专利名称：由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法。
背景技术：
目前糖尿病的治疗主要包括饮食、药物治疗和器官移植等。药物治疗效果不持久、不符合生理，且无法阻止糖尿病的进展和心脏、血管、视网膜等并发症的发生。包括胰岛移植在内的胰腺移植是治疗糖尿病的最有价值的方法。但胰腺和胰岛细胞的来源缺乏和器官移植存在的排斥反应阻碍了胰腺移植的开展。到目前为止，国内开展的胰腺移植尚未突破50例次，远远不能满足糖尿病患者的需要。
近年来，通过干细胞分化成胰岛细胞的研究引起全球的广泛兴趣。多种干细胞如胚胎干细胞(ESC)[Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al.Science.2001；2921389]、肝脏干细胞[Yang L，Li S，Hatch H，et al.Proc NatlAcad Sci USA.2002；998078]、胰腺导管上皮内干细胞[Ramiya VK，Maraist M，Arfors KE，et al.Nat Med.2000；6278]等可分化为功能性胰岛细胞。但这些干细胞分化形成的胰岛细胞都存在显著缺陷(1)这些干细胞非来自糖尿病患者自身，如移植入患者体内必然会引起移植排斥反应。(2)这些干细胞数量少，分化效率低，形成的胰岛细胞可能满足不了临床胰岛细胞移植治疗糖尿病的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法，通过人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞。找一种具有来源丰富、无免疫排斥反应的新的胰岛细胞制备方法将可能为临床胰岛细胞移植提供更有价值的方法。
本发明的技术方案为将取自于人体的新鲜骨髓培养、筛选人骨髓基质干细胞；对人骨髓基质干细胞增殖；将增殖后的人骨髓基质干细胞利用诱导剂β-巯基乙醇和/或尼克酰胺进行诱导，即可得到由人骨髓基质干细胞分化形成的胰岛细胞。
本发明具有以下特点和其他干细胞来源的胰岛细胞相比，发明原料(骨髓干细胞)来源丰富。由于每个人体内都存在大量的骨髓，其中含有丰富的骨髓干细胞[Reyes M，Lund T，Lenvik T，etal.Blood.2001；982615]，且这些细胞容易分离、培养，细胞的增殖效率高达260以上；骨髓干细胞取材容易。只要通过骨髓穿刺等简单手段即可获取骨髓干细胞；糖尿病患者骨髓存在大量干细胞，可通过将糖尿病患者自身骨髓干细胞分离、分化成胰岛细胞，再移植给糖尿病患者本人(自体移植)。由于这些细胞来自于患者本身，不存在其他各类胰岛细胞移植必然产生的移植排斥反应，可避免因排斥反应导致的细胞功能衰竭；本产品产生的可重复性好。我们已采用同样的方法反复培养细胞多次，均可以得到稳定的细胞产品；整个分化过程所需时间短，仅约10天～15天左右即可获得胰岛细胞。由本方法获得胰岛细胞可以批量生产、获得大量的人胰岛素，这类胰岛素由于来源于患者本身，无免疫原性，效果将更为持久。此方法骨髓基质干细胞诱导分化形成胰岛细胞目前在国际、国内都未见报道。
图1本发明诱导分化形成的胰岛细胞团的形态学观察图I图2本发明诱导分化形成的胰岛细胞团的形态学观察图II图3本发明诱导分化形成的胰岛细胞团的形态学观察图III图4本发明诱导分化形成的胰岛细胞团的形态学观察图IV图5本发明诱导分化形成的胰岛细胞团的形态学观察图V图6本发明诱导分化形成的胰岛细胞团的形态学观察图VI图7本发明免疫细胞化学技术标记分化后细胞表达胰岛素图I图8本发明免疫细胞化学技术标记分化后细胞表达胰岛素图II图9本发明免疫细胞化学技术标记分化后细胞表达胰岛素图III图10本发明免疫细胞化学技术标记分化后细胞表达胰岛素图IV图11本发明免疫细胞化学技术标记分化后细胞表达胰岛素图V图12本发明免疫细胞化学技术标记分化后细胞表达胰岛素图VI具体实施方式
材料人骨髓取自正常健康人群。低糖Dulbecco最低必需培养培养基(L-DMEM)、高糖Dulbecco最低必需培养培养基(H-DMEM)、RPMI1640培养基、HAM培养基、Fischer培养基、胎牛血清(FSC)、B27等外购，白血病抑制因子(LIF)、β-巯基乙醇、尼克酰胺、碱性磷酸酶组织化学检测试剂盒、胰岛素(Insulin)单克隆抗体、Nestin、PDX-1、OCT-4单克隆抗体、胰岛素放射免疫(RIA)检测试剂合、Nanog抗体外购。
仪器细胞培养箱、流式细胞仪、倒置相差显微镜、放射免疫检测仪。
实施方法1、骨髓基质干细胞的培养、筛选和增殖。本步骤的目的是分离骨髓基质干细胞，并促进骨髓干细胞的大量增殖。该步骤有多实施方法实现实施例1无菌条件下取人新鲜骨髓0.1～4ml，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer充分吹打成单细胞悬液，200目筛网过滤，调整细胞密度，按1×109/L密度接种，37℃、5％CO2的细胞培养箱培养48小时后更换培养液，弃去未贴壁细胞，此后每3-4天换液1次。约10天待贴壁接近长满瓶底时以0.25～0.5％胰蛋白酶消化、吹打成单细胞悬液，1000r/min离心10分钟，弃上清，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer悬浮沉淀，按1∶3～8比例传代。
实施例2无菌条件下取人新鲜骨髓0.1～4ml，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer充分吹打成单细胞悬液，200目筛网过滤，调整细胞密度，按1×109/L密度接种，37℃、5％CO2的细胞培养箱培养48小时后更换培养液，弃去未贴壁细胞，向细胞培养液中加入LIF，每3-4天换液1次。约10天待贴壁接近长满瓶底时以0.25～0.5％胰蛋白酶消化、吹打成单细胞悬液，1000r/min离心10分钟，弃上清，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer悬浮沉淀，按1∶3～8比例传代。
实施例3无菌条件下取人新鲜骨髓0.1～4ml，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer充分吹打成单细胞悬液接种培养48小时后弃去未贴壁细胞，贴壁细胞消化后进行梯度稀释培养以形成单细胞克隆，原位杂交、RT-PCR或免疫细胞化学、流式细胞仪技术检测Nanog表达，挑选Nanog+细胞克隆进行培养传代3～10代，加入视黄酸(Retinoic Acid)抑制Nanog表达。
实施例4无菌条件下取人新鲜骨髓0.1～4ml，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer充分吹打成单细胞悬液接种培养48小时后弃去未贴壁细胞，向培养细胞导入Nanog基因后筛选培养传代3～10代，加入视黄酸(Retinoic Acid)抑制Nanog表达。
实施例5无菌条件下取人新鲜骨髓0.1～4ml，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer充分吹打成单细胞悬液接种培养48小时后弃去未贴壁细胞，流式细胞仪技术筛选CD34-，CD44low，CD45-，CD117(cKit)-，I类HLA-，和HLA-DR-细胞，传代培养。
实施例6无菌条件下取人新鲜骨髓0.1～4ml，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer充分吹打成单细胞悬液接种培养48小时后弃去未贴壁细胞，贴壁细胞消化后进行梯度稀释培养以形成单细胞克隆，原位杂交、RT-PCR或免疫细胞化学、流式细胞仪技术检测OCT-4表达，挑选OCT-4+细胞克隆进行培养传代3～10代。
实施例7无菌条件下取人新鲜骨髓0.1～4ml，用含0.5～20％FSC的L-DMEM/RPMI1640/HAM/Fischer充分吹打成单细胞悬液接种培养48小时后弃去未贴壁细胞，细胞化学法检测碱性磷酸酶(AKP)表达水平，挑选AKP+细胞克隆进行传代培养。
2、诱导骨髓干细胞分化为胰岛细胞。本步骤的目的是通过诱导剂的诱导手段促使骨髓干细胞分化形成胰岛细胞，并促进胰岛细胞增殖。该步骤有多实施方法实现。
实施方式1取传代骨髓干细胞细胞接种，待细胞长至50％-90％融合时，按下列方法诱导骨髓干细胞分化用1～20mmol/L尼克酰胺和1～10mmol/Lβ-巯基乙醇的培养液L-DMEM(培养液含0.5～20％FSC)预先诱导10～48小时，更换培养液，用PBS洗涤，再加入含1～10mmol/L尼克酰胺和0.1～10mmol/Lβ-巯基乙醇的无血清培养液H-DMEM(培养液含2％B27和1～10ng EGF和1～10ng bFGF)诱导4～48小时，用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer培养。
实施方式2用含1～20mmol/L尼克酰胺的L-DMEM(0.5～20％FSC)预先诱导10～48小时，更换培养液，PBS洗涤3次，再加入含1～20mmol/L尼克酰胺的无血清H-DMEM诱导5～24小时。用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer培养。
实施方式3按实施方案1诱导后，不含EGF、bFGF等生长因子的培养基，按同样方法培养细胞。
实施方式4用含1～10ng EGF和/或1～10ng bFGF的培养液培养干细胞1～10代，用不含EGF、bFGF等生长因子的培养基，待细胞长至50％-90％融合时，再用含1～20mmol/L尼克酰胺的L-DMEM(培养液含0.5～20％FSC)预先诱导10～48小时，更换培养液，PBS洗涤3次，再加入含1～20mmol/L尼克酰胺的无血清H-DMEM诱导5～24小时。
实施方式5用含1～10ng EGF和/或1～10ng bFGF的培养液培养干细胞1～10代，用不含EGF、bFGF等生长因子的培养基，待细胞长至50％-90％融合时；1～20mmol/L尼克酰胺+1～10mmol/Lβ-巯基乙醇的L-DMEM(含0.5～20％FSC)预先诱导10～48小时，更换培养液，洗涤，再加入含1～10mmol/L尼克酰胺+0.1～10mmol/Lβ-巯基乙醇的无血清H-DMEM(含2％B27+1～10ng EGF+1～10ng bFGF)诱导4～48小时。
骨髓基质干细胞分化为胰岛细胞的形态学鉴定图1所示，倒置显微镜下放大40倍观察培养细胞，可见散在的未分化骨髓干细胞，呈单个、梭形贴壁生长(↑)。而分化为胰岛细胞的细胞则呈团或葡萄状聚集，细胞呈圆形，内含丰富的分泌颗粒 图2所示，放大200倍观察骨髓细胞分化为胰岛细胞，可见分化后的胰岛细胞呈典型的圆形聚集排列。
图3所示，骨髓基质干细胞诱导分化为胰岛细胞的形态学观察，可见典型的葡萄状、圆形胰岛细胞形成。
图4所示，另外一组骨髓基质干细胞诱导分化为胰岛细胞，可见典型的葡萄状、圆形胰岛细胞形成。
图5所示，又一组骨髓基质干细胞诱导分化为胰岛细胞，可见典型的葡萄状、圆形胰岛细胞形成。
图6所示，又一组骨髓基质干细胞诱导分化为胰岛细胞，可见典型的葡萄状、圆形胰岛细胞形成。
骨髓干细胞分化为胰岛细胞的功能学鉴定免疫组织化学检测胰岛素Insulin表达免疫细胞化学的基本原理是利用抗原-抗体的特异反应来标记细胞表达的蛋白质。在本专利实施中，我们用抗胰岛素单克隆抗体和细胞中的蛋白质反应，如细胞中有胰岛素表达，抗体就和胰岛素结合，再通过与抗体偶联的化学反应显色，就可以测定细胞是否表达相应蛋白质及蛋白质表达水平。本方案中如细胞显示棕色染色，就表明细胞表达胰岛素；如没有棕色显色，则细胞不表达胰岛素。在诱导分化为胰岛样细胞的胞浆中可以见到大量的Insulin阳性表达产物，而在未分化的梭形细胞未见到Insulin表达。
通过免疫细胞化学技术标记细胞内胰岛素，发现在诱导分化后的胰岛细胞团中大量的胰岛细胞表达丰富的胰岛素分子。说明通过诱导骨髓基质干细胞分化后，这些分化的细胞可以产生胰岛素，因而这些细胞是有产生胰岛素功能的胰岛细胞。
而在没有分化成胰岛细胞的那些梭形细胞中没有胰岛素表达(↑)，说明没有分化的骨髓干细胞不产生胰岛素。
如图7所示，免疫细胞化学法检测细胞表达胰岛素情况(胰岛素为棕色↑)，可见到分化形成的胰岛细胞中有大量的棕色颗粒，即这些细胞表达大量的胰岛素。而在未分化的骨髓干细胞中，无棕色颗粒，即这些细胞不表达胰岛素。
如图8所示，另外一组诱导分化的胰岛细胞团中也有大量的胰岛素表达，未分化细胞不表达胰岛素。
如图9所示，又一组分化胰岛细胞(放大200倍)中可见丰富的胰岛素阳性棕色颗粒。
如图10所示，再一组分化的胰岛细胞团，同样可见到极其丰富的胰岛素表达，说明骨髓干细胞成功分化成为具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞。
如图11所示，又一组分化的胰岛细胞团，分化的胰岛表达丰富的胰岛素，说明骨髓干细胞成功分化成为具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞。
如图12所示，再一组分化的胰岛细胞团，分化的胰岛表达丰富的胰岛素，说明骨髓干细胞成功分化成为具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞。
骨髓基质干细胞诱导分化为胰岛细胞前后分泌的胰岛素水平测定放射免疫方法测定胰岛细胞分泌胰岛素水平。放射免疫测定方法的基本原理是竞争抑制。样品中的胰岛素和一定量的胰岛素抗体结合后，将I125标记胰岛素再与抗体进行结合反应。在测定结合物中的I125含量。由于总抗体含量一定，样品中的胰岛素就和标记胰岛素竞争胰岛素抗体，因而结合物中的I125就可反映样品中的胰岛素含量。放射免疫方法具有特异性好、灵敏度高的特点。
为进一步确定骨髓基质干细胞是否分化成为胰岛细胞，我们对骨髓基质干细胞分化为胰岛细胞前后的细胞培养上清液进行胰岛素浓度测定(放射免疫法)。在流组测定的细胞中，可以发现，在细胞分化前，培养液中的胰岛素浓度很低(可能来源于培养基)。而在诱导分化为胰岛细胞48小时后，这些细胞的培养液中的胰岛素浓度明显增加，说明诱导分化的胰岛细胞向培养液中分泌了大量的胰岛素，进一步证明了这些分化的细胞具有分泌胰岛素的功能，即骨髓干细胞成功分化为胰岛细胞。见下表表不同组骨髓干细胞分化为胰岛细胞前后细胞培养液中胰岛素浓度(RIA法)组别 诱导分化前诱导分化48小时分泌胰岛素水平(IU/L) 分泌胰岛素水平(IU/L)11.67 410.7922.53 383.2131.53 465.8143.36 308.2852.20 516.4563.40 597.0权利要求
1.由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法，其方法是将取自于人体的新鲜骨髓培养、筛选人骨髓基质干细胞；对人骨髓基质干细胞增殖；将增殖后的人骨髓基质干细胞利用诱导剂β-巯基乙醇和/或尼克酰胺进行诱导，即可得到由人骨髓基质干细胞分化形成的胰岛细胞。
2.如权利要求1所述由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法，其特征在于所述进行诱导是利用β-巯基乙醇和尼克酰胺的低糖最低必需培养培养基预先诱导10～48小时，更换培养液，洗涤，再加入β-巯基乙醇和尼克酰胺的无血清高糖最低必需培养培养基进行诱导4～48小时。
3.如权利要求2所述由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法，其特征在于所述高糖最低必需培养培养基中含有B27和EGF和bFGF。
4.如权利要求2所述由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法，其特征在于所述的低糖最低必需培养培养基中含有胎牛血清。
5.如权利要求2所述由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法，其特征在于在利用β-巯基乙醇和尼克酰胺的低糖最低必需培养培养基预先诱导步骤前，先用含EGF和/或bFGF的培养液培养干细胞1～10代，用不含EGF、bFGF等生长因子的培养基。
6.如权利要求1所述由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法，其特征在于所述进行诱导是用含EGF和/或bFGF的培养液培养干细胞1～10代，撤去FGF和/或EGF；用含尼克酰胺的低糖最低必需培养培养基预先诱导10～48小时，更换培养液，PBS洗涤，再加入含尼克酰胺的无血清高糖最低必需培养培养基诱导5～24小时。
7.如权利要求1所述由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法，其特征在于诱导后用含0.5～20％FSC的培养基L-DMEM或RPMI1640或HAM或Fischer培养。
8.如权利要求1～7所述任意1项由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法，其特征在于所取新鲜骨髓为0.1～4毫升单位，预先诱导所用β-巯基乙醇为1～10mmol/L单位，预先诱导所用尼克酰胺为1～20mmol/L单位，所用EGF为1～10ng单位，所用bFGF为1～10ng单位，第二次诱导所用β-巯基乙醇为0.1～10mmol/L单位，第二次诱导所用尼克酰胺1～10mmol/L单位。
全文摘要
本发明公开了一种由人骨髓基质干细胞分化形成胰岛细胞的方法。它是将取自于人体的新鲜骨髓培养、筛选人骨髓基质干细胞；对人骨髓基质干细胞增殖；将增殖后的人骨髓基质干细胞利用诱导剂β－巯基乙醇和/或尼克酰胺进行诱导，即可得到由人骨髓基质干细胞分化形成的胰岛细胞。由于本方法的细胞可取自于患者本身，不存在其他各类胰岛细胞移植必然产生的移植排斥反应，可避免因排斥反应导致的细胞功能衰竭；本产品产生的可重复性好。本发明原料(骨髓基质干细胞)来源丰富。
文档编号C12N5/071GK1609198SQ20031011127
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月23日 优先权日2003年10月23日
发明者陈立波, 姜晓兵, 杨炼 申请人:陈立波, 姜晓兵, 杨炼