专利名称：一种检测a组人轮状病毒的膜基因芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种基因微阵列的生物芯片，尤其涉及一种检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，属生物芯片和诊断试剂技术领域。
背景技术：
基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列固定于固相支持物上，然后与待测的标记的核酸样品按碱基配对原理进行杂交，再经过一定的检测系统对杂交信号进行检测，并配以计算机系统对每一杂交信号进行数据分析和处理，从而迅速得出所要的信息。与传统的杂交技术相比，该技术具有微型化，高灵敏性，高度平行性，和高速性的显著特点。其发展速度和其中所运用的技术令人瞩目。迄今为止，已在基因表达检测，基因突变检测，单核苷酸多态性和DNA序列测定等方面展开了广泛的研究和应用。
轮状病毒(Rotavirus，RV)是全世界人和动物急性腹泻的最主要病原，危害巨大。按其结构蛋白VP6的抗原性差异，轮状病毒被分成A～G共七个组，其中A组RV是全世界5岁以下儿童急性腹泻的最主要病原，危害巨大。在发展中国家，A组RV每年引起87.3万童死亡，在儿童死因中居第二位；腹泻在我国儿童死因中也居第二位，秋冬季儿童腹泻50％是由RV引起，直接威胁国家的公共安全、社会稳定、经济发展以及人口素质。
目前对于轮状病毒的检测，主要是针对粪便中的病毒抗原或基因，已经建立的技术可归纳为3类一类为病毒分离与形态观察法，缺点是灵敏度较低，并且需要电子显微镜，不适合基层使用。一类为免疫学技术，包括酶免疫技术(EIA)，乳胶凝集试验(LA)和胶体金试纸等技术。免疫学技术的主要局限就是样品限制，固体受试物几乎不可能用这种方法检测。一类为病毒核酸检测主要包括RT-PCR、电泳等方法。相比于免疫学技术，PCR技术有着更高的灵敏度。但是由于PCR技术本身的局限性，仅凭电泳结果，容易得出假阳性的结论，不通过杂交反应则无法对扩增产物的正确性进行验证。
经检索，有关利用地高辛标记的PCR产物和膜基因芯片杂交来检测A组人组轮状病毒的基因芯片，至今未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本实用新型要解决的技术问题是提供一种检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，并同时公开A组人轮状病毒的特异性检测探针和阴阳性探针。所述芯片能有效克服现有技术存在的检测灵敏度低和受检样品受限的缺陷，能满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域的需要。
本实用新型的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，由膜基片和阵列式分布于基片之上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成，其特征在于，所述的膜基片是尼龙膜基片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1～10个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括6条A组人轮状病毒特异性检测探针，1条阳性对照探针，3条阴性对照探针以及空白点样液对照。
其中，所述的膜基片是表面带正电荷的未经任何化学修饰的尼龙膜基片。
其中，所述的膜基片是任意几何形状之一，厚度为0.05mm～0.5mm。
其中，上述的膜基片优选是长方形，面积是50.0mm～77.0mm×20.0mm～27.0mm；厚度优选为0.1mm～0.3mm。
在上述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片中，所述的A组人轮状病毒特异性检测探针与对照样品的点涂层的大小，可以根据点直径、点个数和点间距的变化而变化。
其中，优选的实施方式是当点直径为0.25mm，点间距为0.6mm时，点涂层微阵列的面积为3.5mm×3.5mm(如图1所示)，且可同时在一张膜基片上设置1～8个涂层区。
在上述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片中，所述点涂层中6条A组人轮状病毒特异性检测探针是PbA15′-ATATCGAAGCATTCAATAA-3′PbA25′-ATGTTGTCGAAGTCTCCA-3′PbA35′-GATATTGGACCATCTGATTCT-3′PbA45′-TTCAAACAATCCACTCACC-3′PbA55′-TTCGATTAGATCGAATGCAG-3′PbA65′-ATGCAGATGCTGGCGTGTCT-3′；1条阳性对照探针是PbP即5′-DIG-PbA1-3′；3条阴性对照探针是PbEC即大肠杆菌特异性探针，PbSA即金黄色葡萄球菌特异性探针，PbHBV即HBV乙肝病毒特异性探针；空白点样液对照是3×SSC。
其中，所述阳性对照探针优选分布位于点涂层阵列的四角。
本实用新型所述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片具有如下优点与效果(1)本实用新型所采用的地高辛标记的上游引物对待检病毒核酸实现扩增和标记，并结合带正电荷的尼龙膜，可以不通过特定的仪器，而以肉眼直接观察并判定实验结果，更适合于基层单位使用。
(2)本实用新型所采用的以带正电荷的尼龙膜作为基因芯片的基片，可以使用以常规方法合成的寡核苷酸作为探针，较之采用其它材料作为基片需要以化学基团和连接臂修饰寡核苷酸，大大节约了成本。
(3)本实用新型所采用的以带正电荷的尼龙膜作为基因芯片的基片，由于尼龙膜是一种多孔材料和具有渗水性，作为黏附核酸的载体，可以固定大量的核酸分子，从而提高检测的灵敏度。
(4)本实用新型的检测探针选用多条基因序列不同的寡核苷酸探针，对A组人轮状病毒的基因检测不是仅靠一种探针就能判定，而是看产生阳性杂交信号的探针的条数与均值相比较，这同传统的PCR分型方法相比，是一个很大的进步。
(5)本实用新型所采用的人轮状病毒组特异性检测探针，能够实现对A组人轮状病毒的高度灵敏性检测和A组组别鉴定。
总之，本实用新型涉及的芯片可用于对A组人轮状病毒的基因检测和组别鉴定，具有广阔的应用前景，有望满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域对人轮状病毒检测的需要。
图1本实用新型所述检测A组人轮状病毒的膜基因芯片的直观图，其中，1为膜基片；2为探针涂层区。
图2本实用新型所述检测A组人轮状病毒的膜基因芯片的探针排布图，其中，所述探针排布为A1，A6，B1，B6，E6，F1，F6为阳性对照PbP(10μmol/L)；A2，A3，A4，A5为检测探针PbA1(10μmol/L)；B2，B3，B4，B5为检测探针PbA2(10μmol/L)；C2，C3，C4，C5为检测探针PbA3(10μmol/L)；D2，D3，D4，D5为检测探针PbA4(10μmol/L)；E2，E3，E4，E5为检测探针PbA5(10μmol/L)；F2，F3，F4，F5为检测探针PbA6(10μmol/L)；C1为阴性探针PbEC(10μmol/L)；C6为阴性探针PbSA(10μmol/L)；E1为阴性探针PbHBV(10μmol/L)；D1，D6为空白对照3×SSC。
图3琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其中所述各泳道是泳道M为核酸分子marker DL2000；泳道1为实施例3中所述对A组人轮状病毒的PCR扩增。
图4A组人轮状病毒PCR扩增产物同基因芯片的杂交扫描结果结果显示，A组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测A组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
具体实施方式
实施例1下面结合图1所述检测A组人轮状病毒的膜基因芯片的直观图以及图2所述检测A组人轮状病毒的膜基因芯片的探针排布图对本实用新型的内容作进一步阐述本实用新型的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，由膜基片和阵列式分布于基片之上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成，其中，所述的膜基片是表面带正电荷的未经任何化学修饰的尼龙膜基片，形状是长方形，面积是25.0mm×76.0mm，厚度为0.12mm；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1个，所述涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括6条A组人轮状病毒特异性检测探针，1条阳性对照探针，3条阴性对照探针以及空白点样液对照；具体为6条A组人轮状病毒特异性检测探针是PbA15′-ATATCGAAGCATTCAATAA-3′PbA25′-ATGTTGTCGAAGTCTCCA-3′PbA35′-GATATTGGACCATCTGATTCT-3′
PbA45′-TTCAAACAATCCACTCACC-3′PbA55′-TTCGATTAGATCGAATGCAG-3′PbA65′-ATGCAGATGCTGGCGTGTCT-3′；1条阳性对照探针是PbP即5′-DIG-PbA1-3′；3条阴性对照探针是PbEC即大肠杆菌特异性探针，PbSA即金黄色葡萄球菌特异性探针，PbHBV即HBV乙肝病毒特异性探针；空白点样液对照是3×SSC。
上述圆形点涂层直径为0.25mm，点间距为0.6mm，点涂层微阵列的面积为3.5mm×3.5mm。且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角。
实施例2本实用新型所述检测A组人轮状病毒的膜基因芯片的制备以5′-DIG-PbA1-3′作为阳性对照(记为PbP)，以大肠杆菌特异性探针(记为PbEC)，金黄色葡萄球菌特异性探针(记为PbSA)，HBV乙肝病毒特异性探针(记为PbHBV)作为阴性对照，以3×SSC作为稀释液将上述检测探针分别稀释为10μM，以3×SSC为空白对照，以生物芯片点样仪Pixsys5500配以SMP3点样针接触式点制在所述带正电荷的尼龙膜基片上，取样板中液面高度是5mm，针在取样孔中停留时间是20ms，点样时，针在尼龙膜基片上的停留时间是10ms，且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角，各点的直径为0.25mm，点间距为0.6mm，点涂层微阵列的大小为3.5mm×3.5mm(详见图1，图2所示)；将点制后的芯片平放于紫外交联仪内，4500J/cm2下交联3min，即得所述检测A组人轮状病毒的膜基因芯片。
实施例3利用本实用新型所述检测A组人轮状病毒的膜基因芯片检测A组人轮状病毒(1)对人A组人轮状病毒标准毒株RV5和Wa株进行细胞培养，提取培养液上清中的病毒RNA，用Takara公司RNA PCR(AMV)VER 2.1试剂盒说明书操作对RNA进行逆转录反应。然后建立PCR体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，17.5μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，0.5μl引物混合物(DIG-PAu，PAd各10μmol/L)，0.5μl RT产物。
(2)PCR扩增产物的电泳检测取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果，见图3。
(3)PCR扩增产物同检测A组人轮状病毒的膜基因芯片杂交取50μl扩增产物与杂交液等体积混合，杂交液为10×Denhardt’s，10×SSPE，50μg/ml葡聚糖，0.1％SDS。将杂交混合液变性100℃10min。然后迅速置于冰水浴中。膜芯片置于合适尺寸的自制塑料袋中，加入60μl杂交混合液，在55℃的杂交温度下杂交30min。
(4)免疫显色和结果的读取杂交结束后，以双蒸水洗膜3min；然后以5×SSC/0.5％SDS洗膜10min，浸入封闭液(1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl)封闭30min。然后再浸入抗体溶液(0.02％Anti-DIG-AP，1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl)中，37℃反应15min。以洗脱液洗脱5min后，在检测稀释液中平衡2min，再加入2％NBT/BCIP，37℃下显色。待阳性对照的颜色深度达到要求时，以双蒸水冲洗膜芯片终止反应，以AlphaScanTM扫描仪对膜芯片上的杂交信号进行扫描和图像的存储(见图4)。
结果显示，A组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测A组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
实施例4利用本实用新型所述检测A组人轮状病毒的膜基因芯片检测92例临床疑似A组RV感染的婴幼儿腹泻标本(1)婴幼儿腹泻标本中RNA的提取以1×PBS将粪便样本稀释10倍，10000rpm离心2min；取300μl上清，加入30μl 10％SDS，56℃保温30min；加入800μl Trizol试剂，室温放置5min；加入200μl氯仿，涡旋震荡15sec后，室温静置10min；4℃离心，12000rpm离心10min；小心吸取上层液至1.5ml离心管中，加500μl异丙醇，室温下放置10min；4℃离心，12000rpm离心10min；小心吸弃上清，加1ml 75％乙醇(高压灭菌后的0.5‰DEPC水配制)，4℃离心，7500rpm离心5min；弃乙醇，干燥后加20μl 0.5‰DEPC水(已高压灭菌)溶解，-80℃贮存。
(2)PCR扩增用Takara公司RNA PCR(AMV)VER 2.1试剂盒说明书操作对RNA进行逆转录反应。然后建立PCR体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.0μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，0.5μl引物混合物(DIG-PAu，PAd各10μmol/L)，0.5μl RT产物。
PCR程序为94℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
(3)PCR扩增产物的电泳检测取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果。
(4)PCR扩增产物同检测A组人轮状病毒的膜基因芯片杂交取50μl扩增产物与杂交液等体积混合，杂交液为10×Denhardt’s，10×SSPE，50μg/ml葡聚糖，0.1％SDS。将杂交混合液变性100℃10min。然后迅速置于冰水浴中。膜芯片置于合适尺寸的自制塑料袋中，加入60μl杂交混合液，在55℃的杂交温度下杂交30min。
(5)免疫显色和结果的读取杂交结束后，以双蒸水洗膜3min；然后以5×SSC/0.5％SDS洗膜10min，浸入封闭液(1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl)封闭30min。然后再浸入抗体溶液(0.02％Anti-DIG-AP，1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl)中，37℃反应20min。以洗脱液洗脱5min后，在检测稀释液中平衡2min，再加入2％ NBT/BCIP，37℃下显色。待阳性对照的颜色深度达到要求时，以双蒸水冲洗膜芯片终止反应，以AlphaScanTM扫描仪对膜芯片上的杂交信号进行扫描和图像的存储。
经上述本实用新型所建立的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片杂交后，检测结果显示A组人轮状病毒检测阳性的有83例，阴性的有9例。
(6)同时对相同的92例临床疑似A组RV感染的婴幼儿腹泻标本进行ELISA试剂盒(深圳安群生物工程公司，生产批号20050115)抗原检测。
检测结果显示78例为ELISA试剂盒抗原检测阳性，14例为阴性。
证明我们所建立的检测多组人轮状病毒的膜基因芯片的检测灵敏度高于现在临床上普遍使用的轮状病毒抗原检测试剂盒。
权利要求1.一种检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，由膜基片和阵列式分布于基片之上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成，其特征在于，所述的膜基片是尼龙膜基片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1～10个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括6条A组人轮状病毒特异性检测探针，1条阳性对照探针，3条阴性对照探针以及空白点样液对照。
2.如权利要求1所述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述的膜基片是表面带正电荷的未经任何化学修饰的尼龙膜基片。
3.如权利要求1或2所述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述的膜基片是矩形，厚度为0.05mm～0.5mm。
4.如权利要求3所述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述的膜基片是长方形，面积是5.0mm～77.0mm×5.0mm～27.0mm；厚度为0.1mm～0.3mm。
5.如权利要求1所述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，当点直径为0.25mm，点间距为0.6mm时，点涂层微阵列的面积为3.5mm×3.5mm，且可同时在一张膜基片上设置1～8个涂层区。
6.如权利要求1所述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述点涂层中6条A组人轮状病毒特异性检测探针是PbA 15′-ATATCGAAGCATTCAATAA-3′PbA25′-ATGTTGTCGAAGTCTCCA-3′PbA35′-GATATTGGACCATCTGATTCT-3′PbA45′-TTCAAACAATCCACTCACC-3′PbA55′-TTCGATTAGATCGAATGCAG-3′PbA65′-ATGCAGATGCTGGCGTGTCT-3′；1条阳性对照探针是PbP即5′-DIG-PbA1-3′；3条阴性对照探针是PbEC即大肠杆菌特异性探针，PbSA即金黄色葡萄球菌特异性探针，PbHBV即HBV乙肝病毒特异性探针；空白点样液对照是3×SSC。
7.如权利要求1或6所述的检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角。
专利摘要本实用新型公开了一种检测A组人轮状病毒的膜基因芯片，由表面带正电荷的尼龙膜基片和阵列式分布于基片之上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1～10个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括6条A组人轮状病毒特异性检测探针，1条阳性对照探针，3条阴性对照探针以及空白点样液对照。本实用新型的芯片可用于对A组人轮状病毒的基因检测和组别鉴定，具有广阔的应用前景，有望满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域对人轮状病毒检测的需要。
文档编号C12Q1/68GK2903080SQ2005201246
公开日2007年5月23日 申请日期2005年11月15日 优先权日2005年11月15日
发明者黄海燕, 韩金祥, 王健伟 申请人:山东省医药生物技术研究中心