专利名称：丙型肝炎多表位抗原基因及其核酸疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种丙型肝炎疫苗。
背景技术：
HCV是引起肠道外传播的输血后肝炎或散发性非甲非乙型肝炎的主要病因，属黄病毒科，是单股正链RNA病毒。目前到少报道了16株HCV的全基因序列，由于基因型不同，分离的HCV基因组长度也不一致，一般为9400-10000b以之间，编码3010～3033个氨基酸的多蛋白前体。前体蛋白在蛋白酶的裂解作用下，生成成熟的病毒蛋白，包括位于病毒基因组的氨基端的核壳蛋白(C)和包膜蛋白(E1、E2)，位于羧基端的非结构蛋白(NS1/E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b，)。C区基因编码一个含191个氨基酸残基的蛋白，主要构成HCV的核心颗粒，故称该区为核心蛋白基因区。该基因区是HCVRNA读码框架中最保守的区域，保守程度紧次于5’非编码区，其合成的核蛋白中，仅有2-8(1.0-9.4％)个氨基酸发生改变，而且在其氨基酸序列中，至少有二个高保守的亲水区，是稳定的抗原决定簇。E2/NS1区基因的C端相对保守，N端变异较大，有两个高变区(hypervariableregion)即HVR1(384-473aa)和HVR2(474-480aa)，HVR1比HVR2更易变异，HVR1平均每月有一个氨基酸改变。而E1区基因变异非常大，使其编码的膜蛋白具有高变性，有利于逃避机体免疫系统的攻击，但该区域也存在相对稳定的区域，例如第315-327密码子区处于高保守区，其编码的表位肽有比较稳定的抗原性，是研制HCV疫苗可利用的区段。NS2位HCVRNA基因组的第730-1006位密码子区，编码一个含有277个氨基酸的蛋白，该蛋白含有较多的疏水氨基酸。因此具有较强的疏水性，其功能可能与膜结合作用有关。NS3位于HCVRNA基因组的第1007-1615位密码子区，编码一个含60个氨基酸的蛋白，该区变异性较小，与RNA解旋酶的表达有关。NS3蛋白含有较强的优势抗原表达区，不仅没有型特异性，而且相应的抗体出现较早。NS4位HCVRNA基因组1616-2013位密码子区，编码一个由398个氨基酸组成的蛋白，经水解成为两个蛋白NS4a(1616-1862)和NS4b(1863-2013)。该区编码的蛋白有较好疏水性，可能与膜结合有关。NS5位于HCVRNA基因组的2014-3010位密码子区(6372-9362nt)，编码一个含997个氨基酸残基的蛋白，该区有较高的保守性，是依赖于RNA的RNA聚合酶基因区，与病毒复制有关。
HCV病毒株极易变异，不同的HCV株间核酸序列的同源性仅为60％～92％。由于同类病毒不同突变株之间核酸序列的同源性如小于80％则分属不同的基因型，因此目前所获得的HCV病毒株主要分为4个主要基因型(HCV I、II、III、IV)，中国HCV基因型以II型为主。HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。可能的原因是(1)HCV高度变异，逃避机体的免疫清除；(2)HCV在肝组织及血液中含量低及诱导机体产生保护性的抗原性弱；(3)病毒颗粒与低密度脂蛋白或免疫球蛋白紧密联接，导致抗原决定簇被掩盖；(4)外周血淋巴细胞可能有HCV储存库的作用。对HCV感染目前还没有一种有效的治疗手段，因此，急需开发安全、有效的疫苗以控制HCV感染。
新型疫苗的研究必须有新的战略，在详尽研究病毒分子结构极其生物功能，分析病毒抑制宿主免疫应答的分子，激活宿主免役细胞产生保护性免疫应答的分子，从而在病毒基因水平上进行人工剪切修饰及组合，去除抑制免疫应答的组分，保留诱导编码不同的保护性片段，重建成人工疫苗，则可提高免疫效果，抑制病毒突变的免疫逃逸。以抗原表位为基础的DNA疫苗即具备了上述特点。近年来HCV全基因组序列的测出使得HCV基因疫苗的研究已展开并逐步深入。核酸疫苗是从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗，有些核酸疫苗不仅能高效诱导免疫应答，而且有明显的治疗作用。随着对核酸疫苗免疫机制认识的不断深入和对核酸疫苗结构及免疫方法的不断改进，这种新型疫苗必将成为有效的治疗性疫苗。DNA疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，其加工处理过程与病原的自然感染过程相似。因此，可以表达出与病原体相似的抗原。同时，两者的抗原提呈过程亦相同，因而，可以与自然感染一样诱导接种动物既产生细胞免疫又产生体液免疫。这是灭活疫苗和亚单位疫苗所不能比拟的。另外，DNA疫苗引发的免疫应答持久。由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，可以有效持续刺激免疫系统。
技术内容本发明的目的在于，提供根据HCV抗原表位的构象特点，设计、构建最佳的疫苗抗原构象，开发以HCV抗原表位为基础的丙型肝炎多表位抗原基因及其核酸疫苗。
本发明丙型肝炎多表位抗原基因的基因序列是gccaccatgt acaggatgca actcctgtct tgcattgcac taagtcttgc acttgtcaca 60aacagtgcag gcttcgccga cctcatgggg tacattccgc tcgtcggcgc ccccttggcc 120gccgctgcca agttcgtggc tgcctggacc ctgaaggccg ccgctacggg cgactttgac 180tcagtgatcg actgtaacgc cgccgctcag tacatcaagg ctaatagcaa attcatcgga 240atcaccgagc tggccgccgc tgaattcgat atcctcgagg ccgccgctga cctcatgggg 300tacattccgg ccgtcgccgc cgctaggctc tggcactacc cctgcactgt cgccgccgct 360tgtgcctcac acctccctta catcgaacag ggaatgcagc tcgccgagca gttcaagcag 420aaggcggccg ccgcttccta tacatggaca ggcgccttga tcacgccatg tgctgcggag 480gaggccgccg cttagtaa 498本发明优选HCV基因组中六个高度保守的免疫优势表位，加入一个破伤风类毒素----TT的辅助性T淋巴细胞表位基因及一个来源于恶性虐原虫环子孢子抗原的辅助性T淋巴细胞表位，各表位间用三个丙氨酸连接，同时在上述融合基因的5’端引入人IL-2 ER信号肽引导序列，并优化ATG前后碱基使之符合Kozak规则，最后在所设计基因前后分别引入BamHI和XbaI两个酶切位点，获得HCV复合多表位抗原基因----CEG。
本发明所述的HCV基因组中六个高度保守的免疫优势表位是1.HCV C129-144ggcttcgccg acctcatggg gtacattccg ctcgtcggcg cccccttg 482.HCV NS3439～449acgggcgact ttgactcagt gatcgactgt aac 33
3.HCV C132-140gacctcatgg ggtacattcc ggccgtc 274.HCV E2(614-622)aggctctggc actacccctg cactgtc 275.HCV NS41711-1732tgtgcctcac acctccctta catcgaacag ggaatgcagc tcgccgagca gttcaagcag aaggcg 666.HCV NS5(2422-2437)tcctatacat ggacaggcgc cttgatcacg ccatgtgctg cggaggag 48本发明丙型肝炎多表位核酸疫苗是将上述所获得HCV复合多表位抗原基因进行回收、纯化，与pMD18-T载体连接重组，获得pMD18-T-CEG；再用BamHI/XbaI双酶切pVAX1载体质粒和pMD18-T-CEG质粒，连接重组为pVAX1-CEG HCV复合多表位DNA疫苗。
本发明丙型肝炎多表位核酸疫苗的基因序列是gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720accgagctcg gatccgccac catgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt 780cttgcacttg tcacaaacag tgcaggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 840ggcgccccct tggccgccgc tgccaagttc gtggctgcct ggaccctgaa ggccgccgct 900acgggcgact ttgactcagt gatcgactgt aacgccgccg ctcagtacat caaggctaat 960agcaaattca tcggaatcac cgagctggcc gccgctgaat tcgatatcct cgaggccgcc 1020gctgacctca tggggtacat tccggccgtc gccgccgcta ggctctggca ctacccctgc 1080actgtcgccg ccgcttgtgc ctcacacctc ccttacatcg aacagggaat gcagctcgcc 1140gagcagttca agcagaaggc ggccgccgct tcctatacat ggacaggcgc cttgatcacg 1200ccatgtgctg cggaggaggc cgccgcttag taatctagag ggcccgttta aacccgctga 1260tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 1320tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 1380tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 1440ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct 1500actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta 1560aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctc gccgccaagg atctgatggc 1620gcaggggatc aagctctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 1680atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 1740cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 1800cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag 1860cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 1920ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 1980
ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 2040cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 2100gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 2160tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg 2220tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 2280gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 2340cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 2400gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 2460gaattattaa cgcttacaat ttcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 2520tttcacaccg catacaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640tcaataatag cacgtgctaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct 2700ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 2760ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 2820cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 2880aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 2940agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 3000tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 3060ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 3120cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 3180atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 3240ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 3300
tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 3360gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg gcttttgctg 3420gccttttgct cacatgttct t 3441........ .......... ....................
本发明所述的抗原基因同时适合多种真核及原核表达载体。本发明的优点和积极效果为1、本发明得到HCV复合多表位DNA疫苗为人工设计，在HCV表达产物中优选的高度保守的免疫优势T/B细胞表位基因，删除产生免疫抑制及免疫病理的基因序列。
2、本发明得到HCV复合多表位DNA疫苗引入了一个MHC非限制性的辅助性T淋巴细胞表位基因，增强了疫苗的细胞免疫及体液免疫水平。
3、本发明得到HCV复合多表位DNA疫苗抗原基因的5’端引入hIL-2 ER信号肽引导序列，增强了疫苗的细胞免疫水平。
4、本发明得到HCV复合多表位DNA疫苗可诱导BALB/c小鼠产生针对所选表位的特异性体液免疫和细胞免疫反应。
5、本发明得到HCV复合多表位DNA疫苗对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。
6、本发明得到HCV复合多表位DNA疫苗的基因序列来自HCV II型中国流行株，该疫苗可进一步作为我国预防兼治疗丙型肝炎的DNA疫苗。
具体实施例方式1.HCV多表位基因的合成
1.1引物合成引物名CEG-1 F01；CEG-1 R01；CEG-1 F02；CEG-1 R02；CEG-1F03；CEG-1 R03；CEG-1 F04；CEG-1 R04；CEG-1 F05；CEG-1 R05。具体序列见附图
一。
1.2 Taq酶聚合反应1.2.1 DNA链延伸反应将上述合成的10条寡核苷酸片段中的F01和R01(frag.I-1)、F05和R05(frag.II-1)分别进行链延伸反应。在Microtube中调制下列反应液引物1(0.010D/μl) 5ul引物2(0.010D/μl) 5ul10×LA BUffer 10uldNTP 16ulH20 63ul94℃保温5分钟后，在10分钟内冷却至55℃，加入TaKaRa LA Taq酶1ul后，保温5分钟，72℃保温5分钟。
此反应液为DNA延伸液。
①如果DNA延伸液宣接进行克隆时用DNA延伸液进行乙醇沉淀，然后溶于100ul的TE Buffer中(此溶液称为PCR Frag.溶液)。
②如果需要用DNA延伸液进一步进行PCR反应时，按下列条件进行PCR反应。
1.2.2 PCR反应分别取Frag.-I和Frag.-II反应产物各1μl，前者以F02和R02(frag.I-2)，后者以F04和R04(frag.II-2)为引物进行PCR反应，各引物加量光密度值均为0.01，反应体积100μl，PCR条件为94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环.再分别取Frag.I-2 FragII-2反应产物各1μl，以F03和R03为引物进行PCR反应，反应体系及PCR条件为同前。反应产物用乙醇沉淀后溶解于200μlTE Buffer中。
将上述所得的PCR产物回收，纯化，与pMD18-T载体连接。连接产物命名为pMD18-T-CEG。
1.2.3 DNA序列测定使用F引物(M13-47)CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC对上述连接产物进行序列测定，测序结果见附图二。
2.大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)以无菌接种环刮取冻存于-70℃冰箱的大肠杆菌菌种，划线接种于不含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板，37℃培养16h左右。挑取单一菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃、250r/min振摇培养到OD600＝0.4～0.6，在无菌条件下将细菌培养液转移到两个无菌并以冰预冷的聚丙烯离心管中(以下操作均需无菌)，冰浴10min，使培养物冷却到0℃；4℃、2000r/min离心10min，弃上清，以10ml用冰预冷的75mmol/L CaCl2、10mmol/L(pH6.5)溶液重悬沉淀，冰浴10min，4℃，2000r/min离心10min，弃上清，以2ml用冰预冷的，含15％(v/v)甘油的75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重悬每管沉淀，用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管200μl；标明菌株、体积和日期，置-70℃冰箱冻存备用。
3.转化将适量质粒DNA(体积质粒＜1μl，连接产物＜10μl，DNA＜50ng)加入200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃水浴热冲击90s，冰浴冷却2min；加入200μl37℃预热的LB培养基，37℃150r/min振摇培养50min；取培养液涂布于含Amp(50μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养14～16h后，出现转化菌落。
4.质粒的提取4.1质粒的小量制备(碱裂解法)挑取单个转化菌落，接种到2ml含50μg/ml Amp的LB培养液(下同)中，37℃250r/min振摇培养12～16h；将1.5ml转入微量离心管中，12000r/min离心30s，弃上清。以200μl冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)重悬沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，颠倒数次混匀，加入200μl用冰预冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，颠倒混匀，4℃12000r/min离心10min，取上清，分别用等量饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍体积冷无水乙醇，混合均匀，置-20℃30min，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤抽干。以20μl含终浓度20μg/ml RNA酶(无DNA酶)的TE(10mmol/LTris·HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，琼脂糖凝胶电泳检查或-20℃保存。
4.2质粒的大量制备与纯化将含有目的质粒的细菌接种于100ml LB培养液中，37℃250r/min振摇培养16～18h；冰浴10min，4℃4000r/min离心10min，弃上清，沉淀用20ml预冷的特殊TE(STE，10mmol/L Tris·Cl，pH8.0；50mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤一次，4000r/min离心10min，弃上清；用4ml预冷的溶液I重悬沉淀，加8ml新配的溶液II充分混匀，冰浴10min后，加6ml预冷的溶液III中止反应，冰浴10min，4℃7000r/min离心15min，取上清加0.6～0.7倍体积的异丙醇，37℃作用30min；4℃，7000r/min离心15min，弃上清，以适量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等体积的氯化锂(5mol/L)充分混匀，8000r/min离心10min；取上清，加2倍体积100％冷乙醇，-20℃30min，4℃12000r/min离心10min；弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤并抽干。以适量TE(pH8.0)溶解沉淀，加无DNA酶的RNA酶(10mg/ml)至终浓度20μg/ml，37℃水浴30min；加等体积13％聚乙二醇溶液(PEG8000，2.5mol/L NaCl)，4℃静置过夜；4℃12000r/min离心10min，弃上清；加400μl TE(pH8.0)溶解沉淀，用等体积酚、酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次，加0.1倍体积3MNaAC(pH5.2)，2倍体积100％冷乙醇，混匀后-20℃30min以上，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤并抽干，溶于适量TE(pH8.0)中，-20℃保存。
4.3质粒DNA的定量以TE(pH8.0)为空白对照，用TZK-800Z型紫外可见分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。OD260＝1相当于含质粒大约50μg/ml，双链DNA纯品的OD260/OD280值为1.8，如样品OD260/OD280值明显低于1.8，则可能有蛋白质或酚污染，需进一步纯化。
5.琼脂糖凝胶电泳用0.5×TBE电泳缓冲液(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/L EDTA)配0.8-1.2％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热至琼脂糖完全溶解后，加EB(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml；混匀倒入封固好的胶模中，插入相应的梳子，梳子距底板1.0mm左右，待凝胶完全凝固，小心移去梳子，将凝胶放入装有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，取适量DNA样品在封口膜上与适量体积加样缓冲液(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖)混匀，用微量加样器将样品加到梳孔中，以5v/cm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至适当位置，在长波紫外灯下观察结果和拍照。
6.DNA操作6.1限制性内切酶酶切反应单酶切反应将1.0μg质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为18μl，加入2-3单位限制性内切酶及1μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2～3h，琼脂糖凝胶电泳检查。对大量质粒DNA的酶切反应，相应扩大限制性内切酶用量和反应体积，取少量反应液电泳检查，完全酶切后，-20℃保存，以备进一步鉴定或回收片段之用。
双酶切反应选择反应活性等于或接近100％的同一缓冲系统进行双酶切反应，若温度或缓冲系统不同，则按先低温后高温，先低盐后高盐的顺序进行；或第一酶切完成后，酚/仿抽提，乙醇沉淀后，再进行第二酶切反应。
6.2 DNA片段的回收将酶切完全的含目的DNA片段的溶液与上样缓冲液混合，加入适当浓度的琼脂糖凝胶板中电泳至目的DNA片段完全分离，使用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit(Code No.D301)切胶回收载体和插入片段，溶于20ml的dH2O中，-20℃保存。
6.3外源DNA片段与质粒载体的连接反应取0.5μg回收的载体DNA，加3～5倍摩尔量的外源DNA片段，2μl5×连接缓冲液加水定容至10ul，最后加入1 Weiss单位T4DNA连接酶，混匀并离心，16℃连接1～4h，取7μl连接反应液转化E.coli感受态细胞。
6.4重组子的酶切筛选和鉴定将连接产物转化DH5α，37℃培养过夜。取单菌落接种于2ml AmpLB培养液中，小量制备质粒DNA。选择1～2种合适的限制性内切酶单独或组合消化，琼脂糖凝胶电泳分析。挑选酶切结果与预计相同者进一步用2种以上的内切酶消化，所有酶切结果均与预计完全相同者，即为目的重组质粒。
7.重组表达质粒的构建用BamHI和XbaI双酶切pMD18-T-CEG，与用相同限制性内切酶双酶切的pVAXI载体片段相连接，构建成pVAX1-CEG HCV重组表达质粒。
8.重组表达质粒的双酶切鉴定使用BamH I/Xba I双酶切鉴定质粒pVAXI-CEG，琼脂糖凝胶电泳，结果见附图三，证明重组表达质粒构建正确。
9.重组表达质粒转染哺乳动物细胞2.2.1接种细胞将处于对数生长期的P815(小鼠的肥大细胞瘤细胞)和HeLa(人宫颈癌细胞)细胞。贴壁细胞用胰酶消化后，制备成3×105/ml细胞悬液，于3cm细胞培养板上加入3ml细胞悬液，于37℃、5％CO2下培养过夜。
2.2.2转染取待转染质粒5-10ug，加入无血清1640培养基500ul混匀，温育30分钟，另取脂质体溶液(Lipofectamine)2mg/ml10ul，加入无血清1640培养基500ul，混匀后温育30分钟，将上述两种溶液逐滴加入，吹气混匀，室温下静置30分钟后，加入转染的Hela细胞培养液中，37℃、5％CO2下培养孵育10-12小时后，补加3ml含10％FBS的1640细胞培养液，37℃、5％CO2下培养。
将获得的重组表达质粒感染P815(小鼠的肥大细胞瘤细胞)和HeLa细胞。于感染后48h收获细胞，检测目的蛋白的表达。
10.重组表达质粒表达产物的检测
10.1间接免疫荧光鉴定表达产物检测在6×30mm培养板中放入盖玻片，传代培养P815和Hela细胞。次日，在500ml无血清MEM中加入10mg欲转染的质粒，混匀。另取500ml无血清MEM，加入10ml转染试剂(Lipofectin Reagent)，混匀。将含有质粒的500ml MEM逐滴加入含有转染试剂的500ml MEM中，轻轻混匀，室温静置30分钟。将长成40％-60％单层Hela细胞的培养液MEM吸出，用无血清MEM洗两次，加入上述含脂质体包裹的质粒的1ml MEM，于37℃、5％CO2感作16-18小时后补加3ml含5％小牛血清MEM，继续培养48小时。以上操作均需在无菌条件下进行。
取出盖玻片，PBS(pH7.2)漂洗一次，冷丙酮固定10-15分钟。PBS洗涤3次，与兔抗HCV CEG多表位抗原阳性血清(1∶300)反应1.5小时，PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG反应1.5小时。PBS洗涤3次，在载玻片上滴一滴甘油缓冲液(50％甘油PBS)，将载有细胞的盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下，波长495nm处观察和拍照。
间接免疫荧光(IFA)检测显示，转染重组核酸疫苗质粒pVAX1-CEG的Hela细胞，在核周围及细胞浆中出现与特异性荧光抗体发生反应的黄绿色荧光，而对照质粒pVAXI转染的细胞看不到黄绿色荧光。结果说明，构建的核酸疫苗质粒表达了CEG蛋白。
10.2免疫印迹(Western blot)将转染重组核酸疫苗质粒pVAX1-CEG的Hela细胞和P815细胞用1mlTEN(40mmol/L Tris.Cl pH7.5、1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脱，3000r/min离心5min，弃上清。沉淀细胞用50μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris.Cl pH7.4、1mmol/L MgCl2、0.5％NP40、20μg/mlDNase I)裂解，冰水浴30min，5000r/min离心5min，加等量2×SDS上样缓冲液，沸煮3min，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至硝酸纤维素膜上。5％脱脂乳或3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封闭2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·ClpH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗涤3次，每次5～10min，分别用兔抗HCV CEG多表位抗原阳性血清(1∶300)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3～5次，碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(1∶1000)室温感作2h，洗涤3～5次后，每次5～10min，用10ml碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·Cl pH9.5)加入66μl NBT(0.5g NBT，70％二甲基甲酰胺)，混匀后再加33μlBCIP(0.5gBCIP，100％二甲基甲酰胺)，显色10～20min，用蒸馏水中止反应。结果证实，表达产物可以与兔抗HCV CEG多表位抗原阳性血清发生反应，证明重组核酸疫苗质粒pVAX1-CEG能在哺乳动物细胞得以成功地表达。
11.HCV复合多表位DNA疫苗的实验免疫研究11.1核酸疫苗免疫小鼠BALB/c雌性小鼠36只，雌性，6～8周龄，属SPF(III)级动物，以上实验动物均具合格证书。随机分三组，分别注射空质粒pVAXI对照组、pVAX1-CEG免疫组及PBS免疫组。每只小鼠于双侧胫前肌直接注总容量为100μl(1μg/μl)的PBS质粒溶液或100μl PBS溶液。共免疫三次，第一次、第二次时间间隔为25天。第二次、第三次时间间隔为20天。最后一次免疫后第7天摘眼球取血，颈椎脱臼处死，凝血分离血清供ELISA检测抗HCV抗原的IgG抗体。无菌取其脾脏分别检测细胞毒性T细胞活性和用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚类的数量。
11.2脾脏免疫学指标的检测11.2.1脾脏单淋巴细胞悬液制备断头处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于盛有RPMI 1640培养基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，1500r/min，离心5min，弃上清。用Hanks液离心洗细胞两次，重悬于含10％NBS的RPMI 1640培养液中，计数，调至2×107个/ml备用。
11.2.2脾T淋巴细胞亚类数量的检测取脾细胞悬液0.1ml，加5ml PBS，1500r/min，离心10min，洗细胞两次，在0.5ml PBS细胞悬浮液中分别加荧光标记大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+单克隆抗体(此抗体用PBS按1∶10稀释)室温避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min离心10min，将管底细胞用200μl PBS悬浮，待上流式细胞仪检测。FACS检测10000个细胞，所得数据进行统计学处理。
结果，pVAX1-CEG免疫组的CD3+CD4+与CD3+CD8+淋巴细胞数都显著高于空白质粒pVAXI对照组和PBS对照组，说明所有重组质粒免疫小鼠后，均表达了外源蛋白，并诱导免疫鼠良好的免疫反应。
11.2.3脾细胞特异性CTL细胞毒活性检测1)靶细胞的制备将H-2d限制性HCV识别表位多肽GlyPheAlaAspLeuMetGlyTyrIleProLeuValGlyAlaProLeu和SerTyrThrTrpThrGlyAlaLeuIleThrProCysAlaAlaGluGlu与P815细胞在37℃，5％CO2培养箱共孵育2h，制备成相应肽标记的靶细胞。
2)特异性CTL细胞毒活性检测将GlyPheAlaAspLeuMetGlyTyrIleProLeuValGlyAlaProLeu、SerTyrThrTrpThrGlyAlaLeuIleThrProCysAlaAlaGluGlu两种表位多肽及无关对照肽AlaGlyCysLysAsnPhePheTrpLysThrPheThrSerCys为体外刺激原，与小鼠的脾细胞于37℃，5％CO2培养箱共孵育2h，加入丝裂霉素C至终浓度为40mg/L，培养2h后用PBS洗涤细胞4次，以除掉丝裂霉素。制备成相应肽标记的刺激细胞。制备免疫小鼠的脾细胞悬液，调整细胞浓度至5×107个/ml。靶细胞和刺激细胞各1ml加入60mm细胞培养皿，补加2ml RPMI1640，培养24h后加入IL2至终浓度10u/ml，继续培养5天。2000r/min离心5min。沉淀以RPMI1640悬浮，调整细胞浓度至107个/ml。作为效应细胞。以乳酸脱氢霉释放法检测CTL反应。96微孔板上划分好样品、自然释放及最大释放孔，效靶细胞比例(E/T)为20∶1、50∶1、100∶1，每孔补加RPMI1640至200μl，每组设3个复孔，效靶细胞于37℃5％CO2共同孵育4h，取上清50μl，加入LDH作用底物50μl，室温、避光反应30min后加50μl终止液终止反应，490nm下测吸光度，计算公式如下杀伤活性(％)＝(实验孔OD值—靶细胞自然释放孔OD值—效应细胞自然释放孔OD值)/(最大释放管孔OD值—靶细胞自然释放管孔OD值)×100％结果表明，pVAX1-CEG免疫组产生了针对所选表位GlyPheAlaAspLeuMetGlyTyrIleProLeuVal GlyAla ProLeu和SerTyrThrTrpThrGlyAlaLeu IleThrProCysAlaAlaGluGlu的强CTL反应，与pVAXI对照组、PBS对照组及不相关对照肽AGCKNFFWKTFTSC组相比，差异显著(P＜0.01)。
11.3 ELISA法测定免疫小鼠血清中特异性抗体(抗HCV-CEG IgG)以大肠杆菌表达的CEG蛋白包被，二抗为HRP-兔抗鼠IgG，1∶10 000稀释。在酶联免疫仪450nm测量各孔OD值，将酶标仪测得的OD450值进行统计学分析。
结果表明，pVAX1-CEG免疫组抗体水平明显高于pVAXI对照组和PBS对照组，差异显著(P＜0.05)。
合成CEG基因所需引物的具体序列CEG-1 F01GGATCCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACEG-1 R01GCCAAGGGGGCGCCGACGAGCGGAATGTACCCCATGAGGTCGGCGAAGCCTGCACTGTTTGTGACAAGTGCEG-1 F02CTCGTCGGCGCCCCCTTGGCCGCCGCTGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCCGCCGCTACGGCEG-1 R02CTTGATGTACTGAGCGGCGGCGTTACAGTCGATCACTGAGTCAAAGTCGCCCGTAGCGGCGGCCTTCAGGCEG-1 F03CCGCCGCTCAGTACATCAAGGCTAATAGCAAATTCATCGGAATCACCGAGCTGGCCGCCGCTGAATTCGATATCCCEG-1 R03AGCCTAGCGGCGGCGACGGCCGGAATGTACCCCATGAGGTCAGCGGCGGCCTCGAGGATATCGAATTCAGCGGCGCEG-1 F04GCCGTCGCCGCCGCTAGGCTCTGGCACTACCCCTGCACTGTCGCCGCCGCTTGTGCCTCACACCTCCCTTCEG-1 R04GGCCGCCTTCTGCTTGAACTGCTCGGCGAGGTGCATTCCCTGTTCGATGTAAGGGAGGTGTGAGGCACAACEG-1 F05AGTTCAAGCAGAAGGCGGCCGCCGCTTCCTATACATGGACAGGCGCCTTGATCACGCCATCEG-1 R05TCTAGATTACTAAGCGGCGGCCTCCTCCGCAGCACATGGCGTGATCAAGGCGCCT
权利要求
1.一种丙型肝炎多表位抗原基因，其基因序列是gccaccatgt acaggatgca actcctgtct tgcattgcac taagtcttgc acttgtcaca 60aacagtgcag gcttcgccga cctcatgggg tacattccgc tcgtcggcgc ccccttggcc 120gccgctgcca agttcgtggc tgcctggacc ctgaaggccg ccgctacggg cgactttgac 180tcagtgatcg actgtaacgc cgccgctcag tacatcaagg ctaatagcaa attcatcgga 240atcaccgagc tggccgccgc tgaattcgat atcctcgagg ccgccgctga cctcatgggg 300tacattccgg ccgtcgccgc cgctaggctc tggcactacc cctgcactgt cgccgccgct 360tgtgcctcac acctccctta catcgaacag ggaatgcagc tcgccgagca gttcaagcag 420aaggcggccg ccgcttccta tacatggaca ggcgccttga tcacgccatg tgctgcggag 480gaggccgccg cttagtaa 498
2.根据权利要求1所述的丙型肝炎多表位抗原基因，其特征在于优选HCV基因组中六个高度保守的免疫优势表位，加入一个破伤风类毒素----TT的辅助性T淋巴细胞表位基因及一个来源于恶性虐原虫环子孢子抗原的辅助性T淋巴细胞表位，各表位间用三个丙氨酸连接，同时在上述融合基因的5’端引入人IL-2 ER信号肽引导序列，并优化ATG前后碱基使之符合Kozak规则，最后在所设计基因前后分别引入BamHI和XbaI两个酶切位点，获得HCV复合多表位抗原基因----CEG。
3.根据权利要求2所述的丙型肝炎多表位抗原基因，其特征在于所述的HCV基因组中六个高度保守的免疫优势表位是1.HCV C129-144ggcttcgccg acctcatggg gtacattccg ctcgtcggcg cccccttg 482.HCV NS3439～449acgggcgact ttgactcagt gatcgactgt aac 333.HCV C132-140gacctcatgg ggtacattcc ggccgtc 274.HCV E2(614-622)aggctctggc actacccctg cactgtc 275.HCV NS41711-1732tgtgcctcac acctccctta catcgaacag ggaatgcagc tcgccgagca gttcaagcag aaggcg 666.HCV NS5(2422-2437)tcctatacat ggacaggcgc cttgatcacg ccatgtgctg cggaggag 48
4.一种丙型肝炎多表位核酸疫苗，其特征在于将上述所获得HCV复合多表位抗原基因进行回收、纯化，与pMD18-T载体连接重组，获得pMD18-T-CEG 再用BamHI/XbaI双酶切pVAX1载体质粒和pMD18-T-CEG质粒，连接重组为pVAX1-CEG HCV复合多表位DNA疫苗。
5.根据权利要求4所述的丙型肝炎多表位核酸疫苗，其基因序列是gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720accgagctcg gatccgccac catgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt 780cttgcacttg tcacaaacag tgcaggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 840ggcgccccct tggccgccgc tgccaagttc gtggctgcct ggaccctgaa ggccgccgct 900acgggcgact ttgactcagt gatcgactgt aacgccgccg ctcagtacat caaggctaat 960agcaaattca tcggaatcac cgagctggcc gccgctgaat tcgatatcct cgaggccgcc 1020gctgacctca tggggtacat tccggccgtc gccgccgcta ggctctggca ctacccctgc 1080actgtcgccg ccgcttgtgc ctcacacctc ccttacatcg aacagggaat gcagctcgcc 1140gagcagttca agcagaaggc ggccgccgct tcctatacat ggacaggcgc cttgatcacg 1200ccatgtgctg cggaggaggc cgccgcttag taatctagag ggcccgttta aacccgctga 1260tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 1320tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 1380tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 1440ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct 1500actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta 1560aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctc gccgccaagg atctgatggc 1620gcaggggatc aagctctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 1680atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 1740cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 1800cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag 1860cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 1920ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 1980ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 2040cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 2100gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 2160tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg 2220tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 2280gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 2340cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 2400gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 2460gaattattaa cgcttacaat ttcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 2520tttcacaccg catacaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2580atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2640tcaataatag cacgtgctaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct 2700ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 2760ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 2820cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 2880aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 2940agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 3000tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 3060ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 3120cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 3180atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 3240ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 3300tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 3360gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg gcttttgctg 3420gccttttgct cacatgttct t 3441........ .......... .......... ..........
6.根据权利要求1、2所述的丙型肝炎多表位抗原基因，其特征在于所述的抗原基因同时适合多种真核及原核表达载体。
全文摘要
一种丙型肝炎多表位抗原基因及其核酸疫苗，属于生物技术领域，特别是涉及一种丙型肝炎疫苗。这种疫苗是从HCV基因中优选的六个高度保守的优势T/B细胞表位基因与一个破伤风类毒素(TT)的辅助性T淋巴细胞表位基因以及一个来源于恶性虐原虫环子孢子抗原的辅助性T淋巴细胞表位基因融合在一起，同时在上述融合基因的5’端引入hIL－2 ER信号肽引导序列，再与安全性核酸疫苗表达载体pVAXI构建成HCV多表位核酸疫苗。该疫苗可刺激BALB/c小鼠产生有效的特异性的细胞免疫和体液免疫反应，可作为我国丙型肝炎预防性疫苗和HCV感染者的治疗性疫苗。该疫苗具有高效、安全、价廉等特点。
文档编号C12N15/51GK1690207SQ200410010809
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者李子健, 尹一子, 高越, 赵健琦, 李玉书 申请人:吉林大学第一医院