具有cAMP生成活性的新肽的制作方法

专利名称：具有cAMP生成活性的新肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的并且有用的肽、编码这些肽的基因以及含有这些肽的药物组合物。更具体地，本发明涉及具有(1)到(10)特性的肽；(1)在中枢神经系统中表达，(2)强烈地作用于降钙素受体，(3)促进细胞产生cAMP，(4)以浓度-依赖的方式结合钠离子，(5)抑制钙离子的吸收，以及(6)抑制细胞增殖；编码这些肽的基因；以及含有这些肽的药物组合物。
背景技术：
降钙素，一种已知的肽，是含有32个氨基酸的肽激素。在哺乳动物中，其由甲状腺的C细胞分泌且具有降低血液中钙浓度的功能。其已被用作诸如血钙过多和代谢性骨病的治疗剂。现在人们已经认识到降钙素存在于外周系统诸如甲状腺而并非存在于中枢神经系统中。与上述相反，降钙素受体存在于中枢神经系统中。既然是这样，人们期望能揭示降钙素受体在中枢神经系统中的存在以及功能的重要性。
降钙素基因-相关肽(CGRF)是含有37个氨基酸的肽，所述氨基酸是通过如下的方式产生的其mRNA通过可变剪接机制获自与降钙素相同的基因。降钙素基因-相关肽(CGRP)也具有与降钙素相同的功能，即减少血液中的钙浓度。此外，其激活钙离子通道并增加乙酰胆碱受体的数量，表明了其为神经递质的可能性。现在已有报道OGRP主要位于向心感觉神经和中枢神经中(Goodman等，Life Sci.382169-2178(1986)；Poyner，D.R.Pharmac.Ther.5623-51(1992))，且主要具有激活腺苷酸环化酶的作用。已经报道了CGRF的多种功能，包括扩张外周和脑血管(Brain等，Nature31354-5681985))，增加心率(Sigrist等，Endocrinology 119381(1986))，调节钙代谢作用(Grunditz等，Endocrinology 1192313-2324(1986))，导致较少的肠运动(Fargeas等，Peptides 61167-1171(1985))，调节葡萄糖代谢(降低胰岛素分泌和胰岛素敏感性)(Hermansen等，Peg.Peptides 27149-157(1990))，抑制食欲(Molina等，Diabetes 39260-265(1990))以及抑制生长激素的释放(Tannenbaum等，Endocrinology，1162685-2687(1985))。
CGRP受体也已被人们所知位于脑、心血管系统、内皮的和平滑肌细胞中。
同样已报道了关于合成的降钙素受体-结合化合物的发明，所述的化合物的特征在于具有小于大约10,000道尔顿的分子量且形成与放射性强度金属螯合剂共价连接的试剂，其中所述试剂与降钙素受体具有的结合亲合性高于放射性强度天然降钙素与降钙素受体结合亲合性(PCT申请No.2001/523,257的公开的日文译文)；含有嘧啶衍生物的降钙素受体活性物质(未审查的专利申请公开No.2001/294,574)；人降钙素基因-相关肽受体组分因子(OGRP-RCF)(的多核苷酸和多肽未审查的专利申请公开No.10/201,482)，等等。

发明内容
目前仍没有证实这些肽直接作用于中枢神经系统降钙素受体，所以需要直接并且更强烈地作用于中枢神经系统中降钙素受体的肽。
本发明的目的是提供新的并且有用的肽，其在中枢神经系统中表达且作用于降钙素受体，本发明还提供了编码这些肽的基因以及含有所述肽的药物组合物。
本发明的发明人已经通过利用中枢神经系统产生cAMP的能力作为指标研究了新的生理活性肽，且因此分离和纯化的新肽被认为通过降钙素受体作用于细胞。这种肽结构的序列已通过数据库(Genbank，swissprot，DDBJ)检索结果被证实是新的。因为它们作用于降钙素受体，本发明的发明人将该新肽命名为降钙素受体-刺激肽(CRSP)。
因此，本发明涉及至少具有下述氨基酸序列的肽Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly 38或其部分氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有以下特性(1)在中枢神经系统中表达，(2)强烈地作用于降钙素受体以及(3)促进细胞的cAMP生产能力，更优选地，(4)以浓度-信赖的方式结合钠离子，(5)抑制钙离子的吸收，以及(6)抑制细胞增殖。
更具体地，本发明涉及上述的具有序列表SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO9，SEQ ID NO12，SEQ ID NO16或SEQ ID NO19所示氨基酸序列，或具有其中部分氨基酸被缺失，取代或添加的氨基酸序列，以及与所述氨基酸序列具有75％或更高同源性的氨基酸序列的肽。
在另一个实施方案中，本发明的肽包括与降钙素基因-相关的肽CGRP)具有同源性的肽。因此，它们被期望除了CRSP作用之外具有类似于CGRP的生理活性。因此，除了上述(1)到(6)外，本发明的肽也预计具有下述类似于CGRP的特性(7)强烈地作用于降钙素-基因相关肽受体，(8)诱导血管的舒张，(9)利尿，以及(10)改变血管内皮细胞，血管平滑肌和成纤维细胞的增殖能力。
本发明进一步地涉及具有编码上述本发明肽的碱基序列的基因。更具体的，本发明涉及具有序列表中SEQ ID NO3，SEQ ID NO7，SEQ ID NO10，SEQ ID NO13，SEQ ID NO17或SEQ SEQ IDNO20所示，碱基序列的上述基因。
本发明更进一步地涉及含有至少一个上述本发明的肽和药用载体的药物组合物。尤其是，本发明涉及上述的药物组合物，其中药物组合物是用于骨质疏松症的预防/治疗药物，用于癌症的预防/治疗药物，利尿剂，食欲抑制剂，止痛剂，抗高血压药或用于预防PTCA(经皮腔内冠状动脉成形术)后再狭窄的药物。
附图的简要说明

图1图示了本发明CRSP的结构。
图2显示了本发明CRSP(pCRSP)的氨基酸序列与猪降钙素基因-相关肽(pCGRP-I)、人降钙素基因-相关肽I(hCGRP-I)、人降钙素基因-相关肽II(hCGRP-II)、人糊精(hAmylin)、猪降钙素(pCT)和人肾上腺髓质素(hAM)氨基酸序列的比较。
图3为显示在寻找本发明CRSP的表达位点的Northern印迹结果的示图。图3中的箭头显示了CRSP mRNA的位置。
图4显示了利用LLC-PK1细胞，研究本发明的CRSP对cAMP生产率影响的结果。图4中的纵坐标显示了cAMP产生的量(pmol/105细胞/30分钟，而横坐标显示了每一肽浓度的负对数(-log(肽浓度(M))。图4中的实心圆(●)表示本发明的CRSP，空心圆(○)表示猪降钙素基因-相关肽(猪CGRP)且空心菱形(◇)表示猪降钙素(猪CT)。
图5显示了利用LLC-PK1细胞在缺乏5-(N-乙基-N-异丙基)-氨氯吡脒(EIPA)的情况下进行的本发明CRSP与钠离子的结合试验的结果。图5中的纵坐标表示每一离子的结合量(cpm)，而横坐标的左端显示为对照(没有加入的肽)且右边显示为每一浓度的CRSP。符号***表示当p＜0.001时有显著性差异。
图6显示了在EIPA存在下利用LLC-PK1细胞进行的本发明CRSP的钠离子结合的结果。图6中的纵坐标表示每一离子的加入量(cpm)，而横坐标的左端显示为对照(没有加入肽)且右边显示为每一浓度的CRSP和EIPA。符号***表示当p＜0.001时有显著性差异。
图7显示了利用LLC-PK1细胞进行的本发明CRSP的钙离子结合的结果。图7中的纵坐标表示每一离子的加入量(cpm)，横坐标的左端显示为对照(没有加入肽)且右边显示为sCT(鲑鱼降钙素)和CRSP。符号*和**分别表示当p＜0.05和p＜0.01时有显著性差异。
图8显示了LLC-PK1细胞中伴随本发明的CRSP引起的细胞增殖而合成DNA量的测定结果。图8中的纵坐标表示125I-DU(×100cpm/孔)的加入量而横坐标表示每一肽的负对数(-log(肽浓度(M))。图8中的实心圆(●)表示本发明的CRSP，空心圆(○)表示猪降钙素(猪CT)且空心菱形(◇)表示鲑鱼降钙素(鲑鱼CT)。
图9显示了利用计数板测定的在LLC-PK1细胞中通过本发明CRSP引起的细胞增殖产生的细胞数。图9中的纵坐标表示细胞数(×1,000细胞/孔)，横坐标的左端显示为对照(没有加入CRSP)且右边显示为每一浓度的CRSP。符号*表示当p＜0.05时有显著性差异。
图10显示了细胞(COS-7)中通过本发明肽CRSP刺激，测定cAMP生产率的结果，其中降钙素受体以遗传操作的方式表达。附图10中的纵坐标表示cAMP的产量(pmol/孔/30分钟)而横坐标表示每一肽(配体)浓度(M)的负对数(-log(配体浓度(M))。图10的实心圆(●)表示本发明的CRSP且空心菱形(◇)表示猪降钙素(pCT)。
图11显示了负鼠的肾上皮细胞中通过本发明的肽CRSP刺激测定的cAMP生产率的结果，其中猪降钙素受体(CTR)在肾上皮细胞中表达。附图11中的纵坐标表示cAMP的产量(fmol/孔/小时)而横坐标表示CRSP浓度的负对数(-log(CRSP浓度(M))。图11的实心圆(●)表示导入猪降钙素受体(CTR)的负鼠肾上皮细胞的情况，且实心正方形(■)表示负鼠肾上皮细胞(OK细胞)的情况。
图12显示了在负鼠肾上皮细胞中通过本发明的肽CRSP刺激的钠离子结合试验的结果，其中负鼠肾上皮细胞表达猪降钙素受体(CTR)。图12中的纵坐标表示钠离子加入量的比例(其中对照为100)而横坐标表示CRSP浓度的负对数(-log(CESP浓度(M)))。图12中的实心圆(●)表示导入猪降钙素受体(CTR)的负鼠肾上皮细胞的情况且实心正方形(■)表示负鼠肾上皮细胞(OK细胞)的情况。图12中的符号***表示当p＜0.001时有显著性差异。
图13显示了通过将本发明的CRSP施用于大鼠，血液中钙浓度改变的测定结果。图13中的纵坐标表示在血液中的钙浓度(mM)而横坐标表示时间(分钟)。附图13中的符号**表示当p＜0.01时有显著性差异。
图14显示了通过施用本发明的CRSP，大鼠血压变化的测定结果。图14中的纵坐标表示血压(mmHg)而横坐标表示时间(分钟)。
图15显示了通过CRSP或CRSP-Gly刺激细胞产生的cAMP量的放射性强度免疫测定结果，其中猪降钙素受体(CTR)被导入到哺乳动物表达载体pcDNA 3.1中并在恒河猴的肾细胞(COS-7)中表达。纵坐标表示cAMP的产生量(pmol/孔/130分钟)而横坐标表示CRSP浓度的负对数(-log(CRSP浓度(M))。
图16显示了利用LLC-PK1细胞研究由本发明肽猪CRSP、牛CRSP和犬CRSP的cAMP产生-促进活性的结果。纵坐标表示cAMP的产量(pmol/孔/10分钟)而横坐标表示CRSP的负对数。在图16中(■)表示猪CRSP，(●)表示牛CRSP以及(▲)表示犬CRSP。
图17显示了CRSP基因的核苷酸序列。下划线部分表示外显子。在下划线部分下面，显示了由CRSP基因编码的氨基酸序列。
图18显示了CRSP-2基因的核苷酸序列的第一个半部分(从1到3840的碱基)。
图19显示了CRSP-2基因的核苷酸序列的第二个半部分(从3841到7673的碱基)。加下划线部分表示外显子。在下划线部分下面，显示了由CRSP-2基因编码的氨基酸序列。
图20显示了CRSP-2的cDNA核苷酸序列。在图20中，实线包围的区域为成熟肽且灰色的部分表示假定被改变为酰胺的甘氨酸。
图21显示了CRSP-3的cDNA核苷酸序列。在图21中，实线包围的区域为成熟肽且灰色的部分表示假定被改变为酰胺的甘氨酸。
图22显示了CT-2的DNA核苷酸序列。在图22中，实线包围的区域为成熟肽且灰色的部分表示假定被改变为酰胺的甘氨酸。在图22中，位于成熟物质N-末端一侧的谷氨酰胺被推测转化为焦谷氨酸。
图23显示了比较CRSP、CGRP、AM、CT-2和CT的氨基酸的图。
显示了本发明的肽CRSP(pCRSP)、CRSP-2(pCRSP-2)、CRSP-3(pCRSP-3)和CT-2(pCT-2的氨基酸序列与猪降钙素基因-相关肽(pCGRP)、猪降钙素(pCT)和猪肾上腺髓质素(pAM)的氨基酸序列的比较。
图24显示了通过RT-PCR高灵敏度定量测定的CRSP、CRSP-2、CRSP-3、CT-2、CT和CGRP的基因表达量的结果。图表中的纵坐标表示不同的基因而横坐标表示被测定基因表达量的猪的组织。为了校正总的RNA量，也同样测定了GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的表达量。
本发明的最佳实施方式本发明人利用肾上皮细胞的cAMP产生作为指标从猪脑提取物中纯化了两种新的生理活性肽。当分析产生肽的氨基酸序列时，发现它们是一种含有下列38个氨基酸的肽(在下文中，称为CRSP)Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly-NH238和一种(在下文中称为CRSP-G)含有下列39个氨基酸的肽，其中甘氨酸被结合于上述肽的C-末端Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly-Gly-OH 39
当那些肽的氨基酸序列通过数据库(Genbank，swissprot，DDBJ)检索时这两种肽被证实具有新的氨基酸序列。
这些氨基酸序列被分别显示在序列表的SEQ ID NO1和SEQ IDNO2中。
基于产生肽的氨基酸序列制备合成引物并通过PCR利用猪基因作为模板进行扩增由此克隆了目的基因。
基于氨基酸序列，在N-末端一侧所用的引物为TG(C/T)AA(C/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)TG(C/T)ATGAC且在C-末端一侧为CC(A/G)AA(A/C/G/T)AC(C/T)TT(A/G)AA(A/C/G/T)CCCATA。
所得到的基因的碱基序列显示于序列表的SEQ ID NO3中且由此编码的氨基酸序列显示如下。
Met-Gly-Phe-Trp-Lys-Phe-Pro-Pro-Phe-Leu-10Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Val-Leu-Tyr-Gln-Ala-20Gly-Met-Phe-His-Thr-Ala-Pro-Met-Arg-Ser-30Ala-Phe-Gly-Ser-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Thr-40Leu-Ser-Glu-Glu-Glu-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-50Ala-Ala-Met-Val-Asn-Asp-Tyr-Glu-Gln-Met-60Lys-Ala-Arg-Glu-Met-Gln-Lys-Gln-Arg-Ala-70Gln-Gly-Ser-Gly-Ile-Ser-Val-Gln-Lys-Arg-80Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-90Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arq-Ser-Gly-100Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-110Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly-Gly-Arg- 120Arg-Arg-Asn-Phe-Trp-Ile 126
(在该结构式中，加下划线的从第81到第118为CRSP)。
氨基酸序列被显示在序列表中的SEQ ID NO4。
利用猪CRSP cDNA作为探针，从牛和犬甲状腺cDNA的文库制备本发明的肽。
牛CRSP的氨基酸序列用单字母表示如下。
ACNTATCMTHRLAGWLSRSGSMVRSNLLPTKMGFKIFNGP-OH用三字母表示如下。
Ala-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10Arg-Leu-Ala-Gly-Trp-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Ile-Phe-Asn-Gly-Pro-OH 40犬CRSP的氨基酸序列用单字母表示如下。
SCNSATCVAHWLGGLLSRAGSVANTNLLPTSMGFKVYN-OH用三字母表示如下。
Ser-Cys-Asn-Ser-Ala-Thr-Cys-Val-Ala-His-10Trp-Leu-Gly-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Gly-20Ser-Val-Ala-Asn-Thr-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Ser-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Tyr-Asn-OH 38
每一氨基酸序列、核苷酸序列和基因编码的总的氨基酸序列显示于序列表中。
牛的本发明肽的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO6中，其基因的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO7以及基于该基因的肽的氨基酸序列显示于SEQ ID NO8。
犬的本发明肽的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO9中，该基因的核苷酸序列被显示于序列表的SEQ ID NO10以及基于该基因的肽的氨基酸序列显示于SEQ ID NO11。
利用猪CRSP cDNA编码区的全长作为探针，从猪基因组文库制备编码与CRSP具有同源性的肽的基因。基因的产物肽被分别命名为CRSP-2和CRSP-3。
类似地，鉴定了编码与猪降钙素(CT)具有同源性的肽的基因。基因的产物肽被命名为CT-2。
CRSP-2的氨基酸序列用氨基酸的三字母码表示如下。
Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Ser-Cys-Val-Thr-His-10Lys-Met-Thr-Gly-Trp-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Val-Ala-Lys-Asn-Asn-Phe-Met-Pro-Thr-30Asn-Val-Asp-Ser-Lys-Ile-Leu-NH237CRSP-3的氨基酸序列用三字码表示如下。
Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Ile-Cys-Val-Thr-His-10Lys-Met-Ala-Gly-Trp-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20
Ser-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Met-Pro-Ile-30Asn-Met-Gly-Ser-Lys-Val-Leu-NH237CT-2的氨基酸序列用三字码表示如下。
Glu-Cys-Asn-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-10Gly-Thr-Tyr-Thr-Trp-Asp-Val-Asn-Lye-Phe-20Tyr-Ala-Phe-Pro-Leu-Thr-Thr-Thr-Gly-Ile-30Arg-Val-Ser-NH233CRSP-2的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO12中，其cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO13且基于该cDNA的肽(一种前体肽)的氨基酸序列显示于SEQ ID NO14中。CRSP-2基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO15。
CRSP-3的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO16中，其cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO17且基于该cDNA的肽(一种前体肽)的氨基酸序列显示于SEQ ID NO18。
CRSP-2的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO19中，其cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO20且基于该cDNA的肽(一种前体肽)的氨基酸序列显示于SEQ ID NO21。CRSP-3基因和CT-2基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO22。
在图1中，猪CRSP的结构用示意图显示为本发明肽的实例。在这些实例的肽的情况中，第二个Cys和第七个Cys为-S-S-的结合方式。
图2显示了本发明的肽猪CRSP(pCRSP)的氨基酸序列与猪降钙素基因-相关肽(pCGRP-I)、人降钙素基因-相关肽I(hCGRP-I)、人降钙素基因-相关肽II(hCGRP-II)、人糊精(hAmylin)、猪降钙素(pCT)和人肾上腺髓质素(hAM)氨基酸序列的比较。
本发明的CRSP与猪降钙素基因-相关肽(PCGRP)、人CGRP-I和人CGRP-II分别具有71.1％、63.2％和71.1％的同源性。
CRSP、CRGP、AM、CT-2和CT与获自猪的肽的氨基酸比较显示于附图23中。
用于研究CRSP表达位点的Northern印迹结果通过照片作为图显示于附图3中。图3中的箭头表示CRSP mRNA的位置。此外，每一组织中肽的含量利用抗CRSP抗体通过放射免疫测定的方式测定。测定的结果显示于下表1中。
表1通过放射性强度免疫测定的组织中CRSP的浓度


每一值表示平均值±标准误差(n＝3)结果，发现本发明CRSP基因的高水平表达存在于中枢神经系统中，诸如中脑和下丘脑，以及在外围系统诸如甲状腺中。中度表达在桥脑/延髓中被检测到。仅仅少量的表达被检测存在于大脑和垂体中。另一方面，组织中CRSP的浓度在垂体后叶和甲状腺中是最丰富的，且在中脑、下丘脑和垂体前叶中也是高含量的。
然后研究CRSP的生物活性。
首先，CRSP的cAMP生产能力利用LLC-PK1细胞进行研究。
将溶于DMEM的CRSP加至LLC-PK1细胞的培养基中并利用cAMP-特异性抗体通过放射免疫测定测定cAMP的分泌量。结果显示于图4中。图4中的纵坐标表示cAMP的产量(pmol/105细胞/30分钟)而横坐标表示每一肽浓度的负对数(-log(肽浓度(M))。图8中的实心圆(●)表示本发明的CRSP，空心圆(○)表示猪降钙素基因-相关肽(猪CT)且空心菱形(◇)表示猪降钙素(猪CT)。结果，本发明的CRSP以浓度-依赖的方式非常强烈地增加了获自猪肾上皮细胞的LLC-PK1细胞的胞内腺苷酸环化酶活性(ED50为大约1.5nM)。其活性比猪降钙素(ED50大约8.7nM)和猪CGRP(ED50大约62nM)分别强大约6倍和大约40倍。
然后，研究本发明CRSP促进钠离子和钙离子结合的功能。
用Hanks氯化胆碱溶液代替LLC-PK1细胞的培养液，在其中加入具有预先确定放射性强度(22Na)的CRSP和氯化钠使得各终浓度为0M、10-8M、10-7M和10-6M，10分钟后洗涤细胞来完全地除去细胞外溶液中的22Na并通过γ-计量器测定结合到细胞的放射性强度。类似地，LLC-PK1细胞的培养液用Hanks氯化胆碱溶液代替，加入具有预测定的放射性强度(22Na)的氯化钠以及CRSP和阿米洛利衍生物(5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利)(EIPA)使得终浓度分别为0M CRSP+0MEIPA，10-6M CRSP+0M EIPA，10-6M CRSP+10-8M EIPA，10-6MCRSP+10-7M EIPA，10-6M CRSP+10-6M EIPA以及0M CRSP+10-6MEIPA，其中的阿米洛利衍生物(5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利)是Na/H共-转运系统的抑制剂。10分钟后冲洗细胞使得细胞外溶液中含有的22Na被完全去除且通过γ-计数器测定掺入细胞的放射性强度。
结果显示于附图5(在缺乏EIPA的情况下掺入钠离子)，附图6(在EIPA存在下掺入钠离子)以及附图7(掺入钙离子)。图5、图6和图7中的纵轴表示每一离子的加入量(cpm)，而横坐标的左端表示对照(没有肽加入)；且右边表示每一浓度的CRSP。图6横坐标的对照的右边表示CRSP单独给药的情况，其右侧表示CRSP与EIPA共同给药的各浓度且右端表示EIPA单独给药的情况。图7中的sCT表示鲑鱼降钙素。在图5、图6和图7中，标记*、**和***分别表示当p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001时有显著的差异。
结果，人们发现CRSP激活LLC-PK1细胞上的阿米洛利-敏感的Na/H共-转运系统，因此促进了钠吸收到细胞中并且抑制钙吸收到细胞中。
然后研究CRSP对于细胞增殖的抑制作用。
各种浓度的每种肽的DMEM溶液添加于LLC-PK1细胞中，然后将含有用125I(125I-DU)标记的溴脱氧尿苷的DMEM(含有0.1％BSA)添加到各孔中，5小时后，通过γ-测量器测定结合到核中的放射性强度来测定作为细胞增殖结果的DNA合成的量。结果显示于图8中。图8中的纵坐标表示125I-DU(×100cpm/孔)的加入量而横坐标表示每一种肽的负对数(-log(肽浓度(M)))。图8中的实心圆(●)表示本发明的CRSP，空心圆(○)表示猪降钙素(猪CT)且空心菱形(◇)表示鲑鱼降钙素(鲑鱼CT)。
根据增殖细胞的数目，各种浓度的CRSP的DMEM溶液被添加给10000细胞/孔的LLC-PK1细胞，进行温育，通过胰蛋白酶-EDTA溶液取出在温育平皿上的细胞并利用计数板进行细胞计数。结果显示于图9中。图9中的纵坐标表示细胞数(×1,000细胞/孔)，而横坐标的左端表示对照(没有加入CRSP)且右边显示为每一浓度的CRSP。符号*表示当p＜0.05时有显著性差异。
结果，人们发现CRSP具有抑制LLC-PK1细胞生长的作用。
研究了本发明CRSP对降钙素受体的作用。
猪降钙素受体(CTR)被导入到哺乳动物表达载体pcDNA 3.1中，在恒河猴肾细胞(COS-7)中表达并利用放射免疫测定法测定通过CRSP刺激产生的cAMP量。类似地，在负鼠肾细胞(OK细胞)中表达CTR并利用放射免疫测定法测定通过CRSP刺激产生的cAMP量，同时通过通过γ-测量器测定具有放射性强度的氯化钠(22Na)的掺入来测定钠离子的吸收。结果显示于图10中(细胞(COS-7)中通过CRSP刺激的cAMP生产率的变化，在所述细胞(COS-7)中以遗传操作的方式表达降钙素受体)，图11(负鼠肾上皮细胞中cAMP生产率的改变，在所述负鼠肾上皮细胞中表达猪降钙素受体(CTP))以及图12(负鼠肾上皮细胞中那里子吸收的改变，在所述负鼠肾上皮细胞中表达猪降钙素受体(CTP))。
图10中的纵坐标表示cAMP的产生量(pmol/孔/30分钟)而横坐标表示每一肽(配体)浓度的负对数(-log(配体浓度(M))。图10的实心圆(●)表示本发明的CRSP且空心菱形(◇)表示猪降钙素(pCT)。图11中的纵坐标表示cAMP的产生量(fmol/孔/小时)而横坐标表示CRSP浓度的负对数(-log(CRSP浓度(M)。图11的实心圆(●)表示导入猪降钙素受体(CTR)的负鼠肾上皮细胞的情况且实心正方形(■)表示负鼠科肾上皮细胞(OK细胞)的情况。图12中的纵坐标表示钠离子加入量的比例(其中对照为100)而横坐标表示CRSP浓度的负对数(-log(CESP浓度(M))。图12中的实心圆(●)表示导入猪降钙素受体-CTR)的负鼠肾上皮细胞的情况且实心正方形(■)表示负鼠肾上皮细胞(OK细胞)的情况。图12中的符号***表示当p＜0.001时有显著性差异。
结果，人们注意到，当CTR在COS-7中表达并通过CRSP刺激时，胞内的腺苷酸环化酶活性增加(ED50大约0.2nM)。活性比猪降钙素(ED50大约71nM)高大约350倍。CRSP的这种作用比猪降钙素高大约350倍且在已知的生理活性肽中是最强的。类似地，人们注意到，当CTR在负鼠肾上皮细胞(OK细胞)中表达并通过CRSP进行刺激时，胞内的腺苷酸环化酶活性增加，且同时激活了阿米洛利-敏感的Na/H共转运系统由此促进了钠吸收到细胞中。
也研究了由CRSP导致的大鼠血压以及血浆中离子浓度的变化。
将16nmol/kg的溶于生理盐溶液的CRSP在麻醉的情况下较短的时间内从颈静脉施用于大鼠并测定血浆中的钙浓度以及血压。结果显示于图13(通过施用CRSP导致的血液中钙浓度的变化)以及图14(通过施用CRSP导致的血压的变化)中。图13中的纵坐标表示血液中钙浓度且横坐标表示时间(分钟)。图14中的纵坐标表示血压(mmHg)且横坐标表示时间(分钟)。图13中的符号**表示当p＜0.01时有显著性差异。
结果，人们注意到，当施用CRSP时，血浆中钙浓度瞬时降低而血压没有明显的变化。
然后，研究由CRSP和CRSP-Gly导致的cAMP产生-促进活性的差异。
猪降钙素受体(CTR)被导入到哺乳动物表达载体pcDNA 3.1中然后在恒河猴肾细胞(COS-7)中表达，利用放射免疫测定法测定由CRSP刺激产生的cAMP量。结果显示于图15中。
结果，人们注意到CRSP和CRSP-Gly具有几乎相同的cAMP生产率。
进一步地，根据在母牛和狗中鉴定的本发明的肽(牛CRSP和狗CRSP)，通过与上述相同的方法利用LLC-PK1细胞研究CRSP产生cAMP的活性。结果显示于图16中。图16中的纵坐标表示cAMP的产量(pmol/孔/10分钟)而横坐标表示加入CRSP的浓度。
结果，人们发现牛和狗CRSP获得了与猪CRSP相同的结果。
利用RT-PCR进行的高灵敏度定量测定，确定了本发明的各种肽，CRSP、CRSP-2、CRSP-3、CT-2、CTCGRP和GAPDH的基因表达量。结果显示于图24中。
中枢神经系统，甲状腺和卵巢中观察到CRSP-2和CRSP-3的表达。相反地，在任何没有观察到表达的组织中CT-2条带没有扩增。推测CT-2仅仅在除显示于图24的组织之外的其它区域表达。
如上所述，人们注意到本发明的肽以比降钙素更强的方式刺激降钙素受体，据此腺苷酸环化酶通过本发明的肽被激活。上述表明本发明的肽是降钙素受体的天然内源性配体。
因此，本发明的肽被认为作用于外围组织中的降钙素受体并激发起下面的药效。
降钙素通过作为降钙素的受体的降钙素受体促进钙吸收到骨中。可以推断，类似于降钙素，本发明的肽作用于降钙素受体并促进钙吸收到骨中。事实上，如图13所示，通过将肽施用于大鼠，在血浆中检测到钙浓度的下降。可以推断该结果支持了促进钙吸收到骨中。通过利用这种作用，所述肽适用于作为恢复由于骨质疏松症而降低的骨密度到健康状态的药物，并可被用作骨质疏松症的预防和治疗药物。
此外，如图13所示，本发明的肽具有降低血浆中钙浓度的活性，由此其可适于作为将碱中毒等引起的血钙过多症中血浆钙浓度降低到正常水平，且可被用作血钙过多症的治疗和预防药物。
本发明的肽激活肾上皮细胞的阿米洛利-敏感的Na/H共-转运系统的作用。也就是说与维持钾的利尿剂药物阿米洛利活性相反，本发明的肽可用作抗利尿剂药物。
如图8和图9所示，本发明的肽通过降钙素受体强烈地抑制肾上皮细胞的生长。已有报道称降钙素通过降钙素受体强烈地抑制腺癌细胞等的生长(Cancer Res.1985，45，4890-4894以及其它)。因此，人们期望本发明的肽能类似地通过降钙素受体以比降钙素更强烈的方式抑制癌细胞的生长且希望它们能够被用作治疗和预防癌症的药物。
在中枢神经系统中检测到大量的本发明的肽。已知降钙素在现有技术中作为激动剂，在中枢神经系统中没有检测到其表达而降钙素受体在中枢神经系统中表达，此事实表明本发明的肽是中枢神经系统中的天然内源性配体。已经有报道，当降钙素被施用于脑室中时，产生了食欲抑制和止痛的作用。因为降钙素在脑中不表达，可以确证本发明的肽在脑中具有这样的作用。
因此，认为本发明的肽作用于中枢神经系统中的降钙素受体并引发下列药效。
已经报道降钙素作用于中枢神经系统抑制食欲(Science 1979，206，850-852；The Bone 1992，6，69-74；等)。本发明的肽，可以比降钙素更强烈地激活降钙素受体，其非常可能引起强烈的食欲-抑制作用。本发明的肽，通过给药的方式，可被用作肥胖症以及由此引起的疾病(诸如高血压和高血脂)的治疗和预防药物。
进一步地报道认为降钙素制剂显示出对由于癌扩散，骨质疏松症等引起的骨疼痛以及偏头痛和胰腺炎等疼痛的止痛作用。(Am.J，Med.Sci.1997，313，13-16；等)。比降钙素更强烈地激活降钙素受体的本发明的肽非常可能具有和降钙素一样强烈的止痛作用且它们可以有效地用作镇痛药。
本发明的肽具有下述特性(1)在中枢神经系统中表达，(2)强烈地作用于降钙素受体，(3)促进细胞的cAMP生产活性，且所涉及的肽至少具有下列的氨基酸序列Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10
Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly 38或其中缺失、取代或增加部分氨基酸的氨基酸序列。如果本发明的肽含有上述氨基酸序列，则包括酰胺衍生物、酯衍生物和各氨基酸的侧链官能团的衍生物，诸如赖氨酸的氨基和丝氨酸的羟基。更优选地，本发明的肽具有下列特性(4)以浓度-依赖的方式吸收钠离子，(5)抑制钙离子的吸收，(6)抑制细胞增殖。
本发明的肽不局限于上述的氨基酸序列，只需具有上述(1)到(3)的特性或，优选地，(1)到(6)的特性，且它们可以是氨基酸序列中部分氨基酸缺失、取代和/或添加的肽。这种氨基酸序列虽然不局限于但优选地具有50％或更高同源性，更优选地可以为75％或更高，80％或更高，更优选地最好为具有85％或更高的同源性。此外，本发明的优选肽包括那些与降钙素或降钙素基因-相关肽具有50％或更高，优选地60％或更高同源性的氨基酸序列的肽。
在上述实例中，已描述了本发明来源于猪的CRSPs，然而本发明的肽不局限于那些来源于猪的肽而是包括来源于哺乳动物诸如人，大鼠，狗和牛以及鱼诸如鲑鱼等的肽。
本发明的肽可通过诸如提取的方式由天然产物分离或纯化而来，或可通过常用的肽合成方法的合成。进一步地可通过基因重组技术来产生肽，其中将本发明的基因导入到合适的载体中，且利用原核细胞或真核细胞作为宿主。
本发明的药物组合物含有本发明的肽和药用载体。本发明的药物组合物可通过口服或非肠道给药，且优选地通过诸如静脉注射和肌内注射的方式进行非肠道给药。
本发明的药物组合物可制备成制剂诸如注射剂，冷冻干燥制剂和用于直肠给药的制剂。也可被制备成外用制剂诸如粘合剂，膏剂和贴膏。进一步地可被制备成诸如舌下片剂。可通过肽制剂的常规方法制备制剂。
本发明的药物组合物可与除了本发明肽之外的其它有效成份一起使用。本发明的药物组合物的施用剂量，通常在1μg/kg体重到1,000mg/kg体重的范围内，优选地本发明的肽的每日剂量为从0.1mg/kg到500mg/kg体重，然而，可依据患者的特性和基础病而有所改变。因为本发明的肽比降钙素更强烈地作用于降钙素受体，其可以以和常规的降钙素制剂相同的方式应用于疾病。
由于本发明的肽还包括与基因-相关肽(CGRP)具有同一性的肽，其不但可应用于上述目的而且可以利用其类似于CGRP的生理活性。
CGRP已知的生理活性包括诸如强烈地作用于CGRP受体和促进细胞中cAMP的产生。也已经报道CGRP诱导血管的舒张(ReguI.Pept.1986，15，1-23；等等)，促进利尿(Proc.Soc.Exp.BioI.Med.1998，188，316-322；等等)以及改变血管内皮细胞以及细胞诸如血管平滑肌和成纤维细胞的细胞增殖活性(Proc.NAT1.Acad.Sci.USA 1990，87，3299-3303；Regul.Pept.2001，101，169-178；等)。
因此，本发明的某些肽，尤其是与CGRP具有高度同源性的那些肽，预期具有下列功能(1)在中枢神经系统中表达，(2)强烈地作用于降钙素受体，(3)促进细胞的cAMP产生活性，(4)浓度-依赖性吸收钠离子，(5)抑制钙离子的吸收，和(6)抑制细胞增殖。除了上述外，本发明的肽也预期具有下述类似于CGRP的特性诸如(7)强烈地作用于降钙素-相关的肽受体，(8)诱导血管的舒张，(9)促进利尿，以及(10)改变血管内皮细胞，血管平滑肌和成纤维细胞的增殖活性，不过并非所有本发明的肽都具有(7)到(10)的功能。
根据CGRP具有的功能，含有本发明肽的药物组合物可作为制剂用于除上述用途之外的下述目的。即，其可被用作诸如直接利用血管舒张功能的降血压剂，通过中枢和周围神经系统利用血管舒张功能的降血压剂，利尿剂，以及利用抑制血管平滑肌增生功能用于PTCA(经皮腔内冠状动脉成形术)后再狭窄的预防剂。
同时，日本专利申请2002/162,797说明书中公开的内容在此处引入作为参考。
实施例本发明将通过下列实施例的方式进行更具体地说明，虽然本发明不受这些实施例的限制。
实施例1(CRSP肽的提取和分离)将猪脑(20kg)在4倍量的水中煮沸10分钟，冷却以及添加乙酸并搅匀使其终浓度为1M，通过离心除去不溶物质来制备猪脑提取物。通过超滤(Pericon Cassette PLAC#000-05，Millipore生产)进行脱盐和浓缩，并在用冰冷却的条件下脱盐后逐渐添加丙酮到提取物中使得终浓度为66％。通过离心分离去除沉淀物，利用蒸发器除去上清液中的丙酮并用反相柱(LC-SORB SPW-C-ODS；Chemc；1.51)吸附残余物。用3倍量的0.5M乙酸冲洗柱后，用3倍量的洗脱缓冲液(水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1)洗脱肽组分。利用蒸发器从洗脱物中除去乙腈然后进行冷冻干燥。
对冷冻干燥的样品进行称重，溶于1M乙酸，通过用阳离子交换树脂(SP-Sephadex，Pharmacia，3×28cm)填充的空心柱吸附，并直接流过分馏为级分(SP-I)，用2M吡啶(pH8.0)洗脱得到级分(SP-II)以及用2M吡啶-乙酸(pH值5.0)洗脱得到级分(SP-III)来制备SP-III强离子级分。冷冻干燥级分，溶于1M乙酸中并通过凝胶过滤(Sephadex G-50，Pharmacia，7.5×145cm，1M乙酸，流速100ml/小时)分馏为相应分子量的级分，收集对应于1kDa到5kDa分子量的部分。其再次进行凝胶过滤(Sephadex G-25，Pharmacia，7.5×145cm，1M乙酸，流速100ml/小时)来分离相应分子量的级分，且收集从2kDa到4kDa分子量的部分并进行冷冻干燥。
利用离子交换层析(CM52，Whatman，2.4×45cm；溶液A10mM甲酸铵(pH6.5)∶乙腈＝9∶1；溶液B1M甲酸铵(pH6.5)∶乙腈＝9∶1；流速35ml/小时)由10mM到0.5M的甲酸铵对冷冻干燥样品进行浓度-梯度洗脱。
然后冷冻干燥1/1000的各级分，通过溶入冷冻干燥样品的DMEM培养基(DMEM，含有0.05％的牛血清白蛋白(BSA))刺激LLC-PK1(获自猪肾脏的上皮细胞)，在37℃温育1小时并通过放射免疫测定法测定分泌到培养基中的cAMP的量。
方法如下。由此，将4％的相同量的二氧杂环乙烷-三乙胺(二氧杂环乙烷∶三乙胺＝4∶1)的混合溶液溶于琥珀酸酐，添加到含有未知量cAMP的100μl培养基中以及含有已知量cAMP的培养基中，混合物在室温中静置30分钟使得cAMP被琥珀酰化并利用离心蒸发器蒸干，残余物溶于1ml的缓冲液置(50mM乙酸钠(pH6.2)，1mM EDTA，0.025％的叠氮化钠，0.5％血清白蛋白和0.01％的Triton×-100)中，分别取100μl到试管中且向每50μl中加入放射性标记的琥珀酰化cAMP和抗体，然后在4℃静置48小时。然后，加入100μl的1％γ-球蛋白和500μl的25％的聚乙二醇，充分混合混合物并离心，通过γ-测量器测定沉淀物的放射性强度并与根据已知浓度cAMP制作的标准曲线的放射性强度进行比较，由此测得cAMP的量。
利用阳离子交换HPLC(TSK-gel CM-2SW，Tosoh，7.8×300mm；溶液A10mM甲酸铵(pH3.8)∶乙腈＝9∶1；溶液B1M甲酸铵(pH3.8)∶乙腈＝9∶1；流速2ml/min)对其中观察到cAMP量增加的级分(大约0.3M甲酸铵(pH6.5))进行甲酸铵浓度-梯度洗脱。同样地，取出1/1000量活性已被测定的各组分，通过利用反相HPLC(C18218TP54，Vydac，4.6×250mm；溶液A水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；溶液B水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1，流速1ml/分钟)对已观察活性的级分(大约0.36M的甲酸铵(pH3.8))进一步进行乙腈浓度-梯度洗脱，收集具有活性的级分(大约32％的乙腈)。通过反相HPLC(联苯219TP5215，Vydac，2.1×150mm；溶液A水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；溶液B水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1；流速0.2ml/min)再次分离制备最终的纯样品(大约29％的乙腈)。
制备肽(大约50pmol)。这种肽的分子量为4,099且理论上的等电点被计算为12.81。此外，如上所述所述肽具有能在Vydac的C18柱(4.6×250mm，218TP54)中用大约32％浓度的乙腈在0.1％三氟乙酸存在的情况下洗脱的疏水性。
实施例2(CRSP氨基酸序列的测定)通过Edman方法利用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列。首先，通过氨基酸测序仪分析5pmol的纯样品的N-末端，结果如下。
Ser-Xaa-Asn-Thr-Ala-Thr-Xaa-Met-Thr-His-Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Ser-Met-Val之后，对10pmol的纯样品进行胰蛋白酶降解并利用反相HPLC(C18218TP5215，Vydac，2.1×150mm；溶液A水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；溶液B水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60流速0.2ml/分钟)进行乙腈浓度-梯度洗脱。通过氨基酸测序仪分析产生的峰，能够获得下列的六个序列。
Ser-Xaa-Asn-Thr-Ala-Thr-Xaa-Met-Thr-His-Arg，
Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg，Ser-Gly-Ser-Met-Val-Arg，Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-Lys，Met-Gly-Phe-Lys以及Val-Phe根据这些序列与数据库比较的结果，断定本发明的肽与降钙素基因-相关肽具有同源性且具有下列序列。
Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-NH2与此同时，利用质谱仪测定其分子量且结果为4,130.6±0.7Da。此结果与从氨基酸序列推测的4,042Da有大约89Da的差异，但该差异被推测是由于两个甲硫氨酸的氧化(2×16Da)和C-末端甘氨酸的存在(57Da)，它们不能被氨基酸测序仪测得。最后，从下面的实施例3，可发现与这些推测相吻合。
Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly-NH2(在第二半胱氨酸和第七半胱氨酸之间形成了一个二硫键)CRSP的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO1中而CRSP-Gly的氨基酸序列显示于SEQ ID NO2中。
实施例3(互补DNA碱基序列和前体氨基酸序列)通过基于实施例2的氨基酸序列利用N-末端侧的(TG(C/T)AA(C/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)TG(C/T)ATGAC)和C-末端侧的(CC(A/G)AA(A/C/G/T)AC(C/T)TT(A/G)AA(A/C/G/T)CCCATA)形成合成引物并通过利用猪基因作为模板进行PCR扩增来制备探针。
利用Pharmacia的Time Saver cDNA制备试剂盒和Stratagene的λZAPII由猪下丘脑mRNA(3μg)制备互补DNAλ噬菌体文库。筛选方法如下。因此，大肠杆菌被侵染λ噬菌体(具有大约100,000个独立的克隆)，与含有LB培养基的0.7％琼脂糖混合，涂布在含有LB培养基的1.5％琼脂培养基的培养皿上，并在37℃温育大约8小时。在冰箱中冷却大约2个小时后，由此成形的噬菌斑被转到碱性(用0.5M氢氧化钠和1.5M氯化钠溶液处理2分钟；用0.5M Tris-盐酸(pH7.5)和1.5M的氯化钠溶液处理2分钟；以及用45mM柠檬酸钠(pH7.0)和450mM氯化钠溶液处理5分钟)的的尼龙滤膜上然后在80℃干燥滤膜2小时。然后，干燥滤膜在预杂交液(50％的甲酰胺，0.09M的柠檬酸钠(pH7.0)，0.9M的氯化钠，0.5％的牛血清白蛋白，0.5％的Ficoll，0.5％的聚乙烯吡咯烷酮和0.5％的十二烷基硫酸钠)中37℃浸渍两小时，加入用32p标记的探针且混合物于42℃杂交16小时。滤膜用洗涤液(30mM柠檬酸钠的水溶液(PH7.0)，300mM的氯化钠和0.1％的十二烷基硫酸钠在室温下5分钟洗涤两次并用3mM的柠檬酸钠(pH7.0)，30mM的氯化钠和0.1％的十二烷基硫酸钠水溶液在65℃1小时洗涤两次)冲洗后，暴露于X-光胶片，用放射性射线感光的区域与培养皿上的噬菌斑相比较并从噬菌斑分离阳性克隆。
利用Stratagene的辅助噬菌体R408将分离的阳性λ噬菌体克隆转化到适合于DNA测序的载体-质粒pBluescript，且通过Sanger法测定核苷酸序列。
测定的碱基序列显示于序列表的SEQ ID NO3中而其氨基酸序列显示于SEQ ID NO4中。
产生的CRSP与猪降钙素(CT)基因-相关肽(CGRP)、人CGRP-I和人CGRP-II的氨基酸序列分别具有71.1％、63.2％和71.1％的同源性(参见图2)。
实施例4(表达位点)通过用酸性胍，苯酚和氯仿提取的方式制备基因表达量的RNA。大约1g的猪组织与5ml的变性溶液(4M硫氰酸胍，25mM的柠檬酸钠(pH7.0)，0.1M的2-巯基乙醇和0.5％肌氨酸钠)匀浆化，与1/10量的2M乙酸钠，等量的水饱和的苯酚和1/5量的氯仿一起充分搅拌且混合物进行离心分离。然后，分离水层，加入相同量的2-丙醇并充分搅拌混合物，-20℃保持静置1小时并离心来回收沉淀物(RNA)。利用甲醛-琼脂糖改性的凝胶(1％的琼脂糖，2.2M的甲醛，20mM的Mops(pH7)，8mM的乙酸钠和1mM的EDTA)对30μg的这种RNA进行电泳，电泳后用水充分冲洗凝胶来除去甲醛然后用0.05M的氢氧化钠处理15分钟，用0.3M柠檬酸钠(pH7)和3M氯化钠溶液处理45分钟。然后，通过毛细管印迹法将含于凝胶中的RNA转入尼龙滤膜，并将转录的RNA的滤膜在80℃干燥。然后，滤膜浸渍在Ambion的ULTRAhyb杂交液中37℃2小时，加入用32P标记的探针，编码CRSP(cDNA上第346到第488之间的碱基对)并且在42℃进行16小时的杂交。杂交后，用洗涤液(用30mM的柠檬酸钠(pH7.0)，300mM的氯化钠和0.1％的十二烷基硫酸钠的溶液在室温下5分钟两次，用1.5mM柠檬酸钠(pH7.0)，15mM氯化钠以及0.1％十二烷基硫酸钠的水溶液在65℃1小时两次)冲洗滤膜，然后于X-胶片上曝光，定量测定其上的RNA。
结果显示在图3中。
实施例5(表达量的测定)通过放射免疫测定法利用制备的该合成肽的抗体测定各组织中的肽的量。用10倍量的水煮沸该组织(大约1g)并用冰冷却，加入乙酸将其制成1M，进行匀浆化作用并通过离心分离除去不溶物质来制备提取物。提取物被冷冻干燥并溶于缓冲液(50mM的磷酸钠(pH7.4)，80mM的氯化钠，25mM的EDTA，0.5％的TritonX-100，0.5％的牛血清白蛋白和0.05％的叠氮化钠)中并各取出100μl于试管中。在这种含有CRSP的缓冲液和已知CRSP浓度的缓冲液中加入相同量的放射性标记的CRSP和抗体，搅拌混合物并于4℃静置48小时，加入100μl的γ-球蛋白和500μl的23％聚乙二醇，充分混合混合物并离心并将沉淀物的放射性强度与标准溶液的放射性强度比较，标准溶液由其中CRSP的量已被测定的已知浓度的CRSP来制备。
结果显示在上述表1中。
实施例6(CPSP对于LLC-PK1细胞中cAMP产生的促进作用)LLC-PK1细胞温育在培养基(DMEM，含有10％的胎牛血清(FCS))中，两天后用溶于含有0.05％牛血清蛋白的DMEM中的CRSP替换细胞培养基，温育细胞30分钟，回收培养基并通过放射免疫测定法利用cAMP-特异性抗体测定分泌的cAMP的量。
结果显示于图4中。
实施例7(在CRSP存在下对LC-PK1中细胞的钠离子和钙离子吸收的作用)在六孔培养皿上，LLC-PK1细胞在DMEM(含有10％FCS)中温育两天。钠离子吸收的测定如下。
LLC-PK1细胞的温育溶液用Hanks氯化胆碱溶液，具有已预测定放射性强度量的氯化钠(22Na)替换，并加入CRSP使得最终浓度分别为0M，10-8M，10-7M和10-6M，10分钟后洗涤细胞来完全地除去细胞外溶液中的22Na并通过γ-测量器测定细胞中的放射性强度。类似地，LLC-PK1的温育溶液用Hanks氯化胆碱溶液，具有预测定放射性强度的氯化钠(22Na)替换并加入各CRSP和作为Na/H共-转运系统抑制剂的阿米洛利衍生物(5-(N-乙基N-异丙基)-阿米洛利)(EIPA)使得终浓度为0M CRSP+0M EIPA，10-6M CRSP+0M EIPA，10-6M CRSP+10-8MEIPA，10-6M CRSP+10-7M EIPA，10-6M CRSP+10-6M EIPA和0MCRSP+10-6M EIPA，10分钟后冲洗细胞来完全地除去细胞外溶液中含有的22Na，并通过γ-测量器测定细胞中的放射性强度。
不存在EIPA的结果显示于图5中而存在EIPA的结果显示于图6中。
钙离子吸收的测定如下。因此，LLC-PK1细胞用Hanks溶液(不含钙的Hanks溶液)洗涤其中氯化钙的浓度被降低到0mM。氯化钙(45Ca)被添加到细胞上不含钙的Hanks溶液和CRSP中，10分钟后冲洗细胞来完全洗掉细胞外溶液中的45Ca并通过液体闪烁计数器测定细胞中的放射性强度。
结果显示于图7中。
实施例8(通过CRSP抑制细胞增殖)LLC-PK1细胞在24-孔胶原平板上的DMEM(含有10％FCS)中温育两天，用DMEM冲洗一次并用含有0和10-12到10-6M的CRSP的DMEM(含有10％FCS)替换然后进行温育。两个小时后，将含有125I-标记的溴脱氧尿苷的DMEM(含有0.1％的BSA)加至各孔中，5个小时后，通过γ-测量器测定核中掺入的放射性强度，由此测得细胞增殖后合成的DNA的量。
结果显示于图8中。
类似地，10000细胞/孔的LLC-PK1细胞被涂布在24-孔胶原平板上并用DMEM(含有10％FCS)温育24小时。用DMEM冲洗各孔一次，用含有0M，10-8M和10-6M浓度的CRSP的DMEM(含有10％FCS)替换该培养基并进行温育。24小时后，用胰蛋白酶-EDTA溶液剥离培养皿中的细胞并通过计数板进行细胞计数。
结果显示于图9中。
实施例9(CRSP对降钙素受体的作用)猪降钙素受体(CTR)被导入到哺乳动物表达载体pcDNA 3.1中并在恒河猴肾细胞(COS-7)中表达，并利用放射免疫测定法测定由CRSP刺激产生的cAMP量。
结果显示于图10中。
类似地，在负鼠肾细胞(OK细胞)中表达CTR并利用放射免疫测定法测定由CRSP刺激产生的cAMP量，同时通过掺入放射性氯化钠(22Na)利用γ-测量器测定钠离子的吸收。
结果分别显示于图11和图12中。
实施例10(由CRSP引起的大鼠血压和血浆中离子浓度的改变)溶于生理盐溶液中的相当于16nmol/kg的CRSP在短时间内从大鼠的颈动脉在麻醉条件下进行给药。
结果显示于图13和图14中。
实施例11(CRSP-Gly肽的提取和分离)猪脑(20公斤)在4倍量的水中煮沸10分钟，冷却并添加乙酸匀浆化使得终浓度为1M以及通过离心除去不溶物质来制备猪脑提取物。通过超滤(Pericon Cassette PLAC#000-05，Miliipore生产)的方式脱盐和浓缩，在用冰冷却的条件下脱盐后逐步添加丙酮到提取物中终浓度为66％。通过离心分离除去沉淀物，利用蒸发器除去上清液中的丙酮并用反相柱(LC-SORR SPW-C-ODS；Chemco；1.51)吸附残余物。用3倍量的0.5M乙酸冲洗柱后，用3倍量的洗脱缓冲液(水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1)洗脱肽级分。利用蒸发器除去洗脱物中的乙腈，然后冷冻干燥。称重冷冻干燥样品，溶于1M乙酸，用填充阳离子交换树脂(SP-Sephadex，Pharmacia，3×28cm)的空心柱吸附，并直接流过分馏为级分(SP-I)，用2M吡啶(pH8.0)洗脱得到级分(SP-II)以及用2M吡啶-乙酸(pH5.0)洗脱得到级分(SP-III)来制备SP-III强离子级分。冷冻干燥组分，溶于1M乙酸中并通过凝胶过滤(SephadexG-50，Pharmacia，7.5×145cm，1M乙酸，流速100ml/小时)的方式分馏为各分子量所对应的级分，收集其中的1kDa到5kDa分子量所对应的部分。再次进行凝胶过滤(Sephadex G-25，Pharmacia，7.5×145cm，1M乙酸，流速100ml/小时)来分离各分子量所对应的级分并收集其中从2kDa到4kDa分子量所对应的部分并冷冻干燥。
通过离子交换层析(CM52，Whatman，2.4×45cm；溶液A10mM甲酸铵(pH6.5)∶乙腈＝9∶1；溶液B1M甲酸铵(pH6.5)∶乙腈＝9∶1；流速35ml/小时)利用10mM到0.5M甲酸铵对冷冻干燥样品进行浓度-梯度洗脱。
然后冷冻干燥1/1000量的各组分，通过培养基刺激LLC-PK1(获自猪肾脏的上皮细胞)，其中冷冻干燥样品溶于DMEM(含有0.05％牛血清白蛋白)，37℃温育1小时并通过放射免疫测定法测定培养基中cAMP的分泌量。
方法如下。因此，溶于琥珀酸酐使得浓度为4％的相等量的二氧化杂环己烷-三乙胺(二氧杂环己烷∶三乙胺＝4∶1)的混合溶液添加到含有未知量cAMP和含有已知量cAMP的100μl培养基中，混合物在室温下静置30分钟使得cAMP琥珀酰化并利用离心蒸发器蒸干，残余物溶于1ml的缓冲液(50mM的乙酸钠(pH6.2)，1mM EDTA，0.025％叠氮化钠，0.5％血清白蛋白和0.01％的Triton X-100)中，各取出100μl至试管中并且将放射性标记的琥珀酰化cAMP和抗体分别添加到50μl中，然后4℃静置48个小时。然后，加入100μl的1％γ-球蛋白和500μl的25％聚乙二醇，充分混合混合物并离心，利用γ-测量器测定沉淀物的放射性强度并与通过已知浓度的cAMP制备的标准曲线的放射性强度进行比较由此测定cAMP的量。
由CRSP-Gly所引起cAMP产量增加在由约0.27M的甲酸铵(pH6.5)洗脱的级分中观察到。利用阳离子交换HPLC(TSK-gel CM-2SW，Tosoh，7.8×300mm；溶液A10mM甲酸铵(pH3.8)∶乙腈＝9∶1；溶液B1M甲酸铵(pH3.8)∶乙腈＝9∶1；流速2ml/分钟)进行进一步地甲酸铵浓度-梯度洗脱。再一次，取出活性已测定的1/1000量的各级分，已观察到活性的级分(用大约0.36M的甲酸铵(pH3.8))通过反相HPLC(C18218TP54，Vydac，46×250mm，A溶液水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；B溶液水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1；流速1ml/分钟)由乙腈进一步进行浓度-梯度洗脱并收集具有活性的级分(大约32％乙腈)。通过反相HPLC(联苯219TP5215，Vydac 2.1×150mm；溶液A水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；溶液B水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1；流速0.2ml/分钟)再次分离，由此制备最终的纯样品(用大约29％乙腈洗脱的)。
在实际的纯化步骤中，大约制备了50pmol的肽。这种肽的分子量为4,157Da且理论上的等电点被计算为11.41。此外，所述肽的疏水性可满足如上所述在Vydac的C18柱(4.6×250mm，218TP54)中在0.1％三氟乙酸存在的情况下用大约32％浓度的乙腈洗脱。
实施例12(通过CRSP-Gly对于cAMP产生的促进作用)猪降钙素受体(CTR)被导入到哺乳动物表达载体pcDNA 3.1中，然后在恒河猴肾细胞(COS-7)中表达，并且利用放射免疫测定法测定其中通过CRSP或者CRSP-Gly刺激产生的cAMP量。
结果显示于图15中。
实施例13(狗和牛CRSP的cDNA克隆)通过利用酸性胍，苯酚和氯仿的方法从狗和牛的甲状腺提取RNA。利用Takara Shuzo的Oligotex-dT30 mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。利用Pharmacia公司的Time Saver cDNA制备试剂盒和Stratagene公司的λZAPII由狗和牛的甲状腺mRNA(3μg)制备互补DNAλ噬菌体文库。至于探针，使用具有全长700bp的猪降钙素受体-刺激肽cDNA。筛选方法如下。因此，用λ噬菌体(具有大约300,000个独立克隆)侵染大肠杆菌，与含有LB培养基的0.7％琼脂糖混合，涂布在铺有含LB培养基的1.5％琼脂培养基的培养皿上并在37℃温育大约8小时。在冰箱中冷却大约两小时后，将由此形成的噬菌斑被转至碱性尼龙滤膜上(用0.5M氢氧化钠和1.5M氯化钠溶液处理两分钟；用0.5M Tris-盐酸(pH7.5)和1.5M氯化钠溶液处理两分钟；以及用45mM柠檬酸钠(pH7.0)和450mM氯化钠溶液处理5分钟)然后在80℃处理滤膜两小时。然后，滤膜在37℃浸渍在预杂交液(20％甲酰胺，0.09M柠檬酸钠(pH7.0)，0.9M氯化钠，0.5％的牛-血清白蛋白，0.5％的Ficoll，0.5％的聚乙烯吡咯烷酮和0.5％的十二烷基硫酸钠)中两小时，加入用32p标记的探针并将混合物在42℃杂交16小时。滤膜用洗涤液(30mM柠檬酸钠(pH7.0)，300mM的氯化钠和0.1％十二烷基硫酸钠在室温下5分钟洗涤两次并且用15mM柠檬酸钠(pH7.0)，150mM氯化钠和0.1％十二烷基硫酸钠的水溶液在60℃1小时洗涤两次)冲洗后，曝光于X-光胶片，用放射性射线感光的区域与培养皿上的噬菌斑相比较，并分离阳性克隆。利用Stratagene的辅助噬菌体R408将分离的阳性λ噬菌体克隆转化到适于DNA测序的质粒pBluescript，并且通过Sanger法测定核苷酸序列。
编码测定的牛CRSP的cDNA的核苷酸序列显示于序列表的SEQID NO7中，编码的牛CRSP的前体肽的氨基酸序列显示于SEQ IDNO8。牛CRSP的氨基酸序列显示于SEQ NO NO6。
编码狗CRSP的cDNA的核苷酸序列显示于序列表的SEQ IDNO10，编码的狗CRSP的前体肽的氨基酸序列显示于SEQ ID NO11。狗CRSP的氨基酸序列显示于SEQ ID NO9。
实施例14(定量分析通过用牛CRSP或狗CRSP刺激产生的cAMP量)在培养基(DMEM(含有10％胎儿牛血清))中温育LLC-PK1细胞。两天后，用含有0.05％牛血清白蛋白的DMEM冲洗细胞两次，培养皿中的培养基用含有0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和0.05％牛血清白蛋白(DMEM/BSA/IBMX)的DMEM替换并在37℃温育30分钟。温育后，培养基用溶解了CRSP使得浓度为0M和10-12到10-6M的DMEM/BSA/IBMX替换并在37℃温育10分钟。温育后，除去培养皿中的培养基，加入乙醇并且将培养皿在冰箱中冷冻进行细胞溶解。然后将乙醇转入试管并且利用离心蒸发器蒸干样品。干燥样品溶于DMEM，各取出100μl，加入相同量的溶解了琥珀酸酐使得浓度为4％的二氧杂环己烷-三乙胺混合物(二氧杂环己烷∶三乙胺＝4∶1)并将混合物在室温下静置30分钟使得cAMP被琥珀酰化。利用离心蒸发器再次蒸干，溶于1ml的缓冲液中(50mM的乙酸钠(pH6.2)，1mM EDTA，0.025％的叠氮化钠，0.5％的血清白蛋白以及0.01％的Triton X-100)中，各取出100μl到试管中，加入50μl的放射性标记琥珀酰化的cAMP和50μl的抗体，混合物在4℃静置48小时。然后，加入100μl的1％γ-球蛋白和500μl的25％聚乙二醇，充分混合混合物并离心，利用γ-测量器测定沉淀物的放射性强度并与通过已知浓度的cAMP制备的标准曲线的放射性强度进行比较由此测定cAMP的量。
结果显示于图16中。
实施例15(CRSP-2和CRSP-3/CT-2前体基因的克隆)猪基因组文库购自Clontech。至于探针，使用具有全长700bp的猪降钙素受体-刺激肽的前体cDNA。筛选方法为大肠杆菌被侵染插入了猪基因组的λ噬菌体(其具有约1,000,000个独立的克隆且使用其中的大约300,000个克隆)，与含有LB培养基的0.7％琼脂糖混合，铺板在含有LB培养基的1.5％琼脂培养基的培养皿中并37℃温育大约8小时。在冰箱中冷却大约两小时后，由此形成的噬菌斑被转至尼龙滤膜上并进行碱性修饰(用0.5M氢氧化钠和1.5M氯化钠溶液处理两分钟；用0.5M Tris-盐酸(pH7.5)和1.5M氯化钠溶液处理两分钟；以及用45mM柠檬酸钠(pH7.0)和450mM氯化钠溶液处理5分钟)然后在80℃处理滤膜两小时。然后，滤膜在37℃浸渍在预杂交液(20％甲酰胺，0.09M柠檬酸钠(pH7.0)，0.9M氯化钠，0.5％的胎牛白蛋白，0.5％的Ficoll，0.5％的聚乙烯吡咯烷酮和0.5％的十二烷基硫酸钠)中两小时，加入用32P标记的探针并将混合物在42℃杂交16小时。滤膜用洗涤液(30mM柠檬酸钠(pH7.0)，300mM的氯化钠和0.1％十二烷基硫酸钠在室温下5分钟洗涤两次以及用7.5mM柠檬酸钠(pH7.0)，75mM氯化钠和0.1％十二烷基硫酸钠的水溶液在55℃1小时洗涤两次)冲洗后，曝光于X-光胶片，用放射性射线感光的区域与培养皿上的噬菌斑相比较，并由噬菌斑分离阳性克隆。利用各种限制性酶裂解分离的阳性λ噬菌体克隆，通过Southern印迹法进行分析来制备限制性酶图谱并利用合适的限制性酶将含有阳性克隆的DNA亚克隆到pBluescript中。通过Sanger法测定核苷酸序列。筛选的结果为制备得到25个阳性克隆。利用限制性酶分析和核苷酸序列测定，结果发现十个编码CRSP基因的克隆(附图17)。也发现其余15个克隆中的9个编码其它基因(图18和图19)且6个编码也其它的基因。9个克隆具有与CRSP同源的序列。基因被命名为CRSP-2。其它的6个克隆具有与CRSP和CT同源的序列。那些基因被命名为CRSP-3和CT-2。在图17和图19中，加下划线部分表示外显子。
CRSP基因的核苷酸序列显示于后面所附序列表的SEQ ID NO5中。CRSP-2基因显示于序列表的SEQ ID NO15中。含有CRSP-3基因和CT-2基因的DNA片段的核苷酸序列显示于序列表的SEQ IDNO23中。
利用CRSP和CT/CGRP的基因序列作为参照推测的cDNA序列显示于附图20-22(附图20CRSP-2；附图21CRSP-3；以及附图22CT-2)中。在图20到图22中，实线围起的部分为成熟肽，灰色部分为甘氨酸，其被推测转变为酰胺，且斜体部分为信号肽，并且在图22中，成熟物质的N-末端侧的谷氨酰胺被推测转变为焦谷氨酸。图23是各种CRSP与CGRP、AM和CT-2以及CT氨基酸的比较。
CRSP-2的cDNA的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO13中，CRSP-3的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO17中且CT-2的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO21中。
CRSP-2，CRSP-3和CT-2的成熟氨基酸序列推测如下。
CRSP-2Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Ser-Cys-Val-Thr-His10Lys-Met-Thr-Gly-Trp-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly20Ser-Val-Ala-Lys-Asn-Asn-Phe-Met-Pro-Thr30Asn-Val-Asp-Ser-Lys-Ile-Leu-NH237CRSP-3Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Ile-Cys-Val-Thr-His10Lys-Met-Ala-Gly-Tro-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly20Ser-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Met-Pro-Ile30Asn-Met-Gly-Ser-Lys-Val-Leu-NH237CT-2 pGlu-Cys-Asn-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu 10Gly-Thr-Tyr-Thr-Trp-Asp-Val-Asn-Lys-Phe20Tyr-Ala-Phe-Pro-Leu-Thr-Thr-Thr-Gly-Ile30Arg-Val-Ser-NH233CRSP-2的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO12中，CRSP-3的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO16中，CT-2的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO19中。
实施例16(CRSP-2前体的cDNA克隆)至于cDNA文库，使用插入猪下丘脑DNA的λ噬菌体文库进行CRSP的cDNA克隆。至于探针，使用具有全长700bp的猪降钙素受体-刺激肽。筛选方法为用插入猪下丘脑DNA的λ噬菌体侵染大肠杆菌，与含有LB培养基的0.7％琼脂糖混合，涂布在铺板含有LB培养基的1.5％琼脂培养基的培养皿上并于37℃温育大约8小时。在冰箱中冷却大约两小时后，由此形成的噬菌斑被转至尼龙滤膜上，并进行碱变性(用0.5M的氢氧化钠和1.5M的氯化钠溶液处理两分钟；用0.5M Tris-盐酸(pH7.5)和1.5M的氯化钠溶液处理两分钟；并且用45mM柠檬酸钠(pH7.0)和450mM的氯化钠溶液处理5分钟)然后在80℃处理滤膜两小时。然后，滤膜于37℃在预杂交液(20％甲酰胺，0.09M柠檬酸钠(pH7.0)，0.9M氯化钠，0.5％的胎牛白蛋白，0.5％的Ficoll，0.5％聚乙烯吡咯烷酮和0.5％的十二烷基硫酸钠)中浸渍两小时，加入用32p标记的探针并将混合物在42℃杂交16小时。滤膜用洗涤液(30mM柠檬酸钠(pH7.0)，300mM的氯化钠和0.1％的十二烷基硫酸钠在室温下5分钟洗涤两次以及用15mM柠檬酸钠(pH7.0)，150mM氯化钠和0.1％十二烷基硫酸钠的水溶液在60℃1小时洗涤两次)冲洗后，曝光于X-光胶片，用放射性射线感光的区域与培养皿上的噬菌斑相比较，并由噬菌斑分离阳性克隆。利用Stratagene的辅助Phage R408将分离的阳性λ相克隆转化到适于DNA测序的载体质粒pBluescript中，并通过Sanger法测定核苷酸序列。结果，制备13个阳性克隆。上述其中六个全部是含有几乎全长CRSP前体cDNA的克隆而另外六个全部是含有几乎全长CRSP-2前体cDNA的克隆(附图20)。剩下的一个是编码CRSP-3的3’-非翻译区的短克隆。
实施例17(CRSP-3和CT-2 cDNA的克隆)利用猪下丘脑cDNA(相当于20ng的mRNA)作为模板，引物(CRSP-3GCCCAGCTTACGTCTCCTTT和TCAGGTAACTGCAATGATTTCT-2AGCAGCTTTGATTCTGCCAC和ACCTCCTCTCTGATATTCCA)以及Takara Shuzo的Pyrobest DNA聚合酶进行PCR，共30个循环各包括在94℃15秒，在55℃15秒以及在72℃1分钟。扩增的DNA被用于琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶中回收用溴化乙锭染色的条带并亚克隆到Stratagene的pBluescript II中，并且通过Sanger法测定核苷酸序列。
利用CRSP-3的引物分析扩增的DNA的核苷酸序列，结果发现编码CRSP-3(图5)。此外，在利用CT-2引物进行的PCR中，没有观察到DNA的扩增。
实施例18(通过RT-PCR高灵敏度定量分析CRSP、CRSP-2、CRSP-3、CT-2、CT、CGRP和GAPDH的基因表达量)利用猪的各种组织的总RNA(4μg)制备模板cDNA，寡核苷酸dT引物和Toyobo的Revertra Ace逆转录酶试剂盒及模板的1/40用于RT-PCR。利用Toyobo的rTaq聚合酶进行PCR来扩增各种基因的cDNA，30个循环，每个循环包括94℃15秒，60℃15秒以及72℃1分钟，使用下列的序列作为引物。
CRSP CTCTCTGAGGAGGAATCACG和GAGTTCAGAGTCATAGTAACCCRSP-2CTCACAGAGGAGGAAGTCTC和TAGAGTTCAGTTCCTTGGTGCRSP-3AGCAGCTTTGATTCTGCCAC和TGCAGTGAAAGCAACTTGAGCT-2 AGCAGCTTTGATTCTGCCAC和ACCTCCTCTCTGATATTCCACTGCCACTCAGTGAGAAGGAAG和TGAGGCATGAGGGATGAAGCCGRP GCCACTCAGTGAGAAGGAAG和TCACCTTACATGTGTCCCCAGAPDH TCACTGCCACCCAGAAGACT和AGTGGTCGTTGAGGGCAATG利用3％琼脂糖凝胶对扩增的DNA进行电泳并使用富士胶卷FLA2000进行分析。结果，在中枢神经系统、甲状腺和卵巢中观察到CRSP-2和CRSP-3的表达。此外，在任何组织中没有CT-2扩增条带也没有观察到表达(附图24)。可以确定CT-2在除显示于图24的组织之外的区域限制性表达。
工业实用性本发明提供了新的和有用的肽，其在中枢神经系统中表达并强烈地作用于降钙素受体。本发明的肽与降钙素基因-相关肽具有高度同源性并且比降钙素具有更强烈的作用。它们同样在中枢神经系统中大量地表达，并且非常适用于作为用于骨质疏松症的新的降钙素类肽以及用作止痛药物等。
序列表<110>独立行政法人科学技术振兴机构(Japan Science And Technology Agency)<110>日本国立循环器病中心(Japan as represented by President of the NationalCardiovascular Center)<120>具有cAMP生成活性的新肽(New Peptides Having cAMP Producing Activity)<130>SCT044131-47<140>PCT/JP03/O6641<141>2003-05-28<150>JP2002-162797<151>2002-06-04<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>38<212>PRT<213>猪(Swine)<220>
<221>modified amino acid<222>(38)<223>甘氨酰胺<220>
<223>CRSP<400>1Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Val Gly Leu Leu1 5 10 15Ser Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met20 25 30Gly Phe Lys Val Phe Gly35<210>2<211>39<212>PRT<213>猪(Swine)
<220>
<223>CRSP-Gly<400>2Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Val Gly Leu Leu1 5 10 15Ser Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met20 25 30Gly Phe Lys Val Phe Gly Gly35<210>3<211>679<212>DNA<213>猪(Swine)<220>
<223>CRSP cDNA<400>3tcaagtgtct ctgccgcttc ttccacagtg ccatcgcctg acgccaacgc tgctgcctct 60gctccctcct ctgctccagt ccacctggtt cctgctgccc gaggggcacc atgggcttct 120ggaaatttcc gcccttcctg gttctcagca tcctggtcct gtaccaggca ggcatgttcc 180acacagcacc aatgaggtct gcctttggga gcccttttga tcctgctacc ctctctgagg 240aggaatcacg cctccttttg gctgcaatgg tgaatgacta tgagcagatg aaggcccgtg 300agatgcagaa gcagagggca cagggctccg gcatcagtgt ccagaagaga tcctgcaaca 360ctgccacctg catgacccat cggctggtgg gcttgctcag cagatctggg agcatggtga 420ggagcaacct gttgcccacc aagatgggct tcaaagtctt tggtgggcgc cgcaggaact 480tttggatctg agcagtggga tgattccagg aggaaggtta ctatgactct gaactctatt 540cgtttaattt acaatgaaag caacctacta aaaaatagca tggaagacat ccatgtatgc 600atgcttctgg aaactgaaaa cactcttttc cttgaaataa actaaaacta aatgcaaaat 660aaaatcaatg catcaatgc 679<210>4<211>126<212>PRT<213>猪(Swine)<220>
<223>CRSP的前体肽<400>4Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Val Leu Ser Ile Leu Val1 5 10 15Leu Tyr Gln Ala Gly Met Phe His Thr Ala Pro Met Arg Ser Ala Phe
20 25 30Gly Ser Pro Phe Asp Pro Ala Thr Leu Ser Glu Glu Glu Ser Arg Leu35 40 45Leu Leu Ala Ala Met Val Asn Asp Tyr Glu Gln Met Lys Ala Arg Glu50 55 60Met Gln Lys Gln Arg Ala Gln Gly Ser Gly Ile Ser Val Gln Lys Arg65 70 75 80Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Val Gly Leu Leu85 90 95Ser Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met100 105 110Gly Phe Lys Val Phe Gly Gly Arg Arg Arg Asn Phe Trp Ile115 120 125<210>5<211>3796<212>DNA<213>猪(Swine)<220>
<223>基因CRSP<400>5ctcgaggatc ctgcctcttg tttcccacaa atcctgcctt cctgtgcttg attccagctg 60cctgaatcag accccctgct tgggcacaga atcatcaacc tgctgcgcat taacctccca 120aaccgcactt ggacatggta gtcttagggg accggggatg ccttgtaatg ctggactctg 180ctctacaaag atcacatagc tggggatgga gagggatgtg agcctgcgaa accgaacagg 240taaagtttac catgacgtca aactgtcctt aaattcctgc tcactttgcg tgtgtttttc 300gttggtgccc accaacctcc ccaccccctc ccacccccgc catcaatgac ctcaatgcaa 360atacaagtgg ggtggtcctg ttggatgctc caggttctgg acgcaagtag tgacacaatc 420ctggggctca ggatctttcc tctcattggt tgcctggagc tctgggacca ccccagattc 480agagcggcgg gaataagagc agctgctggt gcggggaagg gttagaggca ctacccacct 540caagtgtctc tgccgcttct tccacagtgc catcgcctga cgccaacgct gctgcctctg 600ctccctcctc tgctccagtc cacctggttc ctgctgcccg gtaagcccgg agattcctgc 660taagctgtgg ttctgtttct ctctccctct cctcccttcc ctctctctcc attggatttt 720cttagctgat ctcttttccc gtctcaaagt tcctgtccac ttctctctgg gtctcttcat 780cctgtaatat gccttactgc gcaattcatt ctaggctcct ttcacaggta actctggatg 840gtctcagttc ggggattccc tgctctactc ttcctgagct gagctgggct ccagtcttgt 900ccccgcagca gacgtgctta ggtccgtgtt gggattttgg agctctccag gcacttcagg 960gagaggagga tgcaggaata gctttgagca gaagaaactt tcatggatcc catctcctct 1020tacctacaag gatcgctgga aatggggtcg ggacctggga cagtgcaaat gggtggcaaa 1080taggtgcaat gactgagggg aaagtagcta ttaaacgcaa gccccagttg aaggttctgg 1140gaactccccc tcccgcaccg ccaccccatt taatcttggg tcccaattta aggctgtacc 1200agcttgtttc ttacagggtg ctctttgcca gagtatggag cagctggaca gtaaaatttg 1260
gttcttcagt ttctcaggga ttccaactgc agagatatgt cctcccaact ccccttcccc 1320ccagccaggt ataagcaaaa atcaggcatc aggagagatg ctgatgggtt gcactatggg 1380aaaagctgtg gtgacaggta ctgcgagtct gtcctccagg agtcccggcc aacaggttga 1440aggtgagagt gtgggtgtgc tgggcagggg gctatggacg gagacctcct cacccagttg 1500tcctgctagg cttctttgct aaaccaaaca tgttgcaggc tcactggatc ttccagcagt 1560ccacttggct gaggaggaaa tgatggtgaa aggaaaggac acgagcagcc tgaagccagg 1620aagccaggga gttggaggca gaggcaggag cagagcccag gtctgtgggc tcaatgaact 1680tggaactgct acaggtggtg acattgttct tcccttgcag aggggcacca tgggcttctg 1740gaaatttccg cccttcctgg ttctcagcat cctggtcctg taccaggcag gcatgttcca 1800cacagcacca atgaggtaag acagccctgc caacaagcac actcacttga tgagaatgta 1860atataaacgt gtatataaat ttattataag gtggctctgt agaacaatgg atagtgcctt 1920gcgctcctat aagtttatca taagctttat gtgtacacaa agtttgtaaa tagacataag 1980atatacagta ctcatgattg taaattttat ataacttatc aaacctcaca gcatgctttt 2040ttgttttcat caaatatttg tacctttagc acacgtatat gctcatatta ccataattta 2100agaaatggat tgtatccaat ttgccaaata ctttgctagt aaatttgtta ttaaatctga 2160tatgggatct acacatctca tttttcacct tcattcaaac tgcattaagc taaaattatt 2220ttcccattca aactatcaga aaccaggcaa cctggctgtt tatcctgggg aggggcaggc 2280aggagatcag aacctgtttt taggcttgct tcccctcctt aggtctgcct ttgggagccc 2340ttttgatcct gctaccctct ctgaggagga atcacgcctc cttttggctg caatggtgaa 2400tgactatgag cagatgaagg cccgtgagat gcagaagcag agggcacagg gctccgggta 2460aggttccctg cccaaggaca acagggcatc cctttcttcc tctggtcagg cccaggaagg 2520catattttaa agtcactttt gagttttctg acccccctgg acatgtctgt gggatgatta 2580tggcatttcc cctgacggcc taggattttc tgctgtgatg accttttcta gcagaaatac 2640tcaaggttca ctggtcctct caaggcagta gtcttccatg acgattctgt cgtacagcac 2700ctgcactcaa cctctcactg acgggccttt tctttcttta tcccacaaat cagcatcagt 2760gtccagaaga gatcctgcaa cactgccacc tgcatgaccc atcggctggt gggcttgctc 2820agcagatctg ggagcatggt gaggagcaac ctgttgccca ccaagatggg cttcaaagtc 2880tttggtgggc gccgcaggaa cttttggatc tgagcagtgg gatgattcca ggaggaaggt 2940gactgccctt tttgtacctt cgggtgggag gacagaggac tgggtattgc aggggtgcat 3000tccacaccct aaccctctgt gagcgcatgg gggtaaaacc tccacatggc aaggtgccca 3060caccagtgtc tggagaaagg actgataatc cctataactg aaacattggg ctctttctct 3120ctgtttctcc agtctctccc tgtgacactg acatcatctg ccaggaaata tagaccctgt 3180ttacttaaaa cactgttccc tgggtattaa ttggggtcca gctctagcat tagaatttga 3240aaggtaatga ccctaccctt ttggagcata ccttacaatg ttatgaactt ggagcataga 3300ctcggattca aatactgtgt ctgtcttcca ctaactgtga ccataggcaa gtatgcctct 3360gagcctcagc ttctccttgt aacttgaagg caacaatagt atcctcaata taaaaattaa 3420ttagtataac atatgacaag agcctgttaa ctaagaatta ataacattct gttacttttt 3480tccctcctag gttactatga ctctgaactc tacttcgttt aatttacaat gaaagcaacc 3540tactaaaaaa tagcatggaa gacatccatg tatgcatgct tctggaaact gaaaacactc 3600ttttccttga aataaactaa aactaaatgc aaaataaaat caatgcatca atgcagttac 3660cttgtgtgca tcttttgtgt atatgattct ataatatgat gcatgtctca ttaggtttaa 3720tggtagcaaa tctggcccct gtcagccaac ctgttggtgg gggcagctct gctaaacctc 3780agggtcacat gaattc 3796<210>6<211>40<212>PRT<213>Bos sp.
<220>
<223>BosCRSP<400>6Ala Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Ala Gly Trp Leu1 5 10 15Ser Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met20 25 30Gly Phe Lys Ile Phe Asn Gly Pro35 40<210>7<211>649<212>DNA<213>Bos sp.
<220>
<223>BosCRSP cDNA<400>7tgtctctgcc acttctgcca gactgccact gcctgctgcc aaagctactg ctgctgctcc 60ttcctctgct cccagccacc tggtgccggc tgtcagagag gtgtcatggg cttctggaag 120ttccccccat tcttggtcct cagcatcctg gtcttgtacc aggcaggcat gtttcatgca 180gcaccattca ggtctgtctt tgatgggcgt tttgatcctg ctaccctgga tgaggaggaa 240tcgcgcctcc tactggctgc gatggtgaat gactacgagc agatgagggc ccgggagtcg 300gagaaggctc agaagaccga gggctcccgc atccagaaga gagcctgcaa cactgccacc 360tgcatgaccc atcgcctggc aggctggctg agcagatctg ggagtatggt gaggagcaac 420ttgctgccga ccaagatggg tttcaagatc ttcaatgggc cccgcaggaa ctcctggttt 480taaacagtga aatgacgctg ggaataaggt caccaggaag ctgaactcta cttttagttt 540gcatgaaggc accttacaaa aaaagaaaat agcatggaag atacccatgt atgcatgctt 600ctcgatattg aaaacattct tcttttccct gaaataaact aaatgcaga 649<210>8<211>125<212>PRT<213>Bos sp.
<220>
<223>BosCRSP的前体肽<400>8Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Val Leu Ser Ile Leu Val1 5 10 15Leu Tyr Gln Ala Gly Met Phe His Ala Ala Pro Phe Arg Ser Val Phe20 25 30Asp Gly Arg Phe Asp Pro Ala Thr Leu Asp Glu Glu Glu Ser Arg Leu
35 40 45Leu Leu Ala Ala Met Val Asn Asp Tyr Glu Gln Met Arg Ala Arg Glu50 55 60Ser Glu Lys Ala Gln Lys Thr Glu Gly Ser Arg Ile Gln Lys Arg Ala65 70 75 80Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Ala Gly Trp Leu Ser85 90 95Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met Gly100 105 110Phe Lys Ile Phe Asn Gly Pro Arg Arg Asn Ser Trp Phe115 120 125<210>9<211>38<212>PRT<213>Canis sp.
<220>
<223>CanisCRSP<400>9Ser Cys Asn Ser Ala Thr Cys Val Ala His Trp Leu Gly Gly Leu Leu1 5 10 15Ser Arg Ala Gly Ser Val Ala Asn Thr Asn Leu Leu Pro Thr Ser Met20 25 30Gly Phe Lys Val Tyr Asn35<210>10<211>686<212>DNA<213>Canis sp.
<220>
<223>CanisCRSP cDNA<400>10tctgccacat ccacggtgcc atcgcctgac atcggacgcc aacactgcca cagctgccgc 60cgcctgtgct ccgagccacc ggctgcctgc agacagagaa gcgtcatggg cttctggaag 120ttctcccctt tcctggttct cggcatcctg gcgctgtacc aggtgggctt cctccaggca 180gcaccattca ggtctgcttt ggaaaatcct ccagactctg gtgtgcgcaa tgaggaggaa 240ttgcgcctcc tcctggctgc agtgatgaag gactatatgc agatgaagac tcatgagctg 300
gagcaggagc aggagactga gggctccagg gttgctgtcc agaagagatc ctgcaactct 360gccacctgtg tggcccattg gctgggaggc ttgctgagca gagccggaag tgtggcaaac 420accaacttgc tgcccaccag catgggcttc aaggtctaca atcgacgccg cagggaactt 480aaggcttaag cagtgacatg accccaggaa gaaggtcacc atgaagtgaa ctctacttct 540cttaacttct aatgaaaaca acttatagaa tgcagagcat ggaagacaca tacatatgca 600tgcttactat taaaacattg tgtcttgttt gaaataaagt aaaactaaat aaagagaata 660aaatcataaa aaaaaaaaaa aaaaaa 686<210>11<211>127<212>PRT<213>Canis sp.
<220>
<223>CanisCRSP的前体肽<400>11Met Gly Phe Trp Lys Phe Ser Pro Phe Leu Val Leu Gly Ile Leu Ala1 5 10 15Leu Tyr Gln Val Gly Phe Leu Gln Ala Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu20 25 30Glu Asn Pro Pro Asp Ser Gly Val Arg Asn Glu Glu Glu Leu Arg Leu35 40 45Leu Leu Ala Ala Val Met Lys Asp Tyr Met Gln Met Lys Thr His Glu50 55 60Leu Glu Gln Glu Gln Glu Thr Glu Gly Ser Arg Val Ala Val Gln Lys65 70 75 80Arg Ser Cys Asn Ser Ala Thr Cys Val Ala His Trp Leu Gly Gly Leu85 90 95Leu Ser Arg Ala Gly Ser Val Ala Asn Thr Asn Leu Leu Pro Thr Ser100 105 110Met Gly Phe Lys Val Tyr Asn Arg Arg Arg Arg Glu Leu Lys Ala115 120 125<210>12<211>37<212>PRT<213>猪(Swine)<220>
<221>modified amino acid<222>(37)
<223>亮氨酰胺<220>
<223>CRSP-2<400>12Ser Cys Asn Thr Ala Ser Cys Val Thr His Lys Met Thr Gly Trp Leu1 5 10 15Ser Arg Ser Gly Ser Val Ala Lys Asn Asn Phe Met Pro Thr Asn Val20 25 30Asp Ser Lys Ile Leu35<210>13<211>690<212>DNA<213>猪(Swine)<220>
<223>CRSP-2 cDNA<400>13ctcaagtgtc tctgccgctt cttccacagt gccatcgcct gacgccaacg ctgctgcctc 60tgctccctcc tctgctccag tccacctggt tcctgctgcc cgaggggcac catgggcttc 120tggaaatttc cgcccttcct ggttctcagc atcctggtcc tgtaccaggc aggcatgttc 180cacacagcac ccgtgagatt gcctttggag agcagctttg attctgccac tctcacagag 240gaggaagtgt cccttctact ggttgcaatg gtgaaggatt atgtgcagat gaaggccact 300gtgctggagc aggagtcaga ggacttcagc atcactgccc aggagaaatc ctgcaacact 360gctagctgtg tgacccacaa gatgacaggc tggctgagca gatctgggag cgtggctaag 420aacaacttca tgcccaccaa tgtggactcc aaaatcttgg gctgacgccg cagagagcct 480caggcctgag ctgtgaaatg actccacaaa gaaggtcacc aaggaactga actctatttc 540ttttaatctg caatgaaagc aatttatttg aaaaatagca tggaaaacac acatatatgc 600atgcttcttg cttgaaatac agcttttagc ttgaaataaa ctaaaactaa atgcagaata 660aaatcattgc agctacctga aaaaaaaaaa 690<210>14<211>117<212>PRT<213>猪(Swine)<220>
<223>CRSP-2的前体肽<400>14Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Val Leu Ser Ile Leu Val1 5 10 15
Leu Tyr Gln Ala Gly Met Phe His Thr Ala Pro Val Arg Leu Pro Leu20 25 30Glu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Thr Leu Thr Glu Glu Glu Val Ser Leu35 40 45Leu Leu Val Ala Met Val Lys Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala Thr Val50 55 60Leu Glu Gln Glu Ser Glu Asp Phe Ser Ile Thr Ala Gln Glu Lys Ser65 70 75 80Cys Asn Thr Ala Ser Cys Val Thr His Lys Met Thr Gly Trp Leu Ser85 90 95Arg Ser Gly Ser Val Ala Lys Asn Asn Phe Met Pro Thr Asn Val Asp100 105 110Ser Lys Ile Leu Gly115<210>15<211>7673<212>DNA<213>猪(Swine)<220>
<223>gene CRSP-2<400>15ggatccacta gttctagata aaatggacaa atacctagaa acagaagacc taccaagatg 60gaaggatgaa gaaatagaaa attcaaatac acctatgact aggaaggaga atgaagcatt 120aatccaaaat cttccaacaa agaaaagccc tggatacgat ggcctcattg gtgaatagta 180ccagacattt aaagaaaacg aataccaatc cttgtcaaac ttttccaaaa acctgaagag 240aaaggacaca ccctaaccta ttctatgagg caggccaaca ttactctgat accaaagatg 300gagaaagatt ctgcaaggag aaaaccccta cagacaaaat cctttatgac atggatgtgg 360aaaccctcaa cagtatgcta gggaattgaa ttcagaagcg tattaaaagg atcctacaac 420atgaccaagt gggatgaatt tctggaatgc aaggatgatt caaaatatga aaattgatca 480aagtgttata tcacaataat ggaatgtagg gaaaaacaca cctgattatt tccactgata 540cagaaaatta tttagtaaaa ttcaatacct tttcaggatt aaaaacaaaa actaggtata 600gaaggagact gcctcagcac aatacaacta tatatgaaaa accaacacca acaccataat 660ccagggtgga aaactgaaag cttttcccct aagatctgga agaaaatgga aaaaaatttt 720taagaatttt cagacagatt tgggtctctg gtacactctg agaaatcatc ttttagaatt 780tttttttttt aaaaataagc acaagaattt catttaaaag aagggaaata acatagcctt 840cagagtttat caggaggtgt aatttttttt tccacactag attgtggcta cctgatgcta 900attttgaggt ttaaacataa tgaaataaga ttgtacagcc aagtgccagc tagtcatgga 960acttttacct cagtactgtt tagtgcttca gtcctaagaa gtttcaggga gggctgcgtg 1020caatacaagt aatcggtact tgctgaaggt ctaaaatttc gagtgcactt ggtaaatcag 1080ggatgggcgc agaggagact ggttctgtaa ctcagactag tgaaccctag aatttagaaa 1140gggtactttt gtgctccaag caaatcctgt tctacctaac taggtccaaa tgctctgcag 1200
gctgtagtta gagccctctc atagcaggga gactgccttg gtgaatctgc cagaggaaat 1260gaatttccat tcacattcat tcaacaaaca ttgggcgagt gccacctcat gtgcaaaaca 1320tggtgctaag tgctaaagaa aagatgttgt tttgtaaact tacccgcagc tcagagccag 1380gacttcttgg aaagtcagag gacttgagga aggagttcat ctcagcccct ccctcactgg 1440agagactggc ttttctttcc aagtaaagct taaaactgct ggaggctaag ttagcaccct 1500ctgggggcag accctgattc ctgcctctca tccccagccc tttgtgtgtg ggcgccaaag 1560atttctgagt gaggaatgaa tgttggcttt gaacaggaaa ggcacaagtg gcagccaagg 1620gtagaatgct gagcctacaa attaacatag ttacaaattt gtcttctaaa ggagtcgttt 1680cttagccata gtgcagccac ctttgcattg atcaaaactg tggttcttcc aatgaaaaaa 1740gacatcccca gacacacata cttacaaatg atttcagaag attgataggt cggaaatctc 1800aggttttgga ttttatttgc aaaagcgttt tgcgcctgag ttttaaactt tttttttttt 1860tttttttttt tgtatttttt cacttctagg gcggcttcgg cggcatatgg aaattcccag 1920gctaggggtc taataggcgc catagccacc ggcctacgcc agagctactg caacgctgga 1980tccgagccgc atctgcaacc tacaccacaa ctcacggcaa tgccggatcg ttaacccact 2040gagcaaggcc agggatcgaa cccgcaacct catggttctt actcagattc gttaaccact 2100gcgccacgac ggccactcca acctaccaga ctcttaatta agtagcagag tccaatttac 2160atgccgcacc acatctgtta ccccgagtta gcgaacttgg tcttggaact aactcctcac 2220ggaaagccaa gccgagtact cataattata gtgctgaacc cccaaaccct ggtctggcct 2280gtgcacccaa tttttgcttg tagtagaaac caggatttac ggagcccgag cagtccgcca 2340tcctgaactc ttctctttct caccttgcct tcatcctgga gtgcacctgc cctctatgaa 2400ccagtttttc cgttcccttg gtctcccgat ccgttgtcta tcctgaggag agcgagatgc 2460aagcacccga ttccctagcc ccaatatttt attctcttgc gaaggagaaa agttgaataa 2520gggtatcttg taaatgagat gttccgagtc cagagagcac aaaccggcaa ggggaacaga 2580tgtgccgcga ggcaggtgtg cggaaagata tagagaaggc tcaggttcgg acctgtggct 2640caggtcacac tcatggcaga gttcggttta atttcggctc tgcctggggg aaccacttaa 2700ctggggtcct tgctgccctc caccggcccc cgatgctgtt gcagcgtttg ccgcgctgga 2760gggtctgtac aggctgctgc ggtttatcgc tgtgtgctca gacacggtga tcctgagcag 2820catccgaact ggattggggt agatgtgggc acagggctgg aatcacaggt cactggaaca 2880tcttggcaaa cagcagccgg aagcaagggg cagctgggca aatggttctg ggacattgat 2940gggcttagat gatgaatggt ggggctggag gtcggcttgg cggcttggga agcatctatg 3000ccgtgcacgt ccctgcccaa gcccagtagg gcaccatctt tccccatatg gtggaccgac 3060cacccagcgc gactccagac atccgcacag aggtggggat tgggcaaatg gatcgcgatc 3120gcacagaatc ccctctgcac ttccctggta agctcttctc gatccctccc tgggtggaga 3180gcaggtacat ggctactaat gataccactc cttgaagacg ggaatatgat gccccgttcc 3240aaaaattaat atattgaggt gctagaagac actagcccga tgatcttact acctagaaaa 3300ggcacagctg gaacaaagtt tccgtgtgac aaagactgtg atcctgcctc ttgtttccca 3360caaatcctgc cttcctgtgc ttgattccag ctgcctgaat cagaccccct gcttgggcac 3420agaatcatca acctgctgcg cattaacctc ccaaaccgca cttggacatg gtagtcttag 3480gggaccgggg atgccttgta acgctggact ctgctctaca aagatcacat agctggggat 3540ggagagggat gtgagcctgc gaaaccgaac aggtaaagtt taccatgacg tcaaactgtc 3600cttaaattcc tgctcacttt gcgtgtgttt ttcgttggtg cccaccaacc tccccacccc 3660ctcccacccc cgccatcaat gacctcaatg caaatacaag tggggtggtc ctgttggatg 3720ctccaggttc tggacgcaag tagtgacaca atcctggggc tcaggatctt tcctctcatt 3780ggttgcctgg agctctggga ccaccccaga ttcagagcgg cgggaataag agcagctgct 3840ggtgcgggga agggttagag gcactaccca cctcaagtgt ctctgccgct tcttccacag 3900tgccatcgcc tgacgccaac gctgctgcct ctgctccctc ctctgctcca gtccacctgg 3960ttcctgctgc ccggtaagcc cggagattcc tgctaagctg tggttctgtt tctctctccc 4020tctcctccct tccctctctc tccattggat tttcttagct gatctctttt cccgtctcaa 4080agttcctgtc cacttctctc tgggtctctt catcctgtaa tatgccttac tgcgcaattc 4140attctaggct cctttcacag gtaactctgg atggtctcag ttcggggatt ccctgctcta 4200ctcttcctga gctgagctgg gctccagtct tgtccccgca gcagacgtgc ttaggtccgt 4260
gttgggattt tggagctctc caggcacttc agggagagga ggatgcagga atagctttga 4320gcagaagaaa ctttcatgga tcccatctcc tcttacctac aaggatcgct ggaaatgggg 4380tcgggacctg ggacagtgca aatgggtggc aaataggtgc aatgactgag gggaaagtag 4440ctattaaacg caagccccag ttgaaggttc tgggaactcc ccctcccgca ccgccacccc 4500atttaatctt gggtcccaat ttaaggctgt accggcttgt ttcttacagg gtgctctttg 4560ccagagtatg gagcagctgg acagtaaaat ttggttcttc agtttctcag ggattccaac 4620tgcagagata tgtcctccca actccccttc cccccagcca ggtataagca aaaatcaggc 4680atcaggagag atgctgatgg gttgcactat gggaaaagct gtggtgacag gtactgtgag 4740tctgtcctcc aggagtcccg gccaacaggt tgaaggtgag agtgtgggtg tgctgggcag 4800ggggctatgg acggagacct tctcacccag ttgtcctgct aggcttcttt gctaaaccaa 4860gcatgttgca ggctcactgg atcttccagc agtccacttg gctgaggagg aaatgatggt 4920gaaaggaaag gacacgagca gcctgaagcc aggaagccag ggagttggag gcagaggcag 4980gagcagagcc caggtctgtg ggctcaatga acttggaact gctacaggtg gtgacattgt 5040tcttcccttg cagaggggca ccatgggctt ctggaaattt ccgcccttcc tggttctcag 5100catcctggtc ctgtaccagg caggcatgtt ccacacagca cccgtgaggt aagacagcac 5160tggtggcagt gctctcgctt cccacggccc ccggaatcat atagttctgt attgtgagtt 5220gtgctgtggt gagtctggct cttggtgggc ttctgtgtat agggggtgtg gggtcctaat 5280gtatgaatat agtcatgtat ataagtttat tataaatatt ttgtgatcca agataatatc 5340acaaagttta caaataaata gaagatatac agtattcact ataaatttct aaactcactg 5400aaccttacag catgtttttg ttgcttttta tgaaatgttt ataactttag caaacctata 5460tagtaattta gccataattt gagcaatgaa ttgcattcta attaagtaat ttgtcaataa 5520atttgttatt aaatctgaaa ggtaatctat acaatttctc accctctttc aaattatatt 5580aatatgaaac cattttcata ttcaaactat catttaattt ttaataatgg ctgtatttaa 5640cactaagctc atacaattcc tgaagatcta accatcagct ttcaaaagcc tacatgatgc 5700actttcagca gaactacttt gtggacaccc cagagcctaa ctcatggtga agcagcattt 5760ttggatgaac actagcctta tgtcctgacc gttgagaatt tcatcagcct tattctcaga 5820ggaagtggca gaaaccagga aatctggctg cttatcctag ggctgtggta ggctcagagc 5880gcatgttggg cttgctttcc cttcccagat tgcctttgga gagcagcttt gattctgcca 5940ctctcacaga ggaggaagtg tcccttctac tggttgcaat ggtgaaggat tatgtgcaga 6000tgaaggccac tgtgctggag caggagtcag aggacttcag gtcagtcttt gcacccctcc 6060cagaatatgg cttaccctct ccctagagta ccaggaaggc atatccttaa gaatgagatt 6120tgttatagtg ccataagcct tgatgtccag tctcataagc cttggtttat ttttagttta 6180ttacacagga gagattgtct attacagttc tgatttccag gtccagtaat gcagagccac 6240ctttgggttt tctgacaccc ctgaaaatgt ctatggggag tgatgatgca ttttcccaaa 6300agccctatgg ttttctgttg ggattttgtg tttagcagaa acatttcagg ttcactggtc 6360cctctcagag ctgtaatttt ccactgatgg tcagtcctgg ggggaatcac ttgccctcaa 6420gctgtcattg gcaggccttc tctttgtctc catcctgaaa atcagcatca ctgcccagga 6480gaaatcctgc aacactgcta gctgtgtgac ccacaagatg acaggctggc tgagcagatc 6540tgggagcgtg gctaagaaca acttcatgcc caccaatgtg gactccaaaa tcttgggctg 6600acgccgcaga gagcctcagg cctgagctgt gaaatgactc cacaaagaag gtgactgctc 6660tagaacatgg gatagcaggg caaatggctg ggtatttcag gggtgttggc tacactctaa 6720ccctccctga gcctgtactg taaaaaaaaa tccataatga agttgctgac cccattatcc 6780tcagaaagaa aagagaatcc taatagccaa aacccctata acttaggttc atttctattt 6840ttttccagtg tctcccagtg actctgaggt catctgtcag gaaacataga ttctattctt 6900ttttcttttc tttttggcta cacccaaggc atgtgaaagt ttttgggcca gggattgaat 6960ctgaaccata gctgtgacct atgcagtacc tgtggcaaca ctggatcctt aacccaatgt 7020accacatcag gaactcctag gtcctattat ttaaaacact gttccctgca gttataattg 7080tgattattct agtttttgag tttgaaaggt aatgatctta tccagtgagt ttgaagtata 7140actacaatgt cacatatatc tgaattcaga gcattgactt ggtttcaaat gcgatgtctg 7200tcttccacta actatacaac catgggccag accctctctg aacctcagtt ctacatgaaa 7260ctttaaggca acaataatat ttacctgtta tcattaatat aaaaagtaac tgagataatt 7320
catggtaaga gcctcactat taataagtaa taatattcta gctcttattt ttttttctcc 7380taggtcacca aggaactgaa ctctatttct tttaatctgc aatgaaagca atttatttga 7440aaaatagcat ggaaaacaca catatatgca tgcttcttgc ttgaaataca gcttttagct 7500tgaaataaac taaaactaaa tgcagaataa aatcattgca gctacctgat atgtatcatt 7560ttaatatttg attctgtatt ctataagtat gactcatgtc tcgctggctt atctggtagc 7620aaatctggac cctgtcagcc aacctgttgg tggtggcagc tctgctaaac ctc7673<210>16<211>37<212>PRT<213>猪(Swine)<220>
<221>modified amino acid<222>(37)<223>亮氨酰胺<220>
<223>CRSP-3<400>16Ser Cys Asn Thr Ala Ile Cys Val Thr His Lys Met Ala Gly Trp Leu1 5 10 15Ser Arg Ser Gly Ser Val Val Lys Asn Asn Phe Met Pro Ile Asn Met20 25 30Gly Ser Lys Val Leu35<210>17<211>685<212>DNA<213>猪(Swine)<220>
<223>CRSP-3 cDNA<400>17gcccagctta cgtctccttt ctccgccagt gccatcacct gccaccagcg cggttgttgc 60ttctcccact tgggctccaa gctacctggt tcctgcatcc agaggggcac catgggcttc 120tggaagttcc cccccttcct gatcctcagc atcctggtcc tgtaccaagc aggaatgctc 180catgccgcgc cattcaggat ggctttggga agcagctttg attctgccac actcacggaa 240gaggaaatgt ccctcctact ggttgcaatg gtgaaggatt atgtgcagat gaaggccact 300gtgctggagc aggagacaga ggacttcagc atcaccaccc aggagagatc ctgcaacact 360gccatctgtg tgacccacaa gatggcaggc tggctgagca gatctgggag cgtggttaag 420aacaacttca tgcccatcaa catgggctcc aaagtcttgg gccggcgccg cagacagcct 480caggcctgag ctgtgaaatg actctaaaaa gaagttgaac tcaagttgct ttcactgcaa 540agttgctttc cctgcaaatt aaaagaacca atttgaaaaa tagcatggaa gacacacata 600
tatgcatgct tcttgcttga aatacaactt tttgcttgaa acaaactaaa cctaaatgca 660gaataaaatc attgcagtta cctga 685<210>18<211>125<212>PRT<213>猪(Swine)<220>
<223>CRSP-3的前体肽<400>18Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Ile Leu Ser Ile Leu Val1 5 10 15Leu Tyr Gln Ala Gly Met Leu His Ala Ala Pro Phe Arg Met Ala Leu20 25 30Gly Ser Ser Phe Asp Ser Ala Thr Leu Thr Glu Glu Glu Met Ser Leu35 40 45Leu Leu Val Ala Met Val Lys Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala Thr Val50 55 60Leu Glu Gln Glu Thr Glu Asp Phe Ser Ile Thr Thr Gln Glu Arg Ser65 70 75 80Cys Asn Thr Ala Ile Cys Val Thr His Lys Met Ala Gly Trp Leu Ser85 90 95Arg Ser Gly Ser Val Val Lys Asn Asn Phe Met Pro Ile Asn Met Gly100 105 110Ser Lys Val Leu Gly Arg Arg Arg Arg Gln Pro Gln Ala115 120 125<210>19<211>33<212>PRT<213>猪(Swine)<220>
<221>modified amino acid<222>(33)<223>丝氮酰胺<220>
<221>modified amino acid<222>(1)
<223>pyroglutamic acid<220>
<223>CT-2<400>19Glu Cys Asn Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Thr Tyr Thr Trp Asp1 5 10 15Val Asn Lys Phe Tyr Ala Phe Pro Leu Thr Thr Thr Gly Ile Arg Val20 25 30Ser<210>20<211>802<212>DNA<213>猪(Swine)<220>
<223>CT-2 cDNA<400>20gcccagctta cgtctccttt ctccgccagt gccatcacct gccaccagcg cggttgttgc 60ttctcccact tgggctccaa gctacctggt tcctgcatcc agaggggcac catgggcttc 120tggaagttcc cccccttcct gatcctcagc atcctggtcc tgtaccaagc aggaatgctc 180catgccgcgc cattcaggat ggctttggga agcagctttg attctgccac actcacggaa 240gaggaaatgt ccctcctact ggttgcaatg gtgaaggatt atgtgcagat gaaggccact 300gtgctggagc aggagacaga ggacttcagc ctggacagct ccagagctaa gcagtgcaat 360aatctgagta cctgtgtgct gggaacatat acatgggacg tcaacaagtt ttatgcattc 420cccttaacta caactgggat tagagtatct ggcaagaaat gggtcagggc cagagtctca 480gagaaagtcc attatccctc aaggcagcat accctaaggt gcttaagaag gcccccaccc 540ctcctccttt ctagttcctc tcctagaatt tgcatgtgtt cttctctggt tgctctctga 600gctgctatca gcagctttcc ttgtggccat ggatgtctgg aatatcagag aggaggtggg 660gggtgggggc aggcaggcca gaagaaaatc actcaggaat agattaggag agaatgggca 720gccctgtgag tgcctgtgga tttcacagca gagcttctca gtcctgcttc tgaacatgct 780tttcactagg gaataaaagt at 802<210>21<211>162<212>PRT<213>猪(Swine)<220>
<223>CT-2的前体肽<400>21Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Ile Leu Ser Ile Leu Val
1 5 10 15Leu Tyr Gln Ala Gly Met Leu His Ala Ala Pro Phe Arg Met Ala Leu20 25 30Gly Ser Ser Phe Asp Ser Ala Thr Leu Thr Glu Glu Glu Met Ser Leu35 40 45Leu Leu Val Ala Met Val Lys Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala Thr Val50 55 60Leu Glu Gln Glu Thr Glu Asp Phe Ser Leu Asp Ser Ser Arg Ala Lys65 70 75 80Gln Cys Asn Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Thr Tyr Thr Trp Asp85 90 95Val Asn Lys Phe Tyr Ala Phe Pro Leu Thr Thr Thr Gly Ile Arg Val100 105 110Ser Gly Lys Lys Trp Val Arg Ala Arg Val Ser Glu Lys Val His Tyr115 120 125Pro Ser Arg Gln His Thr Leu Arg Cys Leu Arg Arg Pro Pro Pro Leu130 135 140Leu Leu Ser Ser Ser Ser Pro Arg Ile Cys Met Cys Ser Ser Leu Val145 150 155 160Ala Leu<210>22<211>7142<212>DNA<213>猪(Swine)<220>
<223>CRSP-3和CT-2的基因<400>22taccgggccc cccctcgagg tcgacggtat cgataagctt gatatcgaat tcctgcagcc 60cgggggatcc ttaaccaact gagggaggcc agggattgaa ctgcgccctc atggatacta 120gtccggtttg ttacacctca gcaacgggaa cccccctggt cactttgaag agggttttca 180tacagatcct cccacctccg ctatcagtga cctcaatgcg aatacaagtg cggtggttct 240gttaaattct ccaggttccg gaagcaagta ccgacataat cctcttgggg ctcaggattt 300ttcccctcat tggttgcctg gagttccagg accaccctgg attcacagca gcgggaataa 360gagcagctgc tggtgctgag aggcattaga agcactgccc agcttacgtc tcctttctcc 420gccagtgcca tcacctgcca ccagcgcggt tgttgcttct cccacttggg ctccaagcta 480cctggttcct gcatccaggt aagtccaaag attctgctta gctgtgattc tatttcttct 540ctccctctcc tcccctccat ttctctccca ttacttttcc ttgccggtct cagaggctct 600
atccatttcc ctcggagttc cttcatcact caatctatta cgcgatttat ctcggggtcc 660tttaacaggt aacactaaac ggtctcagtt ccagacactg agtctggctc cagttttgcg 720gtctcctgcc gcatatgtgc ttaggttaat ctcaggaagc tggagcttcc tcaagcaatg 780cgggctgagc agaacgcaga atatctttgt gtagaccgtg agctcaggga aaccctcttg 840tgcctagctg tctgcgggaa atagactcat tttggaatgg attcggaact tagaccaggg 900gaagcgggtg gcaaatagat gcaaagactg aggggcaggg agccattcaa ctgcaagtcc 960tagctgccag tttggggagt tttttggttg tttttttctc cccagtttaa gtcctgtgtc 1020ctaatttaag attccaccag cttgtttttt acagggtact ctttgccaaa gtttgaagca 1080gctgagcagt agaatttggt tcttcagttt ctcagtgatt ctaaccacag agatatgtcc 1140tcccaatccc cctcccctgc cagctatgag caaaagcctg gttcctggaa gacaactctg 1200ggttgcatta tgtgaaaagc tgtggtggct tactccgagt ttgtcctcca ggagtcttgg 1260ccaagaggtt gcaggtgaga gagtgtgtgg tactggggag ggggcaatgg actgagacca 1320cctcacccag atgttctggt aggtttcttt gctaaaccaa gcatgctgca agcgcactgg 1380atatttcagc agtgcacttg gctgaggaga aaatgatggt gaactgaaat gatatgacca 1440gcctgaagcc aagaaaccag ggagttagag gcagaggcag gagcagaatc cagggtctgt 1500aggctcatag aacttggaac tcctacaggt ggtgacatta ttcttccctt gcagaggggc 1560accatgggct tctggaagtt cccccccttc ctgatcctca gcatcctggt cctgtaccaa 1620gcaggaatgc tccatgccgc gccattcagg taagccagcc ctgccaggag ccctctcacc 1680tccctcaacc cctgaaatct tagagttctg tgttgagtgg tactatgctg aatatggctc 1740tctgtggggt tgtgggggtg tggggtcctg atgtacgaat gtaaacttgt atacaagtta 1800atcagaaatg ttttaggagg ctatgtatca caaagtttac aaataaacaa aatatatagt 1860acttgttatt tcatataacg cactgaacct cacagcatgc tgctattgct ttttctcaaa 1920catttgtacc tttagcaaac ctatttacta atttcaccat actttgagca gtgggttaca 1980tcctaatctg ctaattactt taccaataaa tttgttatta aatgtgatat gtggtccata 2040catctaattt cttaccctca ttcaaattat attaagataa atattttcat attcaaacta 2100tcattatcat ttattgttta ataatggctg tatttaacac taagctcata cagttcctga 2160aaattaccat cagctttcaa aagcctatat gatccacctc cagcaaacct cttcttttag 2220gtcaccctag agcctaactc gtggtgaagc agcatttttg catgaatact ggcctcatgt 2280cctgtctgtt gagtttggtt ggccacatcc tcagtggaag tggcagaaat gaggagtagg 2340ggttggggta ggctcagcac atgttgggtt tgcttccctt ccccaggatg gctttgggaa 2400gcagctttga ttctgccaca ctcacggaag aggaaatgtc cctcctactg gttgcaatgg 2460tgaaggatta tgtgcagatg aaggccactg tgctggagca ggagacagag gacttcaggt 2520cagtctctgc acccctccca gaatatggct taccctctcc cctggagtac caggaaggca 2580tgcgcgtgtg catgcacatg cacactcaca cacacaggta ggagagagca cagctagaca 2640ggcagcctgg ggcacaactc ttctacaggc tccactaaaa tcataggtca tgtggaagaa 2700ccacagataa aaacattcct ttctgaaagc agtaggggaa gccgtgagat cacctacagt 2760ggaaattttg tagcagtact tgggagacct cccagcactg gagtttagcc ttgtaaggta 2820aagccaggga atgaatctca tgtatctcag gagattttag aaatttggct ccttctcgtt 2880aacctgccca tgatattctt tcacacctgc aaggcatctt cattgcacat ttgcaaggtg 2940aagccagagc acttagaaaa gatgagtcag gtagagcagt ttctgaaata ggtctgaggc 3000ctttagatgt gtagaatctg tggagatgtg catgttctca tggggccaga cacctttctc 3060cagtcccaac tctctgtgca ctgagtttac tgttcatacc agctcctgac cgagctgtac 3120ctgggcagag gcatgtgctg cacctttatc cgctctaaga acctctgtgc agagcataaa 3180ggtctgagca gcatgtggaa tgccagaaaa ggtcgtccct ccccaccaca gcccttcccc 3240acatcgccct ggctcagtga acctctgcat cctcctaatg gaggatgcat gagccgccct 3300cctgcttgcc ccctcctgcc tctgttccag gtcccccttc cctggtctaa ccttctgcat 3360gactgccctt gggggcagcc ctggtgcatg gtattgtctg gcatgtcttt tccctgcagc 3420ctggacagct ccagagctaa gcagtgcaat aatctgagta cctgtgtgct gggaacatat 3480acatgggacg tcaacaagtt ttatgcattc cccttaacta caactgggat tagagtatct 3540ggcaagaaat gggtcagggc cagagtctca gagaaagtcc attatccctc aaggcagcat 3600accctaaggt gcttaagaag gcccccaccc ctcctccttt ctagttcctc tcctagaatt 3660
tgcatgtgtt cttctctggt tgctctctga gctgctatca gcagctttcc ttgtggccat 3720ggatgtctgg aatatcagag aggaggtggg gggtgggggc aggcaggcca gaagaaaatc 3780actcaggaat agattaggag agaatgggca gccctgtgag tgcctgtgga tttcacagca 3840gagcttctca gtcctgcttc tgaacatgct tttcactagg gaataaaagt atgtttctaa 3900aaacacctga gctatagtgg ccatgtcaca tgcttcatgg atacagagac ttgtctgtca 3960agtagcctta gtcctgggta gctggagtca gggcatggtg ggtggtccct ggagcaacct 4020caagttgcaa aatcaggagc actaaggaac aaaacaagca cctctgggac ttgatgctac 4080aaactcactt cctcttgcag gaagacaggg gaactttcct ttttctaagg agtactcagt 4140acctctgaat gggaggcacc ttccagacaa gtccttaaga atggggttgg gtgtgccacc 4200aaaatctctc tatgtcttgg ttaaatttta gtttacttgt acagaaaaga ttggctgtta 4260aagttctgtg ttccttggct tgttgcccag agcacatttg ggttttctga cacctctgga 4320aatgtctatg gagagtgatg atggcatttc cccaaaagcc ctatggtttt ctgttgggat 4380tttgtgttta gcagaaacat ttcaggttca ctggtccctc tcagagctat aattttccac 4440ggatggtcag tcctgggggg aagcacctgc cctcaggctc tcactgacag gccttctctt 4500tgtctccatc ctgaaaatca gcatcaccac ccaggagaga tcctgcaaca ctgccatctg 4560tgtgacccac aagatggcag gctggctgag cagatctggg agcgtggtta agaacaactt 4620catgcccatc aacatgggct ccaaagtctt gggccggcgc cgcagacagc ctcaggcctg 4680agctgtgaaa tgactctaaa aagaaggtga ctgctctaga acctggggta gcagggcaaa 4740tggctgggta ttgcagaggt gctggccaca ctctaacctt ccgtgggcct gtattataaa 4800aacatccaca gcaaaagggc caaccctagt gtccagagaa agaacagggt cccaagagct 4860gaaatcccta gaatttggaa tcacttctat ttttttcagt ttctcccagt gattctgaga 4920tcatctgcaa ggaaatatag atcctatgaa tttaaaacac tgttccctgc acttacaatt 4980gccattgtag gttttgagtt ttaaaggtaa tgatcctatc caatgagttt gaagtatatc 5040gtacaatgtc acgtacacct gaattcagag catagacttg gtttcaaatg tgatgtctgt 5100cctctactaa ctatatgacc atgggccagg ccctctctgc gtctcagcct ctacatgtaa 5160ttttaaggca aaaacagtat ctacctgtta ttgttaatat aaaaagtaat tgagataatt 5220catggcaaga gcctcaacat taataaataa taatatccta gctcttgttt tttttttctc 5280ctaggtcacc aagaagttga actcaagttg ctttcactgc aaagttgctt tccctgcaaa 5340ttaaaagaac caatttgaaa aatagcatgg aagacacaca tatatgcatg cttcttgctt 5400gaaatacaac tttttgcttg aaacaaacta aacctaaatg cagaataaaa tcattgcagt 5460tacctgatgt gtatcttttt aatatttgat tctgtattct gtaagtatga ctcatgtctc 5520actggcttat ctggtagcaa atctggaccc tgtcagccaa cctgttggtg gtggcagctc 5580tgctaaacct caggagcaca tgaaattgct gccctatggg tgtctgggga tgcacagaaa 5640tgttgagcct cagtggaacc tttaaagaaa tggtcttgga attcccatca tagctcagtg 5700gaagcaaatc tgaccagcat cgataaggat gccggtttga tccatggcct tgcccattgg 5760gtcaaggata tgttgttgcc atgagctgtg gtataggtta caggcgcagc tcagatctgg 5820cattgctgtg gctgtggtat aggccagcag ctgcagctcc gattcaaccg ctagcctggg 5880aacctccatg tgctgcaggt gcggccctaa aaagacagaa aaaaagaaga gaaaaaaaaa 5940tgttctcatt tgttcacttc atcaagccag aaaatgtatt ttcagtacac ttaaaaggag 6000tccctgctgc tatttatgct gtttccccca taagaacctc agggacctgt gaacacttgg 6060ttgaccaggt tgctcaaatg aggcaatatc gtgcttgggg tgggtcctca gtatcctgta 6120ctctcagtgt ctagtgaaac atccttatgg gattagaatc ctctgcatct cagagagaca 6180ttcacattct cagagggcac cctggttccc agccccagaa gttatctgtt ctctctctcc 6240ttgactcagg tttgccctta tccatccctg cctttcctcc ccaacagctc ctctttacac 6300atcctatagc ctgcaaaacc ctttagagca atggctcaca gcttgaaagg gtatcgcaga 6360ctggcagacc tggaaaggtc ctcagatgcc atctaatcca actttttact cttgaagttg 6420cagagaagga aaattatgtt gctcagggtc ctgcaataac tttatgagac atccctatat 6480ttaagaaata ataattgagt gtctgctatc tctttgacac tatttaagct ccaggaatag 6540agcaataaac agaacagaca aaaccccctg cattcatgga gcttatattc taactggaag 6600agactgaggt gatacatgct ctggaattag aaacattcag cactggaagg aatctgggat 6660gtcataaggg tataaaggct tatttgatat agctatttca tgggatcaac atccctggca 6720
tatgctggca atgctggtta ccatctgttg actatgactt ccaaggtgac tggacagcca 6780gtttcattgg tggacagtca attaagtggg atattttcca ttagagaagt catcccctac 6840tacctacaga ttatagttat ttcctaagaa gcacatagaa ttatgaccct tctcccattc 6900attctgtagt catcacagta acccaacctt agccataaag gtagatcaga ccatgtctcc 6960cttaggacag aatactctat tatagactcc ccttctcaca aagtaaacat tttaggcatt 7020gcagtgtctt cttaatcaac tctacttggt cagagtatat gtattaaaat ttacttccaa 7080atttggaatt ccctggtggt taaggatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg 7140ag714权利要求
1.一种肽，至少具有如下的氨基酸序列Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His- 10Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly- 20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr- 30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly 38或其中有部分氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有如下特性(1)在中枢神经系统中表达，(2)强烈地作用于降钙素受体以及(3)促进细胞的cAMP产生活性。
2.根据权利要求1的肽，其中所述肽进一步具有如下特性(4)浓度-依赖性吸收钠离子，(5)抑制钙离子吸收以及(6)抑制细胞增殖。
3.根据权利要求1或2的肽，其中所述肽至少具有序列表中的SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO9，SEQ IDNO12，SEQ ID NO16或SEQ ID NO19所示的氨基酸序列或者其中有部分氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列。
4.根据权利要求1到3任一项所述的肽，其中的肽获自哺乳动物。
5.编码权利要求1到4任一项所述的肽的基因。
6.根据权利要求5的基因，其中所述基因具有序列表中SEQ IDNO3，SEQ ID NO7，SEQ ID NO10，SEQ ID NO13，SEQ ID NO17或SEQ ID NO20所示的核苷酸序列。
7.一种包括权利要求1至4任一项所述的肽以及药用载体的药物组合物。
8.根据权利要求7的药物组合物，其中的药物组合物是骨质疏松症的预防/治疗剂，癌症的预防/治疗剂，利尿剂，食欲抑制剂或止痛剂。
9.根据权利要求7的药物组合物，其中的药物组合物是降血压剂或预防PTCA(经皮腔内冠状动脉成形术)后再狭窄的药物。
全文摘要
本发明的目的是提供在中枢神经系统中表达并作用于降钙素受体的新并且有用的蛋白质，其基因以及含有所述蛋白质的药物组合物。本发明公开了肽，至少具有下列氨基酸序列Ser－Cys－Asn－Thr－Ala－Thr－Cys－Met－Thr－His－ 10；Arg－Leu－Val－Gly－Leu－Leu－Ser－Arg－Ser－Gly－ 20；Ser－Met－Val－Arg－Ser－Asn－Leu－Leu－Pro－Thr－ 30；Lys－Met－Gly－Phe－Lys－Val－Phe－Gly 38；或通过这些氨基酸的部分缺失、取代或添加的氨基酸序列衍生的氨基酸序列，并且所述肽具有下列特性(1)在中枢神经系统中表达，(2)强烈地作用于降钙素受体，以及(3)促进细胞的cAMP－产生活性，以及，进一步优选地(4)浓度－依赖性吸收钠离子，(5)抑制钙离子吸收，以及(6)抑制细胞增殖；本发明还公开了编码这些肽的基因；以及含有这些肽的药物组合物。
文档编号C12N15/09GK1697878SQ03818749
公开日2005年11月16日 申请日期2003年5月28日 优先权日2002年6月4日
发明者南野直人, 片渊刚 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 日本国立循环器病中心