专利名称：微生物的通用检测方法和用于实施该方法的反应环境的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，特别是涉及在可能发现微生物的不同环境中检测和鉴定微生物的方法。
针对不同的需要，人们已经开发了许多检测微生物的方法。对此，可以提到的有医疗样本分析、农业食品工业中的质量控制和水处理后续工作。
理想的微生物检测方法应该是快速、特异(不应有假阳性)、敏感、易于实施。该方法应该允许在不同环境中检测活的和死的微生物。最后，对涉及到的细菌类型进行初步鉴定将是一种附加的优点。
在有盖培养皿或液相中培养的方法允许以很好的敏感性检测在大多数环境中处于生长期的所有细菌。理论上，单个细菌足以保证在培养后获得阳性结果，在液相中的培养可以自动化(G.Aubert et al.，1993)。但是，获得结果所需要的时间有时是非常长的。因此，检测血液产品中的丙酸杆菌菌株(Propionibacterium)需要四天多培养时间(ME.Brecheret al.，2001)。对于分枝杆菌(Mycobacterium)，检测需要二十多天(H.Saitoh et al.，2000)。细菌的生长也很大程度上被所选择的培养环境调节，所述环境可以是简单的或加料强化的(enriched)，包含或不包含抗菌剂抑制剂。培养条件对于待检测的细菌来说也是特异的。因此，应用了不同的培养温度和需氧或厌氧条件。鉴定微生物应该在培养后的第二时间通过这些方法来进行。最后，这种技术不能检测死的或不能再生的细菌。
实施分子生物学技术的方法几小时的温育就足以产生阳性样本，而且可以在一次反应中检测至少十种微生物，因此这种方法是快速而敏感的。
使用特异于靶DNA的荧光探针进行聚合链式反应(PCR)允许即时检测样本中的细菌污染(Q.He et al.，2002)。为了保护在扩增潜在抑制因子的反应中必需的聚合酶，对样本进行纯化是必要的。例如，在血浆中发现了许多的PCR抑制因子(WA.Al-Soud et al.，2002)。这种预先的纯化步骤使得利用PCR来检测微生物的方法不易实施。因此，如果样本包含被白细胞吞噬的细菌时，任何残留的DNA痕迹都会带来样本阳性的结果，这将大大损害该方法的特异性。
杂交技术可以通用和/或特异检测细菌(EB Braun-Howland et al.，1992；S.Poppert et al.，1992；S.Poppert et al.，2002)。类似于PCR，样品的制备步骤再次成为该方法中的一个限制步骤。残留核酸的存在也再次成为假阳性的根源。
分子生物学技术的主要限制在于引物的选择，引物的特异性必须足够大以进行基因检测，为避免假阳性反应，对于待检测微生物是特异性的。通常需要不同引物的混合物，这就产生了技术上的限制。
利用针对细菌细胞壁的抗体的免疫组织化学或免疫细胞化学标记方法(酶联免疫吸附分析，ELISA)受限于抗体的特异性。实际上，现在没有抗体能进行微生物的通用检测。这种技术仅仅能用于精确鉴定细菌菌株(K.Kakinoki et al，2001；J.Guarner et al.，2002)。它也需要对待分析的细胞或组织进行特殊的制备，包括例如对样品的固定和细胞渗透，这将引起丙酮、甲醛和甲醇类溶剂的干预。
利用比色法的显微方法，使用例如GRAM着色剂或必需的(vital)着色剂或荧光染料，可以对于污染细菌的类型进行可见形态学鉴定(P.Fazii et al.，2002)。然而，它们缺乏敏感性而且为了确保可见而需要延长的操作时间以及若干天的微生物生长(S.Mirrett et al.，1982)。
使用细胞计量术可以以一种快速简单方式检测微生物(DT.Reynolds et al.，1999；H.Okada et al.，2000)。
但是，这种方法的限制在于标记过程。实际上，无论是对于靶菌株细胞壁特异性的抗体还是嵌入剂类型DNA标记物(可以自己插入核酸碱基对形成的平台(plateaus)之间的分子)都不能进行微生物的通用检测。但是，后一种选择为了使得标记物穿透细菌的细胞壁而需要细菌的预操作(D.Marie et al.，1996)。
为克服上述缺陷，本申请人设计了一种微生物的通用检测方法，利用了一种通用于所有细菌、酵母、霉菌、寄生虫的标记物，例如对特殊核酸序列非特异性的DNA的嵌入剂化合物。
本检测方法可应用于任何生物学液体。在本发明中，术语“生物学液体”表示任何含有一种或几种微生物的液体，如离子环境、培养基环境、生理环境如血液或其衍生物，如血小板浓缩物或红细胞或血浆，因而涉及不同的应用领域如医学样品的分析，农业食品工业中的质量控制及水处理的后续操作。
本发明的微生物检测方法优选应用于血液或其衍生物如血小板浓缩物或红细胞或血浆中。
构成本发明主题的标记微生物的方法使用了一个反应环境，其包括一种标记试剂、细胞穿透试剂，该穿透试剂有利于标记试剂进入微生物基因组的分子通道而与微生物的性质无关。在一个特别优选的方法中，本发明的标记方法允许微生物的结构，特别是细菌被完整保存。
这种反应环境允许标记试剂通过-细胞质膜，也就是无论是哪一种微生物的脂质分子和膜蛋白双层结构；-革兰氏阳性细菌的细胞壁，大部分由肽聚糖或胞壁质组成，与细胞质膜接触并且可能被多糖表层覆盖；-革兰氏阴性细菌的外膜，含有许多磷脂、脂蛋白和脂多糖，它通过一个周质空间与细胞质膜隔开，周质空间中有蛋白并且被多个孔穿透。除了从孔中穿过的物质之外，这种壁对于大多数物质是不通透的。
这种微生物标记的新方法允许对活的微生物以及死亡的或不能再生的微生物进行通用标记。
以这种方式标记的微生物是可以进行分析的，例如，通过利用落射荧光显微镜的显微镜荧光技术和/或液体细胞计量术和/或固相细胞计量术。
本发明的方法包括一个从含有微生物的样品起始来初始准备微生物。在同一步骤中为穿透微生物使用了不同试剂而不改变它们的形态学并使它们标记上荧光。
本发明的方法允许细菌的结构以一种完整的方式保存，以按照细胞生物学技术进行分析，所述细胞生物学技术可以视觉鉴别出大类别的微生物杆菌，球菌，孢子，酵母。
本方法同时允许基于微生物形状和大小来检测和形态学鉴定微生物。本方法可用于检测不同生理、培养、离子环境中的微生物。
本方法优选并同时允许基于存在于血液或其衍生物如血小板浓缩物或红细胞或血浆中的微生物的形状和大小来检测和形态学鉴定微生物。
所述微生物的通用检测方法包括4或5个步骤。
悬浮于缓冲液、生理血清、培养环境、血液、血浆或血液衍生物的水中的微生物置于包括嵌入剂和至少一种细胞穿透反应物的单一反应环境中。
本发明中“细胞穿透反应物”表示一种溶液，该溶液至少包括至少一种透化剂(agent perméabilisant)、一种去污剂、一种离子螯合剂和一种防腐剂的混合物。
更准确的，本发明涉及一种检测可能存在于生物学液体中的微生物的方法，包括以下步骤a)提取生物学液体样品，b)将这种样品置于与反应环境接触，该反应环境包括一种标记试剂和一种穿透这些微生物的膜的细胞反应物，
c)将样品在一种能保留可能存在于样品中的被标记的微生物的滤器上过滤，和d)检测步骤c)中的经标记并保留在滤器上的微生物。
标记试剂优选是一种DNA的嵌入剂化合物，选自包括下述物质的组花青衍生物，碘化丙啶，吖啶橙和溴化乙啶。花青衍生物选自由PicoGreen、SYBR green和YOPRO1组成的组。关于它们的优选浓度，花青衍生物的浓度是从0.001％到0.5％(体积/体积)，优选是0.003％到0.05％。碘化丙啶、吖啶橙或溴化乙啶的浓度是从0.1μg/ml到100μg/ml，优选是从1μg/ml到40μg/ml。
标记试剂优选是PicoGreen。
在下文和权利要求以及没有相反的提示的实施例中，“优选浓度”表示在最终反应环境“生物样品和反应环境(标记试剂+细胞穿透反应物)”中的产物浓度。本领域技术人员知道如何容易地调节穿透反应物中不同组分的浓度，如在浓缩的母液中。
微生物的细胞穿透反应物优选是一种溶液，该溶液至少包括至少一种透化剂、一种去污剂、一种离子螯合剂和一种防腐剂的混合物。
根据本发明，在最终反应物中的透化剂、去污剂、离子螯合剂和防腐剂的百分含量(以重量计)包括从1×10-4％/0.03％/0.02％/6×10-4％到2.5×10-3％/0.8％/0.6％/0.015％。
透化剂选自聚乙二醇(PEG)、毛地黄皂苷(digitonine)、莫能菌素、聚氮丙啶(polyethylenimine)(PEI)、六甲基磷酸钠(sodiumhexamethapHospHate)和苯扎氯铵(benzalkonium chloride)。
这些透化剂的优选浓度如下-PEG的浓度为从0.01％到1％，优选是从0.05％到0.5％；-毛地黄皂苷的浓度从0.01μg/ml到10μg/ml，优选是从0.05μg/ml到5μg/ml；-莫能菌素的浓度从0.1μg/ml到5μg/ml，优选是从0.5μg/ml到1μg/ml；-PEI的浓度从1μg/ml到400μg/ml，优选是从5μg/ml到120μg/ml；-六甲基磷酸钠的浓度从0.005％到1％，优选是从0.01％到0.1％；-苯扎氯铵的浓度从0.001％到0.1％，优选是从0.005％到0.05％；透化剂优选是聚氮丙啶(PEI)。
在去污剂中，优选的是如下那些N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷(NOG)，皂角苷(saponine)，Tween，Triton，Igepal和CHAPS。它们的优选浓度如下-皂角苷或Tween的浓度从0.005％到10％，优选是从0.05％到0.5％；-NOG的浓度从0.01％到10％，优选是从0.1％到0.5％；-Triton的浓度从0.0001％到0.05％，优选是从0.0008％到0.002％；-Igepal的浓度从0.01％到20％，优选是从1％到5％；去污剂优选是N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷(NOG)。
对于离子螯合剂，优选是包括EDTA和EGTA的组中的那些。
离子螯合剂的浓度优选包括从0.05％到0.8％。
离子螯合剂优选是EDTA。
-EDTA的浓度从0.1mM到50mM，优选是从0.2mM到7.5mM。
防腐剂选自包括下列物质的组吡咯烷酮碘(betadine)，溴棕三甲铵(cetrimide)，茶树油，萜品烯-4-醇，氯己啶(chlorexidine)，多粘菌素B和利福平。
防腐剂优选是氯己啶。
-氯己啶的浓度从0.0005％到0.5％，优选是从0.001％到0.05％；-溴棕三甲铵的浓度从0.01％到5％，优选是从0.05％到1％；-吡咯烷酮碘的浓度从0.0001％到0.001％，优选是从0.0005％到0.005％；-茶树油的浓度从0.0001％到0.1％，优选是从0.0005％到0.05％；
-萜品烯-4-醇的浓度从0.05％到10％，优选是从0.5％到5％；-多粘菌素B和利福平的浓度从0.1μg/ml到100μg/ml，优选是从1μg/ml到50μg/ml。
穿透反应物还可以包括一种酶或一种细菌素。
酶优选溶菌酶，细菌素优选乳链菌肽。
溶菌酶浓度有利的是从0.5μg/ml到200μg/ml，优选是从0.05μg/ml到20μg/ml，乳链菌肽的浓度有利的是从0.005μg/ml到10μg/ml，优选的是从0.005μg/ml到0.05μg/ml。
根据本发明，为了有效穿透细菌细胞壁，还可以使用低温防护试剂，如DMSO或离子(NaCl，KCl，MgCl2，次氯酸钠)或蔗糖。
DMSO的浓度从0.05％到20％，优选是从0.5％到5％；蔗糖的浓度从0.5％到70％，优选是从5％到20％；次氯酸钠的浓度从0.001％到5％，优选是从0.005％到0.5％；柠檬酸钾的浓度从0.5mM到200mM，优选是从5mM到50Mm。
根据本发明的一种具体实施方案，微生物检测方法中步骤b)可以两个子步骤b’)和b”)来实现。
在步骤b’)中，样品与包括一种标记试剂和一种选自聚乙二醇(PEG)或聚氮丙啶(PEI)的渗透聚合物的反应环境接触。优选使用聚氮丙啶(PEI)。
在步骤b”)中，将一种混合物加入到所述反应环境中，该混合物包括至少一种去污剂、一种离子螯合剂、一种防腐剂和选自乳链菌肽、毛地黄皂苷、六甲基磷酸钠和苯扎氯铵的另一种透化剂。
当本发明方法的步骤b)以两个子步骤b’)和b”)来实现时，所述酶加入到步骤b”)中。
本发明还涉及一种用于标记微生物的反应环境，包括一种标记试剂和一种用于穿透这些微生物细胞的反应物。
根据本发明，优选在反应环境中包含的用于标记微生物的所述标记试剂和穿透反应物及其浓度或其组分的浓度与本发明前述检测方法中使用的相同。
根据本发明的细胞穿透反应物优选包括-1/22000的PicoGreen(分子探针)；-终浓度为5.5μg/ml的PEI；-终浓度为4.5×10-4％的氯己啶双乙酸盐；-终浓度为0.16％的N-辛基吡喃葡糖苷；-终浓度为0.018μg/ml的乳链菌肽；-终浓度为0.45mM的EDTA；-数量足以达到所需最终体积的磷酸盐缓冲液(PPS)。
本发明将借助以下实施例和附图进行说明，其中提及的浓度是指穿透反应物的浓度
图1显示了添加乳链菌肽对表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和大肠杆菌(Escherichia coli)的检测的影响。结果以固相细胞计量术检测出的细菌数(图1A)和相对于酶测法检测到的细菌的百分比(图1B)表示。
图2显示了单独使用EDTA对检测在不同试验环境中制备的表皮葡萄球菌和大肠杆菌的影响。
图3图示了不同浓度的乳链菌肽联合不同浓度EDTA对改进检测革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)的试验结果。结果以相对于酶测法的检测百分比表示。
图4图示了不同浓度乳链菌肽联合固定浓度7.5mM的EDTA检测革兰氏阴性细菌(大肠杆菌和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))和革兰氏阳性细菌(表皮葡萄球菌)的试验结果。结果以固相细胞计量术检测出的细菌数量表示。
图5图示了在存在乳链菌肽0.2μg/ml/EDTA 7.5mM条件下使用DNA荧光标记物时pH对检测大肠杆菌的影响。
图6显示了在存在乳链菌肽0.2μg/ml/EDTA 7.5mM，pH4.8时使用DNA荧光标记物对革兰氏阴性细菌大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)的检测。
图7显示了N-辛基吡喃葡糖苷作为细胞穿透反应物联合乳链菌肽0.2μg/ml和EDTA 7.5mM对改进表皮葡萄球菌(革兰氏阳性)和铜绿假单胞菌(革兰氏阴性)的标记的试验结果(N/E＝乳链菌肽0.2μg/ml/EDTA 7.5mM的溶液)。
图8显示了使用氯己啶作为细胞穿透反应物对改进大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粘质沙雷氏菌(革兰氏阴性细菌菌株)的标记的结果和对表皮葡萄球菌的效果。
图9显示了在不同环境中细菌(铜绿假单胞菌)的DNA标记和检测。
图10显示了在氯己啶中细菌的DNA标记和检测，证明了联用NOG对提高标记物的渗透能力和穿透的重要性。图10A显示了标记PBS中细菌悬浮液，图10B显示了在血小板浓缩物中标记细菌悬浮液。
图11显示了在使用DNA荧光标记物时不同浓度的PEI对粘质沙雷氏菌的检测效果。
图12图示了PEI对DNA标记和荧光检测大肠杆菌的影响。
图13显示了在不同环境中存在包括乳链菌肽/EDTA/CLX/NOG/PEI标记组合物时对表皮葡萄球菌和大肠杆菌的检测结果。
检测样品中微生物的方法可通过对样品实施两个步骤的处理来进行，第一个步骤标记/细胞穿透，通过向样品加入一种包括标记试剂和一种第一细胞穿透反应物的组合物进行，温育一段时间之后进行第二步骤，在该步骤中加入一种包括其他细胞穿透反应物的组合物。
所述方法可以例如按照下述方案来实施
将3ml待处理样品在1ml第一细胞穿透/标记溶液(PicoGreen0.5ml/l，PEI 60mg/l，PBS溶液)中温育40分钟。这一步骤在室温下搅拌进行。
第二步骤中添加7ml呈溶液的一种组合物，该组合物使得可以后续进行标记(乳链菌肽0.2mg/l，NOG 2.5g/l，EDTA 1.86g/l，氯己啶双乙酸盐50mg/l)。在室温下温育20分钟。然后将样品在炭滤器如聚碳酸酯或聚酯上过滤，并用固相细胞计量术进行分析。
检测样品中微生物的方法也可以通过以单一步骤对样品实施处理来进行，即向这种样品中加入包括标记试剂和一种或多种细胞穿透试剂的组合物。
所述方法可以例如根据下述方案来实施将8ml待处理样品在室温下与3ml细胞穿透/标记溶液(PicoGreen0.17ml/l，PEI 20mg/l，EDTA 4.34g/l，乳链菌肽0.47mg/l，NOG 5.83g/l，氯己啶双乙酸盐116.7mg/l)共同温育60分钟。然后将样品在聚碳酸酯炭滤器上过滤并用固相细胞计量术分析。
所有的这些处理可以在开放装置如在试管或封闭装置如注射器或一种为细菌学分析制备血小板的装置(hemosystem，ref.SPK01)中无差别地实现。
微生物检测确定用于标记/细胞穿透的反应环境的最佳组合物1-在乳链菌肽存在下进行标记单独使用乳链菌肽作为有利于标记试剂穿透的透化剂。
I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中以1/2000制备PicoGreen溶液(分子探针)。
乳链菌肽溶液用蒸馏水制备一系列的乳链菌肽稀释液(起始物质为2.5％重量/重量)0.1g乳链菌肽溶于50ml蒸馏水＝50μg/ml溶液，0.02g乳链菌肽溶于50ml蒸馏水＝10μg/ml溶液，0.004g乳链菌肽溶于50ml蒸馏水＝2μg/ml溶液，在PBS中制备细菌悬浮液大肠杆菌(CIP105901)表皮葡萄球菌(68.21)调整所述制品以获得104细菌/ml的悬浮液II方法1.2ml标记溶液+3ml细菌悬液在22℃下温育15分钟+7ml乳链菌肽溶液以0.4μm孔隙的炭滤器进行过滤III分析和结果过滤后滤器通过固相细胞计量术分析，结果以固相细胞计量术检测出的细菌数量和以相对于酶检测法检测到的细菌百分比来表示。
这些结果显示了乳链菌肽的加入对表皮葡萄球菌和大肠杆菌的检测的影响并图示在附图1A、1B中。
可以确定乳链菌肽的加入允许革兰氏阳性细菌很好的标记，且优选低浓度。
2-使用EDTA本身作为利于标记试剂穿透的透化剂。
I反应物标记溶液在PBS缓冲液中以1/2000制备PicoGreen溶液(分子探针)。
EDTA溶液EDTA 5mM0.093g EDTA二钠，QSP(拉丁语＝足量)50ml蒸馏水在PBS、蒸馏水、TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)环境以及血浆中制备细菌悬浮液。
大肠杆菌(CIP105901)表皮葡萄球菌(CIP68.21)调整所述制品以获得103细菌/ml的悬浮液II方法1.2ml标记溶液+3ml不同环境下的细菌悬浮液在22℃下温育15分钟+7ml EDTA溶液以0.4μm孔隙的炭滤器进行过滤III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以荧光细菌的数量表示。
这些结果显示了单独使用EDTA对在不同检测环境中制备的表皮葡萄球菌和大肠杆菌的检测的影响并图示在附图2中。
可以确定EDTA自身并不允许对革兰氏阳性和阴性细菌的正确标记。
3-联合使用乳链菌肽/EDTA作为利于标记试剂穿透的透化剂。
I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中以1/2000制备PicoGreen溶液(分子探针)。
乳链菌肽/EDTA溶液乳链菌肽10μg/ml0.02g乳链菌肽(起始物质为2.5％重量/重量)QSP 50ml蒸馏水。
EDTA 20mM0.372g EDTA二钠，QSP 50ml蒸馏水，用0.25、2.5、12.5和18.75ml的20mM的EDTA制备一系列EDTA(浓度范围0.1；1；5和7.5mM)，加入50、250、500μl或1ml 10μg/ml的乳链菌肽(浓度范围0.10；0.05；0.1和0.2μg/ml)，QSP 50ml蒸馏水。
在PBS中制备的细菌悬液大肠杆菌(CIP 105901)调整所述制品以获得103细菌/ml的悬浮液II方法1.2ml标记溶液+3ml细菌悬浮液在22℃下温育15分钟+7ml乳链菌肽溶液或乳链菌肽/EDTA溶液以0.4μm孔隙的炭滤器进行过滤III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以固相细胞计量术检测出的细菌的数量和以相对于酶检测法检测到的细菌百分比表示。
这些结果显示了乳链菌肽与EDTA联合加入对大肠杆菌检测的影响并图示在附图3中。
可以确定当存在乳链菌肽/EDTA混合物时进行标记对细菌检测有协同作用。还可确定当乳链菌肽浓度为0.1μg/ml和EDTA为7.5mM时，标记的大肠杆菌百分比最大。
4-乳链菌肽/EDTA联用作为检测细菌的细胞穿透反应物的最佳浓度
I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中以1/2000制备PicoGreen溶液(分子探针)。
乳链菌肽/EDTA溶液0.02g乳链菌肽(起始物质为2.5％重量/重量)溶于50ml蒸馏水即10μg/ml，乳链菌肽0.05μg/ml/EDTA 7.5mM250μl乳链菌肽10μg/ml+0.140g EDTA二钠，QSP 50ml蒸馏水，乳链菌肽0.1μg/ml/EDTA 7.5mM500μl乳链菌肽10μg/ml+0.140g EDTA二钠，QSP 50ml蒸馏水，乳链菌肽0.5μg/ml/EDTA 7.5mM2.5ml乳链菌肽10μg/ml+0.140gEDTA二钠，QSP 50ml蒸馏水，在PBS中制备的细菌悬浮液大肠杆菌(CIP 105901)表皮葡萄球菌(CIP 68.21)粘质沙雷氏菌(CIP 103716)调整所述制品以获得103细菌/ml的悬浮液II方法1.2ml标记溶液+3ml细菌悬浮液在22℃下温育15分钟+7ml不同浓度的乳链菌肽/EDTA溶液以0.4μm孔隙的炭滤器进行过滤III分析和结果过滤后，对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以固相细胞计量术检测出的细菌的数量表示。这个实验的结果显示了在存在与EDTA7.5mM联用的不同浓度乳链菌肽时革兰氏阴性细菌(大肠杆菌，粘质沙雷氏菌)和革兰氏阳性细菌(表皮葡萄球菌)的检测结果示于附图4中。
可以确定大肠杆菌的标记百分率在乳链菌肽浓度为0.1μg/ml时最大，当乳链菌肽以0.2μg/ml与EDTA 7.5mM联用时对所有的试验细菌来说可以获得更好的检测结果。
5-pH对乳链菌肽/EDTA存在时细菌标记的影响I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中制备1/2000 PicoGreen溶液(分子探针)。
乳链菌肽/EDTA溶液乳链菌肽10μg/ml0.02g乳链菌肽(起始物质为2.5％重量/重量)QSP 50ml蒸馏水。
EDTA 20mM0.372g EDTA二钠，QSP 50ml蒸馏水，18.75ml EDTA 20mM+1ml乳链菌肽10μg/mlQSP 50ml蒸馏水这种溶液的pH为4.8用NaOH(1M)进行缓冲直到为pH6，pH7，pH8。
在PBS中制备的细菌悬浮液大肠杆菌(CIP 105901)表皮葡萄球菌(CIP 68.21)粘质沙雷氏菌(CIP 103716)产气肠杆菌(CIP 60.86T)铜绿假单胞菌(CIP 76110)奇异变形菌(CIP 104588)调整所述制品以获得103细菌/ml的悬浮液
II方法1.2ml标记溶液+3ml细菌悬浮液在22℃下温育15分钟在不同pH下+7ml乳链菌肽/EDTA溶液以0.4μm孔隙的炭滤器进行过滤III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以检测的荧光细菌的数量表示。
这个实验的结果显示pH对在乳链菌肽0.2μg/ml/EDTA 7.5mM存在下用DNA荧光标记物检测大肠杆菌的影响的结果示出附图5中。
可以确定，在所述预定的条件下增加pH不会改进大肠杆菌的标记。
在pH4.8存在乳链菌肽0.2μg/ml/EDTA 7.5mM时，用DNA荧光标记物进行革兰氏阳性细菌表皮葡萄球菌和革兰氏阴性细菌大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形菌的检测示于附图6中。
可以确定，在pH4.8的条件下，革兰氏阴性细菌不同菌株之间的标记是均一(homogène)的。革兰氏阳性细菌表皮葡萄球菌的检测比阴性细菌更好。
6-乳链菌肽/EDTA/N-辛基吡喃葡糖苷的联用I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中制备1/2000 PicoGreen溶液(分子探针)。
乳链菌肽/EDTA/NOG溶液乳链菌肽100μg/ml0.2g乳链菌肽(起始物质为2.5％重量/重量)QSP 50ml蒸馏水。
EDTA 100mM1.86g EDTA二钠，QSP 50ml蒸馏水，N-辛基吡喃葡糖苷5％2.5g溶于50ml蒸馏水20，10，5或2.5ml 5％的NOG+3.75ml 100mM的EDTA+0.1ml 100μg/ml的乳链菌肽QSP 50ml蒸馏水这种溶液的pH为4.8。
在PBS中制备的细菌悬浮液表皮葡萄球菌(CIP 68.21)铜绿假单胞菌(CIP 76110)调整所述制品以获得103细菌/ml的悬浮液II方法1.2ml标记溶液+3ml细菌悬浮液在22℃下温育15分钟+7ml乳链菌肽/EDTA溶液或乳链菌肽/EDTA/NOG溶液以0.4μm孔隙的炭滤器进行过滤III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以荧光细菌的数量表示。
在用N-辛基吡喃葡糖苷作为微生物细胞穿透反应物与乳链菌肽0.2μg/ml和EDTA 7.5mM联用的反应环境的组合物来改进表皮葡萄球菌(革兰氏阳性)和铜绿假单胞菌(革兰氏阴性)的标记的这种试验的结果显示在附图7中。
可以确定，添加0.25％和0.5％的N-辛基吡喃葡糖苷对表皮葡萄球菌(革兰氏阳性)和铜绿假单胞菌(革兰氏阴性)的标记有积极的作用。
7-在氯己啶的存在下进行标记为利于细菌标记试剂的穿透，仅仅使用氯己啶作为透化剂而实施的试验。
I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中制备1/2000 PicoGreen溶液(分子探针)。
氯己啶溶液氯己啶双乙酸盐5％1g溶于20ml蒸馏水50、25或10μl 5％的氯己啶双乙酸盐溶于50ml蒸馏水以获得0.01％；0.005％或0.001％的浓度范围。
在PBS、血小板浓缩物和自体血浆中制备的细菌悬浮液大肠杆菌(CIP 105901)表皮葡萄球菌(CIP 68.21)粘质沙雷氏菌(CIP 103716)铜绿假单胞菌(CIP 76110)调整所述制品以获得103细菌/ml的悬浮液II方法1.2ml标记溶液+3ml细菌悬浮液在22℃下温育15分钟+7ml不同浓度的氯己啶溶液用0.4μm孔隙的炭滤器进行过滤III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以荧光细菌的数量表示。计数使用参考方法在48小时在有盖培养皿(Petri dish)上进行。
用包括作为细胞穿透反应物的氯己啶来改进大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌(革兰氏阴性细菌菌株)和表皮葡萄球菌的标记的反应环境的组合物进行的这一试验的结果显示在附图8中。
可以确定，对于革兰氏阴性细菌的检测来说氯己啶的最佳浓度为0.005％。但是该浓度对于革兰氏阳性细菌是有毒的，会破坏革兰氏阳性细菌。
从图9中可以确定，血浆的存在对于氯己啶对铜绿假单胞菌标记物的细胞穿透的作用有拮抗作用。为了在包括生物学液体的不同环境中进行通用标记，氯己啶是不能单独被使用的。
8-氯己啶和N-辛基吡喃葡糖苷的联用I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中制备1/2000 PicoGreen溶液(分子探针)。
氯己啶/N-辛基吡喃葡糖苷溶液氯己啶双乙酸盐5％1g溶于20ml蒸馏水N-辛基吡喃葡糖苷1％0.5g溶于50ml蒸馏水50或25μl氯己啶双乙酸盐1％(最终浓度0.001％或0.0005％)+N-辛基吡喃葡糖苷5％(最终浓度0.25％)QSP 50ml蒸馏水在PBS和机采血小板(Apheresis Platelets)浓缩物中制备的细菌悬浮液大肠杆菌(CIP 105901)表皮葡萄球菌(CIP 68.21)粘质沙雷氏菌(CIP 103716)铜绿假单胞菌(CIP 76110)调整所述制品以获得103细菌/ml的悬浮液II方法1.2ml标记溶液
+3ml细菌悬浮液在22℃下温育15分钟+7ml氯己啶/NOG溶液在0.4μm孔隙的炭滤器上过滤III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以荧光细菌的数量表示。
表明在存在含为提高标记物渗透能力和穿透作用而使用的氯己啶和NOG的反应环境的组合物的条件下，DA的标记和标记细菌的检测的试验结果显示在附图10A和10B中。
可以看出氯己啶的最高浓度下获得细菌的最佳标记效果。
9-在仅有PEI存在下的标记I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中制备1/2000的PicoGreen溶液(分子探针)并添加PEI以获得最终浓度40、80、100、120、140和160μg/ml。
在PBS中制备的细菌悬浮液粘质沙雷氏菌(CIP 103716)分析的样品将细菌悬浮液在血小板浓缩物样品中以＞1/20稀释来获得104/ml粘质沙雷氏菌的最终浓度。
II方法1.2ml标记溶液+3ml样品在23℃下温育45分钟以5μm过滤(PALL滤器32mm)在7ml PBS中温育20分钟以0.4μm孔隙率过滤。
III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以检测到的荧光细菌的数量表示。
表明不同浓度PEI对于使用荧光DNA标记物检测粘质沙雷氏菌的影响的这一试验的结果显示在附图11中。
可以确定，获得细菌的最佳细菌检测效果的PEI浓度范围是从40到100μg/ml。
10-乳链菌肽/EDTA/N-辛基吡喃葡糖苷/氯己啶/PEI的联用本试验的目标是确定对标记大肠杆菌而言的PEI的最佳浓度范围I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中制备1/2000 PicoGreen溶液(分子探针)并添加PEI以获得最终浓度100、80和60μg/ml。
氯己啶/N-辛基吡喃葡糖苷/EDTA溶液0.5％氯己啶双乙酸盐500μl(氯己啶双乙酸盐终浓度5×10-3％)+1ml或500μl 25％的N-辛基吡喃葡糖苷(N-辛基吡喃葡糖苷终浓度0.5或0.25％)+500μl 20μg/ml的乳链菌肽(乳链菌肽终浓度0.2μg/ml)+500μl 0.5M的EDTA(EDTA终浓度5mM)QSP 50ml PBS于PBS中制备细菌悬浮液大肠杆菌(CIP 105901)，浓度调整为104细菌/ml。
分析的样品3ml细菌悬浮液+27ml血小板浓缩物或在血小板浓缩物样品中以1/10稀释的细菌悬浮液以获得细菌终浓度为105/ml。
II方法
1.2ml浓度分别为60、80或100μg/ml的PEI标记溶液+3ml样品在23℃下温育45分钟以5μm过滤(PALL滤器32mm)在7ml 0.5％或0.25％NOG的细胞穿透溶液中温育20分钟以0.4μm孔隙过滤(Whatman monocolorés碳滤器)。
III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以检测到的荧光细菌的数量表示。
表明PEI对DNA标记及大肠杆菌的荧光检测的影响的这一试验的结果显示在附图12中。
可以确定，无论NOG的浓度是多少，PEI浓度60μg/ml是DNA标记物穿透的最佳浓度。
11-不同环境下细菌的通用标记I反应物标记溶液在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中制备1/2000 PicoGreen溶液(分子探针)并添加PEI以获得最终浓度60μg/ml。
氯己啶N-辛基吡喃葡糖苷/EDTA/乳链菌肽溶液0.5％氯己啶双乙酸盐500μl(氯己啶双乙酸盐终浓度5×10-3％)+500μl 25％的N-辛基吡喃葡糖苷(N-辛基吡喃葡糖苷终浓度0.25％)+500μl 20μg/ml的乳链菌肽(乳链菌肽终浓度0.2μg/ml)+500μl 0.5M的EDTA(EDTA终浓度5mM)QSP 50ml PBS于PBS中制备的细菌悬浮液大肠杆菌(CIP 105901)，浓度调整为104细菌/ml。
表皮葡萄球菌(68.21)分析的样品在生物学液体样品中以1/10稀释细菌悬浮液以获得细菌终浓度为105/ml或3ml细菌悬浮液+27ml蒸馏水3ml细菌悬浮液+27mlPBS3ml细菌悬浮液+27ml培养环境(胰蛋白胨大豆肉汤)3ml细菌悬浮液+27ml人血浆3ml细菌悬浮液+27ml血小板浓缩物II方法1.2ml标记溶液+3ml样品在23℃下温育45分钟以5μm过滤，在7ml细胞穿透溶液中温育20分钟以0.4μm孔隙率过滤。
III分析和结果过滤后对滤器进行固相细胞计量术分析，结果以检测到的荧光细菌的数量表示。
示出表皮葡萄球菌和大肠杆菌在不同环境下的检测的本实验结果显示在附图13中。
以这种方式限定的方案允许在不同离子、培养和生理环境下检测革兰氏阳性和阴性细菌。这种检测对于两种类型的细菌是等同的。
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Wallner G，Tillmann D，Haberer K，Cornet P，Drocourt J-L.TheChemscan systema new method for rapid microbiological testing of water.European Joumal of Parenteral Sciences 1997；2(4)123-2权利要求
1.一种检测可能存在于生物学液体中的微生物的方法，其特征在于a)获取生物学液体样品，b)将这种样品与用于标记微生物的反应环境接触，该反应环境包括一种标记试剂和一种穿透这些微生物的膜的细胞穿透反应物，c)将这种样品在一种能保留可能存在于这一样品中的被标记的微生物的滤器上过滤，和d)检测被标记并保留在步骤c)中滤器上的微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述标记试剂是一种DNA的嵌入剂化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于DNA嵌入剂选自包括花青衍生物、碘化丙啶、吖啶橙和溴化乙啶组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于花青衍生物选自由PicoGreen、SYBR green和YOPRO1组成的组。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于花青衍生物的浓度包括从0.001％到0.5％，优选是从0.003％到0.05％，碘化丙啶，吖啶橙或溴化乙啶的浓度包括从0.1μg/ml到100μg/ml，优选是从1μg/ml到40μg/ml。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于微生物的细胞穿透反应物是一种溶液，该溶液至少包括至少一种透化剂、一种去污剂、一种离子螯合剂和一种防腐剂的混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于在所述细胞穿透反应物中在最终反应物中的透化剂、去污剂、离子螯合剂和防腐剂之间的比例包括从1×10-4％/0.03％/0.02％/6×10-4％到2.5×10-5％/0.8％/0.6％/0.015％。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述透化剂选自聚乙二醇(PEG)、毛地黄皂苷、莫能菌素、聚氮丙啶(PEI)、六甲基磷酸钠和苯扎氯铵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于PEG的浓度包括从0.01％到1％，优选是从0.05％到0.5％，毛地黄皂苷的浓度包括从0.01μg/ml到10μg/ml，优选是从0.05μg/ml到5μg/ml，莫能菌素的浓度包括从0.1μg/ml到5μg/ml，优选是从0.5μg/ml到1μg/ml，PEI的浓度包括从1μg/ml到400μg/ml，优选是从5μg/ml到120μg/ml，六甲基磷酸钠的浓度包括从0.005％到1％，优选是从0.01％到0.1％，苯扎氯铵的浓度包括从0.001％到0.1％，优选是从0.005％到0.05％。
10.根据权利要求6至9任一项所述的方法，其特征在于去污剂选自包括N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷(NOG)、皂角苷、Tween、Triton、Igepal和CHAPS的组中。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于皂角苷或Tween的浓度包括从0.005％到10％，优选是从0.05％到0.5％，NOG的浓度包括从0.01％到10％，优选是从0.1％到0.5％，Triton的浓度包括从0.0001％到0.05％，优选是从0.0008％到0.002％，Igepal的浓度包括从0.01％到20％，优选是从1％到5％。
12.根据权利要求5至11任一项所述的方法，其特征在于所述离子螯合剂选自包括EDTA和EGTA的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于EDTA的浓度包括从0.1mM到50mM，优选是从0.2mM到7.5mM。
14.根据权利要求5至13任一项所述的方法，其特征在于防腐剂选自包括下列物质的组吡咯烷酮碘，溴棕三甲铵，茶树油，萜品烯-4-醇，氯己啶，多粘菌素B和利福平。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于氯己啶的浓度包括从0.0005％到0.05％，优选是从0.001％到0.05％，溴棕三甲铵的浓度包括从0.01％到5％，优选是从0.05％到1％，吡咯烷酮碘的浓度包括从0.0001％到0.001％，优选是从0.0005％到0.005％，茶树油的浓度包括从0.0001％到0.1％，优选是从0.0005％到0.05％，萜品烯-4-醇的浓度包括从0.05％到10％，优选是从0.5％到5％，多粘菌素B和利福平的浓度包括从0.1μg/ml到100μg/ml，优选是从1μg/ml到50μg/ml。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其特征在于穿透反应物还可以包括一种酶或一种细菌素。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于酶是溶菌酶，溶菌酶浓度优选包括从0.5μg/ml到200μg/ml，特别优选是从0.05μg/ml到20μg/ml。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于细菌素是乳链菌肽，乳链菌肽的浓度优选包括从0.005μg/ml到10μg/ml，特别优选的是从0.005μg/ml到0.05μg/ml。
19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其特征在于所述穿透反应物还包括低温防护试剂，如DMSO或离子(NaCl，KCl，MgCl2，次氯酸钠)或蔗糖。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于DMSO的浓度包括从0.05％到20％，优选是从0.5％到5％，蔗糖的浓度包括从0.5％到70％，优选是从5％到20％，次氯酸钠的浓度包括从0.001％到5％，优选是从0.005％到0.5％。
21.根据权利要求1至20任一项所述的方法，其特征在于所述检测微生物的方法的步骤b)可以由两个子步骤b’)和b”)来实现，其中步骤b’)为将样品与包含一种标记试剂和一种选自聚乙二醇(PEG)或聚氮丙啶(PEI)的渗透聚合物的反应环境接触，所述渗透聚合物优选聚氮丙啶(PEI)，步骤b”)为将一种混合物加入到反应环境中，该混合物包括至少一种去污剂，一种离子螯合剂，一种防腐剂和另一种选自乳链菌肽、毛地黄皂苷、六甲基磷酸钠和苯扎氯铵的透化剂。
22.用于标记微生物的反应环境，其特征在于包括一种标记试剂和至少一种这些微生物的细胞穿透反应物。
23.根据权利要求22所述的反应环境，其特征在于所述标记试剂如权利要求2至5任一项所述。
24.根据权利要求22所述的反应环境，其特征在于所述微生物的细胞穿透反应物如权利要求6至21任一项所述。
25.一种细胞穿透反应物，其特征在于包括-1/22000的PicoGreen(分子探针)；-终浓度为5.5μg/ml的PEI；-终浓度为4.5×10-4％的氯己啶双乙酸盐；-终浓度为0.16％的N-辛基吡喃葡糖苷；-终浓度为0.018μg/ml的乳链菌肽；-终浓度为0.45mM的EDTA；-数量足以达到所需最终体积的磷酸盐缓冲液(PPS)。
全文摘要
本发明涉及一种检测微生物的方法，使用了一种反应介质，其包括一种标记试剂，至少一种促进所述标记试剂向微生物基因组中分子穿过的细胞穿透试剂。本发明还涉及所述标记反应介质。
文档编号C12Q1/68GK1717495SQ200380104048
公开日2006年1月4日 申请日期2003年11月25日 优先权日2002年11月25日
发明者伊莎贝尔·贝松富尔, 让－皮埃尔·埃尔梅, 塞巴斯蒂安·里博 申请人:海默系统公司