专利名称：与小麦抗白粉病基因紧密连锁的scar分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与白粉病抗性基因紧密连锁的SCAR分子标记及其获得方法。
背景技术：
由专性寄生真菌小麦白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)引起的小麦白粉病是危害小麦生产的主要病害之一。近年来，随着矮秆、半矮秆小麦品种的推广，田间栽培密度的增加以及水肥条件的改善，该病害在我国南北麦区危害程度日趋严重，成为当前小麦高产、稳产的主要障碍因素之一。1990年小麦白粉病在全国39％的小麦种植区流行，造成产量损失达4亿公斤。目前，小麦白粉病已经成为威胁我国小麦生产的常见病害之一，所以对该病的防治刻不容缓。
尽管实践中可以采取化学药剂来防治小麦白粉病，但是，培育抗病品种是最为安全、经济、有效的措施。70年代初，我国引入具1B/1R的小麦衍生品种做为抗源，曾经一度有90％以上的品种携有Pm8抗白粉病基因，由于抗性基因的单一性，结果导致小麦白粉病在全国范围内多次大流行。此后，我国小麦育种家致力于多方引入和转育具有新抗病基因的品种，但由于有些抗病基因在不同遗传背景中表达不一致，致使真正用于生产实际的抗白粉病基因很少，在育种中应用的仅有Pm4a、Pm4b、Pm6、Pm8及其组合Pm2+6、Pm2+4等，再加上小麦白粉病菌具有群体大，适应范围广，生理小种多且毒力变异快等特点，使得许多花费多年时间培育的抗病品种(系)刚应用不久，有的甚至还未应用，便由于病菌群体毒性的变化而丧失了抗性。“九五”期间，Pm4a、Pm6在全国各地均已开始丧失抗性。二十世纪末，北京地区推出了我国第一个自行转育成功并定名的Pm21基因。目前，我国小麦育种项目中较为广泛地利用了该基因，应引起警惕，防止抗源单一现象再次发生，有效地控制白粉病的流行。为此就必须大力挖掘和利用新抗源并不断地进行抗病基因的累加，培育抗性持久的小麦品种。
为实现上述任务，挖掘新抗源，以往，育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，但这类标记具有工作量大、标记数量少、易受环境影响等缺点。随着分子生物学的发展，一类基于DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学者应用于小麦抗白粉病研究。应用分子标记，可以免除传统育种中繁重的工作程序，跟踪、检测外源基因，还可以把多个抗白粉病基因聚合到同一优良品种中，获得持久抗性。此外，将基因精确定位于高密度的分子图谱上，以紧密连锁的分子标记为起点，应用染色体步行(Chromosome Walking)等方法，逐渐逼近目标基因，最终克隆该基因。实践证明DNA分子标记是进行抗病性鉴定和辅助育种研究的重要工具。
小麦对白粉病的抗性主要由主效基因控制，早期基因符号为M1，正式命名的基因符号为Pm(powdery mildew)。自从1930年澳大利亚学者首次报道了澳大利亚春小麦品种Thew携带一个显性抗白粉病基因以来，至今已鉴定出30个Pm基因位点，除Pm29外，其余主效基因已被定位到染色体或染色体臂上。此外尚有抗病基因未被正式命名，临时以M1表示。自从90年代初开展小麦抗白粉病基因分子标记研究以来，已有接近一半的抗病基因找到了相应的分子标记，但仍有很多抗白粉病的未知基因，尚未筛选出分子标记。因此，继续用分子标记的方法，筛选与抗白粉病基因相关的标记，在农业上有重要应用价值。
发明内容
解决的问题本发明是针对上述情况，用分子生物学方法以强抗小麦品种Brock为材料筛选和寻找新的、而且稳定存在与白粉病抗性基因紧密连锁的分子标记及其方法，用于小麦白粉病辅助选择育种，从而克服了常规遗传育种周期长等缺点；由于研究所用材料为对15号生理小种免疫的小麦品种(15号生理小种为混合型生理小种，为华北地区流行的多种白粉病病菌)，其对华北地区白粉病菌具有比较广普的抗性。因此，根据所得分子标记有望克隆到新的白粉病抗性基因。
技术方案与小麦抗白粉病基因相连锁的SCAR分子标记，其特征在于所述的分子标记SCAR860、SCAR200，它是用RAPD分子标记方法筛选出S2092972分子标记，再将S2092972转换成稳定的SCAR标记，该标记是采用下述方法得到的(1)抗病基因供体亲本来自英国普通小麦品种Brock，其与感病普通小麦亲本015和感病亲本京411进行杂交，杂交组合为“Brock/015//京411”，抗病单株是通过杂交、回交和自交，从抗白粉病稳定的高世代株系中得到；(2)用苯酚-氯仿方法提取小麦亲本幼苗及杂交后代幼苗DNA；(3)采用RAPD分子标记方法，进行与小麦白粉病抗性相关的分子标记的筛选；(4)筛选出一个RAPD分子标记S2092900，经过连锁性鉴定，发现该标记与小麦抗白粉病基因相连锁，与抗性基因的遗传距离为4.3cM；(5)将S2092900克隆并测序并转换为SCAR标记，即SCAR860、SCAR200。
采用RAPD分子标记方法，进行与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记，其筛选的具体做法是
·标记筛选利用120个Operon和93个S系列随机引物(10bp)在抗性亲本Brock、感亲本京411以及它们的杂交、回交后代抗性单株间进行DNA多态性分析，即用RAPD标记技术筛选，采用10bp寡核苷酸作为随机引物，在PE-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20ng/μl小麦基因组DNA1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mM dNTP0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，总体系25μl，反应程序96℃变性1分钟、35℃退火1分钟、72℃延伸2分钟、4个循环，94℃变性45秒、36℃退火1分钟、72℃延伸90秒、45个循环，72℃补齐10分钟；产物检测在含有0.5％μg/μl EB的1.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。
·分子标记的连锁性鉴定利用Brock×京411 F2群体131株单株为材料进行分子标记与抗病基因间连锁性分析。小麦杂交后代(131株单株)白粉病抗性鉴定在田间进行，白粉菌接种在孕穗期的小麦苗，将带菌感病对照株移栽至田间待鉴定的材料旁，通过自然传播接种，2-3周后调查抗病性，调查级别分0、0；为免疫，1-4级分别表示高强抗、抗、敏感、高度敏感。抗性鉴定表明，101株为抗病，30株为感病，分别提取抗病、感病单株的总体DNA，用上述同样的反应体系及程序，用引物S2092进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapmakerEXP3.0b计算标记与抗白粉病基因之间的遗传距离。临界LOD值为3.0，根据Kosambi函数，将重组率转变成图距单位厘摩尔(cM)。
·SCAR标记的转换首先将S2092900克隆在细菌质粒PGEM-T easy Vector上，经双端测序后，S2092900分子标记的实际长度为972bp(提交GenBank，登录号为AY324385)，根据该序列设计并合成3个SCAR引物，命名为S2092972A、S2092972B、S2092972C，其A与B为一对、A与C为一对，在Brock、杂交、回交(Brock/015//京4117)后代抗性单株中分别进行扩增，在抗性单株中均能扩增出预计的两个SCAR标记SCAR860和SCAR200，为了检测这两个SCAR标记的可靠性，我们对Brock×京411的F2分离群体抗感个体进行了分析。结果表明，在F2分离出的抗性个体中都检测到了这两个SCAR标记，而感病个体中没有发现，SCAR标记在抗、感单株中出现的规律与RAPD标记相一致。
上述转化工作的具体做法如下a)抗性片段的克隆测序参照经典的克隆DNA片段的实验方法低熔点琼脂糖纯化PCR产物，PGEM-Teasy Vector(Promega)连接，转化大肠杆菌Jm109，重组质粒经T7、Sp6 PCR电泳检测，EcoR I酶切鉴定，获得阳性克隆子，送Sangon测序。将测序结果用生物信息学SMS进行分析，并通过Internet与GenBank国际基因数据库进行同源性分析。
b)引物设计及SCAR分析用根据S2092972序列设计并合成的上述两对SCAR引物S2092972A 5’GGTTGTTCCCAAAGAGGTCA 3’S2092972B 5’ATGTTTGAAGCAGGGTGCAG 3’S2092972C 5’TCCTCAATCTGGAGGGACAC 3’，在Brock、杂交、回交(Brock/015//京4117)后代抗性单株中分别进行扩增，反应条件如下反应体系为25μl，各组分物质的含量分别为template 20ng；10×Buffer 2.5μl；MgCl21.6mM；dNTP 0.15mmol/L；5pmol primer Taq 1.25U，ddH2O补齐25μl，混匀，离心收集，在PTC-150-25上进行反应，反应程序如下94℃变性3min，64℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，72℃ 5min，4℃保存。1.0％琼脂糖凝胶(含EB)，电泳1小时，紫外反射透射分析仪观察并照相。
有益效果白粉病是影响小麦生产的一种严重病害。本发明是利用分子标记方法得到一个新的与白粉病抗性基因紧密连锁的RAPD分子标记，并通过克隆、测序、引物设计，又将RAPD标记转换成稳定的SCAR标记。利用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，而且能够有目标地将抗病基因在实验室内选择得到，还可以有目的地聚合多个抗白粉病基因、培育出具有稳定抗性的小麦新品种，同时也可利用这个新白粉病抗性基因的分子标记克隆抗白粉病基因，并对其进行结构和功能分析，这对于进一步了解小麦抗白粉病的分子遗传学机理有积极意义。因此，本研究结果在小麦育种实践及抗病理论研究上都很有价值。其优点具体归纳如下(1)本发明的与白粉病抗性基因紧密连锁的分子标记，是在对华北地区白粉病菌免疫的小麦品种Brock及其抗性稳定的杂交后代单株中获得的新的标记，对15号生理小种均有抗性，而且稳定存在，可以用于小麦白粉病品种鉴定和小麦抗病后代的辅助选择育种。
(2)本研究所用材料为对15号生理小种(为混合型生理小种，为华北地区流行的多种白粉病病菌)免疫的小麦品种，对华北地区白粉病菌具有比较广普的抗性。因此，根据所得分子标记有望克隆到新的白粉病抗性基因。
(3)本标记为稳定的SCAR标记，并且与抗白粉病基因紧密连锁(遗传距离为4.3cM)，可直接用于小麦抗白粉病分子标记的辅助选择育种，同时为克隆小麦抗白粉病基因、基因序列分析以及转抗白粉病基因小麦研究奠定了良好基础。
图1京411、抗性单株、Brock基因组DNA的RAPD分子标记S2092900
筛选电泳谱带图；图2检测分子标记S2092900与抗白粉病连锁的电泳谱带图；图3SCAR860、SCAR200标记谱带图；图4SCAR860和SCAR200标记在抗病亲本和抗病单株中的分布谱带图；图1-4中符号分别表示为1感病亲本京411；2抗性单株；3抗病品种Brock；MλDNA Hind III/EcoR I Markers；R有特异带的杂交后代抗病单株；R*没有特异带，但表型为抗病的杂交后代单株；S没有特异带的杂交后代感病单株；
具体实施例方式(结合附图具体说明)实施例1用RAPD分子标记方法，得到与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记S2092900.该分子标记的实际长度为972bp，用SCAR方法转换成SCAR860、SCAR200两个稳定的分子标记。
具体做法是抗病基因供体亲本为英国普通小麦品种Brock，其与感病普通小麦品系015和感病亲本京411进行杂交，用京411回交，组合为“Brock/015//京4117”，抗病单株是通过杂交、回交和自交，从抗白粉病稳定的高世代株系中得到的。用于连锁性鉴定的抗、感单株则是Brock/京411F2中分离得到，包括101个抗性个体和30个感病个体；一、提取DNA取小麦叶片0.2g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提取缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；50mM NaCl)，65℃温浴15分钟，其间颠倒混匀2-3次，0℃冰浴10分钟。3000转/分钟离心10分钟，取上清液，加入等体积Tris-HCl(pH8.0)饱和酚，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入等体积酚、氯仿和异戊醇(25∶24∶1)抽提，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入等体积氯仿，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入两倍体积的冷乙醇，-20℃沉淀2个小时，12000转/分钟离心20分钟，倾去上清液，70％乙醇洗涤沉淀两次，自然凉干后溶于100μl TE中。加入1μl RNase(10mg/ml)，37℃保温1小时，以除去样品中的RNA，加入等体积的酚、氯仿抽提一次，3000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用等体积的氯仿抽提一次，加入两倍体积的冷乙醇，-20℃沉淀2小时以上，12000转/分钟离心20分钟，70％7醇洗涤沉淀两次，风干后，溶于50μl TE中。紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
二、扩增多态性DNA(RAPD)分析RAPD引物为OP系列120个，购自美国OPERON公司(即10bp寡核苷酸)S系列93个，购自上海生物工程公司，总共213个。
1.PCR扩增(1)反应体系为小麦基因组20ng/μlDNA 1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mM dNTP 0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，总体系25μl。混匀，瞬间离心收集，美国PE公司PE9700进行反应。
(2)反应程序96℃变性1分钟，35℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，4个循环；94℃变性45秒，36℃退火1分钟，72℃延伸90秒，45个循环；72℃补齐10分钟。
2电泳检测取扩增产物8μl，1.4％的琼脂糖凝胶(含有0.5％μg/μl EB)电泳，紫外灯下观察并照相。
我们利用213个随机引物对京411和杂交后代抗病单株进行了RAPD分析，发现只有引物S2092的扩增产物在京411和抗病单株和Brock中表现多态性。图1是引物S2092的扩增结果，在抗病单株和Brock中能观察到一条分子量约为900bp的特异带S2092900，重复实验三次，此带仍能稳定出现。如图1所示1，京411、2，抗病单株、3，Brock。说明这条特异带可能与小麦抗白粉病特性存在联系。
三、RAPD分子标记S2092900的连锁性鉴定小麦杂交后代白粉病抗性鉴定在田间进行，白粉菌接种在孕穗期的小麦苗，将带菌感病对照株移栽至田间待鉴定的材料旁，通过自然传播接种，2-3周后调查抗病性，调查级别分为免疫、强抗、抗、感和高感。分别提取抗病、感病单株的总体DNA，用上述同样的反应体系及程序，用引物S22092进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapmakerEXP3.0b计算标记与抗白粉病基因之间的遗传距离。以S2092对杂交后代群体131个单株进行PCR扩增。结果显示，101个抗病单株中有95株存在特异带，6株没有特异带；30个感病单株中均没有特异带。这一实验结果表明特异DNA片段S2092900与小麦的抗病性是紧密连锁的，但在抗病和感病单株中都有一定的交换。如图2所示R是有S2092900特异带的杂交后代抗病单株；R*是没有S2092900特异带，但表型为抗病的杂交后代单株，表明发生了交换；S是没有S2092900特异带的杂交后代感病单株；经计算，S2092900与抗病基因间的遗传距离为4.3cM。
四、S2092900的克隆、测序与SCAR标记转换为了将S2092900转换成稳定的SCAR标记，将S2092900DNA片段用低熔点琼脂糖凝胶纯化，纯化的DNA片段与PGEM-T easy Vector(Promega)连接，转化大肠杆菌Jm109，重组质粒经T7、Sp6 PCR电泳检测，EcoR I酶切鉴定，获得阳性克隆子，送Sangon测序。将测序结果用生物信息学SMS进行分析，并通过Internet与GenBank国际基因数据库进行同源性分析。经双端测序后，S2092900标记共由972个bp组成。由于从GenBank没有查询到相关的基因序列与该片段同源，该片段可以认为是Brock中与抗白粉病基因相连锁的新的分子标记。
根据克隆片段的DNA序列，我们合成了3个20碱基的SCAR标记引物，并命名为S2092972A、S2092972B、S2092972C，序列如下S2092972A 5’GGTTGTTCCCAAAGAGGTCA 3’S2092972B 5’ATGTTTGAAGCAGGGTGCAG 3’S2092972C 5’TCCTCAATCTGGAGGGACAC 3’其中引物A含有RAPD分子标记S2092的10mer引物序列，并向3’端延伸10个碱基，引物B和C分别根据S2092972序列中碱基设计而成，不含RAPD分子标记S2092的随机引物序列。用上述引物在Brock、杂交、回交(Brock/015//京4117)后代抗性单株中分别进行扩增，反应条件为反应体系为25μl，各组分物质的含量分别为template 20ng；10×Buffer 2.5μl；MgCl21.6mM；dNTP0.15mmol/L；5pmol primer；Taq 1.25U，ddH2O补齐25μl，混匀，离心收集，在PTC-150-25上进行反应，反应程序如下94℃变性3min，64℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，72℃ 5min，4℃保存。1.0％琼脂糖凝胶(含EB)，电泳1小时，紫外反射透射分析仪观察并照相。扩增结果证明，在Brock、杂交、回交(Brock/015//京4117)后代抗性单株中分别扩增出860bp和200bp两个特异带。而在京411中则没有检测到这两条特异带如图3所示。在图3中，M1DL2000Marker，M2λDNA EcoRI/HindIII Marker.1，2SCAR860；3，4SCAR200.
为了检测这两个SCAR标记的可靠性，我们对Brock×京411的F2分离群体抗感个体进行了分析。结果表明，在F2分离出的抗性个体中都检测到了这两个SCAR标记，而感病个体中没有发现，如图4所示。在图4中，M为λDNAEcoRI/HindIII Marker。
权利要求
1.小麦抗白粉病基因相紧密连锁的分子标记，其特征在于所述的分子标记SCAR860、SCAR200，是用RAPD分子标记方法筛选出S2092972分子标记，再将S2092972转换成稳定的SCAR标记，该标记是采用下述方法得到的(1)抗病基因供体亲本来自英国普通小麦品种Brock，其与感病普通小麦品系015和感病亲本京411进行杂交，杂交组合为“Brock/015//京411”，抗病单株是通过杂交、回交和自交，从抗白粉病稳定的高世代株系中得到；(2)用苯酚-氯仿方法提取小麦亲本幼苗及杂交后代幼苗DNA；(3)采用RAPD分子标记方法，进行与小麦白粉病抗性相关的分子标记的筛选；(4)筛选出一个RAPD分子标记S2092900，经过连锁性鉴定，发现该标记与小麦抗白粉病基因相连锁，与抗性基因的遗传距离为4.3cM。(5)将S2092900转换为SCAR标记，即SCAR860、SCAR200。
2.按照权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，其特征在于采用RAPD分子标记方法，进行与小麦白粉病抗性相关的分子标记，其筛选的具体做法是用10bp随机引物在抗、感亲本以及它们的杂交后代间DNA多态性分析，即用RAPD标记技术筛选，采用美国OPERON公司开发的10bp寡核苷酸作为随机引物，在PE-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20ng/μl小麦基因组DNA1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mMdNTP0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，总体系25μl，反应程序96℃变性1分钟、35℃退火1分钟、72℃延伸2分钟、4个循环，94℃变性45秒、36℃退火1分钟、72℃延伸90秒、45个循环，72℃补齐10分钟；产物检测在含有0.5％μg/μl EB的1.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果；
3.按照权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，其特征在于分子标记的连锁性鉴定，即小麦杂交后代白粉病抗性鉴定在田间进行，白粉菌接种在孕穗期的小麦苗，将带菌感病对照株移栽至田间待鉴定的材料旁，通过自然传播接种，2-3周后调查抗病性，调查级别分为免疫、强抗、抗、感和高感。分别提取抗病、感病单株的总体DNA，用上述同样的反应体系及程序，用引物S22092进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapmakerEXP3.0b计算标记与抗白粉病基因之间的遗传距离。
4.按照权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，其特征在于将S2092900转换成稳定的SCAR标记，是这样实现的首先将该标记克隆在细菌质粒PGEM-T easy Vector上，经双端测序后，S2092900分子标记的实际长度为972bp，根据该序列设计并合成3个SCAR引物，命名为S2092972A、S2092972B、S2092972C，其A与B为一对、A与C为一对，在Brock、杂交、回交即Brock/015//京4117后代抗性单株中分别进行扩增，在抗性单株中均能扩增出预计的两个SCAR标记SCAR860和SCAR200，为了检测这两个SCAR标记的可靠性，对Brock×京411的F2分离群体抗感个体进行了分析，其结果在F2分离出的抗性个体中都检测到了这两个SCAR标记，而感病个体中没有。
全文摘要
与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记属于农业生物技术工程，特别涉及与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记及其获得方法。本发明克服常规标记方法工作量大、易受环境影响、育种周期长等缺点。采用RAPD分子标记方法对抗、感小麦亲本及抗病杂交后代“Brock/015//京411”进行抗性标记筛选。RAPD标记用10bp寡核苷酸为随机引物，得到与小麦抗白粉病基因相连锁的新分子标记S209文档编号C12Q1/68GK1556218SQ20031012206
公开日2004年12月22日 申请日期2003年12月31日 优先权日2003年12月31日
发明者彭永康, 陈宏 , 王振英 申请人:天津市农业生物技术研究中心