基培养基的配制2％胰化蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖，2％琼脂糖，加蒸馏水至1000ml，121℃，20分钟灭菌，冷却至50℃铺板，贮藏于+4℃。
(8)BMGY(Buffer Glycerol-complex Medium)(1升)培养基的配制a.将10g酵母提取物和20g胰化蛋白胨溶于700ml蒸馏水中。
b.121℃高压20分钟灭菌。
c.冷却至室温后，加入以下混合物100ml 100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，100ml 10X YNB，2ml 500X B，100ml 10X GY。
d.混匀后贮藏于+4℃。
(9)BMMY(Buffer Methanol-complex Medium)(1升)培养基的配制a.将10g酵母提取物和20g胰化蛋白胨溶于700ml蒸馏水中。
b.121℃高压20分钟灭菌。
c.冷却至室温后，加入以下混合物100ml 100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，100ml 10X YNB，2ml 500X B，100ml 10X M。
d.混匀后贮藏于+4℃。
5.2重组毕赤氏酵母KM71pPIC9K-FL的小量培养(1)挑取单菌落，接种在20mlBMGY培养基中，28℃振荡摇菌48小时。
(2)将上述培养物转入200mlBMGY培养基中，28℃振荡摇菌48小时。
(3)室温2,000g离心10分钟后弃上清，用20mlBMMY培养基重悬菌体，加入1000ml三角瓶中，28℃振荡培养。
(4)每隔8小时补充甲醇至终浓度0.5％。
(5)每隔12小时取样分析。
(6)KM71pPIC9K菌株同上培养方法，为阴性对照。
5.3重组毕赤氏酵母KM71pPIC9K-FL的全自动发酵罐发酵(1)从YPD培养基中接种单菌落到另一新鲜的斜面培养基上，培养24小时。
(2)挑取单菌落接种到装有100ml BMGY培养基的1000ml灭菌三角瓶中，28℃、220r/min培养24-30小时(种子液稀释100倍后OD600约为0.15-0.20左右)。
(3)按接种量的10％通过兰格蠕动泵无菌接入装有2000ml BMGY发酵培养基的5L全自动发酵罐进行分批培养。
(4)用25-30％的氨水来调节反应体系的pH在5.5至6.0之间。
(5)28℃培养，溶氧控制在30％以上，稳定后发酵过程中通气量、搅拌转速及罐压均保持不变，36-48小时左右当底物耗尽后，观察到溶氧值陡然上升。
(6)通过取样口将发酵液取出，离心，收集酵母菌体，用BMMY充分重悬后通过蠕动泵加入全自动发酵罐，28℃诱导培养，每隔8小时加入甲醇使其终浓度到达0.5％。
(7)每隔12小时取样分析。
5.4蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳5.4.1蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳样品准备(1)取1ml酵母培养上清液，4℃、5,000g离心5min。
(2)取上清50μl加入等体积2×加样缓冲液
蛋白电泳加样缓冲液的配制50mmol/L Tris-Hcl PH6.8，100mmol/L DTT，2％SDS，10％甘油，0.1％溴酚蓝。
(3)沸水浴煮10min，自然冷却至室温。
5.4.2蛋白脱糖基处理(1)将20μl样品溶于100μl水中，加入1/10体积蛋白变性溶液(5％SDS，10％巯基乙醇)，100℃变性10分钟。
(2)加入1/10体积的酶切缓冲液。
(3)加入500u PNGase F酶，37℃保温45分钟。
5.4.3聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳(1)凝胶槽玻璃板冲洗干净后硅化处理；(2)配制4×分离胶缓冲液(50ml)a.8.5g Tris(1.5M)加双蒸水至45ml，用HCl调pH至8.8。
b.加2ml 10％SDSc.加双蒸水至50ml。
(3)配制15ml 15％聚丙烯酰胺分离凝胶液a.3.64ml双蒸水b.7.5ml 30％丙烯酰胺母胶液c.3.75ml 4×分离胶缓冲液d.110μl 10％过硫酸铵e.6μl TEMED(四甲基乙二胺)f.充分混匀后灌制凝胶，直至距短玻璃板顶端2至3cm处，并在凝胶溶液上加水饱和正丁醇隔绝空气并使凝胶聚合后形成一个平整的表面；(4)配制2×积层胶缓冲液(50ml)a.1.5g Tris(0.25M)加双蒸水至45ml，用HCl调pH 6.8b.加1ml 10％SDS
c.加双蒸水至50ml(5)30％丙烯酰胺母胶液(29∶1，50ml)a.14.5g丙烯酰胺b.0.5g甲叉双丙烯酰胺c.加双蒸水至50ml(6)配制3ml 4％聚丙烯酰胺积层凝胶液a.1.1ml双蒸水b.0.4ml 30％丙烯酰胺母胶液c.1.5ml 2×积层胶缓冲液d.21μl 10％过硫酸铵e.1μl TEMED(四甲基乙二胺)，充分混匀；(7)待分离胶完全聚合后，弃去正丁醇，用1×积层胶缓冲液充分冲洗后，在分离胶顶层用4％聚丙烯酰胺积层凝胶液继续灌制凝胶，并插入合适的梳子，等待凝胶聚合。
(8)配制5×电泳缓冲液(1L)a.15.15g Tris碱b.72g甘氨酸c.加双蒸水至900ml，调节μH至8.3d.50ml 10％SDSe.加双蒸水至1L(9)凝胶聚合后，拔出梳子，用1×电泳缓冲液冲洗加样孔，并安装至电泳系统。
(10)取30μl准备好的蛋白样品上样，15mA恒流进行电泳，直至溴酚蓝指示剂泳制凝胶底部，停止电泳，取出凝胶。
3.5.4.4 凝胶的考马斯亮蓝染色(1)配制凝胶固定液a.50％甲醇b.10％乙酸c.40％双蒸水
(2)将凝胶用固定液固定30分钟，弃去固定液。
(3)配制0.2％考马斯亮蓝R250染液0.2g考马斯亮蓝R250溶于100ml凝胶固定液中，充分搅拌过滤后备用。
(4)凝胶用0.2％考马斯亮蓝R250染液染色1小时，弃去染色液。
(5)染色后的凝胶用固定液进行漂洗，弃去固定液。
(6)重复步骤5，直至蛋白质条带清晰，背景清楚。
(7)凝胶放入10％乙酸中，使凝胶重新膨胀。
(8)扫描凝胶，记录凝胶影像。
5.4.4 Western印渍分析(该方法参照PIERCE公司的SuperSignal WestPico试剂盒的使用说明)(1)SDS-PAGE凝胶电泳结束后，将凝胶取下，放于一张大小一样的用转移缓冲液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.37％SDS，20％甲醇)浸湿的滤纸上。
(2)剪一张PVDF膜，酒精浸润5分钟，再用转移缓冲液平衡30分钟。
(3)将PVDF膜覆盖在凝胶上，上面再盖一层用转移缓冲液浸湿的滤纸上，放于转移电泳槽中，70mA 4℃转移8小时。
(4)转移结束后，PVDF膜取出室温干燥10分钟，转入TBST溶液中浸泡10分钟。
(5)将滤膜转入含1％BSA的TBST溶液中室温温和震荡孵育1小时，弃掉溶液。
(6)加入适量TBST(刚刚浸没PVDF膜)，再加入1∶5000第一抗体，室温温和震荡孵育1小时。
(7)室温下20mlTBST洗PVDF膜3×15分钟。
(8)加入适量TBST(浸没PVDF膜)，再加入1∶2000HRP标记第二抗体，室温轻轻摇动孵育40分钟。
(9)室温下，20mlTBST洗PVDF膜3×15分钟。
(10)用TBS洗膜一次，去除Tween20。
(11)加入显色缓冲液(PIERCE)放置5分钟，用杂交袋包装好，与X光片夹在一起使之曝光3分钟。
5.5 Lowry法检测总蛋白含量(1)取10mg牛血清白蛋白，加D.D.W溶解定容100ml。
(2)配制试剂A4％ Na2CO3，0.2mol/L NaOH，1％ CuSO4，2％酒石酸钠，按50∶50∶1∶1。
(3)取6支试管分别编号为0到5号，分别加入标准蛋白溶液0ml，0.08ml，0.16ml，0.24ml，0.32ml，0.40ml，加D.D.W补足至0.40ml。
(4)各管加入试剂A 2ml，混匀后室温放置10分钟。
(5)各管加入酚试剂0.2ml，混匀后37℃水浴放置30分钟。
(6)分光光度计750nm波长测各管标准蛋白溶液样品吸光值，以0号为参比，绘制标准曲线。
(7)取待测样品0.4ml，分光光度计750nm波长测样品吸光值。
(8)将样品吸光值代入上述标准曲线，计算蛋白浓度。
实施例6表达产物体外活性检测我们分离出外周血单个核细胞(PBMC)为实验对象，检测毕赤氏酵母分泌表达的重组FL蛋白的生物学活性。用KM71pPIC9K-FL培养液上清协同SCF、IL-3等细胞因子体外扩增CD34+细胞检测了KM71pPIC9K-FL表达产物的生物活性。结果表明(表一)，体外培养7天后，SCF+IL-3+KM71pPIC9K-FL培养液上清组CD34+细胞数量扩增近3倍，明显高于对照组(SCF+IL-3+KM71pPIC9K培养液上清组)的细胞扩增数量，有显著性差异(P＜0.05)(如图26)。如图27所示，单核细胞体外扩增7天后，SCF+IL-3+KM71pPIC9K-FL培养液上清组有核细胞总数扩增3.25倍，与SCF+IL-3+KM71pPIC9K培养液上清组(对照组)无显著性差异(P＞0.05)。
以上实验结果表明，以细胞因子组合SCF+IL-3+FL对于CD34+细胞的扩增倍数与对照组相比，具有显著性差异，表明KM71pPIC9K-FL培养液上清明显促进了CD34+细胞的增生。结果表明毕赤氏酵母KM71pPIC9K-FL分泌表达的重组FL蛋白具有与天然蛋白FL相似的生物学功能。
表一不同细胞因子组合时有核细胞总数，CD34+细胞扩增倍数时间(天)组别0 7有核细胞扩增倍数SCF+IL-3+KM71pPIC9K培养液上清 12.25±0.16SCF+IL-3+KM71pPICgK-FL培养液上清13.25+0.22CD34+细胞扩增倍数SCF+IL-3+KM71pPIC9K培养液上清 11.5±0.15SCF+IL-3+KM71pPIC9K-FL培养液上清12.9±0.3权利要求
1.一种根据酵母偏爱密码子重组的FL胞外区DNA序列，其编码具有Seq IDNO.1的氨基酸序列的多肽。
2.权利要求1的DNA，其具有Seq ID NO.2的多核苷酸序列。
3.一种包含权利要求1或2中任一项DNA的重组质粒。
4.一种构建的工程菌株，该菌株含有权利要求3中的重组质粒，能高效分泌FL蛋白。
5.一种产生多肽的方法，该方法包括用权利要求4的宿主菌表达所述的DNA编码的多肽。
全文摘要
本发明涉及一种新的多核苷酸，和包含该多核苷酸的质粒、宿主以及表达这种多核苷酸的方法。更具体的说，本发明采用P.Pastoris所偏爱的密码子，人工合成了FL胞外区的编码序列。以酵母分泌型表达质粒pPIC9K为载体，通过5’AOX和3’AOX置换的方法整和到宿主菌P.Pastoris KM71的基因组中，构建了高效分泌表达FL胞外区蛋白的基因工程菌株。而后分别以Southern，Northern和Westerns方法检测了外源目的基因的整和、转录以及目的蛋白的分泌表达，并以检测刺激CD3文档编号C12N15/31GK1504572SQ0215364
公开日2004年6月16日 申请日期2002年12月3日 优先权日2002年12月3日
发明者郝希山, 任秀宝, 黄宗堂 申请人:天津市肿瘤医院