专利名称：利用平面波导管定量测定酶活性的制作方法
技术领域：
本发明涉及定量酶活性的方法。
附图简述
图1.采用荧光标记的平面波导管技术图示。
图2.用于利用荧光酶底物的“水解切断模式”中的平面波导管技术图示。
图3.用于利用荧光酶底物的“反应转化模式”中的平面波导管技术图示。
图4.用于利用荧光标记的“偶联模式”的平面波导管技术图示。
图5.用于利用荧光酶底物的“空间排阻模式”的平面波导管技术图示。
图6.用于利用荧光酶底物的“细胞分离模式”的平面波导管技术图示。
发明详述本发明提供了采用平面波导管技术以灵敏而且定量地测定酶活性的酶活性传感器。本发明的酶活性传感器具有许多优点，包括小规模的操作，速度，灵敏度，特异性，并易于生产。该传感器可用于任何需要测定酶活性的环境下，并且能够在复杂的流体系统中检测酶活性而不用纯化样品。如果需要，可以并行地进行多个酶测定。
平面波导管本发明的酶活性传感器含有平面波导管，其包括用于一种或多种酶的一种或多种底物。平面波导管典型地包含一层具有高折射率的材料(例如Ta2O5或者TiO2)薄膜，沉积于低折射率的透明支持物上(例如玻璃或聚合物)。制造平面波导管层的方法在本领域是公知的，并且可以使用任何已知的方法。参见，例如美国专利5959292；美国专利6078705；美国专利5846842；Rowe-Taitt等，Biosensors & Bioelectronics 14，785-94，2000。
在平面波导管上酶底物的固定将被测试酶的底物固定在平面波导管上。固定蛋白质的方法在本领域是公知的，并且可以用任何一种这类方法来将酶底物固定在检测区域上。参见，例如，Scouten等，Trends in Biotechnology 13，178-85，1995；Shriver-Lake等，Biosensors and Bioelectronics 12，1101-06，1997；Rowe-Taitt等，2000。所选择的方法在一定程度上依赖于该特定酶底物的性质，并且是本领域的技术人员所公知的。典型地，底物通过共价键直接固定在平面波导管层上或者经化学修饰平面波导管表面，例如经过硅烷化或施加聚合物层之后再固定。如果需要的话，可以将一层薄的间隔层(例如SiO2)直接加到平面波导管层上，以用作促粘合层从而有助于在该波导管上酶底物的固定。
在另一些的实施方案中，平面波导管层涂覆有抗生物素蛋白，酶底物可以偶联于对抗生物素蛋白有很强亲和力的生物素部分。参见Rowe-Taitt等，2000。在另一些实施方案中，波导管涂覆有由聚异丁烯酰肼构成的水凝胶膜，其中聚异丁烯酰肼经处理生成游离的马来酰亚胺基；将一些酶底物氧化生成反应性硫醇基，之后与马来酰亚胺基反应。还有另一些实施方案中，硅烷化的波导管表面涂覆有由乙二胺基衍生的聚乙二醇。这些基团也能与氧化的酶底物反应。
非共价的相互作用也可用于将底物固定在平面波导管上。这种相互作用包括，但不限于，疏水吸附、范德华作用、氢键合、和静电力。
如果使用涂层，其优选加到平面波导管上能获得可再生的，恒定的层厚度。典型的可用于涂覆平面波导管的方法的实例包括喷涂、刮刀涂布、旋涂，或者浸渍涂布。可以通过任何适当的方法对涂覆进行质量控制，包括显微镜法、干涉测量法、椭圆测量法以及接触角测量法。
不同的酶底物可固定在平面波导管上的不同且互斥的区域。底物优选设置成空间可寻址阵列。例如，波导管表面上可具有多个板孔或通道以便可以对对照和样品溶液的可检测标记进行同时比较。任选地，可以在波导管周围边缘的大部分涂覆反射涂层以防止光线从边缘泄漏，这样能增强渐逝场的亮度。还可以制备空间可寻址阵列作为区域或点用以检测单个流体样品内的多种酶活性。
可检测标记在下面描述的一些实施方案中，酶底物含有可检测的标记。在另一些实施方案中，酶活性改变了底物从而包含可检测的标记。用于本发明的可检测标记典型的是光反应标记，例如荧光标记、磷光标记、和紫外线吸收标记。荧光标记尤其适用，因为场对荧光团的激发不需要大量的流体透过幅射，从而限制了背景信号，提高了灵敏度。在多肽和其它酶底物上连接可检测标记的方法在本领域是公知的。
合适的标记包括罗丹明、荧光素衍生物、香豆素衍生物、联苯乙烯联苯类，芪衍生物，酞菁染料、naphthalocyanines、聚吡啶基-钌配合物如三(2，2’-二吡啶基)-氯化钌、三(1，10-菲咯啉)氯化钌、三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)氯化钌以及聚吡啶基-吩嗪-钌复合物，铂-卟啉配合物如八乙基-铂-卟啉，长寿命铕和铽配合物或花青染料。吸收和发射波长在600-900nm的范围内的染料尤其适合用于分析血液或血清。
尤其适用的可检测标记是染料，例如含有官能团的荧光素衍生物，通过该官能团其可以共价连接到底物上，例如异硫氰酸荧光素。同样十分适用的还有功能性荧光染料，可购自Biological Detection Systerms Inc.，例如单和双功能的CY5.5TM染料，Clinical Chemistry 40，1819-22，1994。如果需要的话，用于不同酶的底物可以含有不同的可检测标记。
酶活性传感器的实例本发明的酶活性传感器可用在一些不同的“模式”中。根据所使用的模式，酶底物可以包含或不包含上述的可检测标记。同时根据所使用的模式，酶活性检测可以涉及检测可检测标记的量的减少或者增加。
例如，含有经可检测地标记后的底物的酶活性传感器可用于“水解切断模式”。在这种模式下，酶将底物从平面波导管表面切下，所减弱的信号就反映出酶的活性。参见图2。
另一些酶底物含有被酶修饰成可检测标记或者是不再能检测到的标记的部分(“反应转化模式”)。如果酶修饰该部分使它产生可检测标记，则增强的信号反映出酶活性。另一方面，如果酶修饰该部分使它不再能检测到，则减弱的信号反映出酶活性。参见图3。
而在另一些实施方案中，酶将可检测标记偶联到酶底物上(“偶联模式”)。参见图4。在这些实施方案中增强的信号反映出酶活性。
在一些实施方案中，通过在空间上分离不同的酶底物，例如通过空间位置、离子、或疏水作用的机制(“空间排阻模式”)，可以用底物连接或间隔结构来增强对目标酶活性的选择性。参见图5。这些机制尤其适用于本发明的酶活性传感器，因为空间定位可检测分子的标记部分的能力使得可以控制检测过程的灵敏度，因为渐逝场的亮度与到平面波导管传感器表面的距离成指数式衰减。Shriver-Lake等，1997。
例如，使用不同长度的间隔物可以平衡多重测试中不同位点的荧光信号。类似地，由于酶反应的位点也能通过相同的因子来控制，因此在存在多种潜在反应分子的情况下，可以实现对一些特定反应的增强或消除。
任何上述实施方案都可用于原位细胞培养中，以检测细胞分泌酶的培养基(“细胞分离模式”)。参见图6。在这种情况下，通过大孔聚合物层，例如亲水性聚合物(例如多羟基化甲基丙烯酸酯或者多糖)，酶活性传感器可从细胞群，或单个细胞中分离出来。细胞分离模式允许在生理学条件下，不需细胞与底物或可能的反应产物接触，而检测由活细胞分泌的酶。许多酶活性检测系统是不与活细胞相容的。因而该实施方案是对现有技术的改进，因为该反应体系能够用于检测那些有毒的或者对细胞存在不利影响的酶的活性。细胞分离模式还可以在不由于辐射而潜在改变细胞的生物学性质的条件下进行测量。
酶活性传感器的应用这里所公开的酶传感器可用于任何需要对酶活性进行定性或定量测定的装置中。可以检测任何类型的酶的活性，包括但不限于，蛋白水解酶(例如，氨基肽酶，天冬氨酰蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，金属蛋白酶，半胱氨酰蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶，溶菌酶，因子VIIIC)，糖苷酶，酯酶，水解酶，核酸酶，合成酶，异构酶，聚合酶，激酶，磷酸酶，还原酶，包括氧化还原酶，转移酶，连接酶，限制酶，酰胺酶，ATP酶，糖酶，脂肪酶，纤维素酶，脱氢酶，和氧化酶。这些酶的底物在本领域是公知的并可在许多供应商处购得。
本发明的酶活性传感器尤其适于用作诊断工具，因为其可以原位地、高度多重性地实时研究复杂的生物酶系统。尤其是，这些传感器可以实时监控酶活性，甚至于在混浊流体中，例如未经样品制备的血清或血液。因此该传感器在看护环境下很容易被用作快速诊断工具。
在临床设备中，与平面波导管相接触的流体是生物来源的，包括但不限于，血液、血浆、尿、脑脊液、唾液、支气管灌洗液、房水、腹水、血管外肺积水、滤泡液、迷路液、内淋巴、外淋巴、淋巴、乳糜(chyle)、鼻灌洗液，以及滑液。这些流体还可以是其中培养了来自于患者的细胞的培养基。
临床中关注的酶包括，例如，淀粉酶和脂肪酶(胰腺疾病)；肌酐激酶、乳酸脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶、血清谷草转氨酶、和肌酸磷酸激酶(心脏病发作、肌肉疾病和中风)；氨基丙氨酸转移酶、血清谷草转氨酶、血清谷丙转氨酶、和乳酸脱氢酶(肝病)；碱性磷酸酶(肝或肾病)；血管紧张素转化酶(活动的结节病、非典型分支杆菌、原发性胆汁性肝硬化、高雪氏症、或麻风病)；因子VIIIC(血友病)；肾素(肾血管性高血压)；半乳糖-1-磷酸盐尿苷酰转移酶(半乳糖血症)；葡糖脑苷脂酶(高雪氏症)；以及生物素化酶(生物素化酶缺乏症)。
本发明的酶活性传感器还可用于商业或研究设备中，用以监测大或小规模酶纯化过程中的酶活性。其可用于监测发酵培养基中的酶活性。其可用于检测公众健康危害，例如用于检测诊断致病细菌、病毒和真菌的酶。本发明的酶活性传感器还可用于对可降低特定酶活性的治疗剂的高通量筛选测定中。
可检测标记的生成和检测本发明的酶活性传感器可以取非常少的液体层样品用于可检测的标记，其中采用了由平面波导管内激光束反射产生的渐逝场。该渐逝场延伸入液体中大约100nm，强度呈指数式衰减；因此，不能检测到该场外部的可检测标记。参见图1。
将含有被测定酶的流体设置成与所述平面波导管接触。接触可以是静态的，也可以使流体通过平面波导管的上方。将偏振光，最常见的是来自于激光光源如小型二极管激光器的偏振光，通过全反射引导到波导层的界面上。通过光的内部反射在波导管边界处的不同折射率材料之间的界面处产生渐逝的波或场。渐逝场的强度依赖于波导层本身的厚度以及波导层和周围介质的折射率之比。在薄波导管的情况下，即其层厚度等于或小于被传导的波长时，可以区分出被传导光的离散模式。
在平面波导管的光学上更薄的介质中，但仅仅是在直接邻近于被传导光波的地方，渐逝场激发发光。用于检测该渐逝激发的发光的方法和设备是本领域公知的，并且描述于例如，美国专利4582809，美国专利5081012，WO 90/06503，和Biosensors & Bioelectronics 6(1991)，595-607中。可采用光电二极管、光电电池、光电倍增管、CCD照相机和检测器阵列，例如CCD电池。所发出的光可以用光学元件例如镜、棱镜、透镜、菲涅耳透镜、以及梯度指数透镜来成像。已知的元件例如滤光片、棱镜、单色滤光片、双色镜，以及衍射光栅可用于选择适当的发射波长。
本公开说明中所引用的所有专利、专利申请，以及参考文献在此都特意引入全文作为参考。
权利要求
1.一种含有平面波导管的酶活性传感器，其中包括酶的底物，其中(1)所述底物包含可检测的标记；或者(2)所述酶的活性改变底物从而包含可检测的标记。
2.权利要求1所述的酶活性传感器，其中进一步包括检测元件。
3.权利要求1所述的酶活性传感器，其中所述底物包含可检测的标记。
4.权利要求1所述的酶活性传感器，其中所述酶的活性改变底物从而包含可检测的标记。
5.权利要求1所述的酶活性传感器，其中所述可检测的标记为光反应标记。
6.权利要求5所述的酶活性传感器，其中所述光反应标记选自下组荧光标记、磷光标记、和紫外线吸收标记。
7.权利要求1所述的酶活性传感器，其中所述可检测标记为荧光部分。
8.权利要求1所述的酶活性传感器，其中所述底物包括间隔结构。
9.权利要求1所述的酶活性传感器，其中所述酶选自下组酰胺酶、酯酶、氧化酶、还原酶、聚合酶、转移酶、连接酶、限制酶和蛋白酶。
10.权利要求1所述的酶活性传感器，其中包括多种底物。
11.权利要求10所述的酶活性传感器，其中底物中的至少两种是不同酶的底物。
12.权利要求11所述的酶活性传感器，其中第一种底物含有第一种间隔结构，以及其中第二种底物含有将第一种和第二种底物在空间上隔开的第二种间隔结构。
13.权利要求10所述的酶活性传感器，其中所述底物设置成空间可寻址阵列的形式。
14.一种检测酶活性的方法，包括步骤(a)在允许酶与底物作用的条件下，将权利要求1所述的酶活性传感器的平面波导管暴露于试样；(b)照射所述平面波导管以产生渐逝场；(c)检测所述渐逝场中可检测标记的存在。
15.权利要求14所述的方法，其中所述底物包含可检测的标记。
16.权利要求15所述的方法，其中所述酶的活性使所述可检测标记从底物释放。
17.权利要求15所述的方法，其中所述酶的活性降低了所述可检测标记的可检测性。
18.权利要求14所述的方法，其中所述酶的活性改变了所述底物从而包含可检测标记。
19.权利要求18所述的方法，其中所述酶将所述可检测标记偶联到所述底物上。
20.权利要求14所述的方法，其中所述可检测标记为荧光部分。
21.权利要求14所述的方法，其中所述底物进一步含有间隔结构。
22.权利要求14所述的方法，其中所述可检测标记为光反应标记。
23.权利要求22所述的方法，其中所述光反应标记选自下组荧光标记、磷光标记、和紫外线吸收标记。
24.权利要求14所述的方法，其中所述酶活性传感器包括多种底物。
25.权利要求23所述的方法，其中至少两种底物是两种不同酶的底物。
26.权利要求24所述的方法，其中第一种底物含有第一种间隔结构，以及其中第二种底物含有将第一种和第二种底物在空间上隔开的第二种间隔结构。
27.权利要求24所述的方法，其中所述底物设置成空间可寻址阵列的形式。
28.权利要求14所述的方法，其中所述试样包括选自下组的流体血液、血浆、尿、脑脊液、唾液、支气管灌洗液、房水、腹水、血管外肺积水、滤泡液、迷路液、内淋巴、外淋巴、淋巴、乳糜、鼻灌洗液，滑液、发酵培养基，以及细胞培养基。
29.权利要求14所述的方法，其中步骤(c)包括定量检测。
30.权利要求14所述的方法，其中步骤(c)包括定性检测。
全文摘要
含有平面波导管的酶活性传感器可用于灵敏和定量地测定酶活性。这种酶活性传感器适用于多种设备中，包括临床、商业以及公众健康设备。
文档编号C12Q1/25GK1824796SQ20051011323
公开日2006年8月30日 申请日期2005年9月8日 优先权日2004年9月8日
发明者R·G·哈奇 申请人:美国拜尔公司