专利名称：类产碱假单胞菌基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的新启动子，所述新启动子可用于在宿主细胞中表达异源基因。
背景技术：
蝗虫属直翅目(Orthoptera)蝗科(Locustidae)，是一种世界性的有害昆虫。在我国是全国性分布和危害。尤其以北方最为严重，在北方草原，以其“种类多、数量大、分布广、危害重”等特点成为草地第一害虫(刘世贵，四川大学学报，1992，292-8)仅北方草原和青藏高原草地，每年发生并危害的面积近1000万公顷，严重危害牧草生长，使草地产草量下降30-70％(李克夫，马耀，杜文亮。中国草地，1992，(1)50-52)，造成巨大经济损失。蝗虫的危害还是导致草地退化、沙化、自然生态环境条件恶化等的重要因素之一。
1991年在重庆市歌乐山林场发现了许多黄脊竹蝗(Ceracris kiangsu)的自然病死虫，从虫尸内分离到一种病原茵，经回复感染原宿主，能引起原宿主致病并死亡，从虫尸体中分离到同样的病原菌，证明该病原茵为蝗虫自身的致病菌。经感染主要草地害虫的初步试验结果表明，该病原茵对多种草地蝗虫具有较高的感染力，5天的致死率高达90％以上，对草地的草原毛虫(Gynephorap runergensis)、粘虫(Leucania separata)也有一定的感染力。并对多种草地蝗虫有较强的感染力，该菌株经鉴定为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(刘世贵，朱文，杨志荣等.微生物学报，1995，35(2)86-89)。
近年来对其杀虫致死机理、杀虫蛋白(张文，杨志荣，微生物学报，1998，38(1)57-62)、安全性(杨志荣，朱文，葛绍荣等。中国生物防治，1996，12(3)114-116)等方面进行了深入研究，证明该菌对蝗虫致病，是由于其代谢产生的一种杀虫蛋白所致。该蛋白分子量为25100Da，在国内外属首次报道。经研究表明该菌无芽孢，本身具有较强毒蛋白，故具有构建成为遗传工程菌，广泛用于生物防治的潜力。由于该菌的遗传背景不清楚，克隆该菌的强启动子可以保证对该菌进行有效的遗传修饰，如在该菌中导入几丁质酶基因使以该菌为原料的灭蝗剂更好地渗入蝗虫体内。
本文中，“启动子”指存在于转录起始位点附近且控制基因表达的DNA区。此外，“启动子活性”指启动子控制其下游基因表达的活性。
基因工程可从一个生物体中分离结构基因并在不同的生物体中表达该基因。基因的表达包括核酸转录为mRNA和mRNA翻译成蛋白质。
为了在新的生物体中表达结构基因，必须将基因与适当位置处的基因转录信号的调节序列连接。调控序列一般包括结构基因上游的启动子序列。启动子序列是指导结构基因转录的DNA序列。结构基因的核酸序列被转录成信使RNA(mRNA)，然后被翻译成特定多肽或蛋白质的特征性氨基酸序列。启动子序列一般位于基因的5’区域，结构基因转录起始位点的上游。
启动予可以是诱导型的，也可以是组成型的。诱导型启动子对诱导剂的反应是活性增加，从而使可操作相连的编码序列的转录速率增加。与之形成对照的是，在组成型启动子的控制下，基因的转录速率不受调节。然而，值得注意的是通过加入操纵基因序列可使组成型启动子变为诱导型启动子。例如，在T7噬菌体启动予中加入lac操纵基因，使其由组成型启动子转变为能被IPTG诱导的启动予(Rosenberg等，美国专利4,952,496)。
尽管不受诱导剂的控制，一些组成型启动子可提供比其它启动子水平更高的转录。提供高水平基因转录的高活性启动子在基因产物的商业生产中具有显著的优点。
通常，启动子在其天然宿主体外指导转录的能力各不相同。另外，特定启动子的转录速率也可随启动子所作用的特定宿主的不同而变化。原核生物启动子与真核生物启动子在DNA保守序列以及基本结构有很大的不同，同是原核生物由于启动子的序列的不同以及不同的宿主细胞转录酶系统的差异，使得外源基因启动子调控之下的基因表达差异极大，结果是表达效率极低或者根本不表达。
由于现在基因工程操作系统在原核生物大部分采用的是以大肠杆菌或枯草杆菌为模式菌株的操作平台，这两种菌株的启动子序列在假单胞菌中转录效率一般很低，因此，需要能在广范围宿主细胞中促进高水平转录的新启动子。
本发明提供了分离自类产碱假单胞菌的新的启动子序列，该启动子在原核细胞(大肠杆菌，类产碱假单胞菌)中进行高水平的基因表达。
发明内容
本发明提供了分离自类产碱假单胞菌的新的启动子序列(SEQ ID NO1)。本发明包括含有本发明启动子序列的基因构建体，所述启动子序列与结构基因的DNA序列可操作相连。本发明还提供了表达由本发明基因构建体的结构基因编码的产物的载体和宿主细胞，以及被与启动子可操作相连的异源基因转化的细胞。
分离的核酸序列作为转录启动子起作用(SEQ ID NO1)。本发明的启动子序列与结构基因可操作相连以指导结构基因在原核中的转录。相对于天然或其它非天然启动子而言，本发明的启动子序列提供了高水平的基因表达，这一点如下文实施例所示。
本发明涉及分离自类产碱假单胞菌基因组的新的核酸序列，该序列显示出很强的启动子活性。本发明的启动子序列与结构基因序列可操作相连，形成“基因构建体”或“表达盒”。在与结构基因DNA序列相连，结构基因可以是编码肽，蛋白质，激素，酶等的任何适当的序列，使用已知方法将基因构建体直接地，或经由载体掺入宿主细胞。基因构建体也优选包括增强子，标记物，聚腺苷酸化序列或其它调节核酸序列。蛋白质表达产物保持细胞内，或者当基因构建体中含有编码信号肽的核酸序列时，所述蛋白质产物被分泌到细胞外。在典型的实施方案中，基因构建体的结构基因序列是异源序列。本文所用的“异源序列”是不同于类产碱假单胞菌中与启动子序列可操作相连之序列的DNA序列。根据此实施方案，适当结构基因的例子包括卡拉霉素抗性基因，几丁质酶基因等。
本发明的基因构建体被导入适当的用于表达基因产物的宿主细胞。直接转化宿主细胞，或通过载体进行转化。在一个实施方案中，用于转化的宿主细胞是例如大肠杆菌菌株JM109的原核细胞，用于转化的适当载体是质粒。
具体地，启动子区可通过如下方法获得，但不限于此。
本发明的启动子可用诸如基因组DNA文库筛选法进行分离。即可用合适的载体直接从DNA文库中进行克隆，或利用已知类产碱假单胞菌cDNA、DNA或其部分作为探针通过与微生物的基因组DNA文库杂交来筛选所述启动子，或利用根据类产碱假单胞菌cDNA或类产碱假单胞菌基因组DNA而设计的引物以及用微生物的基因组DNA文库为模板通过聚合酶链式反应(PCR)来筛选所述启动子。
本发明的启动子也可通过常规方法利用核酸的化学合成产生，如膦酰胺法[Mattencci，M.D.&Caruthers，M.H.，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)103，3185(1981)]和亚磷酸三酯法[Hunkapiller，M.等，Nature 310，105(1984)]。
通常，启动子活性的存在或强度可通过将某蛋白质的编码基因(报道基因)以能表达的方式连接在待测启动子的下游来判定，其中所述蛋白质可通过如标记基因抗性反应、颜色反应或发光反应，或通过用它转化宿主细胞，或通过检测所述如标记基因抗性反应、颜色反应或发光反应来定量测定。
具体地，启动子活性的存在或强度可通过如下方法获得，但不限于此。
1)克隆包含上述基因组DNA或基因组文库的转录调节区的DNA。
2)将1)所获DNA中除类产碱假单胞菌基因编码区以外的DNA片段亚克隆至质粒中，然后将报道基因(如新霉素磷酸转移酶基因或萤光素酶基因等)连接至该2-5kbpDNA片段的下游，以构建一个报道质粒。将报道基因连接至这些DNA片段的下游以构建报道质粒。其中报道基因连接在所述DNA片段下游。
3)位于类产碱假单胞菌基因上游区的启动子区可通过测定，用2)所构建之报道质粒所转化的微生物的报道蛋白活性(例如新霉素磷酸转移酶活性或萤光素酶活性等)来鉴定。
本发明的启动予可用于多种原核宿主细胞。在一个实施方案中，在包括大肠杆菌，类产碱假单胞菌以及其它假单胞菌中使用本发明的启动子促进高水平的基因表达。
本发明还提供了生产蛋白质组分的方法。根据此实施方案，在被本发明基因构建体转化的宿主细胞中产生了蛋白质产物。该基因构建体包括与编码有待在宿主细胞中产生的蛋白质的结构基因可操作相连的本发明的启动子序列。本发明也提供了筛选和分离具有强转录特性的启动子序列(包括下文所示类产碱假单胞菌启动子的截短形式)的方法。
下文实施例中更全面地描述了发现这些新启动子序列的方法。简而言之，类产碱假单胞菌基因组产生限制性DNA片段(Van Etten，1991，微生物学评论，55586-620)。使用已知方法，通过鸟枪克隆法(Sambrook等，1989，分子克隆)将限制性片段插入质粒pSUPV4(张义正等。四川大学学报(自然科学版)，1998，35(2)263-267.)。
质粒载体pSUPV4(图示1)含有的无启动子的卡那霉素抗性标记基因(Kanr)来自转座子Tn903的新霉素磷酸转移酶基因，该基因的启动子和编码区的前30个核苷酸已被除去，基因内的HindIII位点已被消除.在其上游含有多克隆位点以插入DNA限制性片段。然后，用克隆的pSUPV4转化大肠杆菌，用卡那霉素抗性筛选携有启动子序列的转化子。为了得到高活性的启动子，使用生长培养基中增加浓度的卡那霉素进一步筛选卡那霉素抗性转化子。
本文所用的启动予“强度”指的是由启动子指导的转录水平。“强”启动子提供了比弱启动予更高水平的转录。因此，术语“强启动子”可以与“高活性启动子”互换使用。强启动子对于基因产物的商业生产特别有用。
应理解启动子功能可能不需要SEQ ID NO1中每一个所述的完整核酸序列。使用上文和下文实施例中所述的方法，可进一步地限制，如截短或修饰本发明的启动子序列，并进行筛选以提炼出有活性的启动子区域。
制备基因构建体根据本发明，基因构建体包括至少一种与转录控制区可操作相连的结构基因编码序列。转录控制区包括启动子和其它调节元件，如增强子，调节元件，聚腺苷酸化序列，转录起始区和转录终止序列。SEQ ID NO1包括启动子序列，也可包括其它调节元件。将启动子序列与结构基因序列可操作相连的方法是已知的，例见Itakuri等，1977，科学，1981056-1063。
本发明基因构建体的结构基因一般编码蛋白质或多肽产物。使用已知方法可将任何已知的或后来发现的编码所需产物的结构基因与本发明的启动子序列可操作相连。适用于与本发明启动子一起使用的已知结构基因的例子包括编码下列物质的那些核酸序列新霉素磷酸转移酶基因、苯丙酸盐二氧合酶、吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶(Pyridinenucleotide-disulphide oxidoreductase)，以及其它结构基因。
因此，在一个实施方案中，本发明的启动子序列与编码新霉素磷酸转移酶基因的DNA序列可操作相连。
基因转化方法一旦形成基因构建体，直接将它导入宿主细胞，或亚克隆至适当载体中以转化宿主细胞。
转化细胞的方法是已知的，优选的方法随被转化宿主细胞的类型而变化。本文所用的“宿主细胞”指的是最终表达基因构建体的结构基因的细胞。对于包括细菌，酵母和动物宿主细胞的原核和真核宿主细胞而言，优选的转化方法色括冻融法，氯化钙沉淀法，磷酸钙沉淀法，质粒，原生质体转化，脂质体指导的转化，电穿孔和三亲株杂交转化其它已知的转化方法。
本发明的启动子可用于多种原核宿主细胞。用于表达本发明基因构建体的适当细菌宿主细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)，类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)等。
将基因构建体携至原核宿主细胞的适当载体系统包括例如质粒，病毒，噬菌体。如下文实施例中所述，适于用本发明基因构建体转化细菌宿主细胞的适当质粒包括pSUPV4或pUC18。
图1图解说明了pSUPV4质粒的物理图谱及其多克隆位点区图2图解说明了重组质粒电泳3图解说明了PA7片段的启动子区序列分析4图解说明了PA7片段的Southern杂交分析图5图解说明了次克隆重组子BamHI、EcoRV酶切图具体实施方式
参照下列实施例更全面地描述本发明，但实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1类产碱假单胞菌总DNA提取接种类产碱假单胞菌于2ml LB中活化过夜，以1∶100接种于50ml肉汤培养基中，培养12hr。将菌体到入50ml离心管中，以3500rmp离心10min，去上清液，将离心管倒扣于纸巾上让上清夜流尽；加少量溶菌液悬浮菌体，再补充溶菌液到总体积4ml，加入1mlSDS，混匀，60℃10min；加入等体积的苯酚、酚/氯仿抽提物、氯仿各抽提一次；取上层液，加入1/10体积的3M醋酸钾(pH4.8)，混匀，再沿管壁加入2倍体积100％冰冷乙醇，轻轻摇动至丝状沉淀出现；以2000rpm离心5分钟，去上清液；加1ml70％乙醇，洗涤沉淀一次，置室温自然干燥；将沉淀溶于适量TE中。
实施例2产生DNA片断用类产碱假单胞菌总DNA提取液(1μg)通过在(100μl体积的)100mMNaCl，50mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇中用Sau3A I[宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)]，消化产生类产碱假单胞菌DNA片段。将混合物于37℃保温120分钟，通过10mMEDTA终止反应。用乙醇从消化混合物中沉淀出Sau3A1片断，并用乙醇洗涤。
实施例3转化大肠杆菌和选择转化子通过Sambrook等在1989，分于克隆中所述的鸟枪克隆法将按实施例1所述产生的Sau3AI病毒片断克隆至质粒pSUPV4中。质粒启动子探针型载体pSUPV4(APr)由四川大学生命学院分子生物学实验室构建(张义正等。四川大学学报(自然科学版)，1998，35(2)263-267.)。pSUPV4的图谱示于图1。按Sambrook等(文献同上)所述或根据厂商的指导进行DNA的制备，补平反应和连接。
将类产碱假单胞菌DNA片段与1μg预先经BamHI和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理过的pSUPV4连接，产生重组质粒PA1；PA2；PA3；PA4PA5；PA6；PA7；PA8；PA9。这9个与异源卡那霉素抗性标记基因(Kanr)可操作相连的类产碱假单胞菌启动子。牛小肠碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)。
质粒载体pSUPV4含有的无启动子的卡那霉素抗性标记基因(Kanr)来自转座子Tn903的新霉素磷酸转移酶基因，该基因的启动子和编码区的前30个核苷酸已被除去，基因内的HindIII位点已被消除.在其上游含有多克隆位点以插入DNA限制性片段。被pSUPV4转化的大肠杆菌细胞对氨苄青霉素具有抗性，但对卡那霉素敏感，当一段外源片段插入pSUPV4任意一个多克隆位点时，只有其插入方向正确、具有基因启动子序列、具有翻译起始密码子、两基因编码区相位保持一致时才能显示出卡那霉素抗性.如果插入这种启动子，携有重组质粒的细胞即表达新霉素磷酸转移酶基因，从而获得卡那霉素抗性。
实施例4重组子的筛选按Sambtook等，1989(文献同上)所述进行大肠杆菌DH5α和JM109的转化。所述大肠杆菌菌株购自Promega(Madison，WI)。
筛选经转化的大肠杆菌的可显示被pSUPV4转化的氨苄青霉素抗性和显示启动子插入的卡那霉素抗性。通过在递增量的卡那霉素存在下测定细胞生长来估计插入的启动子的强度。
在含有50μg/ml氨苄青霉素和多种浓度卡那霉素(5，10，20，30，50μg/ml)的Luria肉汤(LB)平板上分离阳性菌落。选择抗50μg/ml卡那霉素的大肠杆菌菌落，接种于含100，200，400，600，700，900，1000，1200，1500，2000μg/ml卡那霉素的LB培养基中。通过测定培养物的O.D.500来监测细胞生长。
得到几千个抗20μg/ml卡那霉素的转化子。抗卡那霉素的转化子数目随抗生素浓度的增加而显著降低。仅有约50个转化予抗30μg/ml卡那霉素，仅有9个转化子显示出对50μg/ml卡那霉素的抗性。将这9个重组子依次命名为pPA1-pPA9。被未插入启动予的对照pSUPV4转化的细胞对浓度大于10μg/ml卡那霉素的氯霉素没有抗性。
将显示出对50μg/ml卡那霉素具有抗性的9个转化于进一步暴露于500，700，900，1000，1200，1500，2000，μg/ml卡那霉素中。6个转化子在含有1000μg/ml卡那霉素的LB培养基中显示出正常生长，有一个转化子在1500μg/ml卡那霉素存在下显示正常生长实施例5纯化质粒DNA使用小量柱式质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒(购自于上海华舜生物工程有限公司)，从显示出最高水平卡那霉素抗性(50至1500μg/ml)的那些菌落中纯化质粒DNA。通过限制性核酸内切酶消化对质粒进行分析，结果表明所有质粒都携有DNA插入片段。
对其进行卡那霉素抗性水平测定及HindIII酶切分析，并在7.5％聚丙烯酰胺凝胶或0.8％琼脂糖凝胶上电泳，电泳凝胶显示出大小为300至2000bp的7个病毒启动子片段(图示2)。发现片段大小与卡那霉素抗性水平高低没有相关性(表1)。其中pPA4，pPA5，pPA7，pPA8，pPA9的插入片段大小都约为2000bp，卡那霉素抗性水平均大于1000μg/ml。其中pPA7的卡那霉素抗性达到1500μg/ml，与其它报导的用该方法分离的强启动子抗性相当(1998四川大学学报(自然科学版)，35(5).776-780)。因此选用PA7片段作进一步的研究。
表1 重组子插入片段的大小及卡那霉素抗性水平
实施例6测定启动子片段序列用HindIII从PA7载体上切下含启动子的类产碱假单胞菌DNA片段并亚克隆至pUC18或pBluescriptSK(十)II以供测序。测序采用ABI公司PRISMTM377XL DNA Sequencer进行测序，大连宝生物有限公司完成。
由片段两端所带的pSUPV4多克隆区限制酶切位点断定该片段正向插入了pUC18中。测序结果显示该片段长2070bp，在521bp、549bp处分别有限制酶XmaIII及BstXI的酶切位点，有7个ATG翻译起始位点与pSUPV4上的卡那霉素编码区相位相同。启动予片段DNA序列的大小与通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的限制性片段的大小相符。
比较原核生物典型启动子的保守序列及启动子结构(P.C.Turner，A.G.McLennan，A.D.Bates.1999.Molecular Biology(影印版).北京科学出版社，165-187)，PA7片段5’端980-1100bp片段中具有原核生物启动子区的保守序列-10区TATACT，-35区TTGATT，和两处可能的UP区。该片段中的启动子-10区、-35区与典型原核生物启动子基本吻合，两区相距15bp，-10区保守T后第9个G可能为转录起始位点。对于大多数启动子而言，启动子强度与保守序列的一致性呈正相关。因此从序列上判断该启动子为强启动子。另外，在原核生物强基因启动子还包含了UP区(Rao，L.等J.Mol.Biol，1994，2351421，Ross，W.等Science，1993，2621407)，它位于-35区上游(图示3)，没有一定的保守序列，富含AT，被RNA聚合酶的α亚基的C末端识别。在本片段中-35区上游有两处富含AT的序列，AT含量均大于75％，推测可能为UP区。在转录起始位点下游还有原核生物翻译必需的SD序列GGATAA以及与卡那霉素抗性基因相位一致的翻译起始位点ATG。负超螺旋的DNA往往因为解链所需的能量较小而加强转录，说明在转录起始，链的裂解是非常重要的，而转录起始链的裂解常常由-10区开始。本片段上-10区与转录起始位点间的AT含量约为75％，对DNA双链裂解是十分有利的。
实施例7Southern杂交分析将PA7片段制成探针分别与BamHI完全酶切的类产碱假单胞菌P.pseudoalcaligenes及E.coli JM109总DNA进行杂交，结果显示在类产碱假单胞菌的DNA中具有一条较强的杂交带信号带，而大肠杆菌E.coli的DNA中没有明显的杂交信号，证明该片段来自于类产碱假单胞菌基因组且可能以单拷贝存在(图示4)。
实施例8PA7片段的PCR次克隆为了进一步确定PA7片段的启动子区即为序列所确定的启动子区(5’端931-1090bp)，在保证PCR次克隆片段定向连接到pSUPV4的多克隆位点区并保持与卡那霉素抗性基因编码区相位一致的情况下，分别在PA7片段5’端764bp、899bp处设计正向引物FPPA2、FPPA1，在5’端1120bp、1933bP处设计反向引物RPPA2、RPPA1进行PCR次克隆。
引物由大连宝生物工程有限公司和上海生工生物有限公司合成。
FPPA15’-ATTGGATCCTGGTCAAGCAGGGAAACTACT-3’FPPA25’-ATTGGATCCCGACAGCAACTGCCCGAACCT-3’RPPA15’-CCGGATATCGATTGCCAGGGACTCTTCGTT-3’RPPA25’-ACCGATATCTCAATGACAGTGACCTGTGCG-3’其中GGATCC为BamHI酶切位点，GATATC为EcoRV酶切位点。
通过PCR扩增得到次克隆重组子pPA7-1、pPA7-2、pPA7-3，通过BamHI、EcoRV酶切证明有插入片段(图示5)，插入片段与序列分析一致，分别为1034bp、221bp、356bp。测定卡那霉素抗性发现三种次克隆产物的抗性相似(表2)，在600μg/ml左右，该结果从功能上证明了pPA7-2所克隆的5’端899-1120bp片段在大肠杆菌中具有启动子的功能，这与序列分析的结果一致。该结果还表明5’端1120bp后的片段缺失对启动子没有影响，启动子区前200bp没有类似增强子的序列存在。5’端0.7Kb片段缺失明显影响启动子活性，推测该片段可能对启动子具有增强的作用。
表2 次克隆重组子抗性水平
实施例9PA7片段类产碱假单胞菌中的功能鉴定应用电穿孔转化法将pPA7转入类产碱假单胞菌，在150μg/ml的卡那霉素抗性平板上筛选转化子，卡方检验证明pPA7成功转入了类产碱假单胞菌。随机挑出10个转化子进行卡那霉素抗性测定，发现经过转化的类产碱假单胞菌卡那霉素抗性高于未经转化的类菌，证明PA7片段在类产碱假单胞菌中具有启动子功能。将次克隆的得到的重组子pPA7-2也以同样的方法验证了其在类菌中具有启动子功能。
生物材料样品保藏日期2003年9月10日保藏编号1001分类命名Pseudomonas Pseudoalcaligenes保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏单位地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所核酸序列表SEQ ID NO1<110>张杰 赵建 杨志荣<120>类产碱假单胞菌启动子<160>1<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>2069<212>DNA<213>类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<220>
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权利要求
1.一种DNA，其含有类产碱假单胞菌启动子(SEQ ID NO1)的碱基序列或其部分并具有启动子活性。
2.权利要求1的DNA，其中所述DNA为至少160bp长度。第931-1091bp核苷酸。
3.权利要求1的DNA的一部分，其用来构建含有权利要求1的启动子。
4.一种载体，其含有权利要求1的DNA。
5.权利要求4的载体，其中已将一个外源基因以能表达的方式连接在权利要求1之DNA的下游。
6.含有基因构建体的宿主细胞，所述基因构建体含有与结构基因可操作相连的启动予，所述启动子含有权利要求1的核苷酸序列.
7.生产蛋白质组分的方法，所述方法包括用核酸序列转化宿主细胞，所述基因构建体含有与异源DNA序列可操作相连的启动子，所述启动子含有权利要求1的核苷酸序列；和在宿主细胞中表达异源DNA序列以产生蛋白质组分。
8.生产蛋白质组分的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达核酸序列，其中所述表达受与异源核酸序列可操作相连的启动子驱动，所述启动子含有权利要求1的核苷酸序列。
9.一种蛋白，其可用权利要求7的方法生产。
10.权利要求9的蛋白，其中所述蛋白为转录因子。
全文摘要
本发明提供了得类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)的新的启动子序列。本发明包括含有本发明启动子序列的基因构建体，所述启动子序列与编码结构基因的新霉素磷酸转移酶基因序列可操作地相连。本发明还提供了表达由本发明基因构建体中的结构基因编码的产物的载体和宿主细胞以及被与启动子可操作相连的异源基因转化的细胞。
文档编号C12N15/31GK1616662SQ20031011090
公开日2005年5月18日 申请日期2003年11月11日 优先权日2003年11月11日
发明者杨志荣, 张 杰, 赵建, 岳碧松 申请人:四川大学