专利名称：用于处理有机固体废物的复合菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法，特别是一种用于有机固体废物的生物处理，如对农作物秸秆、固体形畜禽粪便、城市有机垃圾等进行生物处理的复合菌剂及其制备方法。该复合菌剂也可用于对污水或废水进行生物处理。
背景技术：
众所周知，对有机固体废物进行生物处理应用于沼气发酵，已是当前治理有机固体废物对环境的污染和开发可再生能源十分有效的技术。实际应用过程中发现，在沼气发酵工艺处理的有机固体废物中，特别是在各种农作物秸秆、城市有机垃圾中，含有难降解的纤维素和木质素，靠自然环境中的微生物菌群进行分解，其分解速度慢，时间长，发酵效果差。其原因就在于自然环境中处理有机固体废物的堆垛各部位的温度差异较大，有的部位是高温区，只有高温菌群才能发挥其主要优势，非高温区主要是中温菌群发挥作用，各自的生物特性得不到充分利用。因此，出现上述沼气发酵效果差的现象。
据国内、外相关文献报导得知，目前使用的处理有机固体废物，如农作物秸杆等的菌剂，在处理有机固体废物过程中有效菌群的配比存在一定的缺陷性，没有把分解纤维素能力强，酶活力高的优势菌群合理地组合起来应用，不能充分地发挥各菌群自身的生物特性和相互协调的作用功效。另外，现有菌剂生产过程中，采用的混合菌剂是未经单独培养混制而成的菌群，因其各个菌群生长的条件、生长速度差异较大，故会造成相互匹配比例失调，起主要功能的微生物生长缓慢、数量减少，从而导致优势菌群的主要作用不能有效地发挥，影响对农作物秸秆、固体形畜、禽粪、城市有机垃圾等有机固体废物的生物处理效果，降低沼气发酵的产气率和原料利用率。
为增加治理有机固体废物的作用效果，从根本上消除对环境的污染，提高开发可再生能源的原料利用率，国内、外专家在这方面都作了大量工作。但大多停留在生物处理的工艺流程的调整和设备的改造上，如专利申请号为891058680中公开了一种“自动搅拌高效沼气发酵新工艺”，这种工艺是根据能量学、动力学和微生物发酵学的基本原理，采用一种由沼气池内压力变化而自动启闭的装置，使液料定向流动而达到自动搅拌的目的。但是，这种处理工艺的原料为猪粪，不适用全秸杆沼气发酵。如专利申请号为971253234“沼气生成新方法及其沼气快速生成器”中公开了一种带有搅拌装置的圆筒形容器，沼气的生成过程是在一个具有保温和自聚热功能的封闭容器内进行的，是以浆液料为原料接种沼气催化剂，在充分搅拌中使浆液发酵。这种沼气生成器同样也不适用全秸杆沼气发酵。也有的采用研制造气催化剂或生物活性添加剂的方法，来提高沼气发酵的效果和原料利用率。如专利号为971078149中公开了一种“城市有机垃圾发酵产沼气方法”，该方法是利用城市有机垃圾，先进行好氧发酵，然后加入发酵菌液进行厌氧产沼气发酵。它不适用对秸杆类进行直接厌氧产沼气发酵。专利号为011290736“沼气发酵生物活性添加剂”中公开了利用外源导入一定酶活水平、一定配方的水解酶于沼气发酵体系中，来提高原料分得率，但在出料时，该添加剂会流失，增加了沼气生产成本。专利号为021223874“混合沼气发酵料及其制备方法”中虽然公开了一种利用秸杆产沼气，但其是将鲜品秸杆切碎干燥再粉碎，原料受季节约束，破碎工艺较为复杂、麻烦，入池时需加入木薯粉、糟粕渣作为部分氮源补充，其补充数量较大，原料来源有限，故影响其推广应用。另外，因原料未经堆沤，入池后产气慢，特别是在寒冷地区发酵效果更差。专利申请号为2004100128660“一种沼气配制料”中公开了利用高产气的农作物秸杆中的一种或几种为发酵料，并添加米皮糠、葡萄糖、三磷酸腺甙二钠、氧化钙等原料为添加剂，组成沼气配制料。这种沼气配制料未经堆沤，影响其发酵效果，产沼气慢，另外，添加物价格比较贵，且该沼气配料需和粪便等化粪池中的垃圾混合产生沼气，因此，不利于推广应用。
迄今为止，还未见用于有机固体废物生物处理的、单独培养而混配的复合菌剂的相关报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于处理有机固体废物的复合菌剂及其制备方法，该复合菌剂从根本上解决了现有技术中存在的混配菌群不能发挥各自优势的缺陷，其单独培养而混合在一起的菌群匹配合理，适用范围广，能充分地发挥各菌群自身的生物特性和相互协调的作用功效，显著缩短处理有机固体废物时间，提高原料利用率和处理效果及其生成物产量和质量，人工培养过程中的菌种稳定，制备方法简便、菌群生长速度快，有利于对有机固体废物的治理，无任何环境污染。
本发明的目的是这样实现的该用于处理有机固体废物的复合菌剂的技术要点是由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC NO.1364的高温单胞菌(Thermomonospora)，登记入册编号为CGMCC NO.1365的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，登记入册编号为CGMCC NO.1366的木霉菌(Trichoderma)和中国普通微生物菌种保藏管理中心1997年版的菌种目录中公开的菌种编号为1.813的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)混配而成，所述各组份的重量比为高温单胞菌∶枯草芽孢杆菌∶木霉菌∶地衣芽孢杆菌＝9～13∶2～4∶3～4∶2～3。
所述各组份的重量比优先选用高温单胞菌∶枯草芽孢杆菌∶木霉菌∶地衣芽孢杆菌＝11∶3∶3.6∶2.4。
所述用于处理有机固体废物的复合菌剂的制备方法的技术要点是首先将高温单胞菌CGMCC1364、枯草芽孢杆菌CGMCC1365、木霉菌CGMCC1366，分别进行单独培养，生成的菌体经烘干后与记载在菌种目录中并公开使用的木霉菌CGMCC1.813干品混匀，即得复合菌剂；所述各组份的重量比为高温单胞菌∶枯草芽孢杆菌∶木霉菌∶地衣芽孢杆菌＝9～13∶2～4∶3～4∶2～3；所述各菌的单独培养操作步骤如下(1)高温单胞菌CGMCC1364的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得高温单胞菌，再回接到经灭菌的培养基上，从斜面培养到培养罐中培养，采用逐级扩大培养法，培养温度45～60℃下，经生产种培养罐培养24～48小时后得到培养液，与灭过菌的固体培养基混合，培养液∶固体培养基＝1∶3.5～4.0，混合后置入曲池通风培养84～100小时，培养温度为45℃～55℃，长成高温单胞菌体后，于55～60℃下烘干备用；所述培养罐中的培养基各组份的重量比为可溶性淀粉0.5～2.5份、KNO30.1～0.2份、MgSO4·7H2O 0.03～0.08份、NaCl 0.3～0.6份、K2HPO40.05～0.1份、FeSO40.0005～0.001份、酵母膏0.1～0.2份；所述固体培养基各组分的重量比为麦麸80～85份，秸秆粉14～19份，尿素0.5～1份；(2)枯草芽孢杆菌CGMCC1365的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得枯草芽孢杆菌，再回接到经灭菌的培养基上，从斜面培养到培养罐的培养，采用逐级扩大培养法，经生产种培养罐培养，培养温度为45℃～55℃，培养12～24小时后，得到液体培养液，用麦麸吸附，培养液∶麦麸＝1∶2.5～3.0，于55～60℃下烘干备用；培养罐的培养基采用牛肉育0.2～0.3份，蛋白胨0.5～1.0份，蔗糖0.3～0.6份，NaCl 0.2～0.5份；(3)木霉菌CGMCC 1366的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得木霉菌，，再回接到经灭菌的PDA培养基上，从斜面培养到培养罐的培养，采用逐级扩大培养法，斜面种采用PDA培养基；从三角瓶种到曲池培养均采用固体培养基，三角瓶和曲盘用的固体培养基各组分重量比为麦麸90～93份，秸秆粉4.5～6.0份，玉米粉2～3份，(NH4)2SO40.5～1.0份；固体培养基的含水率为55～70％，曲池种的培养基各组分重量比为麦麸85～90份，秸杆粉7～12份，玉米粉2.5～4.0份，尿素0.5～1.0份，培养温度为26℃～34℃，在35～38℃下烘干，从接种到长孢子培养至少72小时；(4)地衣芽孢杆菌CGMCC1.813的制备地衣芽孢杆菌的制备方法与步骤(2)所述枯草芽孢杆菌的制备方法基本相同，其中培养温度为30℃～35℃，培养18～24小时。
由于本发明采用的对有机固体废物进行生物处理的菌剂，是人工单独培养按比例混配的复合菌剂，可以充分地发挥菌剂中各菌群自身的生物特性和相互协同作用，所以能从根本上解决现有技术中存在的依靠自然环境中的微生物菌群进行分解和未经单独培养而混配的菌群，不能有效发挥各菌群自身优势的缺陷。本发明采用分解纤维素的高温菌(嗜热菌)中，所选高温放线菌为高温单胞菌CGMCC1364(以下简称Q-0菌)；所选高温细菌为枯草芽孢杆菌CGMCC1365(以下简称Q-3菌)。在高温菌中这是两株有相互协同作用的菌群，两种菌群组合可以提高纤维素的分解率。采用的中温菌(嗜温菌)中，所选中温真菌为木霉菌CGMCC 1366(以下简称Tri-1菌)，其分解纤维素能力较强；所选中温细菌为分解木质素的地衣芽孢杆菌CGMCC1.813(以下简称L-1菌)。在该复合菌剂制备过程中，将种菌单独培养，最后按适宜比例混配，能很好地保持复合菌剂中的各菌群数量比例相对稳定。另外，在自然环境中处理有机固体废物，启动温度较低，菌剂中的中温菌是启动能，中温菌发酵产热后才能进入高温阶段，在高温条件下高温菌快速生长并加快有机物的降解。另外，处理有机物的堆垛各部位的温度差异较大，有的部位是高温区，高温菌发挥其主要优势，非高温区主要是中温菌发挥作用。本发明的复合菌剂与依靠自然环境进行分解的微生物菌群及与未经单独培养而混配的菌群相比，采用单独培养后再混配在一起的菌群，由于可以根据实际需要选择合理的匹配比例，能充分地发挥菌剂中各菌群自身的生物特性和相互协同作用，所以用其进行生物处理的适用范围非常广泛。将该复合菌剂用于对农作物秸秆、固体形畜、禽粪、城市有机垃圾等有机固体废物进行生物处理，可以显著缩短生物处理时间，提高沼气发酵的生成物产量和质量，提高开发可再生能源的原料利用率，有利于对有机固体废物的治理，在治理过程中不产生任何环境污染。该制备方法与其它生物活性添加剂加工方法相比，操作简便、菌群生长速度快，可为连续批量生产打下良好基础。因此，本发明的复合菌剂及其制备方法容易推广应用。经四川省疾病预防控制中心的小鼠急性毒性检验，结果表明该复合菌剂对雌雄小鼠急性经口LD50值大于10000mg/kg，实验动物经大体解剖各脏器未见异常，参照《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB15193.3中急性毒性分级，实际无毒。
具体实施例方式
以下结合实施方式对本发明进行详细说明。本发明的复合菌剂中，采用的分解纤维素的高温菌(嗜热菌)中，所选高温放线菌为Q-0菌；所选高温细菌为q-3菌。在高温菌中这是两种有相互协同作用的菌群，两种菌群组合可以提高纤维素的分解率。采用的中温菌(嗜温菌)中，所选中温真菌为Tri-1菌，其分解纤维素能力较强；所选中温细菌为分解木质素的L-1菌。L-1菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，Q-0、Q-3、Tri-1三种菌是从四川省宜宾垃圾处理厂堆肥中分离而来。Q-0、Q-3、Tri-1菌的分离方法是从堆肥中取回的样品放入装有好氧纤维素培养基的三角瓶中，分别放入50℃和30℃下振荡培养14天，然后采用含纤维素的培养基进行培养器分离。挑取在培养器培养基上出现分解纤维素的透明圈的菌落，分别进行分离纯化。最后分离得到这三株菌株。好氧纤维素分解菌的培养基重量比为NaCl 0.6份、MgSO4.7H2O 0.01份、KH2PO40.05份、K2HPO40.1份、Cacl20.01份、酵母膏0.1份、(NH4)2SO40.2份，自制纤维素粉0.1份、水100份，PH 7.2～7.5。如果制备固体培养基加入1.5份的琼脂。经中国科学院成都生物研究所测试，人工培养的菌株在显微镜下观察，Q-0、Q-3、Tri-1三株菌的生长特征如下菌株Q-0，分解纤维素，该菌有气生菌丝和基内菌丝，基内菌丝宽0.3～1.0μm，微黄色，多分枝，交结成网；气生菌丝白色，发达，宽1.4-～2.1μm；孢子单个着生在气生菌丝的小梗上，孢子直径0.4～0.7μm，表面光滑，圆形；生长温度35～60℃，最适生长温度为50℃、生长pH 6.0～12.0，最适pH 7.5。在50℃下培养时间24～36小时，在固体培养基上(斜面或培养器上)24小时后出现白色的菌落。培养基的组分重量比为可溶性淀粉2份，KNO30.1份，酵母膏0.1份，MgSO4·7H2O 0.05份，NaCl 0.05份，K2HPO40.05份，FeSO40.001份。该菌是一株高温放线菌。Q-O菌于2005年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号CGMCC NO.1364。
Q-3菌细胞呈直杆状，0.5～2.5μm×1.2～10μm，成对或成链状排列；芽孢椭园、卵园、柱状；培养温度35-～55℃。生长pH 7.2。在50℃下培养时间为24～36小时。培养基重量比为牛肉膏0.2份，蛋白胨0.5份，蔗糖0.4份，NaCl 0.5份。Q-3菌是一株高温细菌，与Q-O混合培养可以提高纤维素的分解率，该菌于2005年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号CGMCC NO.1365。
Tri-1菌，菌丝密集如毡，分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，顶端膨大，分生孢子成团；孢子呈球形、浅色或无色。生长温度27℃～30℃，pH为6.8，斜面培养的培养基为由马铃薯、蔗糖为主要成分的PDA培养基，在30℃下培养24小时开始生长菌丝，48小时后开始生长孢子，最后菌落呈绿色，培养时间72～84小时。三角瓶种和曲盘种培养基重量比为麦麸90～93份，秸秆粉4.6～6份，玉米粉2～3份，(NH4)2SO40.5～1.0份。曲池培养的培养基麦麸85～90份，秸秆粉7～12份，玉米粉2.5～4份，尿素0.5～1份。Tri-1菌是一株真菌，2005年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号CGMCCNO.1366。
L-1菌，细胞呈直杆状，0.5×2.0μm×1.0-12μm，G+，芽孢卵圆、柱状，为好氧菌。该菌是一株分解木质素的细菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)1997年版的菌种目录第7页中公开，菌株编号为1.813。培养基重量比为牛肉膏0.3份，蛋白胨0.5份，NaCl 0.5份，蔗糖0.2份，培养温度30℃。
处理有机固体废物的复合菌剂的制备方法是先将各菌分别进行培养、烘干，最后按比例配制混合后包装而成。复合菌剂中各菌的重量比为Q-0菌9～13份，Q-3菌2～4份，Tri-1菌3～4份，L-1菌2～3份。
所述各菌的单独培养操作步骤如下(1)高温单胞菌CGMCC1364的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得高温单胞菌，再回接到经灭菌的培养基上，从斜面培养到培养罐中培养，采用逐级扩大培养法，培养温度45～60℃下，经生产种培养罐培养24～48小时后得到培养液，与灭过菌的固体培养基混合，培养液∶固体培养基＝1∶3.5～4.0，混合后置入曲池通风培养84～100小时，培养温度为45℃～55℃，长成高温单胞菌体后，于55～60℃下烘干备用；所述培养罐中的培养基各组份的重量比为可溶性淀粉0.5～2.5份、KNO30.1～0.2份、MgSO4·7H2O 0.03～0.08份、NaCl 0.3～0.6份、K2HPO40.05～0.1份、FeSO40.0005～0.001份、酵母膏0.1～0.2份；所述固体培养基各组分的重量比为麦麸80～85份，秸秆粉14～19份，尿素0.5～1份；(2)枯草芽孢杆菌CGMCC1365的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得枯草芽孢杆菌，再回接到经灭菌的培养基上，从斜面培养到培养罐的培养，采用逐级扩大培养法，经生产种培养罐培养，培养温度为45℃～55℃，培养18～24小时后，得到液体培养液，用麦麸吸附，培养液∶麦麸＝1∶2.5～3.0，于55～60℃下烘干备用；培养罐的培养基采用牛肉育0.2～0.3份，蛋白胨0.5～1.0份，蔗糖0.3～0.6份，NaCl 0.2～0.5份；(3)木霉菌CGMCC 1366的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得木霉菌，，再回接到经灭菌的PDA培养基上，从斜面培养到培养罐的培养，采用逐级扩大培养法，斜面种采用PDA培养基；从三角瓶种到曲池培养均采用固体培养基，三角瓶和曲盘用的固体培养基各组分重量比为麦麸90～93份，秸秆粉4.5～6.0份，玉米粉2～3份，(NH4)2SO40.5～1.0份；固体培养基的含水率为55～70％，曲池种的培养基各组分重量比为麦麸85～90份，秸杆粉7～12份，玉米粉2.5～4.0份，尿素0.5～1.0份，培养温度为26℃～34℃，在35～38℃下烘干，从接种到长孢子培养至少72小时；(4)地衣芽孢杆菌CGMCC1.813的制备地衣芽孢杆菌的制备方法与步骤(2)所述枯草芽孢杆菌的制备方法基本相同，其中培养温度为30℃～35℃，培养18～24小时。
实施例一 制备处理有机固体废物的复合菌剂先将各菌分别进行培养、烘干，最后按比例配制混合后包装而成。复合菌剂中各菌的重量比为Q-0菌9份，Q-3菌4份，Tri-1菌4份，L-1菌3份。
所述各菌的单独培养操作步骤如下1、Tri-1菌的制备(1)先制备试管斜面种培养基采用PDA培养基，其组分为去皮切成小块的马铃薯200g，蔗糖20g。将马铃薯煮熟后过滤，取滤液加水到1000ml，加入蔗糖，加入琼脂15g后溶化，装入试管，灭菌制成斜面。将原种接种于斜面上，放于26℃培养箱中培养120小时后才生长孢子。
(2)三角瓶种培养基麦麸90份，秸秆粉6份，玉米粉3份，(NHa)2SO41份，加水使培养培养基的含水率达到55％，混合后装入500ml三角瓶中，在121℃下灭菌30分钟，冷却后，用斜面种作接种，接种后放入30℃培养箱中培养。培养48小时后，培养基布满菌丝，然后进行扣瓶，再继续培养48小时，从接种到长孢子约96小时。
(3)曲盘种培养基组分及其配比、加水量等同三角瓶种，经混合后121℃下灭菌，冷却后用三角瓶种作为接种物，接种后混合均匀，装入曲盘入曲房，在29℃下培养84小时，即为曲盘种。
(4)曲池种培养基为麦麸85份，玉米粉3份，秸秆粉11份，尿素1份，加水使培养基的含水率为45％，混合后121℃灭菌，冷却后加入曲盘种，然后入曲池在28℃下通风培养。培养120小时后，从曲池中出料，经35℃下烘干即成半成品。
2、Q-O菌的制备(1)斜面种每百份重量培养基中含有可溶性淀粉0.5份、KNO30.1份、MgSO4.7H2O 0.03份、NaCl 0.5份、K2HPO40.05份、FeSO40.001份、酵母膏0.1份，余量为水，加入琼脂量为培养基重量的1.8％，溶化后调PH于7.5，分装于试管中，经121℃灭菌后作成斜面，凝固后接入原种，于45℃下培养48小时。
(2)三角瓶种培养基组分和含量同斜面种，不加琼脂作成液体，装入500ml三角瓶中灭菌，冷却后接入试管种，放入50℃振荡培养36小时。
(3)一级培养罐(15升)、二级培养罐(150升)、生产种培养罐(1500升)，培养基组分和含量与三角瓶相同，经灭菌的培养基冷却后，一级培养罐接三角瓶种，经培养36小时后，一级培养罐的种接种到二级培养罐中，二级培养罐中的种又接种到生产种罐中。培养温度均为50℃，培养36小时。
(4)固体培养经生产种罐培养后的培养液接种到固体培养基，固体培养基各组份为麦麸80份、秸秆粉19份、尿素1份，加水使培养基的含水率达到45％，经混合、灭菌、冷却，冷却后加培养液，培养液∶固体培养基＝1∶3.5～4.0，拌均匀后入曲池，50℃下通风培养100小时，最后于58℃下烘干备用。
3、Q-3菌的制备(1)斜面种每百份培养基中含有牛肉膏0.2份、蛋白质0.5份，蔗糖0.3份、NaCl 0.2份、余量为水，琼脂加入量为培养基的1.8％，PH7.2。制备斜面培养的方法同其它菌的斜面培养基。制成的斜面培养基接种，放入45℃培养箱中培养24小时。
(2)三角瓶中，一级培养罐种、二级培养罐种、生产培养罐种。
①培养基的组分和配比除了不加琼脂外其它同斜面种。
②从三角瓶到生产种培养罐(1500升)，均采用逐级扩大。
③培养温度50℃，培养24小时。
④生产培养罐培养好的菌，排出生产培养罐后用麦麸吸附，培养液和麦麸的比例为1∶2.5。
⑤将培养液和麦麸拌均后，58℃条件下烘干备用。
4、L-1菌的制备(1)斜面种每百份培养基中含有牛肉膏0.2份、蛋白质0.5份，蔗糖0.3份、NaCl 0.2份、余量为水，琼脂加入量为培养基的1.8％，PH7.2。制备斜面培养的方法同其它菌的斜面培养基。制成的斜面培养基接种，放入30℃培养箱中培养24小时。
(2)三角瓶中，一级培养罐种、二级培养罐种、生产培养罐种。
①培养基的组分和配比除了不加琼脂外其它同斜面种。
②从三角瓶到生产种培养罐(1500升)，均采用逐级扩大。
③培养温度为30℃，培养24小时。
④生产培养罐培养好的菌，排出生产培养罐后用麦麸吸附，培养液和麦麸的比例为1∶3.0。
⑤将培养液和麦麸拌均后，在35℃条件下烘干备用。
实施例二制备处理有机固体废物的复合菌剂先将各菌分别进行培养、烘干，最后按比例配制混合后包装而成。复合菌剂中各菌的重量比为Q-0菌10份，Q-3菌3份，Tri-1菌3份，L-1菌2.5份。
所述各菌的单独培养操作步骤如下1、Tri-1菌的制备(1)先制备试管斜面种培养基采用PDA培养基，其组分为去皮切成小块的马铃薯200g，蔗糖20g。将马铃薯煮熟后过滤，取滤液加水到1000ml，加入蔗糖，加入琼脂15g后溶化，装入试管，灭菌制成斜面。将原种接种于斜面上，放于30℃培养箱中培养72小时后才生长孢子。
(2)三角瓶种培养基麦麸91份，秸秆粉6份，玉米粉2.5份，(NHa)2SO40.5份，加水使培养培养基的含水率达到55％，混合后装入500ml三角瓶中，在121℃下灭菌30分钟，冷却后，用斜面种作接种，接种后放入30℃培养箱中培养。培养36小时后，培养基布满菌丝，然后进行扣瓶，再继续培养36小时，从接种到长孢子约72小时。
(3)曲盘种培养基组分及其配比、加水量等同三角瓶种，经混合后121℃下灭菌，冷却后用三角瓶种作为接种物，接种后混合均匀，装入曲盘入曲房，在29℃下培养84小时，即为曲盘种。
(4)曲池种培养基为麦麸87份，玉米粉2.5份，秸秆粉10份，尿素0.5份，加水使培养基的含水率为50％，混合后121℃灭菌，冷却后加入曲盘种，然后入曲池在28℃下通风培养。培养96小时后，从曲池中出料，经35℃下烘干即成半成品。
2、Q-0菌的制备(1)斜面种每百份重量培养基中含有可溶性淀粉1.0份、KNO30.15份、MgSO4.7H2O0.05份、NaCl 0.3份、K2HPO40.08份、FeSO40.005份、酵母膏0.15份，余量为水，加入琼脂量为培养基重量的1.8％，溶化后调PH于7.5，分装于试管中，经121℃灭菌后作成斜面，凝固后接入原种，于50℃下培养24小时。
(2)三角瓶种培养基组分和含量同斜面种，不加琼脂作成液体，装入500ml三角瓶中灭菌，冷却后接入试管种，放入50℃振荡培养36小时。
(3)一级培养罐(15升)、二级培养罐(150升)、生产种培养罐(1500升)，培养基组分和含量与三角瓶相同，经灭菌的培养基冷却后，一级培养罐接三角瓶种，经培养36小时后，一级培养罐的种接种到二级培养罐中，二级培养罐中的种又接种到生产种罐中。培养温度均为50℃，培养36小时。
(4)固体培养经生产种罐培养后的培养液接种到固体培养基，固体培养基各组份为麦麸85份、秸秆粉14.5份、尿素0.5份，加水使培养基的含水率达到50％，经混合、灭菌、冷却，冷却后加培养液，培养液∶固体培养基＝1∶4.0，拌均匀后入曲池，50℃下通风培养72小时，最后于58℃下烘干备用。
3、Q-3菌的制备(1)斜面种每百份培养基中含有牛肉膏0.3份、蛋白质0.8份，蔗糖0.5份、NaCl 0.4份、余量为水，琼脂加入量为培养基的1.8％，PH7.2。制备斜面培养的方法同其它菌的斜面培养基。制成的斜面培养基接种，放入50℃培养箱中培养18小时。
(2)三角瓶中，一级培养罐种、二级培养罐种、生产培养罐种。
①培养基的组分和配比除了不加琼脂外其它同斜面种。
②从三角瓶到生产种培养罐(1500升)，均采用逐级扩大。
③培养温度50℃，培养24小时。
④生产培养罐培养好的菌，排出生产培养罐后用麦麸吸附，培养液和麦麸的比例为1∶2.5。
⑤养液和麦麸拌均后，58℃条件下烘干备用。
4、L-1菌的制备(1)斜面种每百份培养基中含有牛肉膏0.3份、蛋白质0.8份，蔗糖0.5份、NaCl 0.4份、余量为水，琼脂加入量为培养基的1.8％，PH7.2。制备斜面培养的方法同其它菌的斜面培养基。制成的斜面培养基接种，放入32℃培养箱中培养18小时。
(2)三角瓶中，一级培养罐种、二级培养罐种、生产培养罐种。
①养基的组分和配比除了不加琼脂外其它同斜面种。
②三角瓶到生产种培养罐(1500升)，均采用逐级扩大。
③培养温度为32℃，培养18小时。
④生产培养罐培养好的菌，排出生产培养罐后用麦麸吸附，培养液和麦麸的比例为1∶3.0。
将培养液和麦麸拌均后，在35℃条件下烘干备用。
实施例三 制备处理有机固体废物的复合菌剂先将各菌分别进行培养、烘干，最后按比例配制混合后包装而成。复合菌剂中各菌的重量比为Q-0菌13份，Q-3菌2份，Tri-1菌2份，L-1菌3份。
所述各菌的单独培养操作步骤如下1、Tri-1菌的制备(1)先制备试管斜面种培养基采用PDA培养基，其组分为去皮切成小块的马铃薯200g，蔗糖20g。将马铃薯煮熟后过滤，取滤液加水到1000ml，加入蔗糖，加入琼脂15g后溶化，装入试管，灭菌制成斜面。将原种接种于斜面上，放于26℃培养箱中培养120小时后才生长孢子。
(2)三角瓶种培养基麦麸92份，秸秆粉5份，玉米粉2.2份，(NHa)2SO40.8份，加水使培养培养基的含水率达到60％，混合后装入500ml三角瓶中，在121℃下灭菌30分钟，冷却后，用斜面种作接种，接种后放入34℃培养箱中培养。培养60小时后，培养基布满菌丝，然后进行扣瓶，再继续培养60小时，从接种到长孢子约120小时。
(3)曲盘种培养基组分及其配比、加水量等同三角瓶种，经混合后121℃下灭菌，冷却后用三角瓶种作为接种物，接种后混合均匀，装入曲盘入曲房，在29℃下培养84小时，即为曲盘种。
(4)曲池种培养基为麦麸90份，玉米粉2.5份，秸秆粉7份，尿素0.15份，加水使培养基的含水率为55％，混合后121℃灭菌，冷却后加入曲盘种，然后入曲池在30℃下通风培养。培养84小时后，从曲池中出料，经35℃下烘干即成半成品。
2、Q-O菌的制备(1)斜面种每百份重量培养基中含有可溶性淀粉2.0份、KNO30.2份、MgSO4.7H2O 0.08份、NaCl 0.6份、K2HPO40.1份、FeSO40.001份、酵母膏0.2份，余量为水，加入琼脂量为培养基重量的1.8％，溶化后调PH于7.5，分装于试管中，经121℃灭菌后作成斜面，凝固后接入原种，于55℃下培养18小时。
(2)三角瓶种培养基组分和含量同斜面种，不加琼脂作成液体，装入500ml三角瓶中灭菌，冷却后接入试管种，放入55℃振荡培养24小时。
(3)一级培养罐(15升)、二级培养罐(150升)、生产种培养罐(1500升)，培养基组分和含量与三角瓶相同，经灭菌的培养基冷却后，一级培养罐接三角瓶种，经培养36小时后，一级培养罐的种接种到二级培养罐中，二级培养罐中的种又接种到生产种罐中。培养温度均为55℃，培养24小时。
(4)固体培养经生产种罐培养后的培养液接种到固体培养基，固体培养基各组份为麦麸82份、秸秆粉17份、尿素1份，加水使培养基的含水率达到45％，经混合、灭菌、冷却，冷却后加培养液，培养液∶固体培养基＝1∶3.5，拌均匀后入曲池，50℃下通风培养100小时，最后于58℃下烘干备用。
3、Q-3菌的制备(1)斜面种每百份培养基中含有牛肉膏0.3份、蛋白质1.0份，蔗糖0.6份、NaCl 0.5份、余量为水，琼脂加入量为培养基的1.8％，PH7.2。制备斜面培养的方法同其它菌的斜面培养基。制成的斜面培养基接种，放入55℃培养箱中培养18小时。
(2)三角瓶中，一级培养罐种、二级培养罐种、生产培养罐种。
⑤培养基的组分和配比除了不加琼脂外其它同斜面种。
⑥从三角瓶到生产种培养罐(1500升)，均采用逐级扩大。
⑦培养温度50℃，培养24小时。
⑧生产培养罐培养好的菌，排出生产培养罐后用麦麸吸附，培养液和麦麸的比例为1∶2.5。
⑨将培养液和麦麸拌均后，58℃条件下烘干备用。
4、L-1菌的制备(1)斜面种每百份培养基中含有牛肉膏0.3份、蛋白质1.0份，蔗糖0.6份、NaCl 0.5份、余量为水，琼脂加入量为培养基的1.5％，PH7.2。制备斜面培养的方法同其它菌的斜面培养基。制成的斜面培养基接种，放入35℃培养箱中培养24小时。
(2)三角瓶中，一级培养罐种、二级培养罐种、生产培养罐种。
⑩培养基的组分和配比除了不加琼脂外其它同斜面种。
从三角瓶到生产种培养罐(1500升)，均采用逐级扩大。
培养温度为30℃，培养24小时。
生产培养罐培养好的菌，排出生产培养罐后用麦麸吸附，培养液和麦麸的比例为1∶3.0。
将培养液和麦麸拌均后，在35℃条件下烘干备用。
处理有机固体废物的复合菌剂已应用于秸秆的处理、垃圾堆肥处理。100Kg秸秆用0.2～0.3Kg菌剂对秸秆进行预处理，秸秆堆沤4～6天后作为沼气的原料，提高了产气量，加快了秸秆产沼气。该菌剂用于城市有机垃圾的堆肥处理，加快了垃圾堆肥腐熟快，堆肥时间缩短到12～15天。
权利要求
1.一种用于处理有机固体废物的复合菌剂，其特征在于由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC NO.1364的高温单胞菌(Thermomonospora)，登记入册编号为CGMCC NO.1365的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，登记入册编号为CGMCC NO.1366的木霉菌(Trichoderma)和中国普通微生物菌种保藏管理中心1997年版的菌种目录中公开的菌种编号为1.813的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)混配而成，所述各组份的重量比为高温单胞菌∶枯草芽孢杆菌∶木霉菌∶地衣芽孢杆菌＝9～13∶2～4∶3～4∶2～3。
2.一种根据权利要求1所述的用于处理有机固体废物的复合菌剂的制备方法，其特征在于首先将高温单胞菌CGMCC1364、枯草芽孢杆菌CGMCC1365、木霉菌CGMCC 1366，分别进行单独培养，生成的菌体经烘干后与记载在菌种目录中并公开使用的地衣芽孢杆CGMCC 1.813干品混匀，即得复合菌剂；所述各组份的重量比为高温单胞菌∶枯草芽孢杆菌∶木霉菌∶地衣芽孢杆菌＝9～13∶2～4∶3～4∶2～3；所述各菌的单独培养操作步骤如下(1)高温单胞菌CGMCC1364的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得高温单胞菌，再回接到经灭菌的培养基上，从斜面培养到培养罐中培养，采用逐级扩大培养法，培养温度45～60℃下，经生产种培养罐培养24～48小时后得到培养液，与灭过菌的固体培养基混合，培养液∶固体培养基＝1∶3.5～4.0，混合后置入曲池通风培养84～100小时，培养温度为45℃～55℃，长成高温单胞菌体后，于55～60℃下烘干备用；所述培养罐中的培养基各组份的重量比为可溶性淀粉0.5～2.5份、KNO30.1～0.2份、MgSO4·7H2O 0.03～0.08份、NaCl 0.3～0.6份、K2HPO40.05～0.1份、FeSO40.0005～0.001份、酵母膏0.1～0.2份；所述固体培养基各组分的重量比为麦麸80～85份，秸秆粉14～19份，尿素0.5～1份；(2)枯草芽孢杆菌CGMCC1365的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得枯草芽孢杆菌，再回接到经灭菌的培养基上，从斜面培养到培养罐的培养，采用逐级扩大培养法，经生产种培养罐培养，培养温度为45℃～55℃，培养18～24小时后，得到液体培养液，用麦麸吸附，培养液∶麦麸＝1∶2.5～3.0，于55～60℃下烘干备用；培养罐的培养基采用牛肉育0.2～0.3份，蛋白胨0.5～1.0份，蔗糖0.3～0.6份，NaCl 0.2～0.5份；(3)木霉菌CGMCC 1366的制备将从堆肥中采集的样品，经分离纯化，纯化后获得木霉菌，，再回接到经灭菌的PDA培养基上，从斜面培养到培养罐的培养，采用逐级扩大培养法，斜面种采用PDA培养基；从三角瓶种到曲池培养均采用固体培养基，三角瓶和曲盘用的固体培养基各组分重量比为麦麸90～93份，秸秆粉4.5～6.0份，玉米粉2～3份，(NH4)2SO40.5～1.0份；固体培养基的含水率为55～70％，曲池种的培养基各组分重量比为麦麸85～90份，秸杆粉7～12份，玉米粉2.5～4.0份，尿素0.5～1.0份，培养温度为26℃～34℃，在35～38℃下烘干，从接种到长孢子培养72～145小时；(4)地衣芽孢杆菌CGMCC1.813的制备地衣芽孢杆菌的制备方法与步骤(2)所述枯草芽孢杆菌的制备方法基本相同，其中培养温度为30℃～35℃，培养18～24小时。
全文摘要
一种用于处理有机固体废物的复合菌剂及其制备方法，由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的编号为CGMCC NO.1364的高温单胞菌，编号为CGMCC NO.1365的枯草芽孢杆菌，编号为CGMCCNO.1366的木霉菌和CGMCC的菌种目录中公开的菌种编号为1.813的地衣芽孢杆菌混配而成，该复合菌剂从根本上解决了现有技术中存在的混配菌群不能发挥各自优势的缺陷，其单独培养而混合在一起的菌群匹配合理，适用范围广，能充分地发挥各菌群自身的生物特性和相互协调的作用功效，显著缩短处理有机固体废物时间，提高原料利用率和处理效果及其生成物产量和质量，人工培养过程中的菌种稳定，制备方法简便、菌群生长速度快，有利于对有机固体废物的治理，无任何环境污染。
文档编号C12R1/885GK1888045SQ20051007779
公开日2007年1月3日 申请日期2005年6月27日 优先权日2005年6月27日
发明者刘晓风, 颜开, 廖银章, 张海涛, 袁月祥, 颜丽, 刘克鑫 申请人:北京合百意生态能源科技开发有限公司, 中国科学院成都生物研究所