一种剔除转基因植物中标记基因的方法

专利名称：：一种剔除转基因植物中标记基因的方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种剔除转基因植物中标记基因的方法，它包括相关基因和结构元件的分离克隆、载体构建、植物遗传转化以及无标记基因转基因植株的田间筛选和分子鉴定等方面。
背景技术：
：植物转基因过程中，由于外源DNA被植物细胞吸收和整合进入植物基因组的频率很低，为了有效的选择、识别和鉴定转化的细胞和植株，导入目的基因的同时，需要引入选择标记基因以赋予受体植物特定的抗性。目前，所用的标记基因主要是编码抗生素或除草剂的基因。随着转基因植物的获得，标记基因已不再具有利用价值，但它仍在植物中不断指导酶的合成，消耗细胞资源，而且由于生物安全问题，其对消费心理也形成一定压力。开发无标记基因或剔除标记基因的转基因系统，创造无标记基因的转基因植物具有重要意义。目前，国内外获得无标记基因转基因植物的方法，可归纳为回避策略和剔除策略两大类共4种，即无标记基因转化法、生理代谢基因选择法、目的基因载体与标记基因载体共转化法和标记基因切除法。第一种方法需借助PCR扩增直接对获得的非选择再生苗进行检测鉴定，后期选择工作量大、费用高。第二种方法局限性大，转入的生理代谢相关基因影响植物个体发育，不宜采用。较为实用的是后两种方法，即双载体共转化法和标记基因切除法，后者又分为转座子法、位点特异重组法等。位点特异重组法是将标记基因置于特定重组位点之间，通过相应的特异识别该位点的重组酶催化，产生特异重组或特异切除，利用此特性可将标记基因剔除。在转基因植物标记基因的剔除过程中，可利用重组位点和重组酶的特点构建特殊植物转化载体系统。即将标记基因置于T-DNA片段上的两个特异重组位点间；同时，将相应的重组酶基因构建到另一个植物转化载体上，将以上两种植物转化载体获得的转化植株杂交，杂种中重组酶表达即可实现标记基因的特异切除。目前主要发现了来源于微生物的五类位点特异重组系统，细菌噬菌体P1的Cre-loxP系统、酵母质粒FLP-FRT系统、λ噬菌体attB-P系统、Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系统以及Mu噬菌体的Gin-gix重组酶系统。后两种方法在植物中还未见应用的报道。Cre-loxP系统的lox位点由34bp特异序列构成，其中有8bp是核心序列，Cre重组酶是一个38.5KD的蛋白质，专一性的识别和催化两loxP位点之间序列的重组。利用了Cre-loxP特异位点重组系统切除转基因植物中的标记基因已在烟草、拟南芥等植物上获得成功。但该系统Cre重组酶的切除并不彻底、效率很低，还需要再一轮的组培再生过程，可行性较差(Gleave，A.P.，Mitra，D.S.andMorris，B.A.M.，1999，Selectablemarker-freetransgenicplantswithoutsexualcrossingtransientexpressionofCrerecombinaseanduseofaconditionallethaldominantgene.PlantMol.Biol.40，223-235)(ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)。FRT位点也是由34bp特异序列构成，其中8bp是核心序列，FLP是48KD的其专一重组酶蛋白。Lloyd等(1994)将酵母的FLP-FRT位点重组系统应用于烟草，实验发现，FLP重组酶在植物组织中具有表达活性，可切除GUS标记基因，但重组酶表达效率较低，(Lloyd，A.M.，Davis，R.W.，1994，FunctionalexpressionoftheyeastFLP/FRTsite-specificrecombinationsysteminNicotianatabacum.Mol.Gen.Genet.242653-657)。本发明首次提出了利用λ噬菌体attB-P系统实现标记基因的剔除，可克服其他剔除方法效率低的不足。目前，有利用att特异位点进行载体构建和基因克隆的专利(一种位点重组反向克隆基因的方法及其利用，申请号01130855.9)，与本发明不同。也有利用att特异位点自主重组实现标记基因的剔除的文献，但其效率很低(ZubkoE，ScuttC，MeyerP.，2000，IntrachromosomalrecombinationbetweenattPregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes.NatureBiotech.18442-445)，且没有申请专利。引入INT重组酶识别att位点切除标记基因的研究还未见相关报道和专利。attB位点的序列段较短(21bp)，核心序列7bp，attP位点由352bp特异序列构成，核心序列也为7bp。λ-att重组酶基因(INT)，可特异识别att-B和att-P位点并进行位点间序列的特异切除。
发明内容本发明的目的在于，利用λ噬菌体识别序列(attP)特异重组位点以及其重组酶基因INT，构建特殊的植物转化载体，剔除转基因植物中的标记基因，获得只含有目的基因的转基因植株，提高转基因农产品的生物安全性。本发明通过以下技术方案实现一种剔除转基因植物中标记基因的方法，利用λ噬菌体识别序列(attP)特异重组位点及其重组酶基因(INT)，构建植物转化载体pMFC和pMFB；所说的pMFC含有INT，所说的pMFB含有目的基因和选择标记基因，该选择标记基因位于两个attP位点之间；通过根癌农杆菌介导或其他转基因的方法分别获得pMFC和pMFB两种载体的转化植株；将所说的转化植株进行杂交，然后从杂交后代分离群体中筛选出剔除标记基因的转基因植株，该植株通过PCR或Southern杂交分子鉴定进一步确认。本发明按照下列步骤实施(1)根据λ噬菌体基因组序列设计引物，分别获得重组酶基因(INT)及其识别序列(attP)；(2)分别构建植物转化载体pMFC和pMFB；(3)通过农杆菌介导或基因枪的方法，利用构建的载体对植物进行遗传转化，获得转基因植株，进一步自交纯化获得该基因纯合的单株或株系；(4)将上述两种转基因纯合株系或杂合材料杂交，剔除标记基因，在分离后代筛选没有抗性标记的单株；(5)从步骤(4)所获得的植株中提取总DNA，以标记基因和目的基因的特异引物同时进行PCR扩增检测，或利用标记基因和目的基因的标记探针进行Southern杂交检测。发明的详细描述如以下步骤所述1.λ噬菌体位点特异性重组系统所需元件的克隆根据λ噬菌体基因组序列(美国国立生物技术信息中心，基因注册号NC001416)设计引物，分别获得重组酶基因(INT)及其识别序列(attP)。扩增INT的正反引物分别是INTF5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′INTB5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′，扩增attP位点的正反引物分别是attPF5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′attPB5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′PCR反应体系为在20μL反应体系中，分别加入13.65μLddH2O，1.5mM/LMgCl2，0.2mM/LdNTPs，0.5μM/L正向和反向引物，0.25μLλ噬菌体裂解物，0.5UTqDNA聚合酶。扩增INT基因的反应循环参数为94℃预变性3min，然后94℃1min，62℃1min，72℃1min30s，反应30个循环，最后72℃延伸10min。扩增attP反应循环参数94℃预变性3min，然后94℃1min，56℃1min，72℃40s，反应30个循环，最后72℃延伸10min。INT和attP的PCR特异片段经切胶回收。前者片段回收产物与pMD18-T载体(Takara公司产品)连接，而后者回收产物和pGEM-TEasy载体(Promega公司产品)连接，分别转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒进行酶切后电泳分析鉴定，获得插入目的片段的重组克隆，分别命名为pMDTINT和pGTP。进一步序列分析证明，重组克隆pMDTINT和pGTP中插入片段分别为INT和attP位点。其序列分别如下①INT序列(1071bp)ATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGCGCCGGGATTTACCCCCTAACCTTTATATAAGAAACAATGGATATTACTGCTACAGGGACCCAAGGACGGGTAAAGAGTTTGGATTAGGCAGAGACAGGCGAATCGCAATCACTGAAGCTATACAGGCCAACATTGAGTTATTTTCAGGACACAAACACAAGCCTCTGACAGCGAGAATCAACAGTGATAATTCCGTTACGTTACATTCATGGCTTGATCGCTACGAAAAAATCCTGGCCAGCAGAGGAATCAAGCAGAAGACACTCATAAATTACATGAGCAAAATTAAAGCAATAAGGAGGGGTCTGCCTGATGCTCCACTTGAAGACATCACCACAAAAGAAATTGCGGCAATGCTCAATGGATACATAGACGAGGGCAAGGCGGCGTCAGCCAAGTTAATCAGATCAACACTGAGCGATGCATTCCGAGAGGCAATAGCTGAAGGCCATATAACAACAAACCATGTCGCTGCCACTCGCGCAGCAAAATCAGAGGTAAGGAGATCAAGACTTACGGCTGACGAATACCTGAAAATTTATCAAGCAGCAGAATCATCACCATGTTGGCTCAGACTTGCAATGGAACTGGCTGTTGTTACCGGGCAACGAGTTGGTGATTTATGCGAAATGAAGTGGTCTGATATCGTAGATGGATATCTTTATGTCGAGCAAAGCAAAACAGGCGTAAAAATTGCCATCCCAACAGCATTGCATATTGATGCTCTCGGAATATCAATGAAGGAAACACTTGATAAATGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCGTCGCGAACCGCTTTCATCCGGCACAGTATCAAGGTATTTTATGCGCGCACGAAAAGCATCAGGTCTTTCCTTCGAAGGGGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGAGAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGACACCATGGCATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAA。②attP序列为(353bp)GATTGCGAGGCTTTGTGCTTCTCTGGAGTGCGACAGGTTTGATGACAAAAAATTAGCGCAAGAAGACAAAAATCACCTTGCGCTAATGCTCTGTTACAGGTCACTAATACCATCTAAGTAGTTGATTCATAGTGACTGCATATGTTGTGTTTTACAGTATTATGTAGTCTGTTTTTTATGCAAAATCTAATTTAATATATTGATATTTATATCATTTTACGTTTCTCGTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCATTATAAAAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGATTTCAATTTTGTCCCACTCCCTGCC。2.构建表达载体分别构建植物转化载体pMFC，其结构如图2所示，pMFB，其结构如图3所示。pMFC的T-DNA区内含有λ噬菌体重组酶基因(INT)和选择标记基因(BAR、NPTII或HPT等)。其构建过程如下以SalI和SacI对pMDTINT进行酶切，回收INT片段与XhoI、SacI酶切pMV(由pBI121改造)的大片段连接，从而将INT构建到植物表达载体中，定名为pMFC。pMFB的T-DNA区含有目的基因和选择标记基因(可以是任何选择标记基因)，选择标记基因位于λ噬菌体位点特异性重组位点attP正向重复序列之间。其构建具体步骤如下以pBI121质粒(美国国立生物技术信息中心，基因注册号AF485783)为基本载体，对其以PmeI酶切并用CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平。两者回收产物连接从而将片段attP插入pBI121的PmeI位点，定名为pPBIP。以HindIII对pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端补平并用CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平。两者回收产物连接从而将attP插入pPBIP的HindIII位点，构建成载体pMFB。其目的基因为GUS基因，具体实施时利用酶切位点可替换成任何目的基因。3.植物的遗传转化通过农杆菌介导或其他转基因方法(例如基因枪方法)把pMFC和pMFB分别转入植物(例如番茄)，通过筛选鉴定并纯化，获得纯合的转基因植株或株系。pMFC转化的植物为通用型杂交亲本，可以和pMFB载体转化的含有不同目的基因的植株进行杂交，从而切除各转基因材料的标记基因。采用根癌农杆菌介导的遗传转化步骤如下准备无菌苗子叶或下胚轴外植体，于KCMS上烟草悬浮细胞看护培养过夜(也可不用看护培养)。用以MS0.2稀释至O.D.≈0.3的农杆菌浸染外植体5分钟，滤纸吸干，回接到预培养基(看护培养基)共培养2天，转移选择再生培养基中诱导芽再生。待再生芽长至1cm左右，转移至生根培养基。生根后炼苗移栽。4.标记基因的剔除把两种转基因纯合株系(也可为杂合材料)杂交，一代杂种种子或植株中INT表达，识别attP位点并对两位点间序列进行特异切除，剔除标记基因。杂种自交其后代分离，通过对幼苗喷施一定浓度的选择标记抗生素(例如卡那霉素100mg/L，或者Basta除草剂1％)，在分离后代中筛选没有抗性标记的单株，得到的多为剔除标记基因而含有目的基因的转基因植株。5.分子鉴定根据载体T-DNA区结构，针对标记基因和目的基因设计特异引物或合成特异标记探针，分别进行PCR扩增或(和)Southern杂交鉴定，可进一步确认获得的剔除标记基因的转基因植株的真实性。具体步骤可见流程图如图1所示。图1.是本发明的流程图。图2是本发明的含有INT的植物转化载体pMFC；图3是本发明的可剔除标记基因的植物转化载体pMFB，其标记基因和目的基因可替换图4是本发明其中一个实施例中可剔除标记基因BAR的植物转化载体pMFB1，其目的基因为BT；图5是本发明其中一个实施例中可剔除标记基因BAR的植物转化载体pMFB2，其目的基因为IPT；图6是本发明实施例1分子鉴定结果。图中Mλ/HindII分子量标记，1、2剔除标记基因植株，3未剔除标记基因的纯合植株；1.8kb片段BT，1.5kb片段含标记基因BAR的片段。图7是本发明实施例2分子鉴定结果。图中1未剔除标记基因的纯合植株，2剔除标记基因植株；1200bp片段PSAG12-IPT嵌合基因片段，540bp片段标记基因BAR片段。具体实施例方式实施例1无标记基因转BT抗虫番茄的获得BT来源于苏云金芽孢杆菌，其表达蛋白能特异毒杀鳞翅目类昆虫，对人和高等动物无害。BT导入番茄对于番茄的抗虫育种具有重要意义。利用本发明构建的植物转化载体和方法，获得了无标记基因的转BT番茄植株，步骤如下1.载体构建以pMFB载体为基本载体，对其以SmaI和EcoRI进行双酶切，用T4DNA聚合酶末端补平后自连，构成pMFO。对质粒pUBC2进行BamHI，回收小片段，其中包含BT，将其插入pMFO的BamHI位点，从而把BT导入载体pMFB。BT取代其中的目的基因，形成新的植物转化载体，定名为pMFB1(图4)。该标记基因介于两个attP位点之间。2.植物遗传转化利用农杆菌介导的遗传转化法，把载体pMFC和载体pMFB1分别转入性状稳定的番茄株系A53，获得转基因植株。根据标记基因和BT的特异引物和特异探针，通过PCR和Southern杂交方法，对获得的T0代转基因植株进行了分子鉴定，以进一步对转基因植株进行确定。3.植株的纯化对于以pMFB1转化的植株，收获第一代种子即T1代。由于T1代进行了分离，利用除草剂喷施法对转基因植株的T1代植株进行了筛选，具有该除草剂抗性的植株为含有转基因的纯合与杂合植株，从T1代抗性植株上按单株收获种子，即T2代。继续利用除草剂喷施法选择T2代植株，在T2代不再分离的株系，证明其对应的T1代植株为纯合单株，该株系为纯合株系；同样，对以pMFC载体转化的植株进行同样的筛选，获得了转基因纯合植株，筛选药物为卡那霉素，喷施浓度100mg/L。4.标记基因的剔除把以载体pMFC和载体pMFB转化的纯合株系进行杂交，获得杂种一代F1。在F1种子形成的早期，INT重组酶启动表达，识别attP重组位点，并特异性的切除该两位点间的标记基因BAR。由于切除标记基因的BT片段与INT片段位于不同的染色体上，根据分离定律，它们将会在F2代分离，从而在F2代植株中进行了筛选，淘汰具有卡那霉素抗性的植株和对除草剂具有抗性的植株，剩余的基本为剔除标记基因而只具备BT的转基因植株；5.分子鉴定提取待鉴定植株叶片DNA，分别以BT、标记基因NPTII和BAR的特异引物，通过PCR扩增进行鉴定，或以BT、NPTII和BAR基因片段的特异探针进行Southern杂交鉴定，BT鉴定为阳性而标记基因为阴性的植株可确定为剔除标记基因的转BT番茄植株。经鉴定，已经获得了剔除标记基因的转BT番茄植株。PCR鉴定结果如图6所示。实施例2无标记基因的抗叶片衰老转IPT番茄的获得IPT基因来自根癌农杆菌T-DNA区的IPT(又称tmr基因)，编码异戊烯基转移酶，催化细胞分裂素生物合成中最重要的一步限速反应，即5’-磷酸腺苷和Δ2-异戊烯基焦磷酸化合生成N6-[Δ2-异戊烯]-5’-磷酸腺苷(异戊烯基腺嘌呤，iPA)的反应。该基因与拟南芥叶片衰老特异启动子PSAG12构建成嵌合基因PSAG12-ITP，具有自我调控延缓衰老功能，已经被转入水稻、番茄等作物，具有明显的抗叶片衰老作用。获得无标记基因的抗叶片衰老转基因番茄的步骤如下1.载体构建以pMFB载体为基本载体，以HindIII和SacI对质粒pMFB进行双酶切，回收大片段。对质粒pSG529进行同样的双酶切获得嵌合基因PSAG12-IPT，两者连接从而将嵌合基因构建至pMFB，形成新的植物转化载体，命名为pMFB2(图5)，筛选标记基因为抗除草剂基因BAR，可抵抗除草剂Basta。该标记基因介于两个attp位点之间。2.植物遗传转化利用根癌农杆菌介导的遗传转化法，把载体pMFC和载体pMFB2分别转入性状稳定的番茄品系A53中，获得转基因的植株。以衰老特异启动子PSAG12的特异引物进行PCR检测，进一步证明获得了该载体的转化番茄植株。3.植株的纯化对于以pMFB2转化的番茄植株，收获第一代种子即T1代。由于T1代进行了分离，利用除草剂喷施法对转基因植株的T1代植株进行筛选，具有该除草剂抗性的植株为含有转基因的纯合与杂合植株，从T1代抗性植株上按单株收获种子，即T2代。继续利用除草剂喷施法选择T2代植株，在T2代不再分离的株系，证明其对应的T1代植株为纯合单株，该株系为纯合株系；同样，对以pMFC载体转化的植株进行同样的筛选，获得了该基因的纯合植株，筛选药物为100mg/L卡那霉素；4.标记基因的剔除把以载体pMFC和载体pMFB2转化的纯合株系进行杂交，获得杂种一代F1。在F1种子形成的早期，INT启动表达，识别两个attP位点，并特异性切除该两位点间的标记基因BAR。切除标记基因的PSAG12-IPT片段与INT片段位于不同的染色体上，它们在F2代进行了分离，利用选择抗生素在F2代植株中进行了筛选，淘汰出具有卡那霉素抗性的植株和对除草剂具有抗性的植株，剩余的基本为剔除标记基因而只具备PSAG12-IPT嵌合基因的转基因植株；5.分子鉴定提取待鉴定植株叶片DNA，分别以启动子PSAG12(鉴定IPT)、标记基因NPTII和BAR的特异引物，通过PCR扩增进行鉴定，IPT鉴定为阳性而标记基因为阴性的植株可确定为剔除标记基因的转PSAG12-IPT番茄植株。结果表明，获得了无标记基因的转PSAG12-IPT番茄植株。PCR鉴定结果如图7所示。权利要求1.一种剔除转基因植物中标记基因的方法，其特征在于利用λ噬菌体attP特异重组位点及其重组酶基因(INT)，构建植物转化载体pMFC和pMFB；所说的pMFC含有INT，所说的pMFB含有目的基因和选择标记基因，该选择标记基因位于两个识别序列(attP)位点之间；通过根癌农杆菌介导或其他转基因的方法分别获得pMFC和pMFB两种载体的转化植株；将所说的转化植株进行杂交，然后从杂交后代分离群体中筛选出剔除标记基因的转基因植株，该植株通过PCR或Southern杂交分子鉴定进一步确认。2.根据权利要求1所述的方法，其步骤在于(1)根据λ噬菌体基因组序列设计引物，分别获得重组酶基因及其识别序列，扩增INT的正反引物分别是INTF5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′INTB5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′attP位点的正反引物分别是attPF5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′attPB5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′(2)分别构建植物转化载体pMFC和pMFB以SalI和SacI对pMDTINT进行酶切，回收INT片段与XhoI、SacI酶切的pMV的大片段连接，定名为pMFC；以pBI121质粒为基本载体，对其以PmeI酶切并用CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平，将两者回收产物连接从而将片段attP插入pBI121的PmeI位点，定名为pPBIP，以HindIII对pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端补平并用CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平，两者回收产物连接从而将attP插入pPBIP的HindIII位点，构建为载体pMFB，其中的基因GUS可替换成任何目的基因；(3)通过农杆菌介导或基因枪的方法，利用构建的载体对植物进行遗传转化，获得转基因植株，进一步自交纯化获得该基因纯合的单株或株系；(4)将上述两种转基因纯合株系或杂合材料杂交，剔除标记基因，在分离后代筛选没有抗性标记的单株；(5)从步骤(4)所获得的植株中提取总DNA，以标记基因和目的基因的特异引物同时进行PCR扩增检测，或利用标记基因和目的基因的标记探针进行Southern杂交检测。全文摘要本发明属于植物基因工程，具体涉及从转基因植物中剔除标记基因的方法。利用λ噬菌体attP特异重组位点以及其重组酶基因INT，构建植物转化载体pMFC和pMFB。pMFC含有INT，pMFB含有目的基因和选择标记基因，其选择标记基因位于两个attP位点之间。通过根癌农杆菌介导等植物遗传转化方法分别获得pMFC和pMFB这两种载体的转化植株，两种转化植株进行杂交，杂种植株中INT重组酶表达可特异切除两attP位点间的标记基因，进而在杂交后代分离群体中筛选出剔除标记基因的转基因植株，该植株可通过PCR或Southern杂交等分子鉴定技术进一步确认。标记基因的剔除可提高转基因农产品的生物安全性。文档编号C12N15/82GK1618960SQ20031011141公开日2005年5月25日申请日期2003年11月19日优先权日2003年11月19日发明者叶志彪,卢永恩,张俊红,李汉霞,欧阳波申请人:华中农业大学