专利名称：一种重组改构人肿瘤坏死因子的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种重组改构人肿瘤坏死因子的生产方法，特别涉及一种采用通过菌种发酵和离子交换法制备重组改构人肿瘤坏死因子的方法。
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF)主要是由巨嗜细胞产生的一种非糖基化可溶性多功能细胞因子，由157个氨基酸组成。其主要生物学活性是能够较为特异地杀伤多种肿瘤细胞。Sermenzatto G(British Jomnal ofCancer，1990；60354)对肿瘤坏死因子的生物学效应进行了详细的描述。但是，临床试验表明，天然人肿瘤坏死因子存在严重的毒副反应，无法达到治愈肿瘤的目的。
将天然TNF的1-7位氨基酸缺失，Pro8Ser9Asp10用ArgLysArg取代，同时将Leu157用Phe取代，得到一种新型改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)。此突变体提高了其抗肿瘤活性，降低了毒副作用，可以应用于临床。
重组改构人肿瘤坏死因子一般以可溶性蛋白的形式存在于胞浆中，而胞浆中细菌蛋白的成分复杂，故从大肠杆菌中分离纯化rmhTNF的方法较困难。目前可见报道的纯化工艺通常包括破菌、离心、盐析、超滤、凝胶过滤、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和亲和层析等一系列复杂步骤，但都存在步骤烦杂、纯化得率低、生产难以放大等缺点，不能满足临床应用的需要。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种重组改构人肿瘤坏死因子的生产方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤(1)采用常规的方法进行裂菌将采用常规方法发酵培养所获得的诱导表达菌，悬浮于5～8倍体积的pH为8～9的缓冲溶液中(25％sucrose，10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA)，按0.3～0.4mg/克菌体加入固体溶菌酶，0～6℃搅拌10～40分钟；按3～7mg/克菌体加入脱氧胆酸钠，搅拌，加MgCl2至终浓度为6～10M，再加入Dnase，混匀后离心分离，上清用30～70％饱和度的硫酸铵盐析沉淀0.5～1.5小时，离心分离，收集上清，加入10～30mmol/L Tris.HCl，pH为8～9，0.1～2mmol/LEDTA透析，换液数次，此即为TNF粗制品；(2)Q-sepharose阴离子交换层析将步骤(1)的TNF粗制品，以30～40ml/min流速上样于用pH为8～9，优选pH为8.5的缓冲溶液(10～30mmol/L Tris.HCl，0.1～2mmol/L EDTA)平衡的Q-sepharose阴离子交换柱，用平衡缓冲液淋洗至样品光吸收值至基线，用0～0.5MNaCl溶液线性洗脱，将目的峰产物用10～30mmol/L pH为7.0～8.0，优选pH为7.5的磷酸缓冲液透析，换液数次，获得目的峰透析液；所述及的Q-sepharose阴离子交换树脂为Amersham Bioscience.公司生产的一种琼脂糖凝胶；(3)SP-sepharose阳离子交换层析将步骤(2)的目的峰透析液以15～20ml/min流速上样于SP-sepharose阳离子交换柱，用平衡缓冲液淋洗至样品光吸收值至基线，用0～1M NaCl溶液线性洗脱，收集目的峰产物，即为本发明的重组改构人肿瘤坏死因子。所述及的SP-sepharose阳离子交换树脂为Amersham Bioscience.公司生产的一种琼脂糖凝胶；采用此生产工艺，单批生产300～400g菌体，可以获得800～1200mg的rmhTNF蛋白，纯度达到95％以上，比活达2～4×108IU/mg，活性回收率为80％以上，原液各项指标符合质量标准，取得良好的生产结果。与以往的生产方法比较，本项目的工艺路线简单，原液质量合格，工艺放大容易，操作周期短，因而优势十分明显。
图1为Q-sepharose层析洗脱峰曲线。
图2为SP-sepharose层析洗脱峰曲线。
图3为rmhTNF SDS-PAGE电泳图，1为标准品2为样品液。
图4为rmhTNF纯度测定(HPLC)。
具体实施例方式
实施例1Q-sepharose阴离子交换层析阴离子交换基质Q-sepharose装柱φ10cm×20cm，用20mmol/L Tris.HCl，pH8.5，1mmol/L EDTA缓冲液平衡，以35ml/min流速将TNF粗制品上样，用平衡缓冲液淋洗2柱体积至样品光吸收值至基线，用0.5M NaCl线性洗脱(见图1)，将目的峰对20mmol/L pH7.5磷酸缓冲液透析，换液3次。
SP-sepharose阳离子交换层析阳离子交换基质SP-sepharose装柱φ5cm×15cm，以18ml/min流速将Q-sepharose目的峰透析液上样，用平衡缓冲液淋洗2柱体积至样品光吸收值至基线，用1M NaCl线性洗脱(见图2)，收集目的峰产物。
结果采用此生产工艺，单批可以获得1200mg的rmhTNF蛋白，纯度达到97.8％，比活达3.6×108IU/mg，活性回收率为86％，原液各项指标符合质量标准。
电泳图如图3，rmhTNF纯度测定(HPLC)如图4。
权利要求
1.一种重组改构人肿瘤坏死因子的生产方法，其特征在于，包括如下步骤(1)采用常规的方法对发酵培养所获得的诱导表达菌进行裂菌获得TNF粗制品；(2)将步骤(1)的TNF粗制品，上样于用pH为8～9的缓冲溶液平衡的Q-sepharose阴离子交换柱，用平衡缓冲液淋洗至样品光吸收值至基线，用NaCl溶液线性洗脱，将目的峰产物用pH为7～8磷酸缓冲液透析，获得目的峰透析液；(3)将步骤(2)的目的峰透析液上样于SP-sepharose阳离子交换柱，用平衡缓冲液淋洗至样品光吸收值至基线，用NaCl溶液线性洗脱，收集目的峰产物，即为本发明的重组改构人肿瘤坏死因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤(1)的TNF粗制品，以30～40ml/min流速上样于Q-sepharose阴离子交换柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤(2)的目的峰透析液以15～20ml/min流速上样于阳离子交换柱。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述及的Q-sepharose阴离子交换树脂为一种琼脂糖凝胶。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述及的SP-sepharose阳离子交换树脂为一种琼脂糖凝胶。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，用0～1M NaCl线性洗脱。
全文摘要
本发明公开了一种重组改构人肿瘤坏死因子的生产方法，特别涉及一种采用通过菌种发酵和离子交换法制备重组改构人肿瘤坏死因子的方法。包括如下步骤采用常规的方法进行裂菌，用Q－sepharose阴离子交换层析，用SP－sepharose阳离子交换层析。采用此生产工艺，单批生产300～400g菌体，可以获得800～1200mg的nrhTNF蛋白，纯度达到95％以上，比活达2～4×10
文档编号C12P21/00GK1566357SQ0312926
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月16日 优先权日2003年6月16日
发明者张玫萍, 曹纬 申请人:上海赛达生物药业股份有限公司