专利名称：单一载体编码多个发夹结构小干扰性rna表达系统及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别涉及RNA干扰技术，尤其涉及短小干扰RNA表达系统及其构建方法。
背景技术：
RNA干扰技术1998年被发现，2001年5月被成功用于哺乳动物细胞，开始了RNA干扰技术的广泛应用。RNA干扰技术是利用21nt或29nt的短小干扰RNA对目的基因进行封闭，达到干扰或封闭目的基因的作用。RNA干扰是生命最为古老的基因免疫监视机制。生命维持健康、抗御病毒侵入、抗肿瘤发生以及维持遗传稳定等等都可能是依靠RNA干扰实现的，所以，对RNA干扰的研究和RNA干扰技术的应用受到空前的瞩目。RNA干扰技术成功应用当年(2001年)就排在纳米技术之后被评为世界十大技术进步的第二位。2002年又被评为十大技术进步的第一位。RNA干扰技术正在飞速发展，2001年5月第一次哺乳动物细胞应用时是采用的化学合成的短小干扰RNA，一年后推出了生物转录合成的短小干扰RNA，2003年以后越来越多的人开始使用质粒载体表达短小干扰RNA。由于技术难度大，目前RNA干扰技术的应用方法只能做到在一个细胞内由一个载体表达针对一个目的基因的一个短小干扰RNA。因为只有一个短小干扰RNA，因此只能对一个目的基因实现干扰。用编码多个针对相同或不同目的基因的短小干扰RNA制备方法，可以构建同时编码多个短小干扰RNA的质粒或载体，大大增强对一个基因干扰的效果，而且可以同时干扰两个以上目的基因。比如，爱滋病病毒利用2个以上受体如CCR4或CCR5感染人体细胞。现在的RNA干扰技术只能封闭一个受体。爱滋病病毒可以利用另一个受体继续感染细胞。而同时编码多个短小干扰RNA制备方法可以同时关闭上述2个或全部的爱滋病病毒感染受体，彻底关闭爱滋病病毒感染途径。而且，可以实现在关闭爱滋病病毒感染受体同时干扰爱滋病病毒基因，阻止爱滋病病毒复制。
现有技术实现一个载体内表达多个shRNA的模式非常困难。因为RNA干扰技术使用的shRNA严格要求双链RNA的长度和序列，增加或减少一个碱基长度或者一个碱基的错误都可能导致shRNA无效。因此在构建载体时要求在启动子之后编码的起始RNA碱基必须“刚好”为目标RNA的起始碱基。而现代生物技术没有达到“刚好”要求的生物酶。由于缺乏合适的可以利用的酶，编码目标shRNA序列插入载体就非常困难。实现一个载体内编码多个shRNA则更加困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种单一载体编码多个发夹结构小干扰性RNA(short hairpinRNA)表达系统及其构建方法，实现一个载体同时编码多个短小干扰RNA，以增强RNA干扰技术对同一目的基因的封闭效果，并且能够实现在一个细胞内同时封闭不同的多个目的基因，提高RNA干扰技术的应用效果，克服上述现有技术的不足。
本发明提供的这种单一载体编码多个发夹结构小干扰RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达系统的构成是在一个表达载体上含有至少2个编码目的发夹结构的小干扰RNA的结构单元，每个编码目的小干扰性RNA的结构单元含有编码一个目的发夹结构小干扰RNA的DNA序列、位于该DNA序列上游的启动子和位于该DNA序列下游的终止子；说述的载体可以是任何类型载体，包括病毒载体，如Lentivirus载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等，或哺乳动物表达载体，如PEGFP-Cl、pCI Mammalian ExpressionExpression Vector等；所述的启动子可为U6启动子，所述的终止子可为U6终止子；所述的编码目的小干扰性RNA的DNA序列由位于中间的茎环序列和分别位于该茎环序列两侧的有义链和与该有义链互补的反义链构成；本发明提供的单一载体编码多个发夹结构小干扰性RNA(short hairpin RNA)表达系统的构建方法包括以下步骤1.构建克隆质粒以PUC18质粒为骨架，将人U6启动子反向插入PUC18质粒多克隆位置的EcoRI和BamHI之间，得到pUC18-U6-MCS；2.体外人工合成“酶切粘端-U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹环-编码目标shRNA反义链DNAs-酶切粘端”结构的正、负链DNAs；3.将步骤2合成的DNAs退火后插入PUC18-MCS-U6克隆质粒，具体步骤是A体外合成带BamHI和XbaI酶切位点的正义链与反义链DNAs，退火后分别得到编码shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，shRNA5和U6终止信号的双链DNA(还可以合成更多)；B用BamHI和XbaI酶切U6-MCS-PUC18质粒，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段；C分别将上述A步骤制备的dsDNA插入BamHI和XbaI酶切后的PUC18-U6-MCS质粒，构建PUC18-U6-shRNA1质粒、PUC18-U6-shRNA2质粒、PUC18-U6-shRNA3质粒、PUC18-U6-shRNA4质粒、PUC18-U6-shRNA5质粒(同理可构建更多的PUC18-U6-shRNAX质粒)；4.构建编码多个shRNA的表达载体这一步是利用不同的酶切位点，将构建在克隆质粒PUC18-U6-MCS中的“U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹换-编码目标shRNA反义链DNAs-U6启动子”结构片段酶切，分离纯化该片段后逐个定向插入哺乳动物细胞载体。先用EcoRI将PUC18-U6-shRNA质粒从U6端切开，然后用Mungbean酶平端化，再用第二个酶将U6终止信号端后的酶切位点切开，纯化回收“酶切粘端-U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹换-编码目标shRNA反义链DNAs-U6启动子-平端”小片段备用；用同样方法处理哺乳动物细胞表达载体，先用-个酶切割多克隆位点，然后用Mungbean酶平端化，再用第二个酶消化，纯化回收大片段备用；将上述制备的小片段插入大片断，即可将U6-shRNA片段定向插入哺乳动物细胞表达载体。反复上述步骤，可将数个U6-shRNA定向插入哺乳动物细胞表达载体。
本发明设计将人U6启动子反向，这样，可以利用常规用酶BamHI，当合成含有BamHI酶切位点粘性末端的DNAs片段插入时，恰好补平了U6启动子末端，使U6启动子转录的起始核苷酸刚好为目标序列的起始核苷酸。然后，在U6启动子起始端和目标DNAs后的U6启动子终止信号后设计了常规用酶的酶切位点。利用这两个酶，可以方便的将不同的“U6启动子-目标DNAs-U6终止信号结构”移入需要的载体。
本发明与现有技术相比，具有以下优点1.封闭一个基因的多个位点，提高RNA干扰效果。在一个载体中编码多个短小干扰RNA与目前在一个载体中编码一个短小干扰RNA技术相比，优点显而易见。例如针对某基因，同时作用于该基因的多个位点理论上比只作用于一个位点效果好，实验结果也证明了同时对基因不同位点的作用增强了效果。2.实现同时封闭不同基因。编码多个短小干扰RNA载体的更大优越性在于可以实现同时对不同基因的封闭作用。目前RNA干扰技术使用的载体只能表达一个shRNA，例如HIV感染人细胞有2个受体；现有的RNA干扰技术只能关闭2个受体中的一个，而编码多个短小干扰RNA的表达质粒可以同时关闭2个受体，在细胞水平上彻底封堵了HIV的传染途径。载体同时加上直接针对HIV某基因或多个基因的shRNA，可以在关闭HIV感染受体的同时，直接抑制HIV复制，同时作用于HIV感染细胞受体和HIV病毒本身，增强了RNA干扰作为药物的效果，实现一种药物作用于多环节。
为实现一个载体编码多个shRNA目的，本发明采用以下技术措施，在一个载体中制备了同时编码封闭2个人淋巴细胞CD3受体基因、2个人淋巴细胞CD4受体基因和一个HIV病毒包膜蛋白基因的共5个发夹结构小干扰性RNA。技术路线如下①构建克隆质粒以PUC18质粒为骨架，将人U6启动子反向插入PUC18质粒多克隆位置的EcoRI和BamHI之间。
①体外人工合成“酶切粘端-U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹环-编码目标shRNA反义链DNAs-酶切粘端”结构的正、负链DNAs。
②将②步骤合成的DNAs插入PUC18-U6-MCS质粒将“酶切粘端-U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹环-编码目标shRNA反义链DNAs-酶切粘端”插入克隆质粒的BamHI酶切位点之后。
A体外合成带BamHI和XbaI酶切位点的正义链与反义链DNAs，退火后分别得到编码shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，shRNA5和U6终止信号的双链DNA(还可以合成更多)。
B用BamHI和XbaI酶切U6-MCS-PUC18质粒，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收约大片段。
C分别将上述A步骤制备的dsDNA插入BamHI和XbaI酶切后的PUC18-U6-MCS质粒，构建PUC18-U6-shRNA1质粒、PUC18-U6-shRNA2质粒、PUC18-U6-shRNA3质粒、PUC18-U6-shRNA4质粒、PUC18-U6-shRNA5质粒(同理可构建更多的PUC18-U6-shRNAX质粒)。
④构建编码多个shRNA的表达载体这一步是利用不同的酶切位点，将构建在PUC18-U6-shRNA1质粒、PUC18-U6-shRNA2质粒、PUC18-U6-shRNA3质粒、PUC18-U6-shRNA4质粒、PUC18-U6-shRNA5质粒中的“U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹换-编码目标shRNA反义链DNAs-U6启动子”结构片段逐个定向插入哺乳动物细胞载体。先用EcoRI将PUC18-U6-shRNA质粒从U6启动子的3’端切开，然后用Mungbean酶平端化，再用第二个酶将shRNA端U6终止信号后的酶切位点切开，纯化回收“酶切粘端-U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹换-编码目标shRNA反义链DNAs-U6启动子-平端”小片段备用；用同样方法处理哺乳动物细胞表达载体，先用-个酶切割多克隆位点，然后用Mungbean酶平端化，再用第二个酶将上述酶切位点5’端切开，纯化回收大片段备用；将上述制备的小片段插入大片断，即可U6-shRNA片段定向插入哺乳动物细胞表达载体。反复上述步骤，可将逐个将U6-shRNA定向插入哺乳动物细胞表达载体。
AU6-shRNA1-Vector制备用EcoRI和XbaI酶切消化pSilencerTM2.1 neoVector，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段。用EcoRI和XbaI酶切消化PUC18-U6-shRNA1质粒并电泳纯化回收含EcoRI-U6-shRNA-XbaI的小片段，将用EcoRI和XbaI酶切消化PUC18-U6-shRNA1质粒得到的小片段EcoRI-U6-shRNA-XbaI插入用EcoRI和XbaI酶切消化pSilencerTM2.1 neo Vector质粒的大片段。T4连接酶连接后转化DH5a感受态细胞，得到U6-shRNA1-vector。这一步直接利用了EcoRI酶切位点，EcoRI酶切后无需平端化。
BU6-shRNA1-shRNA2-Vector制备用XbaI酶切消化扩增并纯化的U6-shRNA1-vector质粒，接着用mungbean酶消化；纯化后用Sal I酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段备用；用EcoRI酶切消化得到的PUC18-U6-shRNA2质粒，接着用mungbean酶消化，纯化后用Sal I酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收Blund-U6-shRNA2-Sal I小片段；将Blund-U6-shRNA2-Sal I小片段插入上述质粒载体大片断。得到U6-shRNA1-shRNA2-vector。
CU6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-Vector制备用Sal I酶切消化扩增并纯化的U6-shRNA1-shRNA2-vector质粒，接着用mungbean酶消化，纯化后用PstI酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段备用；用EcoRI酶切消化得到的PUC18-U6-shRNA3质粒，接着用mungbean酶消化，纯化后用Pst I酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收Blund-U6-shRNA3-Pst I小片段；将Blund-U6-shRNA3-Pst I小片段插入上述质粒载体。得到U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-vector。
DU6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-Vector制备用Pst I酶切消化扩增并纯化的U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-vector质粒，接着用mungbean酶消化，纯化后用Pae I酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段备用；用EcoRI酶切消化的PUC18-U6-shRNA4质粒，接着用mungbean酶消化，纯化后用Pae I酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收Blund-U6-shRNA4-Pae I小片段；将Blund-U6-shRNA4-Pae I小片段插入上述质粒载体。得到U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-vector。
EU6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-shRNA-Vector制备用Pae I酶切消化扩增并纯化的U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-vector质粒，接着用mungbean酶消化，纯化后用HindIII切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段备用；用EcoRI酶切消化得到的PUC18-U6-shRNA5质粒，接着用mung bean酶消化，纯化后用HindIII酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收Blund-U6-shRNA5-HindIII小片段；将Blund-U6-shRNA5-HindIII小片段插入上述质粒载体。得到U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-shRNA5-vector。
图1至图3为pUC18-U6-MCS克隆质粒构建过程，其中图1表示PUC18质粒用BamHI、EcoRI双酶切消化，回收大片段；图2表示pSilencerTM2.1 neo Vector用BamHI和EcoRI双酶切消化，回收小片段，小片段含有U6启动子，结构为BamHI-U6启动子-EcoRI；图3表示将BamHI-U6启动子-EcoRI结构小片段插入pUC18质粒。pUC18质粒含有HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-BamHI-U6启动子-EcoRI结构。
图4至图7为PUC18-U6-MCS-1/2/3/4/5构建过程，其中图4表示用BamHI和XbaI双酶切PUC18-U6-MCS质粒，纯化回收大片段。
图5表示体外合成并退火得到含有BamHI和XbaI酶切位点的编码shRNA1的DNAs。
图6表示将体外合成并退火得到的编码shRNA1的DNAs插入插入上述经BamHI和XbaI酶切的PUC18-U6-MCS质粒中。
图7表示将体外合成并退火得到含有BamHI和XbaI酶切位点的编码shRNA2、shRNA3、shRNA4、shRNA5的DNAs，分别插入上述经BamHI和XbaI酶切的PUC18-U6-MCS质粒中，得到多个相应的PUC18-U6-MCS-shRNA-X的克隆重组质粒。
图8至图10为pU6-shRNA载体构建过程，其中图8-1表示EcoRI和HindIII双酶切PUC18-U6-1质粒(图中用p18U6-MCS-1表示)，回收HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-shRNA1-BamHI-U6启动子-EcoRI小片段；图8-2表示EcoRI和HindIII双酶切pSilencerTM2.1 neo Vector，回收大片段；图8-3表示将HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-shRNA1-BamHI-U6启动子-EcoRI小片段插入pSilencerTM2.1 neo Vector大片段。
图9至14表示构建同时编码多个shRNA的哺乳动物细胞表达载体的过程，其中图9-1表示用EcoRI酶切PUC18-U6-2质粒(同时分别实施EcoRI对PUC18-U6-3、PUC18-U6-4、PUC18-U6-5的酶切；图中标示为p18U6-MCS-2、p18U6-MCS-3、p18U6-MCS-4、p18U6-MCS-5)；用Mung Bean酶平端化EcoRI酶切粘端(同时分别实施MungBean酶对PUC18-U6-3、PUC18-U6-4、PUC18-U6-5的平端化)；用SalI酶切上步得到的酶切及平端化质粒，然后电泳纯化回收小片段，即可得到SalI-shRNA2-Blund小片段。
图9-2表示用PstI酶切得到的酶切及平端化PUC18-U6-3质粒；用PaeI酶切得到的酶切及平端化PUC18-U6-4质粒；用HindIII酶切得到的酶切及平端化PUC18-U6-5质粒，然后电泳纯化回收小片段，即可分别得到PstI-shRNA3-Blund、PaeI-shRNA4-Blund、HindIII-shRNA5-Blund小片段。
图10表示用XbaI酶切pU6-shRNA载体；用Mung Bean酶平端化XbaI酶切粘端；再用SalI酶切得到的平端化载体，然后电泳纯化回收大片段；得到一端为SalI粘端，一端为平端的线性载体。
图11为编码目标shRNA1/shRNA2的哺乳动物细胞载体构建将前述步骤得到的SalI-shRNA-Blund小片段插入上述步骤得到的一端为SalI粘端，一端为平端的哺乳动物细胞线性载体，得到编码目的shRNA1和shRNA2的载体。
图12表示用SalI酶切图11所示步骤得到的编码目标基因shRNA1和shRNA2的载体，用Mung Bean酶平端化SalI酶切粘端；纯化后再用PstI酶切该载体，得到得到一端为PstI粘端，一端为平端的线性载体。然后将前述步骤制备的PstI-shRNA3-Blund小片段插入上述一端为PstI粘端，一端为平端的载体；得到编码目标基因shRNA1、shRNA2和shRNA3的载体。
图13表示用PstI酶切，纯化，然后用Mung Bean酶平端化粘端，再用PaeI酶切上步得到的编码目标基因shRNA1、shRNA2和shRNA3的载体，制备一端为PaeI粘端，一端为平端的线性载体。将前面制备的PaeI-shRNA4-Blund小片段插入该一端为PaeI粘端，一端为平端的线性载体，得到编码目标基因shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4的载体。
图14表示将上步骤得到的编码目标基因shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4的载体用PaeI酶切然后用Mung Bean酶平端化粘端，纯化后再用HindIII酶切，制备一端为HindIII粘端，另一端为平端的线形载体。将前面制备的HindIII-shRNA5-Blund小片段插入该一端为HindIII粘端，另一端为平端的线性载体，得到编码目的shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4和shRNA5的哺乳动物细胞表达载体。
具体实施例方式
实施例1结合附图对本发明编码多个发夹结构小干扰性RNA的单一载体表达系统的构建方法作进一步说明如下(1)用BamHI、EcoRI双酶切消化PUC18质粒，回收大片，得到经BamHI和EcoRI双酶切消化的PUC18质粒；(见图1)(2)用BamHI和EcoRI双酶切消化pSilencerTM2.1 neo Vector，回收小片段，得到含有U6启动子，结构为BamHI-U6启动子-EcoRI的小片段；(见图2)(3)将上述步骤(2)所得的BamHI-U6启动子-EcoRI结构小片段插入前述步骤(1)所得的经BamHI和EcoRI双酶切消化的PUC18质粒中，得到含有HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-BamHI-U6启动子-EcoRI结构单元的重组pUC18质粒；(见图3)(4)用BamHI和XbaI双酶切上述步骤(3)所得的重组pUC18质粒，纯化回收大片段，得到带有5’BamHI和3’XbaI接头的开环重组pUC18质粒；(见图4)(5)体外合成并经退火得到的带有5’BamHI和3’XbaI接头和U6终止子的编码第一个目的shRNA(shRNA1)的DNAs，该编码第一个目的shRNA(shRNA1)的DNAs由位于中间的茎环序列和分别位于该茎环序列两侧的有义链和与该有义)将上述步骤(5)所得的DNAs插入前述步骤(4)所得的带有5’BamHI和3’XbaI接头的开环重组pUC18质粒中，得到含有HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-U6终止子-shRNA1-BamHI-U6启动子-EcoRI结构单元的重组pUC18质粒；(见图6)(7)根据所要编码的其他目的shRNA的序列结构，设计相应的有义链和反义链，重复步骤(5)和(6)，分别得到含有HindIII-PaeI-PstI-SalI XbaI-U6终止子-编码所需目的shRNA的DNAs-BamHI-U6启动子-EcoRI结构单元的重组pUC18质粒，编码相应目的shRNA的DNAs由位于中间的茎环序列和分别位于该茎环序列两侧的有义链和与该有义链互补的反义链构成；(见图7)(8)用EcoRI和HindIII双酶切上述步骤(6)得到的含有编码第一个目的shRNA的DNAs的重组pUC18质粒，回收HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-U6终止子-shRNA1-BamHI-U6启动子-EcoRI小片段；用EcoRI和HindIII双酶切pSilencerTM2.1 neo Vector，回收大片段；将HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-U6终止子-shRNA1-BamHI-U6启动子-EcoRI小片段插入pSilencerTM2.1 neo Vector大片段中，得到含有HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-U6终止子-shRNA1-BamHI-U6启动子-EcoRI结构单元的重组pSilencerTM2.1 neo Vector，得到的载体命名为pU6-shRNA1；(见图8)(9)用EcoRI分别对前述步骤(6)得到的各个含有HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-U6终止子-编码所需目的shRNA的DNAs-BamHI-U6启动子-EcoRI结构单元的重组pUC18质粒进行酶切，并用Mung Bean酶对各个EcoRI酶切粘端进行平端化处理；(图9-1)(10)分别用SalI、PstI、PaeI和HindIII对上述步骤(9)得到的各个经EcoRI酶切及平端化处理的重组pUC18质粒进行酶切，然后电泳纯化回收小片段，分别得到结构为“SalI、PstI、PaeI或HindIII酶切粘端-U6终止子-编码所需目的shRNA的DNAs-BamHI-U6启动子-平末端”的小片段；(见图9-2)(11)用XbaI酶切上述步骤(8)得到的含有HindIII-PaeI-PstI-SalI-XbaI-U6终止子-shRNA1-BamHI-U6启动子-EcoRI结构单元的重组pU6-shRNA1，并用Mung Bean酶平端化其XbaI酶切粘端；再用SalI对其进行酶切，然后电泳纯化回收大片段，得到一端为SalI粘端，另一端为平端的线性重组pU6-shRNA1载体；(见图10)(12)将前述步骤(10)得到的“SalI酶切粘端-U6终止子-编码所需目的shRNA的DNAs-BamHI-U6启动子-平末端小片段SalI-shRNA-Blund”小片段插入上述步骤(11)得到的一端为SalI粘端，一端为平端的线性重组pU6-shRNA1载体，得到含有2个编码目的shRNA结构单元的表达载体；(见图11)(13)用SalI酶切步骤(12)得到的编码目标基因shRNA1和shRNA2的载体，用Mung Bean酶平端化SalI酶切粘端；纯化后再用PstI酶切该载体，形成到一端为PstI粘端，另一端为平端的线性重组pU6-shRNA1-shRNA2载体；(14)将前述步骤(10)制备的PstI酶切粘端-U6终止子-编码所需目的shRNA的DNAs-BamHI-U6启动子-平末端小片段插入上述步骤(13)得到的一端为PstI粘端，另一端为平端的线性重组pU6-shRNA1-shRNA2载体，得到含有3个编码目的shRNA结构单元的表达载体；(见图12)(15)用PstI酶切，纯化，然后用Mung Bean酶平端化粘端，再用PaeI酶切步骤(14)得到的含有3个编码目的shRNA结构单元的表达载体，制备成一端为PaeI粘端，一端为平端的线性载体，将步骤(10)制备的PaeI酶切粘端-U6终止子-编码所需目的shRNA的DNAs-BamHI-U6启动子-平末端小片段插入该线性载体，得到含有4个编码目的shRNA结构单元的表达载体；(见图13)(16)用PaeI酶切上步骤得到的含有4个编码目的shRNA结构单元的表达载体，然后用Mung Bean酶平端化粘端，纯化后再用HindIII酶切，制备一端为HindIII粘端，另一端为平端的线形载体，将步骤(10)制备的HindIII酶切粘端-U6终止子-编码所需目的shRNA的DNAs-BamHI-U6启动子-平末端小片段插入该一端为HindIII粘端，另一端为平端的线性载体，得到含有5个编码目的shRNA结构单元的哺乳动物细胞表达载体。(见图14)实施例2实验目的构建单一载体编码多个发夹结构小干扰RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达系统；制备编码封闭2个人淋巴细胞CD3受体基因、2个人淋巴细胞CD4受体基因的发夹结构小干扰性RNA，导入细胞后检测细胞膜CD3、CD4表达，比较单一载体编码多个发夹结构小干扰RNA与单一载体编码一个发夹结构小干扰RNA二者的效果差异。
实验材料主要试剂和实验工具来源如下试剂和实验工具产品名称 提供产品的公司或单位
PUC18质粒 TaKaRa公司pSilencerTM2.1 neo Vector Ambion/基因公司经销molta4细胞 武汉生物制品研究所EcoRI NEB公司/基因公司经销BamHI NEB公司/基因公司经销HindIII NEB公司/基因公司经销pstINEB公司/基因公司经销XbaINEB公司/基因公司经销SalINEB公司/基因公司经销PaeIPromega公司/基因公司经销T4 DNA Ligase promega公司T4 Polynucleotide KinaseTaKaRa公司Mung bean酶 TaKaRa公司DH5a大肠杆菌武汉大学菌种保藏中心Ampicilline Sigma/生命公司经销琼脂糖 生命公司Dosper脂质体转染试剂盒 Roche/生命公司经销荧光标记CD3单克隆抗体 武汉生物制品研究所荧光标记CD4单克隆抗体 武汉生物制品研究所PCR引物 博亚公司序列测定博亚公司细胞DNA回收试剂盒 中鼎公司/武汉晶赛公司经销UNIQ-10spin柱式DNA胶回收试剂盒 生工公司基因序列来源人白细胞分化抗原CD4受体基因Gene Bank/BC025782Homo sapiens CD4 antigen(p55)，mRNA人白细胞分化抗原CD4受体基因Gene Bank/BC025782Homo sapiens CD4 antigen(p55)，mRNA人白细胞分化抗原CD3受体基因Gene Bank/X06029Homo sapiens partial T-cellreceptor CD3-gamma gene。
人白细胞分化抗原CD3受体基因Gene Bank/X06029Homo sapiens partial T-cellreceptor CD3-gamma gene。
人体免疫缺损病毒包膜蛋白基因Gene Bank/AJ535619Human immunodeficiency virus type 1proviral gpl60 gene for envelope glycoprotein实验方法本发明实施例涉及的全部分子生物学方法如质粒提取、退火、琼脂糖凝胶电泳、分离回收DNA片段、DNA联结、磷酸化、质粒转化感受态细菌、感受态细胞制备等等均按照《分子克隆实验指南》中方法操作，质粒及DNA片段胶纯化回收、酶及酶切方法按照商品化说明书操作。体外合成DNA为专业化公司提供。序列测定交由专业化公司。脂质体-质粒转化细胞、抗体荧光检测按照试剂盒说明书操作。
主要步骤1.首先构建含有U6启动子和多克隆酶切位点的PUC18质粒。
2.人工合成“酶切位点粘端-启动子终止信号-编码目标shRNA的DNAs-酶切位点粘端”的dsDNA结构片段并分别插入上步构建的含有启动子和多克隆酶切位点的PUC18质粒。
3.利用相同的酶切位点，逐步逐个将多个构建于PUC18中的U6启动子、终止子以及编码shRNA的DNA片段定向插入哺乳动物细胞表达载体，构建同时表达多个shRNA的哺乳动物细胞表达载体。
4.细胞免疫荧光测定受体表达。
本发明实施例的具体操作步骤一、PUC18-U6-MCS构建APUC18质粒用EcoRI、BamHI双酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段；B用BamHI和EcoRI双酶切pSilencerTM2.1 neo Vector，2％琼脂糖凝胶电泳纯化回收小片段。(pSilencerTM2.1 neo Vector为商品化的载体，含有可在哺乳动物细胞复制的复制子和反向插入的人U6启动子，U6启动子后为BamHI酶切位点。该质粒经改造除去非多克隆位点中的pstI酶切位点。扩增并纯化该质粒用于上述酶切)。
C将上述小片段插入大片段T4连接酶连接，转化DH5a感受态细胞，氨苄青霉素琼脂平板选择(PUC18带有Amp抗性基因)。
D测定序列检测插入序列正确性。
二、合成编码shRNA和U6终止信号的DNA并插入PUC18-U6质粒A1ug体外合成带BamHI和XbaI酶切粘端的正义链与1ug反义链DNAs混合，退火(95℃水浴3分钟，自然冷却到室温，退火缓冲液为10mMTris，pH8.0，50mMNaCl，1mMEDTA)得到编码shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，shRNA5的双链DNAs(还可以合成更多)。
合成的序列如下shRNA1CD4-15’-GATCCGTGGAGGACCAGAAGGAGGTTCAAGAGACCTCCTTCTGGTCCTCCACTTTTTTGGAAGTCGACA-3’3’-GCACCTCCTGGTCTTCCTCCAAGTTCTCTGGAGGAAGACCAGGAGGTGAAAAAACCTTCAGCTGTTCGA-5’shRNA2CD4-2
5’-GATCCGATTCTGGGAAATCAGGGCTTCAAGAGAGCCCTGATTTCCCAGAATCTTTTTTGGAAGTCGACA-3’3’-GCTAAGACCCTTTAGTCCCGAAGTTCTCTCGGGACTAAAGGGTCTTAGAAAAAACCTTCAGCTGTTCGA-5’shRNA3CD3-15’-GATCCGAATGCTCTTAGATGAGAGTTCAAGAGACTCTCATCTAAGAGCATTCTTTTTTGGAAGTCGACA-3’3’-GCTTACGAGAATCTACTCTCAAGTTCTCTGAGAGTAGATTCTCGTAAGAAAAAACCTTCAGCTGTTCGA-5’shRNA4CD3-25’-GATCCGGAAACCAGTTGAGGAGGATTCAAGAGATCCTCCTCAACTGGTTTCCTTTTTTGGAAGTCGACA-3’3’-GCCTTTGGTCAACTCCTCCTAAGTTCTCTAGGAGGAGTTGACCAAAGGAAAAAACCTTCAGCTGTTCGA-5’shRNA5HIV gp160 env5’-GATCCATGGCAGTCTAGCAGAAGATTCAAGAGATCTTCTGCTAGACTGCCATTTTTTGGAAGTCGACA-3’3’-GTACCGTCAGATCGTCTTCTAAGTTCTCTAGAAGACGATCTGACGGTAAAAAACCTTCAGCTGTTCGA-5’下文中shRNA1表示转录编码干扰人白细胞分化抗原CD4受体基因的发夹结构小干扰RNA；shRNA2表示转录编码干扰人白细胞分化抗原CD4受体基因的发夹结构小干扰RNA；shRNA3表示转录编码干扰人白细胞分化抗原CD3受体基因的发夹结构小干扰RNA；shRNA4表示转录编码干扰人白细胞分化抗原CD3受体基因的发夹结构小干扰RNA；shRNA5表示转录编码人体免疫缺损病毒包膜蛋白基因的发夹结构小干扰RNA。
DNA磷酸化按照说明书进行磷酸化处理。
B用BamHI和XbaI酶切PUC18-U6-MCS质粒，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收约3100bp大片段。
C将上述合成的DNA分别插入酶切后的PUC18-U6-MCS质粒，构建PUC18-U6-1质粒、PUC18-U6-2质粒、PUC18-U6-3质粒、PUC18-U6-4质粒、PUC18-U6-5质粒(同理可构建更多质粒)。
DT4连接酶连接上述制备的大片断与小片段；转化DH5a感受态细胞，氨苄青霉素琼脂平板选择(PUC18带有Amp抗性基因)。
E分别序列测定构建质粒插入序列的正确性。
三、构建同时编码多个shRNA的哺乳动物细胞表达载体U6-shRNA1-Vector、U6-shRNA1-U6-shRNA2-Vector、U6-shRNA1-U6-shRNA2-U6-shRNA3-Vector、U6-shRNA1-U6-shRNA2-U6-shRNA3-U6-shRNA4-Vector、U6-shRNA1-U6-shRNA2-U6-shRNA3-U6-shRNA4-U6-shRNA5-Vector这-步是将构建在PUC18-U6-1质粒、PUC18-U6-2质粒、PUC18-U6-3质粒、PUC18-U6-4质粒、PUC18-U6-5质粒中的U6-shRNA片段逐个插入哺乳动物细胞载体。①先用EcoRI将PUC18-U6-X质粒从U6端切开，然后用Mungbean酶平端化，再用第二个酶将U6终止信号后的酶切位点切开，纯化回收切下的小片段备用；②用同样方法处理哺乳动物细胞表达载体，先用-个酶切割多克隆位点和U6启动子3’端的酶切位点，然后用Mungbean酶平端化，再用第二个酶将5’端切开，纯化回收大片段备用；③将上述小片段定向插入哺乳动物细胞表达载体。④用步骤②描述的方法处理步骤③得到的质粒载体，然后将小片段定向插入。反复上述步骤，即可逐个将U6-shRNA-X定向插入哺乳动物细胞表达载体，完成构建。
AU6-shRNA1-Vector制备1.用EcoRI和XbaI酶切消化pSilencerTM2.1 neo Vector质粒，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段；2.用EcoRI和XbaI酶切消化PUC18-U6-1(编码shRNA的DNAs)质粒，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收含EcoRI-U6-shRNA-XbaI的小片段；3.将用EcoRI和XbaI酶切消化U6-shRNA1-PUC18质粒得到的小片段EcoRI-U6-shRNA-XbaI插入用EcoRI和XbaI酶切消化U6-MCS-vector质粒的大片段。得到U6-shRNA1-vector。(这一步直接利用了EcoRI酶切位点，EcoRI酶切后无需平端化)BU6-shRNA1-U6-shRNA2-Vector制备1.用XbaI酶切消化上步得到的U6-shRNA1-vector质粒，mungbean酶平端化，纯化后用SalI酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段备用；2.用EcoRI酶切消化得到的PUC18-U6-2质粒，接着用mungbean酶平端化，质粒纯化后用SalI酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收Blund-U6-shRNA2-SalI小片段；3.将Blund-U6-shRNA2-SalI小片段插入上述质粒载体大片段。得到U6-shRNA1-shRNA2-vector。
CU6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-Vector制备1.用salI酶切消化扩增并纯化的U6-shRNA1-shRNA2-vector质粒，接着用mungbean酶平端化，纯化后用PstI酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段备用；2.用EcoRI酶切消化得到的PUC18-U6-3质粒，接着用mungbean酶消化，纯化后用PstI酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收Blund-U6-shRNA3-PstI小片段；3.将Blund-U6-shRNA3-PstI小片段插入上述质粒载体大片段。得到U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-vector。
DU6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-Vector制备1.用PstI酶切U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-vector质粒，接着用mungbean酶平端化，纯化后用PaeI酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段备用；2.用EcoRI酶切消化得到的PUC18-U6-4质粒，接着用mungbean酶平端化，纯化后用PaeI酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收Blund-U6-shRNA4-PaeI小片段；3.将Blund-U6-shRNA4-PaeI小片段插入上述质粒载体大片段。得到U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-vector。
EU6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-shRNA5-Vector制备1.用PaeI酶切消化U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-vector质粒，接着用mungbean酶平端化，纯化后用HindIII切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段备用；2.用PaeI酶切消化得到的PUC18-U6-5质粒，接着用mungbean酶消化，纯化后用HindIII酶切消化，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收Blund-U6-shRNA5-HindIII小片段；3.将Blund-U6-shRNA5-HindIII小片段插入上述质粒载体大片段。得到U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-shRNA5-vector。
四、检测U6-shRNA1-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-Vector、U6-shRNA 1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-shRNA5-Vector的RNA干扰作用效果用Dosper质粒转染试剂盒分别将纯化的U6-shRNA1-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-Vector质粒分别导入molta4细胞(方法按照试剂盒说明书)，培养48-72小时。克隆化molta4细胞；PCR测定导入质粒的克隆细胞；收集细胞，用CD3单克隆抗体、CD4单克隆抗体免疫荧光方法染色(方法按照试剂盒说明书)，检测细胞荧光阳性百分率和荧光强度。
Amolta4细胞培养含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，5％CO2，37℃培养。
B质粒纯化200ml 1％Amp LB培养液培养U6-shRNA1-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-Vector、U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-shRNA5-Vector过夜，8000rpm×20分钟收集菌体，用中鼎公司大规模质粒纯化试剂盒纯化上述质粒，操作按照说明书进行。
Cdosper-载体复合物制备按照操作说明书进行。
Ddosper-载体复合物转染molta4细胞按照操作说明书进行。
E转染Dosper-载体复合物molta4细胞克隆化molta4细胞转染Dosper-载体复合物48小时后，用有限稀释法克隆化，3-4天倒置显微镜观察96孔细胞培养板内克隆生长情况，记录单克隆。
8-10天后将单克隆的molta4细胞转入6孔细胞培养板扩大培养。然后转入200ml细胞培养瓶扩大培养。
FPCR测定导入的质粒载体PCR引物如下5’TAATACGACTCACTATAGGG3’5’AGGCGATTAAGTTGGGTA3’模板制备收集扩大培养的导入了质粒的molta4细胞，细胞量106个细胞以上。用中鼎公司的细胞DNA收集试剂盒收集纯化总DNA。
PCR扩增质粒载体DNA片段PCR反应条件94℃3分钟----------94℃30秒58℃30秒72℃30秒35个循环----------
72℃5分钟能够扩增到约500bp的PCR产物者为成功导入质粒载体的molta4细胞。
G细胞荧光测定100ul，106个导入质粒载体的经过克隆化鉴定的molta4细胞，分别加入10ul荧光标记的CD3，CD4单克隆抗体，4℃孵育30分钟，用无Ca++Mg++离子的Hanks液洗3次，洗去未结合的荧光标记的CD3，CD4单克隆抗体，用无Ca++Mg++离子的Hanks液还原到50ul，荧光显微镜观察细胞荧光亮度和计数荧光阳性百分率。
结果用CD4单克隆抗体测定，导入U6-shRNA1-shRNA2-Vector的molta4细胞荧光强度较导入U6-shRNA1-Vector低；用CD3单克隆抗体测定，导入U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-Vector的荧光强度较U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-Vector低。显示编码多个shRNA的载体较编码单个shRNA的载体对目的基因干扰效果好(见下表)。
导入Molta4细胞的载体 CD4荧光CD4荧光CD3荧光CD3荧光阳性率 强度 阳性率 强度U6-shRNA1-shRNA2-Vector 35％ +/-U6-shRNA1-Vector 71％ ++U6-shRNA5-Vector(对照，HIVgp160env) 88％ ++++U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-shRNA4-Vector 41％ +U6-shRNA1-shRNA2-shRNA3-Vector 94％ ++U6-shRNA5-Vector(对照，HIVgp160env)91％ ++++Molta4 87％ ++++ 97％ ++++
序列表<110>江南，封<120>单一载体编码多个发夹结构小干扰性RNA表达系统及其构建方法<130>1<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>69<212>DNA<213>人类<400>1gatccgtgga ggaccagaag gaggttcaag agacctcctt ctggtcctcc acttttttgg60aagtcgaca69<210>2<211>69<212>DNA<213>人类<400>2gatccgattc tgggaaatca gggcttcaag agagccctga tttcccagaa tcttttttgg60aagtcgaca69<210>3<211>69<212>DNA<213>人类<400>3gatccgaatg ctcttagatg agagttcaag agactctcat ctaagagcat tcttttttgg60aagtcgaca69<210>4<211>69<212>DNA<213>人类<400>4gatccggaaa ccagttgagg aggattcaag agatcctcct caactggttt ccttttttgg60
aagtcgaca69<210>5<211>68<212>DNA<213>HIV<400>5gatccatggc agtctagcag aagattcaag agatcttctg ctagactgcc attttttgga60agtcgaca68
权利要求
1.单一载体编码多个发夹结构小干扰RNA表达系统，其特征在于在一个表达载体上含有至少2个编码目的发夹结构的小干扰RNA的结构单元，每个编码目的小干扰性RNA的结构单元含有编码一个目的发夹结构小干扰RNA的DNA序列、位于该DNA序列上游的启动子和位于该DNA序列下游的终止子。
2.根据权利要求1所述的编码多个发夹结构小干扰性RNA的单一载体表达系统，其特征在于说述的载体是任何类型载体。
3.根据权利要求1所述的编码多个发夹结构小干扰性RNA的单一载体表达系统，其特征在于说述的载体是病毒载体或哺乳动物表达载体。
4.根据权利要求1所述的编码多个小发夹结构干扰性RNA的单一载体表达系统，其特征在于所述的启动子为U6启动子，所述的终止子为U6终止子。
5.根据权利要求1所述的编码多个发夹结构小干扰性RNA的单一载体表达系统，其特征在于所述的编码目的小干扰性RNA的DNA序列由位于中间的茎环序列和分别位于该茎环序列两侧的有义链和与该有义链互补的反义链构成。
6.编码多个发夹结构小干扰性RNA的单一载体表达系统的构建方法，包括以下步骤①构建克隆质粒以PUC18质粒为骨架，将人U6启动子反向插入PUC18质粒多克隆位置的EcoRI和BamHI之间，得到pUC18-U6-MCS；②体外人工合成“酶切粘端-U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹环-编码目标shRNA反义链DNAs-酶切粘端”结构的正、负链DNAs；③将②步骤合成的DNAs退火后插入PUC18-MCS-U6克隆质粒，具体步骤是A体外合成带BamHI和XbaI酶切位点的正义链与反义链DNAs，退火后分别得到编码shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，shRNA5和U6终止信号的双链DNA(还可以合成更多)；B用BamHI和XbaI酶切U6-MCS-PUC18质粒，1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收大片段；C分别将上述A步骤制备的dsDNA插入BamHI和XbaI酶切后的PUC18-U6-MCS质粒，构建PUC18-U6-shRNA1质粒、PUC18-U6-shRNA2质粒、PUC18-U6-shRNA3质粒、PUC18-U6-shRNA4质粒、PUC18-U6-shRNA5质粒(同理可构建更多的PUC18-U6-shRNAX质粒)；④构建编码多个shRNA的表达载体这一步是利用不同的酶切位点，将构建在克隆质粒PUC18-U6-MCS中的“U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹换-编码目标shRNA反义链DNAs-U6启动子”结构片段酶切，分离纯化该片段后逐个定向插入哺乳动物细胞载体，先用EcoRI将PUC18-U6-shRNA质粒从U6端切开，然后用Mungbean酶平端化，再用第二个酶将U6终止信号端后的酶切位点切开，纯化回收“酶切粘端-U6启动子终止信号-编码目标shRNA正义链DNAs-发夹换-编码目标shRNA反义链DNAs-U6启动子-平端”小片段备用；用同样方法处理哺乳动物细胞表达载体，先用一个酶切割多克隆位点，然后用Mungbean酶平端化，再用第二个酶消化，纯化回收大片段备用；将上述制备的小片段插入大片断，即可将U6-shRNA片段定向插入哺乳动物细胞表达载体，反复上述步骤，可将数个U6-shRNA定向插入哺乳动物细胞表达载体。
全文摘要
本发明实现了一个载体同时编码多个发夹结构的小干扰RNA，一个载体编码多个shRNA可以同时封闭干扰一个目的基因的不同位点或同时封闭干扰多个不同的目的基因。同时公布了一个载体内编码多个双链RNA(shRNA)的制备方法，建立了同时编码多个双链RNA的哺乳动物细胞表达载体，本发明发展了RNA干扰技术和提高了RNA干扰技术的应用效果，对于RNA干扰技术及短小双链RNA作为基因药物具有应用价值。
文档编号C12N15/63GK1611606SQ200310111299
公开日2005年5月4日 申请日期2003年10月30日 优先权日2003年10月30日
发明者封江南 申请人:封江南