专利名称：一种纤维蛋白溶解酶生产菌及生产纤维蛋白溶解酶的方法
技术领域：
一种纤维蛋白溶解酶生产菌及生产纤维蛋白溶解酶的方法，本发明涉及一种生产纤维蛋白溶解酶菌株——芽孢杆菌(Bacillus sp.nov.)SK006，保藏编号为CCTCC NOM 205071，属于食品生物技术领域。
背景技术：
心脑血管疾病一直号称威胁人类健康的头号杀手，据有关调查报告显示，每24秒就有一个中国人死于心脑血管疾病，每13秒就有一位中国人因此而致残。我国每年死于心脑血管疾病的人有300多万，占我国每年总死亡人数的50％，而患病幸存下来的人中，75％不同程度丧失劳动能力，4％重残。血栓栓塞性疾病是其中致死和致残第一位的原因，没有血栓就没有心脑血管事件。
人体的血管和血液循环作为一个整体，各个系统、器官和组织生理机能的维持需要血液充分而不间断的供应。动脉负责将血液运输到器官和组织；在毛细血管内，血液中的营养物质和氧气供应给组织，组织中的代谢产物也可通过毛细血管运走；然后这些血液通过静脉系统运输回到心脏，心脏再将回流的血液泵向动脉系统，完成一次血液循环。
血栓是流动的血液在血管(动脉或静脉)腔内或心腔内发生凝固，形成血凝块，堵塞血管腔，导致血管内血流明显减少，甚至完全中断的一种疾病。血栓发生在动脉，导致供血的器官或组织严重缺血或血流中断，如脑供血不足、不稳定性心绞痛，甚至坏死，如急性心肌梗死、脑卒中。血栓发生在静脉，如下肢深静脉血栓形成，可引起下肢血液回流障碍，引起水肿和静脉功能不全等。栓塞是心脏或血管内已形成的血栓脱落，顺血流堵塞其他重要脏器血管的综合征。如心房纤颤常有左心房内血栓形成，血栓一旦脱落，则可顺血流堵在脑血管，引起脑组织坏死(脑栓塞)或外周血管(如下肢动脉、肾动脉)栓塞；下肢深静脉血栓形成可脱落堵塞肺动脉(肺栓塞)，引起急性右心衰竭，严重者导致病人死亡。
血栓栓塞性疾病主要包括动脉粥样血栓形成(心肌梗死和脑梗死)和静脉血栓栓塞(肺栓塞和深静脉血栓形成)，血栓栓塞的危害为血栓栓塞导致器官衰竭或功能障碍、致残、丧失工作能力，甚至死亡。血栓栓塞性疾病临床非常常见，严重危害大众生命和健康。如房颤病人每年发生脑部血栓栓塞的危险约为5％左右，房颤导致的血栓占脑梗塞的10％-15％，房颤后脑卒中具有更高的致死率和致残率。血栓栓塞性疾病给人类带来的危害已经得到全世界的关注。
临床上对血栓栓塞性疾病较常用的治疗方法主要有三种第一，外科手术，这是去除血栓最迅速直接的方法，开始于20世纪30年代的法国，50年代流行于美国，这种方法条件复杂，费用昂贵，目前已经较少使用。第二，保守疗法，即给患者长期服用阿司匹林、肝素和水蛭素等药物。第三，溶栓疗法，即服用或注射溶栓剂使血管开通，血栓栓塞性疾病的溶栓、抗栓疗法为新鲜血栓中的纤维蛋白成分可以被溶栓药物溶解，使堵塞的血管再通，恢复器官和组织供血，改善器官功能。这是目前使用的主要方法，致死的危险性比保守疗法降低了10％-50％。
随着溶栓剂的推广使用，血栓栓塞性病人的死亡率明显下降。溶栓剂的研究开发相当活跃，但是，在临床上使用的溶栓药均在不同程度上存在一定的缺陷；或毒性较强、副作用大；或在体内半衰期短，药效难以发挥；或来源紧缺、价格昂贵。
所以，研究人员除了致力于溶栓剂开发的同时，也在寻找天然的较具优势和发展前途的溶栓物质，微生物是溶栓药物的重要来源，如细菌、真菌、放线菌和藻类。董明盛等人通过平板稀释分离从豆豉中分离到产纤溶酶高活力菌株，菌种鉴定为枯草芽孢杆菌。韩润林等人从一种海洋细菌中分离到了一株枯草杆菌(HL-986)，王骏等从链霉菌(Streptomyces sp)Y405发酵液中分离纯化得到一种纤溶蛋白酶SW1。
筛选产酶性能优良的菌种，摸索出成熟的工艺条件，对以后大规模生产至关重要。本发明自行设计筛选纤溶酶产生菌的筛选模型，以发酵食品虾酱为菌源，以纤维蛋白为主要基质的平板为筛子，采用液体培养基富集培养、以纤维蛋白平板初筛和摇瓶复筛的筛选方法，同时进行纤溶活性测定，得到发酵液的酶活为588.4u/ml以上(以尿激酶为标准)发明内容本发明目的是提供一种生产纤维蛋白溶解酶的菌株。
本发明所述生产纤维蛋白溶解酶的菌株芽孢杆菌，最初来源于发酵食品虾酱，样品经液体培养基富集培养后，采用纤维蛋白平板法进行初筛，根据溶圈的直径与菌落直径比值初步定性半定量地确定纤溶活性的高低，筛选到产生纤维蛋白溶解能力相对较高的菌株。然后进行摇瓶复筛，对发酵液的纤维蛋白溶解活性进行定量分析，最终得到生产纤维蛋白溶解酶的菌株，并进行菌株的分离与鉴定。
酶活定义以同具有溶栓能力的尿激酶为标准，pH 7.5，37℃条件下.1分钟内使1ml猪血纤维蛋白酶原在275nm的吸光度增加1的酶量定义为一个尿激酶酶活单位。
本发明的纤维蛋白溶解酶菌株，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.nov.)SK006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NOM205071。
用该菌株生产纤维蛋白溶解酶的方法为种子培养种子培养基以g/100ml计为蛋白胨1，葡萄糖1，酵母膏0.5，Na2HPO4·12H2O 1.2，MgSO4·7H2O0.03，调pH 7.2，121℃灭菌20min，培养条件为摇床转速180rpm，培养温度37℃，培养时间16～18小时。
液体发酵培养液体发酵培养基以g/100ml计为蛋白胨1～2.5，葡萄糖1～2.5，Na2HPO4·12H2O 1～2.5，NaH2PO4·2H2O 0.13，MgSO4·7H2O 0.1，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03，121℃灭菌20min，调pH 7.2；种子培养基按体积百分5％接入25升发酵罐(装液量15升)液体发酵培养基中，培养条件为搅拌速度180rpm，控制通风量0～12h为9L/min，12～24h为10.5L/min，24～36h为12L/min；培养温度35～40℃；培养时间35～40小时。
本发明的有益效果芽孢杆菌CCTCC NOM 205071(Bacillus sp.nov.SK006)最初来源于发酵食品虾酱，是无人体寄生性的高度安全的菌类，通过细菌进行液体发酵生产成本低，可行性强，可用于大规模生产，直接制成胶囊、冲剂、口服液或口服含片，或作为功能性食品配料用于保健食品或普通食品中。本发明改进了以往的纤溶酶产生菌的筛选方法，采用液体培养基富集培养、以纤维蛋白为主要基质的平板初筛和摇瓶复筛的筛选方法，同时进行纤溶活性测定，得到发酵液的酶活为588.4u/ml以上(以尿激酶为标准)。
生物材料样品保藏一种生产纤维蛋白溶解酶的菌株，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.nov.)SK006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NOM205071，保藏日期为2005年3月22日。
具体实施例方式
实施例1将芽孢杆菌(Bacillus sp.nov.)SK006在下述条件下进行发酵，种子培养种子培养基(以质量体积百分计)蛋白胨1％，葡萄糖1％，酵母膏0.5％，Na2HPO4·12H2O 1.2％，MgSO4·7H2O 0.03％，调pH 7.2，121℃灭菌20min，180rpm，37℃培养16～18h。
液体发酵培养液体发酵培养基(以质量体积百分计)蛋白胨1.5％，葡萄糖1.5％，Na2HPO4·12H2O 1.5％，NaH2PO4·2H2O 0.13％，MgSO4·7H2O0.1％，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03％，121℃灭菌20min，调pH7.2；种子培养基按体积百分5％接入25升发酵罐(装液量15升)液体发酵培养基中，培养条件为搅拌速度180rpm，控制通风量0～12h为9L/min，12～24h为10.5L/min，24～36h为12L/min；培养温度37℃；培养时间36小时，得到发酵液的酶活为610.6u/ml。(以尿激酶为标准)。
实施例2将芽孢杆菌(Bacillus sp.nov.)SK006在下述条件下进行发酵，种子培养种子培养基(以质量体积百分计)蛋白胨1％，葡萄糖1％，酵母膏0.5％，Na2HPO4·12H2O 1.2％，MgSO4·7H2O 0.03％，调pH7.2，121℃灭菌20min，180rpm，37℃培养16～18h。
液体发酵培养液体发酵培养基(以质量体积百分计)蛋白胨2.5％，葡萄糖2.5％，Na2HPO4·12H2O 2.5％，NaH2PO4·2H2O 0.13％，MgSO4·7H2O0.1％，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03％，121℃灭菌20min，调pH7.2，种子培养基按体积百分5％接入25升发酵罐(装液量15升)液体发酵培养基中，培养条件为搅拌速度180rpm，控制通风量0～12h为9L/min，12～24h为10.5L/min，24～40h为12L/min；培养温度40℃；培养时间40小时，得到发酵液的酶活为588.4u/ml。(以尿激酶为标准)。
权利要求
1.一种生产纤维蛋白溶解酶的菌株，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.nov.)SK006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NOM205071。
2.一种用权利要求1所述菌株生产纤维蛋白溶解酶的方法，其特征是菌株CCTCC NOM 205071；种子培养种子培养基以g/100ml计为蛋白胨1，葡萄糖1，酵母膏0.5，Na2HPO4·12H2O 1.2，MgSO4·7H2O 0.03，调pH7.2，121℃灭菌20min，培养条件为摇床转速180rpm，培养温度37℃，培养时间16～18小时；液体发酵培养液体发酵培养基以g/100ml计为蛋白胨1～2.5，葡萄糖1～2.5，Na2HPO4·12H2O 1～2.5，NaH2PO4·2H2O 0.13，MgSO4·7H2O 0.1，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03，121℃灭菌20min，调pH7.2；种子培养基按体积百分5％接入装液量为15升液体发酵培养基的25升发酵罐中，培养条件为搅拌速度180rpm，控制通风量0～12小时为9L/min，12～24小时为10.5L/min，24～36小时为12L/min；控制培养温度为35～40℃，培养时间35～40小时。
全文摘要
一种纤维蛋白溶解酶生产菌及生产纤维蛋白溶解酶的方法，属于食品生物技术领域。本发明从发酵食品虾酱中筛选出一种能生产具有溶血栓能力酶的菌株，此菌株经中国典型培养物保藏中心鉴定为芽孢杆菌新种，定名为Bacillus sp.nov.SK006，其保藏编号为CCTCC NOM 205071。本发明还提供了用该菌株生产纤维蛋白溶解酶的方法，其育种工作量小，费用低，安全性能可靠，可以进行液体发酵生产，成本低，可用于大规模生产。其发酵产品无毒，可以直接制成胶囊、冲剂、口服液或口服含片，或作为功能性食品配料用于保健食品或普通食品中。
文档编号C12N9/68GK1782070SQ20051009475
公开日2006年6月7日 申请日期2005年10月9日 优先权日2005年10月9日
发明者江波, 峰芳德, 华颖, 王璋 申请人:江南大学