专利名称：封闭系统多阶段核酸扩增反应的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及用于分析样品中一种或多种核酸的存在的系统和方法，更具体地，涉及用于在封闭条件下进行多阶段核酸扩增反应，特别是聚合酶链式反应(PCR)的系统和方法。
背景核酸扩增反应对于许多研究、医疗和工业应用是极其重要的。这些反应用于临床和生物学研究、检测和监测感染性疾病、检测突变、检测癌症标志物、环境监测、遗传鉴定、生物防御应用中病原体的检测等等，例如Schweitzer等人，Current Opinion in Biotechnology，1221-27(2001)；Koch，Nature Reviews Drug Discovery，3749-761(2004)。特别地，聚合酶链式反应(PCR)已经被应用在所有这些领域中，包括用于病毒和细菌检测、病毒负荷的监测、稀有和/或难以培养的病原体的检测、生物恐怖威胁的快速检测、癌症患者中最少量残留疾病的检测、食物病原体测试、血液供给筛选等等的应用，例如，Mackay，Clin.Microbiol.Infect，10190-212(2004)；Bernard et al，Clinical Chemistry，481178-1185(2002)。关于PCR，如此广泛应用的主要原因是其速度和容易使用(通常使用标准化试剂盒和相对简单和低成本的设备在数个小时内进行)、其灵敏度(经常可以检测到样品中几十个拷贝的靶序列)、以及其可靠性(可以容易地分析低质量样品或保存的样品，例如法医样品或固定的组织样品)，Strachan和Read，Human Molecular Genetics 2(John Wiley & Sons，New York，1999)。
尽管如此广泛的应用反映出核酸扩增技术中的进步，但依然需要速度和灵敏度上的进一步提高，特别是在感染性疾病检测、最少量残留疾病检测、生物防御应用等等领域中。
通过在两阶段扩增反应中使用嵌套的成套引物已经实现了PCR灵敏度的显著提高，例如，Albert等人，J.Clin.Microbiol.，281560-1564(1990)。
在此方法中，第一扩增反应的扩增子成为使用新一套引物的第二扩增反应的样品，所述新一套引物中的至少一个结合到第一扩增子的内部位置。尽管提高了灵敏度，但是该方法具有增加试剂操作和增加引入污染序列的风险的问题，其能够导致假阳性。已使用所谓的封闭试管嵌套PCR(closed-tube nested PCR)进行了克服这些困难的尝试；然而，这些方法主要依赖于这样的设计，即将试剂隔离在同一反应容器中不同部分以使得可以通过利用诸如离心等一些物理方法使试剂合在一起来启动第二阶段反应，例如Yourno，PCR Methods and Applications，260-65(1992)；Wolff等人，PCR Methods and Applications，4376-379(1995)；Olmos等人，Nucleic Acids Research，271564-1565(1999)。因此，第一阶段反应组分的相当大部分存在于第二阶段反应中。
通过在封闭环境中进行反应也实现了灵敏度的显著提高和假阳性的减少。高灵敏度扩增技术的缺点是由于非靶序列的不当扩增造成的假阳性试验结果的发生，例如，Borst等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.，23289-299(2004)。非靶序列的存在可能是由于在反应中缺乏特异性，或者由于来自在前反应的污染(即“携带(carry over)”污染)，或者由于来自直接环境的污染，例如水、一次性用品、试剂等等。这些问题可通过以下方式来进行改善在封闭容器中进行扩增，以使得一旦加入样品和和试剂并将容器密封，就不再发生对反应物或产物的更多操作。“实时”扩增的出现很大程度上使得所述操作成为可能，该“实时”扩增使用连续报告反应混合物中产物含量的标记。
尽管有对封闭容器中多阶段扩增的尝试，现有技术缺乏如下的方法或系统，其中多阶段反应可以在没有来自在前反应的不希望组分(例如引物或其它组分)的干扰影响下进行。因此，亟需进行封闭多阶段扩增反应的新方法，该方法具有单阶段技术的方便，但是其具有使用嵌套引物的多阶段扩增所赋予的更高灵敏度。
发明简要描述本发明提供用于封闭多阶段核酸扩增反应的系统、方法和设备，其中较前阶段反应混合物的一部分作为下一阶段反应的样品。
一方面，本发明提供检测一种或多种靶多核苷酸是否存在于样品中的方法，其具有以下步骤(a)在流体封闭反应系统中，使用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中扩增来自样品的一种或多种靶多核苷酸，形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一种靶多核苷酸的初始引物；(b)在该流体封闭反应系统中分离第一反应混合物的样品；以及(c)在该流体封闭反应系统中，使用第二阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增该样品中的所述一种或多种第一扩增子，形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子的每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的初始引物均嵌套在所述第一扩增子中。
另一方面，本发明提供控制嵌套扩增反应的方法，其包括以下步骤(i)在第一阶段扩增反应中，在反应混合物中存在有荧光指示剂的情况下扩增靶多核苷酸，所述荧光指示剂能够产生与第一阶段扩增反应中扩增子数量相关的光信号；(ii)监测第一阶段扩增反应中荧光指示剂的光信号；以及(iii)当光信号达到或超过预定水平时，自动分离有效部分的第一阶段扩增反应的反应混合物来启动第二阶段扩增反应。
另一方面，本发明提供检测样品中是否存在一种或多种靶多核苷酸的方法，该方法包括以下步骤(i)提供与废料容器、含有样品的样品容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器、以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通的反应室，每一个所述容器均为流体封闭的；(ii)将样品从样品容器以及第一阶段扩增试剂从第一反应物容器以流体形式转移至反应室，以使得当样品中存在靶多核苷酸时第一阶段扩增试剂与样品在扩增反应中反应，产生含有第一扩增子的反应产物；(iii)除了保留在反应室中的有效部分之外，以流体形式将反应产物转移至废料容器；(iv)将第二阶段扩增试剂从第二反应物容器中以流体形式转移至反应室，以使得当反应产物中存在第一扩增子时第二阶段扩增试剂与有效部分的反应产物在扩增反应中反应，产生第二扩增子；以及(v)检测第二扩增子以确定样品中是否存在靶多核苷酸。
另一方面，本发明提供确定样品中一种或多种靶多核苷酸的相对量的方法，该方法包括以下步骤(i)在第一扩增反应中，扩增样品中的所述一种或多种靶多核苷酸以及至少一种参照序列，以形成包含每一种靶多核苷酸和参照序列的第一扩增子的第一反应产物，所述第一扩增反应包括针对每一种靶多核苷酸和参照序列的初始引物；(ii)在第二扩增反应中，从有效部分的第一反应产物扩增所述一种或多种靶多核苷酸的第一扩增子，以形成每一种第一扩增子的第二扩增子，所述第二扩增反应包括针对每一种靶多核苷酸的次级引物，使得每一种第一扩增子的每一种次级引物相对于其初始引物均嵌套在所述第一扩增子中；以及(iii)将第二扩增反应的第二扩增子与第一扩增反应中至少一种参照序列的扩增子进行比较，以确定样品中所述一种或多种靶多核苷酸的相对量。
本发明的另一方面，提供用于进行嵌套扩增反应的流体封闭反应系统，该系统包括(i)反应室，其与含有样品的样品容器、废料容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通，每一所述容器均为流体封闭的；以及(ii)与回转阀可操作地连接的泵，用于以流体形式将样品和第一阶段扩增试剂转移至反应室，在其中进行第一扩增反应以形成反应混合物中的一种或多种第一扩增子；用于分离有效部分的反应混合物；并且用于以流体形式将所述第二阶段扩增试剂和有效部分转移至反应室，其中进行第二扩增反应以形成一种或多种第二扩增子。
另一方面，本发明提供用于进行本发明方法的反应容器，该反应容器包括(i)用于容纳液体的反应室；(ii)通过入口管道与反应室连接的入口；(iii)通过出口管道与反应室连接的出口；以及(iv)反应室中的保留部件，该保留部件被设置成当其余液体通过出口管道移出反应室时其将一定体积的液体保留在反应室中。
另一方面，本发明提供用于进行多阶段反应的设备，该设备包括(a)至少形成有第一和第二管道的本体；和(b)从本体延伸出的反应容器，该反应容器包括(i)用于容纳液体的反应室；(ii))通过入口管道与反应室连接的入口；(iii)通过出口管道与反应室连接的出口；以及(iv)反应室中的保留部件，该保留部件被设置成当其余液体通过出口管道移出反应室时其将一定体积的液体保留在反应室中，其中所述容器的入口连接到本体的第一通道，并且所述容器的出口连接到本体的第二通道。
另一方面，本发明提供计算机可读产品，其包含由计算机执行的程序以控制嵌套扩增反应的进行，所述程序包含指令，用于(a)读取来自第一阶段扩增反应的光信号的值，所述光信号与第一阶段扩增反应中扩增子的浓度单一(monotonically)相关，并且光信号的值具有最新值；(b)从光信号的值确定基线信号水平；(c)从光信号的值计算预定水平；(d)将该预定值与光信号的最新值进行比较；(e)当光信号的最新值等于或高于预定水平时，启动第二阶段扩增反应；以及(f)重复步骤(d)和(e)直至第二阶段扩增反应启动。
另一方面，本发明提供扩增一种或多种RNA序列的方法，该方法包括以下步骤(i)在流体封闭反应系统中，使用逆转录酶试剂在第一反应混合物中转录一种或多种RNA序列，以形成一种或多种互补单链DNA序列；(ii)在该流体封闭反应系统中分离第一有效部分的第一反应混合物；以及(iii)在该流体封闭反应系统中，使用第一阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增所述第一有效部分中的所述一种或多种互补单链DNA序列以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一种互补单链DNA序列的初始引物。
本发明提供检测或测量标本或样品中一种或多种多核苷酸的系统和方法，在其多个方面比目前的技术具有若干优势，包括但不限于，(1)通过避免“携带”反应物实现封闭系统中两阶段扩增反应的较高灵敏度；(2)进行以闭环控制反应启动的实时多阶段扩增反应，更具体地，进行实时嵌套PCR；(3)通过参照序列的单阶段扩增和靶序列的多阶段扩增达到低丰度靶多核苷酸在多阶段扩增中的更加准确的定量；(4)用于进行本发明方法的方便的一次性反应容器。
定义本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循该领域中标准论文和教科书中的那些，例如Kornberg和Baker，DNA Replication(DNA复制)，Second Edition(W.H.Freeman，New York，1992)；Lehninger，Biochemistry(生物化学)，Second Edition(WorthPublishers，New York，1975)；Strachan和Read，Human Molecular Genetics(人类分子遗传学)，Second Edition(Wiley-Liss，New York，1999)；Eckstein，editor，Oligonucleotides and AnalogsA Practical Approach(寡核苷酸及类似物实用方法)(Oxford University Press，New York，1991)；Gait，editor，Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(寡核苷酸合成实用方法)(IRL Press，Oxford，1984)；Sambrook et al，Molecular CloningA LaboratoryManual(分子克隆实验手册)，2ndEdition(Cold Spring Harbor Laboratory，1989)；等等。
“扩增子”指多核苷酸扩增反应的产物。也就是，其为从一种或多种起始序列复制的多核苷酸群，通常为双链。该一种或多种起始序列可以是同一序列的一种或多种拷贝，或者其可以是不同序列的混合物。可以通过其产物为一种或多种靶核酸的多个复制物的多种扩增反应产生扩增子。通常，因为核苷酸或寡核苷酸反应物的碱基配对在产生反应产物所必需的模板多核苷酸中有互补物，所以产生扩增子的扩增反应是“模板驱动”的。一方面，模板驱动反应是使用核酸聚合酶的引物延伸或使用核酸连接酶的寡核苷酸连接。这些反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、线性聚合酶反应、连接酶链式反应(LCR)、链取代反应(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环复制等等，在通过引用方式包括于此的以下参考文献中公开了这些反应Mullis等人，美国专利第4,683,195号；第4,965,188号；第4,683,202号；第4,800,159号(PCR)；Gelfand等人，美国专利第5,210,015号(使用“taqman”探针的实时PCR)；Wittwer等人，美国专利第6,174,670；Landegren等人，美国专利第4,988,617(“LCR”)号；Birkenmeyer等人，美国专利第5,427,930号(“缺口-LCR”)；Kacian等人，美国专利第5,399,491号(“NASBA”)；Walker，美国专利第5,648,211号；第5,712,124号(“SDA”)；Lizardi，美国专利第5,854,033；Aono等人，日本专利公开JP 4-262799(滚环复制)；等等。一方面，本发明的扩增子是通过PCR产生的。如果可获得使得能够随着扩增反应的进行测量反应产物的检测化学，那么扩增反应可以是“实时”扩增，例如下文描述的“实时PCR”或者在Leone等人，Nucleic Acids Research，262150-2155(1998)及类似参考文献中描述的“实时NASBA”。如本文中所用，术语“扩增”指进行扩增反应。“反应混合物”指含有进行反应所需的全部反应物的溶液，其可以包括但不限于在反应期间将pH保持在选定水平的缓冲剂、盐类、辅因子、清除剂(scavenger)等等。
关于扩增反应，“封闭的”指该反应在没有液体可通过的开口的容器(vessel)或容器(container)或室(chamber)中发生，特别是含有非样品物质的液体，例如非样品生物分子或有机体，包括但不限于核酸、蛋白质、病毒、细菌等等。一方面，容纳封闭扩增反应的容器或室可以包括气体可穿过但液体不可穿过的端口或通风孔，例如，在常规反应条件下允许空气通过滤膜但不允许液体通过的端口。用于所述端口或通风孔的合适膜包括织物聚烯烃膜，例如Tyrek膜(杜邦)等等。
“互补的或基本互补的”指杂交或碱基配对或在核苷酸或核酸之间形成双链体，例如，在双链DNA分子的两条链之间或者在寡核苷酸引物和单链核酸的引物结合位点之间形成双链体。通常，互补核苷酸是A和T(或A和U)，或者C和G。在最优地排列和比较以及带有合适的核苷酸插入或删除时，当一条链的核苷酸与另一条链的核苷酸的至少约80％，通常至少约90％至95％，并且更优选约98％至100％配对时，这两条单链RNA或DNA分子被称为基本互补的。或者，当RNA或DNA链在选择性杂交条件下与其互补物杂交时，它们也基本互补。通常，当在至少14至25个核苷酸长度中存在至少约65％互补，优选约75％，更优选约90％互补时，选择性杂交发生。参见，M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)，通过引用将其包括于此。
“计算机可读产品”指用于储存可被读取或可被传输至计算机的信息的有形介质。计算机可读产品包括但不限于磁盘、磁带、光盘、CD-ROM、打孔带或卡、只读存储装置、直接存取装置、门阵列、静电存储器以及其它类似介质。
“双链体”指全部或部分互补的至少两寡核苷酸和/或多核苷酸在它们的所有或大部分核苷酸中进行Watson-Crick型碱基配对，使得形成稳定的复合体。术语“退火”和“杂交”可互换使用，指稳定双链体的形成。关于双链体，“完美匹配”指组成双链体的多或寡核苷酸链与另一条链形成双链结构，以至于每一条链中的每一个核苷酸都与另一条链中的核苷酸进行Watson-Crick碱基配对。术语“双链体”包括可以使用的核苷类似物的配对，所述核苷类似物例如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷、PNA等等。双链体中两个寡核苷酸或多核苷酸之间的“错配”指双链体中的核苷酸对未能进行Watson-Crick成键。
“流体封闭的”指在常规运行条件下，系统中的液体不能与该系统外部交流，并且类似地，该系统外部的液体不能与包含在系统内部的液体交流，该系统包含可能相互连接并且相互沟通的一个或多个容器、室、阀门和/或通道。一方面，常规运行条件指流体封闭的系统的容器、室、阀门和/或通道被加压至低于100psi的程度，或者另一方面，被加压至低于50psi的程度，或者至低于30psi的程度。
“荧光指示剂”指当扩增反应的产物(即扩增产物)存在时能够产生荧光信号的探针，至少在预定的浓度范围内当产物在反应混合物中积累时，荧光指示剂的信号增强。荧光指示剂可以是非特异性的，例如结合双链DNA产物的插入染料，例如YO-PRO-1、SYBR绿1等等，Ishiguro等人，Anal.Biochem.，229207-213(1995)；Tseng等人，Anal.Biochem.，245207-212(1997)；Morrison等人，Biotechniques，24954-962(1998)；或者例如带有荧光分子的具有发卡结构的引物，该荧光分子位于荧光淬灭剂附近直至被引物延伸所分开，例如Whitecombe等人，Nature Biotechnology，17804-807(1999)(“AmplifluorTM引物”)。荧光指示剂还可以是靶序列特异的，通常包含位于荧光淬灭剂附近的荧光分子，直至其所结合的寡核苷酸部分与扩增产物结合，例如Gelfand等人，美国专利第5,210,015号(“taqman”)；Nazarenko等人，Nucleic Acids Research，252516-2521(1997)(“蝎型探针”)；Tyagi等人，Nature Biotechnology，1649-53(1998)(“分子灯塔”)。荧光指示剂可以与实时PCR联合使用，或者它们可被用于在反应结束时测量反应产物的总量。
“内标”指为了能够绝对或相对地量化样本中靶多核苷酸而与靶多核苷酸在同一扩增反应中扩增的核酸序列。内标可以是内源或外源的。也就是，内标可以在样品中天然存在，或者可以在扩增前加入到样品中。一方面，可以向反应混合物中以一系列预先确定的浓度加入多个外源内标以提供校准，靶扩增子可以与其比较来确定样品中其相应靶多核苷酸的数量。对于本领域技术人员来说，外源内标的数目、序列、长度和其它特征的选择是常规的设计选择。优选地，内源内标，本文中也称为“参照序列”，是对应被最少调节的基因的、在样品中天然存在的序列，所述基因显示恒定和独立于细胞周期的转录，例如，Selvey等人，Mol.CellProbes，15307-311(2001)。示例性的参照序列包括但不限于来自以下基因的序列GAPDH、β2-微球蛋白、18S核糖体RNA和β-肌动蛋白(参见Selvey等人，上文已引用)。
“试剂盒”指输送用于进行本发明方法的物质或试剂的任何输送系统。在反应测定中，所述输送系统包括使得反应试剂(例如适当容器中的探针、酶等等)和/或支持物质(例如缓冲液、进行测定的书面用法说明等等)能够从一地到另一地储存、运输或递送的系统。例如，试剂盒包括一个或多个装有相关反应试剂和/或支持物质的包装物(例如盒子)。可以将这些内容物一起或分别地输送至预期接收者。例如，第一个容器可能装有测定中使用的酶，而第二个容器装有探针。
“连接”指在模板驱动反应中，在两个或多个核酸的末端之间形成共价键或连接，所述核酸例如寡核苷酸和/或多核苷酸。所述键或连接的性质可以非常不同，并且连接可以通过酶或化学的方法进行。用在本文中时，通常使用酶方法来进行连接，以在一个寡核苷酸的末端核苷酸的5’碳和另一寡核苷酸的3’碳之间形成磷酸二酯键。以下参考文献中描述了多种模板驱动的连接，通过引用将所述文献包括于此Whitely等人，美国专利第4,883,750号；Letsinger等人，美国专利第5,476,930；Fung等人，美国专利第5,593,826号；Kool，美国专利第5,426,180号；Landegren等人，美国专利第5,871,921号；Xu和Kool，Nucleic Acids Research，27875-881(1999)；Higgins等人，Methods in Enzymology，6850-71(1979)；Engler等人，The Enzymes，153-29(1982)；以及Namsaraev，美国专利公开2004/0110213。
“微流装置”指相互连接并且流体相通的一个或多个室、端口和管道的整合系统，其被设计为单独或与提供支持功能的器械或仪器一起用于进行分析反应或过程，所述支持功能包括样品引入、流体和/或试剂驱动装置、温度控制以及检测系统。微流装置还可以包括阀门、泵以及它们内壁上专门的功能涂层，例如防止样品组分或反应物吸附、通过电渗促进试剂移动等等。通常作为固体基体或者在固体基体中制造这些装置，所述固体基体可以是玻璃、塑料或其它固体聚合材料，并且为了容易检测和监测样品和试剂的移动，特别是通过光学或电化学方法，这些装置通常具有平面形式。微流装置的特征通常具有小于数百平方微米的截面尺寸，并且通道通常具有毛细管的大小，例如，具有约1000μm至约0.1μm的最大截面尺寸。微流装置的容积为通常100μL至少许nL，例如10-100nL。微流装置的制造和操作为本领域公知，如以下文献中所举例，通过引用将所述文献包括于此Ramsey，美国专利第6,001,229号、第5,858,195号、第6,010,607号和第6,033,546号；Soane等人，美国专利第5,126,022和第6,054,034号；Nelson等人，美国专利第6,613,525号；Maher等人，美国专利第6,399,952号；Ricco等人，国际专利公开WO02/24322；Bjornson等人，国际专利公开WO 99/19717；Wilding等人，美国专利第5,587,128号和第5,498,392号。
如本文中所用，“核苷”包括天然核苷，包括2’-脱氧和2’-羟基形式，例如，如Romberg和Baker，DNA Replication(DNA复制)，2ndEd.(Freeman，San Francisco，1992)中所描述。关于核苷，“类似物”包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷，例如Scheit，Nucleotide Analogs(John Wiley，New York，1980)；Uhlman和Peyman，Chemical Reviews，90543-584(1990)等等中所描述的，附带条件为它们能够特异杂交。这些类似物包括设计成增强结合特性、降低复杂度、增加特异性等等的合成核苷。Uhlman和Peyman(上文已引用)；Crooke等人，Exp.Opin.Ther.Patents，6855-870(1996)；Mesmaeker等人，Current Opinion in Structual Biology，5343-355(1995)等等中描述了包含具有增强的杂交或抗核酸酶特性的类似物的多核苷酸。能够提高双链体稳定性的多核苷酸的示例性类型包括寡核苷酸N3’→P5’氨基磷酸酯(本文中称为“酰胺化物”)、肽核酸(本文中称为“PNA”)、寡-2′-O-烷基核糖核苷酸、含有C-5丙炔基嘧啶的多核苷酸、锁核酸(LNA)，以及类似化合物。这些寡核苷酸或者可商购，或者可以使用文献中描述的方法合成。
“聚合酶链式反应”或“PCR”指用于体外扩增特定DNA序列的反应，该反应通过DNA互补链的同时引物延伸来进行。换句话说，PCR是产生靶多核苷酸的在侧翼具有引物结合位点的多个拷贝或复制物的反应，所述反应包括以下步骤的一次或多次重复(i)变性靶核酸，(ii)将引物退火至引物结合位点，和(iii)在三磷酸核苷存在下，通过核酸聚合酶延伸引物。通常，反应在温度循环仪器中在为每一步骤优化的不同温度间循环。具体温度、每一步骤的持续时间以及步骤间转变的速度依赖于本领域技术人员公知的许多因素，例如，参考文献所列举的McPherson etal，editors，PCRA Practical Approach(PCR实践方法)和PCR2A PracticalApproach(PCR2实践方法)(IRL Press，Oxford，1991和1995，依序)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，可以在＞90℃下使双链靶核酸变性，在50-75℃范围内的温度下使引物退火，并且在72-78℃范围内的温度下延伸引物。术语“PCR”包括反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR等等。反应体积从数百纳升，例如200nL，至数百微升，例如200μL。“逆转录PCR”或“RT-PCR”指先进行将靶RNA转换成互补的单链DNA的逆转录反应，然后再扩增该DNA的PCR，例如，Tecott et al，美国专利第5,168,038号，通过引用将该专利包括于此。“实时PCR”指随着反应进行其反应产物的含量被监测的PCR，所述反应产物即扩增子。存在许多形式的实时PCR，它们的主要区别在于用来监测反应产物的检测化学，例如，Gelfand等人，美国专利第5,210,015号(“taqman”)；Wittwer等人，美国专利第6,174,670号和第6,569,627号(插入染料)；Tyagi等人，美国专利第5,925,517号(分子灯塔)；通过引用将所述专利包括于此。用于实时PCR的检测化学被综述在Mackay et al，Nucleic Acids Research，301292-1305(2002)中，也通过引用将其包括于此。“嵌套PCR”指两阶段PCR，其中第一PCR的扩增子成为使用新一套引物的第二PCR的样品，新一套引物中的至少一个结合到第一扩增子的内部位置。用在本文中时，关于嵌套扩增反应“初始引物”指用于产生第一扩增子的引物，并且“次级引物”指用于产生第二或嵌套扩增子的一种或多种引物。“多重PCR”指在同一反应混合物中多种靶序列(或单一靶序列和一种或多种参照序列)同时进行的PCR，例如，Bernard et al，Anal.Biochem.，273221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，对每一扩增序列使用不同的成套引物。通常，多重PCR中靶序列数目在2至10的范围内，或者2至6，或者更典型地，2至4。
“定量PCR”指设计用来测量样品或标本中一种或多种特定靶序列丰度的PCR。定量PCR包括所述靶序列的绝对定量和相对定量。使用可以单独地或与靶序列一起测定的一种或多种参照序列进行定量测量。参照序列对于样品或标本可以是内源或外源的，并且在后一种情况中，可以包含一种或多种竞争模板。典型的内源参照序列包括以下基因的转录物的区段β-肌动蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖体RNA等等。定量PCR技术为本领域普通技术人员所公知，如以下通过引用包括于本文的参考文献中所举例的Freeman等人，Biotechniques，26112-126(1999)；Becker-Andre等人，Nucleic Acids Research，179437-9447(1989)；Zimmerman等人，Biotechniques，21268-279(1996)；Diviacco等人，Gene，1223013-3020(1992)；Becker-Andre等人，Nucleic Acids Research，179437-9446(1989)等等。
“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用且每一个均指核苷酸单体的线性聚合物。组成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体对单体相互作用的常规方式特异结合天然多核苷酸，例如通过Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反Hoogsteen型碱基配对等等。所述单体及它们的核苷酸间键合物(internucleosidic linkage)可以是天然存在的或者可以是其类似物，例如天然存在或非天然存在的类似物。非天然存在类似物可以包括PNA、硫代磷酸酯核苷酸间键合物、含有使得能够附着标记物的连接基团的碱基，该标记物例如荧光团或半抗原，等等。当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶处理时，例如通过聚合酶延伸、连接酶连接等等，普通技术人员应当理解在这些情况下寡核苷酸或多核苷酸在任何或某些位置不含有核酸间键合物、糖部分或碱基的某些类似物。多核苷酸的大小范围通常从几个单体单元至几千个单体单元，所述几个单体单元例如5-40，此时它们通常被称为“寡核苷酸”。当用字母(大写或小写)序列代表多核苷酸和寡核苷酸时，例如“ATGCCTG”，应当理解除另行指明或从上下文明显看出外，核苷酸从左至右为5’→3’顺序且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，以及“T”表示脱氧胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另行说明，术语和原子编号习惯遵循Strachan和Read，Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss，New York，1999)中所公开的。通常多核苷酸包括由磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如，脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷用于DNA或者它们的核糖对应物用于RNA)；然而，它们还可以包括非天然核苷酸类似物，例如，包括修饰的碱基、糖或核苷酸间键合物。本领域技术人员清楚当酶的活性要求特定的寡核苷酸或多核苷酸底物时，例如，单链DNA、DNA/RNA双链体等等，普通技术人员能够选择寡核苷酸或多核苷酸底物的适当组成，特别是有来自论文的指导时，所述论文例如Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)以及类似参考文献。
“引物”指天然或合成的寡核苷酸，其与多核苷酸模板形成双链体后能够作为核酸合成的起始点并且从其3’末端沿模板延伸，从而形成延伸的双体。通常使用诸如DNA或RNA聚合酶等的核酸聚合酶进行引物的延伸。延伸过程中加入核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。通常使用DNA聚合酶延伸引物。引物长度通常为14至40个核苷酸，或者为18至36个核苷酸。在多种核酸扩增反应中使用引物，例如，线性扩增反应使用单一引物或聚合酶链式反应使用两种或多种引物。选择引物的长度和序列用于特定应用的指南为本领域普通技术人员所公知，如以下通过引用包括于本文的参考文献中所显示Dieffenbach编辑，PCRPrimerA Laboratory Manual(PCR引物实验室手册)，2ndEdition(ColdSpring Harbor Press，New York，2003)。
“读出值”指测量和/或检测的、能够被转化为数字或数值的一个或多个参数。在某些情况中，读出值可以指如此收集或记录的数据的实际数字表现。例如，来自微阵列的荧光强度信号的读出值是在该微阵列的每一杂交位点处产生的信号的地址和荧光强度；因此，所述读出值可以以多种方法登记或储存，例如，作为微阵列的图象、作为数字的表等等。
关于一个分子与另一个分子的结合，“特异的”或“特异性”指所述两个分子间识别、接触且形成稳定复合体，以及与其它分子间显著减少的识别、接触和复合体形成，所述一个分子与另一个分子结合例如标记靶序列与探针的结合。一方面，关于第一分子与第二分子的结合，“特异的”指就第一分子在反应或样品中识别另一分子并与其形成复合体的程度而言，其与第二分子形成最大数目的复合体。优选地，此最大的数目为至少50％。通常，参与特异结合事件的分子在其表面或腔中具有引起相互结合的分子之间特异识别的区域。特异结合的例子包括抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸之间形成双链体或三链体、受体-配体相互作用等等。用在本文时，关于特异性或特异结合，“接触”指两个分子足够靠近使得弱的非共价化学相互作用在分子间相互作用中占据优势，所述非共价化学相互作用例如范德瓦尔斯力、氢键、碱基堆积相互作用、离子和疏水相互作用等等。
“Tm”或“解链温度”指双链核酸分子群半解离成单链的温度。本领域公知数个计算核酸的Tm的方程式。例如，当核酸在1M NaCl水溶液中时，可以通过方程式来简单估算Tm值。在Breslauer等人，Proc.Natl.Acad.ScL，833746-3750(1986)和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，26227-259(1991)中可找到根据双体形成和解离的更完全模型计算Tm的方法。
“样品”指生物、环境、医疗或患者来源的一定数量的物质，在其中寻求靶核酸的检测或测量。一方面，其包括标本或培养物(例如微生物培养物)。另一方面，其包括生物和环境样品。样品可以包括人工来源的标本。生物样品可以是包括人在内的动物的流体、固体(例如粪便)或组织，以及液体和固体食品和饲料产品和成分，例如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品，以及废料。生物样品可以包括从患者取得的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰、精液、针吸出物等等。可以从驯养动物以及未驯化的或野生动物的全部各种家族获得生物样品，所述动物包括但不限于有蹄类动物、熊、鱼、啮齿类动物等等。环境样品包括诸如表面物质、土壤、水和工业样品等环境材料，以及从食品和乳品加工仪器、器械、设备、器具、一次性和非一次性物品得到的样品。不应将这些例子理解为限制适用于本发明的样品类型。术语“样品”和“标本”可互换使用。
关于多种荧光标记物，“光谱可分辨的”指标记物荧光发射带足够不同，即充分不重叠，使得能够通过标准光探测系统(例如，使用带通滤光器和光电倍增管系统等等)根据相应标记物产生的荧光信号区分相应标记物所连接的分子标签，例如美国专利第4,230,558、4,811,218号等等，或Wheeless等人，第21-76页，Flow CytometryInstrumentation and DataAnalysis(流式细胞术仪器和数据分析)(Academic Press，New York，1985)中描述的系统。
附图简要说明
图1A-1B说明诸如实时PCR的扩增反应的信号相对于循环次数(或反应时间)的曲线。
图1C是用于实现本发明方法的设备的示意图。
图2A-2H图示说明在使用旋转阀门和活塞型液体泵的流体封闭反应系统中实施嵌套扩增反应。
图3A-3C图示说明用于实现本发明某些实施方案的可替代的反应室。
发明详细说明本发明涉及用于进行多阶段扩增反应的系统、方法和设备，特别是在流体封闭条件下。一方面，本发明的方法在流体封闭反应系统中进行，该系统允许分离一部分第一(或在前)反应混合物并且在第二(或随后)反应混合物中将其用作样品或标本，由此基本上避免了将两个反应混合物简单地混合在一起时第一反应组分对第二反应可能造成的干扰影响。此方面，本发明的系统、方法和设备可以用于任何扩增反应，该扩增反应允许基于使用嵌套引物的多阶段扩增。
特别地，它们非常适合于进行两阶段或嵌套PCR和NASBA反应。以举例的方式，下文描述了嵌套PCR和NASBA反应的基本反应条件；然而，本领域技术人员应当理解在PCR和NASBA反应中使用嵌套引物以达到更高灵敏度的相同原理可以类似地使用在其它使用一种或多种引物的扩增反应中。另一方面，本发明还提供用于两阶段RT-PCR反应的流体封闭反应系统，其中可以在没有影响随后PCR的RT反应的组分情况下进行第二阶段PCR，例如，Sellner等人，Nucleic Acids Research，201487(1992)。另一方面，本发明提供三阶段反应，其中进行逆转录酶反应以将一种或多种靶RNA转化成为互补单链DNA，然后在两阶段扩增反应中扩增该DNA，例如逆转录酶-嵌套PCR，或“RT-nPCR”。
如上所述，本发明一方面提供用于进行两步反应的设备，该设备包括a)至少形成有第一和第二通道的本体；和b)从所述本体延伸出的反应容器，该反应容器具有i)接收液体的反应室；ii)通过入口管道连接到反应室的入口；iii)通过出口管道连接到反应室的出口；以及iv)反应室中的保留部件，该保留部件被设置成当其余液体通过出口管道被移出反应室时其将一定部分的液体保留在反应室中，其中所述容器的入口连接到本体的第一管道且容器的出口连接到本体的第二管道。本发明的设备还包括与第二管道流体相通的通风口，用于从第二管道排放气体。本发明的设备还包括用于迫使本体的第一管道中的流体流过容器的入口而进入反应室的差压源。本发明的容器还包括i)限定反应容器侧壁的刚性框架；和ii)附设于刚性框架相对侧的第一和第二聚合物膜以形成反应室的相对的主要壁。所述设备的本体还包括用于混合流体样品和反应试剂的混合室，该反应室通过第一管道连接到所述容器的入口。所述设备的本体还包括用于接收通过出口管道移出的其余液体的废料室，该废料室通过第二管道连接到容器的出口。所述设备的本体还包括形成于其中的i)样品流动路径；和ii)样品流动路径中的分离区，用于从流体样品中分离需要的分析物，该分离区通过第一管道连接到容器的入口。一方面，所述本体中的分离区包括a)样品流动路径中的溶解室，用于溶解样品中的细胞或病毒以从其中释放物质；和b)置于溶解室中的至少一个固体支持物，用于捕获待溶解的细胞或病毒。所述设备的容器包括限定反应室的许多壁，至少一个壁包含柔性片或膜，并且所述设备还包括a)用于接触所述片或膜的至少一个热表面；b)提高反应室中压力的装置，其中该室中的压力增加足以迫使所述片或膜适应所述热表面；以及c)用于加热或冷却所述表面以向室中引入温度变化的至少一个热元件。
所述设备的容器还包括两个相对的主要壁和将主要壁相互连接以形成反应室的侧壁，至少两个所述侧壁是透光的并且彼此成角度的偏移，并且所述设备还包括具有至少一个光源和至少一个检测器的光学系统，该光源用于透过第一个透光的侧壁向反应室中传输光，该检测器用于检测透过第二个透光的侧壁从该室中发出的光。
嵌套扩增反应关于PCR，如上所述，嵌套扩增反应是多阶段反应，其中在前阶段的扩增子作为使用新的引物或引物对的后续阶段的样品，所述引物或引物对结合到在先产生的扩增子中至少一个内部位置。在嵌套扩增反应的每一阶段中，以常规方式进行扩增反应。将单独扩增反应连接成嵌套扩增反应的设计选择包括(i)每一阶段的循环次数或持续时间，(ii)用作第二阶段反应的样品的第一阶段反应混合物的有效部分的大小，(iii)第二阶段引物的内部结合位点的选择，(iv)是否应当在每一阶段中扩增参照序列，(v)是否应当在每一阶段中进行相同类型的扩增反应，例如，对于两阶段嵌套扩增反应PCR-PCR、NASBA-NASBA、PCR-NASBA等等。通常嵌套扩增反应是连续PCR或连续NASBA反应，并且在常规反应条件下进行。
本发明的一方面，当PCR是嵌套扩增反应的一个阶段时，PCR中的循环次数在20至40的范围内，或者在24至36的范围内。另一方面，循环的次数是足以产生可预定量的扩增子的次数，该扩增子又在实时信号产生化学中产生预定信号。如果嵌套扩增反应包括两个相继PCR，那么相继PCR中的循环次数和其它反应条件可以相同或不同。
对于第一或在前阶段反应，一方面，有效部分是足够启动第二阶段反应的量。一方面，有效部分是足以在第二阶段反应中提供每μL至少一个靶多核苷酸的目标浓度的量，或者另一方面，每μL至少10个靶多核苷酸，或者另一方面，每μL至少50个靶多核苷酸，或者另一方面，每μL至少100个靶多核苷酸，或者另一方面，每μL至少500个靶多核苷酸，或者另一方面，每μL至少1000个靶多核苷酸。另一方面，有效量是占第一阶段反应混合物体积的0.5％至10％的量，或者占第一阶段反应混合物体积的1％至5％的量。如下所述，在一些实施方案中，为了更准确地取出有效部分并且最小化取样误差，在移出或分离一部分之前稀释第一阶段反应混合物。例如，为了获得体积为1μL的第一阶段反应混合物的10％部分，可以稀释至10μL随后移出1μL的稀释混合物，而不是直接移出0.1μL的未稀释混合物。通常，第二阶段扩增反应中的反应物可以与第一阶段反应中的那些相同，但至少有以下例外第二阶段反应中的一种或多种引物不同，但第二阶段反应中引物的浓度是常规的。第一阶段反应和第二阶段反应中的信号产生方案可以相同或不同。
一方面，本发明提供在开环控制或闭环控制之下，自动启动第二阶段(或随后阶段)扩增反应的方法。在具有开环控制的实施方案中，第一阶段扩增反应进行预定的循环次数或预定的反应时间，然后分离有效部分的反应混合物，与第二阶段反应物混合，并且启动第二阶段扩增反应。在这些实施方案中，第一阶段扩增子的实时监测是任选的。在具有闭环控制的实施方案中，监测第一阶段扩增反应的反应参数，并且当其呈现预定值或超过预定阀值时，停止第一阶段反应，并且分离有效部分的反应混合物，与第二阶段反应物混合，并且启动第二阶段扩增反应。用于确定何时启动第二阶段扩增反应的反应参数可以是与反应产物的积累有明确关系的任何参数，或者换句话说，与所述第一阶段反应的完成程度有明确关系的任何参数。优选地，反应参数与第一阶段反应中一种或多种产物的积累有单一关系，因此参数的增加值可以与所述产物的量正相关或负相关，所述产物通常是一种或多种扩增子。反应参数可以包括但不限于反应混合物的光密度、温度、pH、次要反应产物的浓度、扩增子浓度，后者例如基于一种或多种荧光信号、比色信号、化学发光信号、电化学发光信号或电化学信号等等。一方面，反应参数与第一阶段反应中的至少一种扩增子的浓度单一相关。该扩增子可以从靶多核苷酸产生，或者从参照序列或其它内标产生。因此，在具有闭环控制的嵌套PCR中，第一阶段扩增反应是实时PCR。本发明的一方面，反应参数是由荧光指示剂检测的扩增子，该荧光指示剂的信号与反应混合物中扩增子的浓度单一相关。当样品或标本中靶核酸的含量或质量有不同时，第二阶段反应的闭环控制能够产生更加稳定和较少变化的读出值。
由于在一些应用中，样品可以含有或不含有靶多核苷酸。因此，一方面，监测一种或多种参照序列或其它内标的扩增子以确定何时启动第二阶段反应。也就是，所述内标作为阳性对照和用于启动第二阶段反应的反应参数。另一方面，为了启动第二阶段反应，内标和靶多核苷酸的扩增子均必须达到或超过预定水平，所述水平可以相同或不同。
本发明的另一方面，当第一阶段扩增反应是开环控制下的PCR时，在启动第二阶段反应之前进行的循环次数在20至40的范围内，或者另一方面，在20至30的范围内。另一方面，当在预定时间后停止第一阶段扩增反应并且启动第二阶段扩增反应时，可以根据经验选择用于特定类型被分析样品的预定时间。例如，在具有参照序列的样品中，可以选择将选定参照序列扩增至一般样品中其平台值的某些部分的平均时间作为预定时间，所述部分例如四分之一、三分之一、二分之一等等。
当第一阶段扩增反应处于闭环控制之下时，可以使用多种方式选择启动第二阶段反应的第一阶段反应参数值。一方面，该值被确定为基线信号水平或背景噪声数值的函数，或者被确定为描述反应混合物中一种或多种扩增子的积累的函数的特征，如图1A和1B中所示。图1A中，曲线(1000)和(1002)例如分别代表参照序列和靶多核苷酸的积累的扩增子，所述扩增子的积累通过由扩增子特异探针产生的两种不同的荧光信号来确定，所述探针例如为具有在可区别波长处发出荧光的荧光染料的分子灯塔。如图所示，这些曲线通常是S形的，每一条均具有噪声水平或基线信号(1004)之下的低正斜率区、高正斜率的对数线性区(1010)和低正斜率的平台区(1012)，该平台区对应反应物被耗尽和/或干扰副产物积累时的反应阶段。本发明的一方面，当靶扩增子的曲线(1002)达到或超过预定水平(1006)时，启动第二阶段反应，所述预定水平(1006)可以是基线信号(1004)的函数。另一方面，当靶扩增子曲线(1002)和参照序列曲线(1000)均达到或超过预定水平(1006)时，启动第二阶段反应。预定水平(1006)的选择对于本领域技术人员是常规的设计选择，其可能依赖于多种因素，例如，与在第一阶段反应中的靶紧密相关的序列被扩增的可能性(即在测定中缺乏反应特异性)、样品的质量及其对基线信号值的贡献程度、使用的扩增反应的类型、使用的信号检测系统等等。一方面，预定水平(1006)是基线信号值(1004)的倍数。举例来说，预定水平(1006)可以选自基线信号值1.5至25倍的范围。另一方面，预定水平(1006)是基线信号值的1.5倍、或基线信号值的2倍、或基线信号值的3倍、或基线信号值的5倍、或基线信号值的10倍。基线信号值可以是靠近扩增反应起始时的预定循环次数或预定时间间隔的荧光测量值的函数，例如平均值。荧光测量值可以是，或者包括，来自这种通道的信号的测量值，该通道与用于测量由被监测的扩增子产生的荧光信号的通道相同。一方面，基线信号值是至少一个扩增子增长曲线的最初10、或25、或50、或100个测量的光信号值的函数。一方面，所述函数是这些最初光信号值的算术平均值。优选地，预定水平(1006)与曲线(1002)和/或曲线(1000)在其各自的对数线性区(1010)相交。可以使用多种产生光信号的标签来鉴定和/或测量扩增子，包括但不限于荧光指示剂、比色标签、化学发光标签、电化学发光标签等等。
另一方面，可以通过如图1B所示的描述积累的扩增子和扩增反应的循环次数或时间之间关系的曲线(本文中称为“扩增子增长曲线”)的特征来确定启动第二阶段反应的反应参数值。如图1A所示，曲线(1013)和曲线(1015)描述分别对应参照序列和靶多核苷酸的扩增子的积累。两条曲线在每一个点均具有正斜率，然而，斜率的量值从反应早期到反应后期发生改变，开始时斜坡是平的，在对数线性区是陡峭的，并且在平台区再次变平。如果取所述曲线的导数，那么产生在时间或循环数值(1019)处具有最大值的大体对称的函数(1018)。数值(1019)为曲线(1015)的一阶导数的根。数值(1019)对应曲线(1015)的斜率停止增加并且开始减小的点(1014)，也就是，其为拐点，该拐点位于对数线性区大约一半的位置，使得其成为曲线(1015)的吸引人的特征，用于确定启动第二阶段反应的信号值(1022)。另一方面，可以取曲线(1015)的二阶导数以产生如曲线(1021)的另一个大体对称的函数。曲线(1021)的根提供用于确定启动第二阶段反应的信号值的另一候选特征，所述信号值例如(1023)。McMillan等人的美国专利第6,783,934号公开了确定对应描述扩增子积累的曲线(1015)的这些特征的信号值，通过引用将该专利包括于此。如上所述，术语“扩增子增长曲线”指描述反应混合物中扩增子积累的曲线，例如曲线(1000)、(1002)、(1013)或(1015)，该曲线是循环次数或时间的函数，或者是诸如非温度调节的扩增反应中的温度等等相关参数的函数。应当理解，当收集组成所述曲线的数据时，在反应期间重复地计算扩增子增长曲线的特征，例如一阶或二阶导数。还应当理解，由于上述测定的实时性质，可能只能够追溯既往地确定扩增子增长曲线的某些特征；因此，这些特征可能不是在每一种情况下都适合用来确定应当何时启动第二阶段扩增反应。选择扩增子增长曲线的适合特征来确定何时启动第二阶段扩增反应对于本领域技术人员是常规设计选择。
本发明的一方面，通过检测对应反应参数的光信号达到或超过预设值来进行第二阶段反应启动的闭环控制。优选地，反应参数是扩增子的浓度，通常该扩增子对应靶多核苷酸。可获得多种荧光信号产生方案用于在扩增反应中产生与扩增子浓度单一相关的荧光信号。这些荧光信号产生方案包括但不限于分子灯塔、诸如SYBR绿的插入染料、taqman探针、AmplifluorTM引物、“蝎型”引物等等，它们在上文引用的参考文献中公开。可以使用多种仪器操作系统来进行所述基于光信号的闭环控制，所述光信号由诸如扩增子浓度的反应参数产生。如下文更充分描述的，一方面，由Christel等人的美国专利第6,369,893号公开的多通道光学检测系统非常适于所述测量。图1C说明了适用于本发明的所述系统的原理图。Christel等人提供发光二极管LED(1050)至(1056)，用于照射反应室(1070)中的反应混合物。检测器(1060)至(1066)收集由LED(1050)至(1056)激发的荧光，每一个检测器(1060)至(1066)通常任选地与限制检测到的光的波长的带通滤波器关联。LED(1050)至(1056)的激发光束可以相同或不同。一方面，选择带通滤波器以选择性地通过由多种在光谱上可分辨的荧光染料所发出的荧光，使得每一个检测器(1060)至(1066)收集只主要来自多种荧光染料之一的荧光。为了在本发明中使用，LED-检测器对之一，例如(1052)和(1062)，被分配用来检测来自对应靶多核苷酸的扩增子的荧光信号，并且LED-检测器对之一，例如(1056)和(1066)，被分配用来检测来自对应参照序列的扩增子的荧光信号。
通过微处理器(1080)控制检测系统和流体闭合反应系统(1086)的所有组件的控制。通过常规光学处理由检测器(1060)至(1066)收集的光信号并转化为电信号，在经过常规的预放大和调节(1082)后，该电信号被数字化以储存和/或由微处理器(1080)进一步处理。本发明的一方面，微处理器(1080)被编程以连续监测由诸如检测器(1062)的检测器之一收集的信号的数值。当该值达到或超过预编程值时，微处理器(1080)启动向控制器(1084)提供一系列命令以开动流动闭合反应系统(1086)的组件来启动第二阶段扩增反应的子程序。微处理器(1080)还通过控制器(1088)改变和/或调节反应室(1070)的温度。优选通过一个或多个具有耐热元件和冷却风扇的加热板来完成温度控制，所述加热板如Chang等人的美国专利6,565,815和美国专利6,391,541中所教导的，通过引用将其公开包括于此。在使用闭环控制的实施方案中，微处理器(1080)可以以预定间隔计算诸如图1B的(1013)和(1015)的曲线特征的值，使得它们可以与预定值相比较。当所述计算值达到或超过预定水平时，微处理器(1080)启动子程序以开始第二阶段扩增反应，如上所述。
如上所述，优选计算机进行启动第二阶段反应的方法的步骤。在一实施方案中，计算机包括处理单元、存储器、I/O设备和用于在它们之间传输信息的相连的地址/数据总线结构。处理单元可以是由合适操作系统驱动的常规微处理器，包括RISC和CISC处理器，使用嵌入防火墙的专用微处理器，或定制的数字信号处理电路(DSP)，其专用于本方法的特定处理任务。存储器可以在微处理器中，即一级缓存、快速S-RAM，即二级缓存、D-RAM或光盘或磁盘。I/O装置可以是能够在计算机和用户间传递信息的任何装置，例如键盘、鼠标、网卡等等。地址/数据总线可以是PCI总线、NU总线、ISA或任何其它类似的总线结构。当计算机进行本发明的方法时，上述方法步骤可以包含在储存在计算机可读产品之内或之上的程序中。所述计算机可读产品还可以包括用于图形用户界面的程序和改变电泳系统或数据收集装置的设置的程序。一方面，本发明提供控制图1C中描述的流体封闭反应系统中的操作的算法和计算机可读产品。
本发明的一方面，计算机可读产品包括用来在流动封闭反应系统中控制嵌套扩增反应进行的由计算机执行的程序。在一实施方案中，所述程序包括用于以下目的的指令(a)读取来自第一阶段扩增反应的光信号的值，该光信号与第一阶段扩增反应中扩增子的浓度单一相关，并且光信号的值具有最新值；(b)根据光信号的值确定基线信号水平；(c)根据光信号的值计算预定水平；(d)将光信号的预定值和最新值进行比较；(e)当光信号的最新值等于或高于预定水平就启动第二阶段反应；以及(f)重复步骤(d)和(e)直至第二阶段反应被启动。如本文中所用，关于光信号的“最新值”指对应光信号的由监测扩增反应的探测系统最新测量的值。换句话说，其为在扩增反应期间产生的扩增子增长曲线的最新值。
本发明的另一方面，计算机可读产品包括用来在流动封闭反应系统中控制嵌套扩增反应进行的由计算机执行的程序。在一实施方案中，所述程序包括用于以下目的的指令(a)读取来自第一阶段扩增反应的光信号的值，该光信号与第一阶段扩增反应中扩增子的数量或浓度相关；(b)根据光信号的值确定是否超过阀值；以及(c)如果超过阀值，就启动第二阶段扩增反应。
嵌套PCR非常适合用在上述设备中，例如当第一阶段和第二阶段反应均为实时PCR时。举例来说，第一阶段扩增反应可以是实时PCR，其中使用AmplifluorTM发卡引物来产生其强度与扩增子单一相关的荧光信号，例如，Whitcombe等人，Nature Biotechnology，17804-808(1999)。第二阶段扩增反应可以使用相同或不同的标记方案。简而言之，AmplifluorTM发卡引物具有靶结合部分，其选择与常规引物相同，以及位于靶结合部分5’末端的发卡部分，只要发卡存在其就保持荧光团-淬灭剂对互相接近，由此淬灭来自荧光团的任何荧光信号。在PCR的反向延伸步骤中，随着反向链穿过发卡向靶多核苷酸的末端延伸，发卡的双链体部分被替代，由此从荧光团的附近移开淬灭剂使得荧光信号产生。随着双链DNA产物积累，来自反应混合物的荧光信号增加。当荧光信号的强度达到或超过预定水平时，例如三倍于基线时，停止PCR并且分离有效部分的反应混合物，然后与第二阶段反应物混合。通过移出有效部分的第一反应混合物(并且因此一部分的第一扩增子)并且将其作为样品或标本在独立的第二反应中扩增，可以基本上排除来自第一反应组分的干扰，例如来自延伸的AmplifluorTM引物的荧光。
还可以进行嵌套NASBA反应使得在产生的与反应参数相关的信号达到或超过预定水平时启动第二阶段NASBA。NASBA反应基于逆转录酶(通常是鸟类成髓细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶)、RNase H和带有两个寡核苷酸引物的RNA聚合酶(通常是T7 RNA聚合酶)的同时存在的活性，其在常规条件下能够在90至120分钟内产生期望靶序列的109至1012倍的扩增。在NASBA反应中，只有当核酸是单链的并且含有引物结合位点时才是扩增反应的模板。因为NASBA是等温的(通常使用上述酶在41℃进行)，如果在样品准备过程中防止双链DNA的变性，那么可以完成单链RNA的特异扩增。也就是，与诸如RT-PCR的其它技术不同，有可能检测双链DNA背景中的单链RNA目标而不得到由复杂基因组DNA造成的假阳性结果。通过使用与反应相容的荧光指示剂，例如分子灯塔，可以在进行NASBA时实时检测扩增子。分子灯塔是茎环结构的寡核苷酸，其在一个末端带有荧光标记而在另一个末端带有淬灭剂，例如5’-荧光黄和3’-(4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(即3’-DABCYL)，如Tyagi和Kramer所公开的(上文已引用)。示例性的分子灯塔可以具有有六个核苷酸的互补茎链，例如，4个G或C和2个A或T，以及约20个核苷酸的靶特异环，使得该分子灯塔能够与靶序列在诸如41℃的反应温度下形成稳定的杂种分子。典型的NASBA反应混合物是80mM Tris-HCl[pH 8.5]、24mM MgCl2、140mM KCl、1.0mM DTT、每一dNTP各2.0mM、ATP和UTP和CTP各4.0mM、3.0mM GTP和30％DMSO中的1.0mMITP。引物浓度是0.1μM且分子灯塔浓度是40nM。酶混合物是375山梨糖醇、2.1μgBSA、0.08 U RNase H、32 U T7 RNA聚合酶和6.4 U AMV逆转录酶。反应可以包括5μL样品、10μL NASBA反应混合物和5μL酶混合物，总反应体积为20μL。进行实时NASBA反应的更多指导在以下参考文献中公开，通过引用将其包括于此Polstra等人，BMC InfectiousDiseases，218(2002)；Leone等人，Nucleic Acids Research，262150-2155(1998)；Gulliksen等人，Anal.Chem.，769-14(2004)；Weusten等人，NucleicAcids Research，30(6)e26(2002)；Deiman等人，Mol.Biotechnol.，20163-179(2002)。与嵌套PCR类似地进行嵌套NASBA反应；也就是，第一NASBA反应的扩增子成为使用新一套引物的第二NASBA反应的样品，新引物中的至少一个结合到第一扩增子的内部位置。
如上所述，一方面，本发明提供在流体封闭反应系统中进行与一个或多个扩增反应相连的逆转录酶反应的方法。在一实施方案中，如下方式扩增一种或多种RNA序列，例如从细胞或组织样品中提取的选定mRNA(i)在流动封闭反应系统中，使用逆转录酶试剂在第一反应混合物中转录一种或多种RNA序列以形成一种或多种互补单链DNA序列；(ii)在该流体封闭反应系统中分离第一有效部分的第一反应混合物；以及(iii)在该流动封闭反应系统中使用第一阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增第一有效部分中的所述一种或多种互补单链DNA序列以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一种互补单链DNA序列的初始引物。使用常规逆转录酶反应来进行转录的步骤，常规逆转录酶反应的组分，即逆转录酶试剂容易购得，例如，Ambion。大体上，在本实施方案中，以与如上所述的嵌套PCR中的第一阶段扩增反应类似地处理逆转录反应。也就是，分离有效部分(第一有效部分)的逆转录酶反应混合物，优选通过将所述部分保留在反应室中，而弃去其余混合物。在本实施方案中，所述第一有效部分指含有足够量的互补单链DNA的部分，所述DNA可以被随后的扩增反应所检测。因此，以上给出的有效部分的定义适用于本实施方案中的第一有效部分。如上所述，上述两阶段反应之后可以跟随有第三阶段嵌套扩增。通过以下附加步骤进行本方法的此方面(i)在所述流体封闭反应系统中分离第二有效部分的所述第二反应混合物；以及(ii)在所述流动封闭反应系统中，使用第二阶段扩增试剂在第三反应混合物中扩增所述第二有效部分中的所述一种或多种第一扩增子以形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子中每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的所述初始引物嵌套在所述第一扩增子中。优选地，本发明的上述方面作为在流体封闭反应系统中的RT-nPCR来进行。
实现本发明方法的系统可以通过多种系统和设备来实现本发明的方法，所述系统和设备基于用来隔离试剂、将试剂和反应产物移入或移出反应、控制温度和检测反应产物的不同工程方法。系统的选择依赖于许多因素，包括但不限于样品或标本的可获得性、样品或标本的形式、样品或标本引起的危险或传染性的程度、便携的愿望、使用的扩增反应的性质等等。可以用来实现本发明方法的示例性系统包括流体封闭反应系统，其使用微处理器控制下的回转阀和活塞型流体泵，例如Christel等人的美国专利第6,369,893号和Dority的美国专利第6,374,684号所公开的；具有柔性试剂容器的封闭的一次性小管，用于机械地驱动样品、反应物和产物通过反应室和检测点，如Schnipelsky等人的美国专利第5,229,297号和Findlay等人，Clin.Chem.，391927-1933(1993)所公开的；以及微流装置，例如在定义部分引用的参考文献中所公开的，以及Shoji等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，4121-34(1993)和J.Micromech.Microeng.，4157-171(1994)；McCormick等人，Anal.Chem.，692626-2630(1997)；Cheng等人，Topics Curr.Chem.，194215-231(1998)；Stave等人，美国专利第6,663,833号；Neri等人，美国专利第5,714,380号；Northrup等人，美国专利第5,589,136号等等所进一步公开的。所述系统能够在容器和反应室之间以可控的方式以流体形式转移反应物、样品和产物。也就是，所述系统以直接的方式在液体动力作用下移动液体溶液中的反应物、样品、反应产物等等。液体动力包括通过各种泵或压缩气体容器、电磁泵等等所产生的压差。
一方面，可以通过Dority(上文已引用)中总体公开的回转阀、反应物及废料容器和反应室的特定设计和操作方法方便地实现本发明的方法。另一方面，当需要实时监测扩增产物时，所述设备方便地与Christel等人(上文已引用)公开的温度控制器和荧光计一起使用。如下文将要详细描述的，还可以使用Christel等人的设备以提供在Dority的流体封闭反应系统中启动第二阶段反应的闭环控制。
图2A-2I显示遵循Dority(上文引用)中公开的一般设计方法的设备的概略操作，该设备使得能够部分地清空反应室以在反应室中保留有效部分的第一反应混合物用作第二扩增反应的样品。通过电控制被活塞型泵置换的体积来实现所述部分清空。或者，如下文所述，可以通过反应室的其它设计来被动地进行反应室的部分清空，其中容器的“死体积”定义有效部分并且允许活塞型泵运行全冲程。
图2A显示包含回转阀(2002)的壳(2000)，该回转阀(2002)具有可操作地与活塞型泵(2006)相连的内室(2004)。泵(2006)的活塞(2056)的上行程使内室(2004)增压并且迫使流体内容物通过可能与容器等等相连的任何端口流出；类似地，泵(2006)的活塞(2056)的下行程使内室(2004)减压并且通过可能开放并与容器等等相连的任何端口吸入流体。Dority(上文已引用)提供了对所述泵-回转阀装置的操作和结构以及使用内室(2004)进行样品制备的更多描述，为此目的通过引用将其包括于此。回转阀(2002)具有多个端口，例如(2050)和(2052)，以及相关通道(2008)和(2012)，只要所述端口与通向所述容器或反应室(2042)的通道的相应端口对准，那么其允许内室(2004)与多个容器(下文更详细描述)或反应室(2042)流体相通。在该示例性实施方案中，所述相关通道的纵轴径向地置于回转阀(2002)的与回转阀(2002)的轴相垂直的一个或两个平面中(以虚线(2048)和(2049)表示)，以至于可以将内室(2004)设置成与通向置于壳(2000)中的容器等等的通道的端口流体相通。回转阀(2002)还包括连接通道(2010)，其允许所述阀的一个平面中的端口被置于与壳(2000)的端口流体相通，而该壳(2000)的端口与回转阀(2002)的另一个平面对准。所述连接通道(2010)不允许与内室(2004)流体相通。如图2A中所示，当所述连接通道(2020)在(2046)处对准通道(2044)和(2016)的端口时，通道(2044)和(2016)流体相通。类似地，当所述连接通道(2020)在(2038)处对准通道(2040)和(2036)的端口时，通道(2040)和(2036)流体相通。在图2A-2I和3A-3I中，壳(2000)中交叉的通道和容器位于回转阀(2002)的泵近侧平面，而非交叉的通道和容器位于泵远侧平面。如上所述，回转阀(2002)可以使内室(2004)与通过通道相连的、在回转阀(2002)在其中旋转的壳(2000)的基座中有端口的多种容器和反应室(2042)流体相通。在本实例中，所述容器包括以下(i)含有第一阶段扩增试剂的容器(2014)，其可以通过通道(2016)与回转阀(2002)以流体形式相连；(ii)含有例如用于破裂细胞样品的表面膜的溶解试剂的容器(2018)，其可以通过通道(2020)与回转阀(2002)以流体形式相连；(iii)含有样品或标本材料的容器(2022)，其可以通过通道(2024)与回转阀(2002)以流体形式相连；(iv)含有洗涤试剂的容器(2026)，其可以通过通道(2028)与回转阀(2002)以流体形式相连；(v)废料容器(2030)，其可以通过通道(2032)与回转阀(2002)以流体形式相连；以及(vi)含有第二阶段扩增试剂的容器(2034)，其可以通过通道(2036)与回转阀(2002)以流体形式相连。
图2B至2H说明图2A的设备用于在流体封闭条件下进行两阶段扩增反应的运转。为了说明回转阀(2002)的特定实施方案是如何运作的，图2B至2H中的每一幅均图解显示被划分成32个部分的回转阀(2002)，所述部分被编号。回转阀(2002)的每一编号部分毗邻的是壳(2000)的基座中的相应位置，其也被编号。编号32仅仅是反映回转阀(2002)在容器和室的复杂系统中提供互连以及其它能力的设计选择。在回转阀(2002)的起始位置，两套编码每一相邻部分的编号相同，如图2B所示。回转阀(2002)的某些编号(“内部编号”)以圆圈标出(1、5、14、28)，并且与回转阀(2002)相邻并在其之外的某些编号(“外部编号”)以圆圈标出(1、6、8、21、30、31)。圆圈表明通向各个容器和室的端口所在的部分。带有内部阴影的圆圈，例如5、6和8，表明位于回转阀(2002)的“泵近端”平面(2049)中的端口，而无阴影的圆圈，例如1、21、30和31，表明位于回转阀(2002)的“泵远端”平面(2048)中的端口。分别位于部分14和28的内部带点的圆圈(2126)和(2124)表明连接通道(2010)。在图2B中，回转阀(2002)以起始位置显示，其中阀的端口1(2108)对准壳(2000)的端口1使得样品容器(2022)与内室(2004)流体相通，可以在内室中进行样品制备过程。当泵(2006)下行时，通过由通道(2024)、端口(2106)和(2108)以及通道(2012)所限定的路径吸取样品以注入(2104)内室(2104)。可以如图2C和2D所示地进行清洗步骤。简而言之，在图2C中，旋转回转阀(2002)使得部分5的端口(2128)对准壳(2000)的端口6(2110)，使得当活塞(2056)下行时，容器(2026)中的洗涤溶液被吸取(2200)(和(2204))至内室(2004)中。通过旋转回转阀(2002)使得端口5(2128)对准壳(2000)的端口8，使得内室(2004)和废料容器(2030)流体相通，可以通过活塞(2056)的上行将内室(2004)中的洗涤溶液排出(2202)至废料容器(2030)中。
对于含有完整细胞的样品，可以向内室(2004)中加入溶解细胞表面膜的试剂以产生溶胞产物，可以根据需要进一步洗涤该溶胞产物。在图2D中，旋转回转阀(2002)使阀的端口1(2108)对准壳(2000)的端口31(2114)，由此使内室(2004)与容器(2018)流体相通。活塞(2056)的下行会将溶解试剂从容器(2018)吸取(2300)至内室中(2302)。在溶解试剂中孵育后，样品可任选地进一步洗涤，如上所述。在孵育后，或者在孵育和进一步洗涤后，旋转回转阀(2002)使端口1(2108)对准壳(2000)的通道(2016)(在部分30处)的端口，使得通过活塞(2056)的上行迫使内室(2004)中的溶胞产物通过端口1和30、通道(2016)进入容器(2014)，在其中其与第一阶段扩增试剂混合。没有进入通道(2044)的流动，因为在端口1和通道(2044)的端口之间没有流体形式的连接，因为一个位于回转阀(2002)的泵近端平面(图2A中的2049)，而另一个位于回转阀(2002)的泵远端平面(图2A中的2048)。在样品材料与第一阶段扩增试剂混合后，转移混合物至反应室(2042)中。如图2F中所示，可以通过旋转回转阀(2002)使得端口5(2128)对准与反应室(2042)流体相同的通道(2040)的端口以及使得连接通道14(2126)在部分30(2112)处对准通道(2026)和(2044)的端口。当活塞(2056)下行时，反应混合物通过通道(2106)、连接通道14和通道(2044)从容器(2014)被吸取(2500)至反应室(2042)中，在反应室(2042)中进行第一阶段扩增反应，例如使用如Christel等人(上文已引用)所教导的监测光学的实时PCR。依照另一实施方案，只简单地将第一阶段扩增试剂放置在反应室(2042)中以至于不需要第一反应物容器(2014)，并且以流体形式将样品材料转移至反应室中，在反应室中其与第一阶段扩增试剂混合以形成第一反应混合物。
在反应室中进行第一阶段扩增反应以产生第一扩增子。在停止第一阶段扩增反应并且(任选地)通过排空至废料容器(2030)将活塞(2056)带到接近回转阀(2002)后，可以通过活塞(2056)的部分下行将大部分反应混合物移出室(2042)，其中通过在计算机控制下进行活塞(2056)的下行来预先确定保留在反应室(2042)中的反应混合物(2600)的量。选择保留的量以有效进行多阶段反应的下一阶段；因此，可能需要常规实验来确定特定实施方案中的实际体积。在所述部分移出之后，如图2H中所示，旋转回转阀(2002)使得端口5(2128)对准通道(2044)的端口，并且使得连接通道在部分21(2504)处对准通道(2040)和(2036)的端口。按此结构，在含有第二阶段扩增试剂的容器(2034)和内室(2004)之间沿以下路径流体相通通道(2036)、连接通道28(2124)、通道(2040)、反应室(2042)和通道(2044)。当活塞(2056)下行时，第二阶段反应试剂从容器(2034)中被吸取(2700)并且进入反应室(2042)，在其中进行第二阶段扩增，有效部分的扩增子(2600)作为样品。
如图3A中所示，作为使用部分泵冲程以确定保留在反应室(2042)中用于第二阶段扩增的反应混合物(因此为有效部分)的体积的另一选择，可以通过使用含有预定大小的“死体积”的反应室(2042)来被动地控制体积。这可以通过沿反应室(2042)的壁移动通道(2040)的反应室端口至更高位置来实现此目的，使得当通过通道(2040)排出反应混合物时，反应混合物的一部分(2804)在反应室(2042)的底部(2805)留在室(2042)中。在要求可靠性的和不能容忍由于电元件或软件故障造成中断的应用中特别需要这样的被动控制。一方面，本发明提供具有死体积的反应室(2042)，该死体积用于收集有效部分的反应混合物作为第二阶段扩增反应的样品。或者，如图3B所示，可以向反应室加入例如保留壁的保留部件(2852)，而不改变通道(2040)的设计。在此实施方案中，当通过通道(2040)排出反应混合物而降低流体水平(2850)时，在反应室中保留一定体积(2858)(本文中称为“保留体积”)。未被保留部件(2852)保留的流体以流体形式通过通道(2040)被转移出反应室至废料室，直至除保留部件(2852)所保留的之外基本上没有流体保留在反应室中。
本发明的一方面，提供与本发明设备和方法一起使用的反应容器。图3C图解说明了所述反应容器的一个实施方案。最通常地，反应容器(2874)包含用于容纳诸如反应混合物的液体的反应室(2876)、通过入口管道(2882)连接到反应室(2876)的入口(2878)、通过出口管道(2884)连接到反应室(2876)的出口(2880)以及反应室(2876)中的保留部件(2852)，该保留部件(2852)被放置为当通过出口(2880)和出口管道(2884)排空反应室(2876)时，其保留一定体积的液体。在一实施方案中，反应容器(2874)包括限定反应室(2876)的侧壁的刚性框架(2900)，所述测壁包括侧壁(2886)和(2888)，其每一个均透光并且互相成角度地偏移，由此允许对反应室(2876)中的荧光指示剂进行照射以及收集由它们产生的荧光信号。在上文更充分描述的优选实施方案中，通过侧壁(2886)或(2888)中之一照射发光反应室(2876)中的荧光指示剂，并且通过另一侧壁(2886)或(2888)收集荧光信号。通过分别向所述框架的相对侧密封地附设第一和第二塑料膜(2870)和(2872)，从刚性框架(2900)形成流体密封的反应室(2876)。因此，当附设后，第一和第二塑料膜(2870)和(2872)分别形成反应室(2876)的第一和第二主要壁。优选地，塑料膜(2870)和(2872)具有足够的柔性以适应热表面，以允许足够的热传导用于精确调节室(2876)内的温度。反应室(2876)具有深度(进入图3C中附图的平面的维度)和宽度(2902)，其中在图解的实施方案中，宽度(2902)是反应室(2876)主要壁的表面区域的测量。所述反应容器的一方面，选择宽度(2902)和反应室(2876)的深度以使其具有大的表面-体积比，用于快速加热或冷却反应室(2876)的内容物。在一实施方案中，宽度(2902)和反应室(2876)的深度具有约41的比例且反应室的深度(2902)小于2mm。
内标经常需要比较来自不同测定的读出值，例如，当试图确定患者标本中测量的靶基因表达水平是否在正常范围内时。特别在医学应用中，经常需要将来自患者样品的测定结果与来自参照样品的测定结果进行比较。通过确定靶多核苷酸相关信号和来自同一样品的参照序列相关信号的比率，容易进行所述比较。这使得能够将靶多核苷酸的值与来自其它样品或标本的值相比较。内标，尤其是参照序列的使用和选择为本领域普通技术人员所公知，并且反映在以下参考文献中，通过引用将它们包括于本文Rasonic等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，313856-862(2004)；Bustin，J.Mol.Endoccrinol.，2923-39(2002)；Hoorfar等人，J.Clin.Microbiol.，421863-1968(2004)；等等。应当理解与参照序列相关的信号或值还可以是从多个参照序列测量的信号或值的函数，例如平均值。
本发明的一方面，通过以下方法来提供靶多核苷酸的所述相对值在第一阶段扩增反应中扩增参照序列和靶多核苷酸，在第二阶段扩增反应中只扩增靶多核苷酸的扩增子，并且形成比率，其每一个包含来自第二扩增反应中的靶多核苷酸的扩增子的信号对来自第一扩增反应中的参照序列的扩增子的信号。本发明的此方面特别适用于比较来自不同样品的很少或非常低水平的靶多核苷酸的水平。在这样的情况中，通常参照序列远比靶多核苷酸多；因此，如果两个序列都经历两个阶段的扩增，即使各自信号甚至轻微重叠，参照序列信号可能很容易压倒靶多核苷酸信号，有机荧光燃料的发光带就是如此。因此，在此方面的一个实施方案中，通过进行嵌套PCR来提供测量多个样品中靶多核苷酸的相对数量的方法，其中(i)在第一阶段PCR中但不在第二阶段PCR中扩增参照序列以及(ii)从以下两个测量的比值来确定靶多核苷酸的相对量来自第二阶段PCR中从靶多核苷酸产生的扩增子的荧光信号，和来自第一阶段PCR中从参照序列产生的扩增子的荧光信号。在一优选实施方案中，第一阶段和第二阶段反应均为实时PCR。在此方面的另一实施方案中，提供通过进行嵌套NASBA反应来测量多个样品中靶多核苷酸的相对量的方法，其中(i)在第一阶段NASBA中但不在第二阶段NASBA中扩增参照序列以及(ii)从以下两个测量的比值来确定靶多核苷酸的相对量来自第二阶段NASBA中从靶多核苷酸产生的扩增子的荧光信号，和来自第一阶段NASBA中从参照序列产生的扩增子的荧光信号。在一优选实施方案中，第一阶段和第二阶段反应均为实时NASBA反应。在以上描述的两个方法中，均可以通过监测第一阶段PCR或NASBA中的光信号来启动第二阶段反应。一方面，所述光信号提供了对参照序列或靶多核苷酸或二者的扩增子含量的测量。一方面，当所述光信号达到或超过为基线信号水平1.5至10倍范围内的预定水平时可以启动第二阶段反应。另一方面，当所述光信号达到或超过预定水平时可以启动第二阶段反应，该预定水平对应于参照序列的扩增子增长曲线的根或二阶导数。
内标或参照序列类型的选择依赖于被分析样品的性质。对于包括哺乳动物细胞或组织的样品，表1列出了示例性参照序列。
表1示例性参照序列
样品或标本制备用于本发明的含有靶多核苷酸的样品或标本可以来自多种来源，包括细胞培养物、动物或植物组织、患者活组织检查、环境样品等等。使用常规技术制备样品用于本发明的测定，所述技术通常依赖于取得样品或标本的来源。
收集样品或标本应最大程度地减小样品或标本被外源成分污染的机会或样品或标本污染周围环境的机会(如果其含有危险成分)。通常，通过将诸如组织、血液、唾液等等的用于分析的样品直接引入封闭流体系统中的收集室来进行。通常，可以通过将样品通过可密封的开口直接注射入样品收集室中来达到防止样品的交叉污染，所述开口例如为注射阀或隔膜。通常，优选注射阀以减少在样品注射期间或之后任何泄漏的潜在威胁。除上述之外，所述装置的样品收集部分还可以包括用于中和感染剂、稳定样品或标本、pH调节等等的试剂和/或处理。稳定和pH调节处理可以包括，例如，引入肝素以防止血液样品的凝集、加入缓冲剂、加入蛋白酶或核酸酶抑制剂、防腐剂等等。一般可以将所述试剂储存在所述装置的样品收集室中，或者可以储存在单独的可及的室中，其中当向所述装置中引入样品时可以加入所述试剂或与样品混合。根据使用的特定试剂的性质和稳定性，可以以液体或低压冻干的形式将这些试剂包括在所述装置中。
在对样品进行扩增反应之前，经常需要对样品进行一种或多种样品制备操作。通常，这些样品制备操作包括提取细胞内物质的操作，例如从完整细胞的样品、病毒等等中提取核酸。可以容易地将这些多种操作中的一种或多种包括到本发明设想的流体封闭系统中。
对于分析完整细胞、病毒或其它组织样品的那些实施方案，在继续多种样品制备操作之前，通常需要从细胞或病毒中提取核酸。因此，收集样品后，可以从收集的细胞、病毒外壳等等中释放核酸至粗提物中，然后进行其它处理以制备用于随后操作的样品，例如变性污染(DNA结合)蛋白、纯化、过滤、脱盐等等。通常可以通过化学、物理或电解溶解方法来进行从样品细胞或病毒中释放核酸以及DNA结合蛋白的变性。例如，化学方法通常使用溶解剂破坏细胞并且从细胞中提取核酸，然后通过用诸如异硫氰酸胍或脲的离液盐(chaotropic salt)处理提取物来变性任何污染和潜在干扰蛋白质。通常，使用化学提取和/或变性方法时，可以将适当的试剂包括在作为单独的可及的室的样品制备室中，或者可以从外部加入。
可以使用物理方法来提取核酸和变性DNA结合蛋白质。Wilding等人的美国专利第5,304,487号讨论了使用在显微管道内的物理突出物或在室或管道中的边缘锋利的颗粒来刺穿膜且提取它们的内容物，为了所有目的通过引用将所述专利整体包括于此。所述结构和用于振荡的压电元件的组合能够提供用于溶解的合适剪切力。下文关于核酸破碎的部分更加详细地描述所述元件。还可以使用更加传统的细胞提取方法，例如，使用具有受限横截面大小的通道，其当样品以足够的流动压力通过该通道时造成细胞溶解。或者，可以通过向样品施加交流电流来进行细胞提取和污染蛋白质的变性。更具体地，当对流体流动横向施加交流电流时，使细胞样品流过显微管阵列。可以在本发明的装置中使用各种其它方法来进行细胞溶解/提取，例如包括使细胞经受超声振荡，或者迫使细胞通过小孔，由此使细胞接受高剪切压力而造成破裂。
提取后，经常需要将核酸与粗提物中的诸如变性蛋白质、细胞膜颗粒、盐等等的其它成分分离。通常通过过滤、絮凝等等来完成除去颗粒物质。可以容易地将多种过滤器类型包括在所述装置中。此外，当使用化学变性方法时，可能需要在继续下一步骤之前使样品脱盐。一般可以在同一步骤中进行样品的脱盐和核酸的分离，例如，通过将核酸结合到固定相上并且洗去污染盐类或对样品进行凝胶过滤层析、使盐类通过透析膜等等。用于核酸结合的合适固体支持物例如包括硅藻土、硅石(即玻璃绒)等等。还可以将也为本领域公知的合适的凝胶排阻介质包括到本发明的装置中，所述凝胶排阻介质可以从例如Pharmacia和Sigma Chemical购得。
可以在额外的室中进行所述分离和/或凝胶过滤/脱盐，或者，可以将特定层析介质包括在通向随后反应室的管道或流体通道中。或者，一个或多个流体通道或室的内表面自身可以被衍生以提供适合所需纯化的官能团，例如，带电基团、亲和结合基团等等，即用于mRNA纯化的多聚T寡核苷酸。或者，脱盐方法一般可以利用DNA与其它成分相比较高的电泳淌度和负电荷。电泳方法还可以被用在从其它细胞污染物和碎片中纯化核酸中。在一个例子中，所述装置的分离管道或室与两个单独的在其中放置有诸如铂电极的电极的“场”管道或室流体相通。使用适当屏障或“俘获膜”将所述两个场管道与分离管道分开，所述屏障或“俘获膜”允许电流通过而不允许核酸或其它大分子通过。所述屏障一般具有两个基本功能第一，该屏障用来将向正极迁移的核酸保留在分离室中；以及第二，该屏障防止电极处与电解相关的副作用进入反应室(例如，作为盐接界(salt junction))。所示屏障例如可以包括透析膜、稠密胶(densegel)、PEI滤器或其它合适材料。一旦施加适当电场，样品中的核酸将会向正电极迁移并且被俘获膜捕获。样品杂质不与膜结合，然后通过使用适当的流体流被从容器中洗去。一旦电压逆转，核酸以显著更纯的形式从膜上释放。场通道可以被设置在分离室或通道的相同或相对侧或末端，还可以与本文中描述的混合元件联合使用，以保证操作的最大效率。此外，还可以在屏障上覆盖粗过滤器以防止屏障被颗粒物质、蛋白质或核酸淤塞，由此使得能够重复使用。在类似方面，核酸的高电泳淌度及其负电荷可以被用来从污染物中分离核酸，该分离通过使用短的凝胶柱或其它适当基质或凝胶来进行，它们减慢或拖延其它污染物的流动而允许更快的核酸通过。
对于许多应用，可能需要从细胞、细胞碎片和其它污染物中提取和分离信使RNA。因此，在一些情况中，本发明的系统可以包括mRNA纯化室或管道。通常，所述纯化利用mRNA的多聚A尾部。具体地，如上所述可以将多聚T寡核苷酸固定在所述装置的室或管道之内作为mRNA的亲和配体。可以将多聚T寡核苷酸固定在被包括在室或管道之内的固体支持物上，或者，可以被固定在室或管道本身的表面上。
在一些应用中，例如测量来自患者血液的稀少转移细胞中的靶多核苷酸，可以在进行分析之前进行富集步骤，例如通过免疫磁分离。可以使用诸如在以下代表性参考文献中公开的多种本领域已知的技术和材料来进行所述分离或富集，通过引用将所述文献包括于此Terstappen等人，美国专利第6,365,362号；Terstappen等人，美国专利第5,646,001号；Rohr等人，美国专利第5,998,224号；Kausch等人，美国专利第5,665,582号；Kresse等人，美国专利第6,048,515号；Kausch等人，美国专利第5,508,164号；Miltenyi等人，美国专利第5,691,208号；Molday，美国专利第4,452,773号；Kronick，美国专利第4,375,407号；Radbiruch等人，第23章，Methodsin Cell Biology(细胞生物学方法)，Vol，42(Academic Press，New York，1994)；Uhlen等人，Advances in Biomagnetic Separation(生物磁分离进展)(Eaton Publishing，Natick，1994)；Safarik等人，J.Chromatography B，72233-53(1999)；Miltenyi等人，Cytometry，11231-238(1990)；Nakamura等人，Biotechnol.Prog.，171145-1155(2001)；Moreno等人，Urology，58386-392(2001)；Racila等人，Proc.Natl.Acad.ScL，954589-4594(1998)；Zigeuner等人，J.Urology，169701-705(2003)；Ghossein等人，Seminarsin Surgical Oncology，20304-311(2001)。
用来实施本发明的优选磁性颗粒是具有胶体行为的颗粒。这些颗粒的特征为它们的亚微米粒度，其通常小于约200纳米(nm)(0.20微米)，以及这些颗粒对从溶液中重力分离的长时间稳定性。除许多其它优点外，此大小范围使得它们对于常规应用于细胞分析的分析技术来说基本上不可见。考虑在本发明中使用90-150nm范围内且具有70-90％磁性物质的颗粒。合适的磁性颗粒由被分子包围的超顺磁材料的晶体核组成，所述分子通过例如物理吸附或共价结合与磁性核结合并且赋予稳定胶体特性。应当优选以有效防止样品中生物大分子和磁性核之间的非特异性相互作用的量来使用包被材料。所述生物大分子可以包括非靶细胞表面的唾液酸残基、凝集素、糖蛋白以及其它膜成分。此外，所述材料应当含有尽可能多的磁性物质/纳米颗粒。构成核的磁性晶体的尺寸足够小以使得它们不含有完整的磁畴。纳米颗粒的尺寸足够小使得它们的布朗能超过它们的磁矩。结果，甚至在中等强度的磁场中也不发生这些胶体磁性颗粒的北极、南极排列和随后的相互吸引/排斥，对它们的溶液稳定性作出贡献。最后，应当能够在高磁性梯度外部场分离器中分离所述磁性颗粒。该特征有助于样品处理且提供相对于装有铁磁珠或钢棉的更加复杂的内部梯度柱的经济优势。具有上述特征的磁性颗粒可以通过修饰原材料来制备，如美国专利第4,795,698号、第5,597,531号和第5,698,271号中描述的，通过引用将所述专利包括于此。
如上所述，可以从广泛的来源取得用于使用本发明检测或定量靶多核苷酸的样品或标本。示例性靶多核苷酸包括但不限于来自病毒、细菌、真菌、原生动物和哺乳动物的核酸。特别地，哺乳动物核酸包括癌症基因，例如p53、ATP、Her 1(EGFR)、BCR-ABL、PTEN、BRAF、BRCA1、Grb7、拓扑异构酶IIα等等。表II列出了含有可以检测和/或定量的示例性病毒和细菌。对于本领域普通技术人员，从表II的有机体中选择靶多核苷酸是常规设计选择。
表II示例性病毒和细菌
权利要求
1.控制嵌套扩增反应的方法，所述方法包括如下步骤在第一阶段扩增反应中，在反应混合物中存在有荧光指示剂情况下扩增靶多核苷酸，所述荧光指示剂能够产生与所述第一阶段扩增反应中的扩增子的数量相关的光信号；监测所述第一阶段扩增反应中的荧光指示剂的光信号；以及当所述光信号达到或超过阈水平时，自动分离有效部分的所述第一阶段扩增反应的反应混合物，并且启动第二阶段扩增反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一阶段扩增反应的反应混合物处于流体封闭反应系统的第一反应室中，并且其中所述自动分离步骤包括以流体形式将所述有效部分的所述第一阶段反应混合物转移至第二反应室。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一阶段扩增反应的所述反应混合物处于流体封闭反应系统的第一反应室中，并且其中所述自动分离步骤包括，除了保留在所述第一反应室中的有效部分外，以流体形式将所述第一阶段反应混合物转移至废料容器。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一反应室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得当所述第一阶段反应混合物以流体形式通过所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述第一阶段反应混合物被保留在所述第一反应室中所述出口之下。
5.如权利要求4所述的方法，其中保留在所述第一反应室中的所述体积包括所述有效部分。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少1分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述反应混合物具有一定体积并且其中所述有效部分是所述反应混合物的体积百分比，所述百分比选自0.5％至10％的范围。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述阈水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1.5至25的范围。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述阈水平对应由所述光信号确定的增长曲线的最大、最小或零值。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述荧光指示剂选自特异结合双链DNA的插入染料或者包含特异结合扩增产物的寡核苷酸部分。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述扩增子通过在所述第一阶段扩增反应中扩增参照序列而产生。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述扩增子通过在所述第一阶段扩增反应中扩增靶多核苷酸而产生。
14.检测样品中是否存在一种或多种靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤在流体封闭反应系统中，使用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中从样品扩增一种或多种靶多核苷酸，以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一靶多核苷酸的初始引物；在所述流体封闭反应系统中分离有效部分的所述第一阶段反应混合物；在所述流体封闭系统中，使用第二阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增所述有效部分中的一种或多种第一扩增子以形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的初始引物均嵌套在所述第一扩增子中；以及检测所述一种或多种第二扩增子以确定所述样品中是否存在所述一种或多种靶多核苷酸。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述第一反应混合物处于流体封闭反应系统的第一反应室中，并且其中所述分离步骤包括以流体形式将所述有效部分的所述第一反应混合物转移至第二反应室。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述第一反应混合物处于流体封闭反应系统的第一反应室中，并且其中所述分离步骤包括，除了保留在所述第一反应室中的有效部分外，以流体形式将所述第一反应混合物转移至废料容器。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述第一反应室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得当所述第一阶段反应混合物以流体形式通过所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述第一阶段反应混合物被保留在所述第一反应室中所述出口之下。
18.如权利要求17所述的方法，其中保留在所述第一反应室中的所述体积包括所述有效部分。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少1分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述反应混合物具有一定体积并且其中所述有效部分是所述反应混合物的体积百分比，所述百分比选自0.5％至10％的范围。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述分离步骤包括以下步骤监测来自与所述第一反应混合物中所述一种或多种扩增子的一种相关的荧光指示剂的光信号，所述光信号与所述扩增子的数量单一相关；以及当所述光信号等于或高于预定水平时自动分离所述有效部分的所述第一反应混合物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述预定水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1.5至25的范围。
24.如权利要求16至23中任一权利要求所述的方法，其中所述第一阶段扩增试剂和所述第二阶段扩增试剂包括用于进行聚合酶链式反应或NASBA反应的试剂。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述荧光指示剂选自特异结合双链DNA的插入染料或者包含特异结合所述第一反应混合物中的扩增产物的寡核苷酸部分。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种扩增子的所述一种通过在所述第一扩增反应混合物中扩增参照序列而产生。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述流体封闭反应系统是微流装置。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述流体封闭反应系统包括反应室，其与含有所述样品的样品容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通，每一所述容器均为流体封闭的；以及与回转阀可操作地连接的泵，用于将所述样品和所述第一阶段扩增试剂以流体形式转移至所述反应室，用于当所述光信号等于或高于所述预定水平时自动分离所述有效部分的所述第一反应混合物；以及用于将所述第二阶段扩增试剂以流体形式转移至所述反应室用于扩增所述有效部分中的所述一种或多种第一扩增子。
29.检测样品中是否存在一种或多种靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤提供反应室，所述反应室与废料容器、含有样品的样品容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通，每一所述容器均为流体封闭的；以及将样品从所述样品容器以及将第一阶段扩增试剂从所述第一反应物容器以流体形式转移至所述反应室，以使得当所述样品中存在靶多核苷酸时所述第一阶段扩增试剂与所述样品在扩增反应中反应，以产生含有第一扩增子的反应产物；除了保留在所述反应室中的有效部分外，以流体形式将所述反应产物转移至所述废料容器；将第二阶段扩增试剂从所述第二反应物容器中以流体形式转移至所述反应室，以使得当所述反应产物中存在所述第一扩增子时所述第二阶段扩增试剂与所述有效部分的所述反应产物在扩增反应中反应，以产生第二扩增子；以及检测所述第二扩增子以确定所述样品中是否存在所述靶多核苷酸。
30.如权利要求29所述的方法，其中使用所述第一阶段扩增试剂的所述扩增反应是进行预定循环次数的聚合酶链式反应，并且其中在所述扩增反应的预定循环次数之后执行所述以流体形式转移所述反应产物的所述步骤。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述扩增反应的所述预定循环次数在20至50的范围内。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述以流体形式转移所述反应产物的步骤包括以下步骤监测来自与所述第一扩增子相关的荧光指示剂的光信号，所述光信号与所述第一扩增子的数量单一相关；并且当所述光信号等于或高于预定水平时自动分离所述有效部分的所述反应产物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述反应产物具有一定体积并且其中所述有效部分是所述反应产物的体积百分比，所述百分比选自0.5％至10％的范围。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述预定水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1.5至25的范围。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述扩增反应各自是聚合酶链式反应或NASBA反应。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述荧光指示剂选自特异结合双链DNA的插入染料或者包含特异结合扩增产物的寡核苷酸部分。
37.确定样品中一种或多种靶多核苷酸的相对量的方法，所述方法包括以下步骤在第一扩增反应中，扩增所述样品中所述一种或多种靶多核苷酸以及至少一种参照序列，以形成包括每一种靶多核苷酸和参照序列的第一扩增子的第一反应产物，所述第一扩增反应包括针对每一种靶多核苷酸和参照序列的初始引物；在第二扩增反应中，从有效部分的所述第一反应产物扩增所述一种或多种靶多核苷酸的第一扩增子，以形成每一种第一扩增子的第二扩增子，所述第二扩增反应包括针对每一种靶多核苷酸的次级引物，使得每一种第一扩增子的每一种次级引物相对于其所述初始引物嵌套在所述第一扩增子中；以及将所述第二扩增反应的第二扩增子与所述第一扩增反应中的所述至少一种参照序列的扩增子进行比较，以确定所述样品中所述一种或多种靶多核苷酸的相对量。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述第一扩增反应和所述第二扩增反应在流体封闭反应系统中进行。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述第一扩增反应和所述第二扩增反应各自是实时扩增反应。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述第二扩增反应中的所述扩增步骤包括以下步骤监测来自与至少一种所述第一扩增子相关的荧光指示剂的光信号，所述光信号与这种第一扩增子的数量单一相关；并且当所述光信号等于或高于预定水平时自动分离所述有效部分的所述反应产物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述反应产物具有一定体积并且其中所述有效部分是所述反应产物的体积百分比，所述百分比选自0.5％至10％的范围。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述预定水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1.5至25的范围。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述扩增反应各自是聚合酶链式反应或NASBA反应。
44.用于进行嵌套扩增反应的流体封闭反应系统，所述系统包括反应室，其与样品容器、废料容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通，每一所述容器均为流体封闭的；以及与回转阀可操作地连接的泵，用于以流体形式将所述样品容器中的样品和所述第一阶段扩增试剂转移至所述反应室，在其中进行第一扩增反应以在反应混合物中形成的一种或多种第一扩增子；用于分离有效部分的所述反应混合物；并且用于以流体形式将所述第二阶段扩增试剂和所述有效部分转移至所述反应室，在其中进行第二扩增以形成一种或多种第二扩增子。
45.如权利要求44所述的流体封闭反应系统，其中当所述泵分离所述有效部分的所述反应混合物时，除保留在所述反应容器中的所述有效部分外，所述反应混合物以流体形式被转移至废料容器。
46.如权利要求45所述的流体封闭反应系统，其中所述反应室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得当所述反应混合物以流体形式通过所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述反应混合物被保留在所述第一反应室中所述出口之下，其中所述体积包括所述有效部分。
47.权利要求46所述的流体封闭反应系统，还包括与所述反应室可操作地连接的一个或多个检测器，用于收集来自与至少一种所述第一扩增子相关的一种或多种荧光指示剂的一个或多个光信号，所述一个或多个光信号的每一个均与所述第一扩增子的一种的数量单一相关。
48.权利要求47所述的流体封闭反应系统，还包括与所述泵、所述回转阀和所述一个或多个检测器可操作地连接的微处理器，用于监测所述一个或多个光信号的值和用于当至少一个所述光信号等于或高于预定水平时驱动所述泵和所述回转阀以分离有效部分的所述反应混合物。
49.反应容器，其包括用于容纳液体的反应室；通过入口管道与所述反应室相连的入口；通过出口管道与反应室相连的出口；以及所述反应室中的保留部件，所述保留部件被设置成当其余的所述液体通过所述出口管道被移出所述反应室时将一定体积的所述液体保留在所述反应室中。
50.如权利要求49所述的反应容器，其中所述反应容器还包括限定所述反应容器侧壁的刚性框架；以及附设到所述刚性框架相对侧的第一和第二聚合物膜，以形成所述反应室的相对的主要壁。
51.如权利要求50所述的反应容器，其中每一所述主要壁足够柔软以适应各自的热表面。
52.如权利要求50所述的反应容器，其中至少两个所述侧壁是透光的并且相互成角度地偏移。
53.如权利要求49所述的反应容器，其中所述反应室具有如下的宽度和深度，所述反应室的深度和宽度具有至少4∶1的比例，并且其中所述反应室的深度小于2mm。
54.用于进行多阶段反应的设备，所述设备包括在其中至少形成有第一和第二管道的本体；以及从所述本体延伸出的反应容器，所述反应容器包括用于容纳液体的反应室；通过入口管道与所述反应室连接的入口；通过出口管道与所述反应室连接的出口；以及所述反应室中的保留部件，所述保留部件被设置成当其余的所述液体通过所述出口管道移出所述反应室时将一定体积的所述液体保留在所述反应室中，其中所述容器的入口连接到所述本体的第一通道，并且所述容器的出口连接到所述本体的第二通道。
55.如权利要求54所述的设备，其中所述本体还包括与所述第二管道流体相通的通风口，用于当所述液体通过所述入口和所述第一管道进入所述反应室时从所述第二管道通风。
56.权利要求54所述的设备，还包括用于迫使所述本体的所述第一管道中的液体流过所述反应容器的所述入口进入所述反应室的压差源。
57.计算机可读产品，其包含由计算机运行以控制嵌套扩增反应进行的程序，所述程序包括指令，用于(a)读取来自第一阶段扩增反应的光信号的值，所述光信号与所述第一阶段扩增反应中扩增子的浓度单一相关，并且所述光信号的值具有最新值；(b)从所述光信号的值确定基线信号水平；(c)从所述光信号的值计算预定水平；(d)将所述预定值与所述光信号的最新值进行比较；(e)当所述光信号的最新值等于或高于所述预定水平时，启动第二阶段扩增反应；以及(f)重复步骤(d)和(e)直至所述第二阶段扩增反应启动。
58.如权利要求57所述的计算机可读产品，其中所述计算所述预定水平的步骤包括将所述基线信号水平乘以选自1.5至25的范围的系数以获得所述预定水平，或者计算来自所述光学信号的所述值的扩增子增长曲线的特征性值以获得所述预定值。
59.如权利要求58所述的计算机可读产品，其中所述第一阶段扩增反应和所述第二阶段扩增反应各自是聚合酶链式反应或者各自是NASBA反应。
60.如权利要求59所述的计算机可读产品，其中所述嵌套扩增反应在流体封闭反应系统中进行，并且其中所述启动所述第二阶段扩增反应的步骤包括产生指令，所述指令用于在所述流体封闭反应系统中分离有效部分的所述第一阶段扩增反应的反应混合物，以及用于在所述流体封闭反应系统中混合所述有效部分和所述第二阶段扩增反应的反应物。
61.扩增样品中一种或多种靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤在流体封闭反应系统中，使用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中从所述样品扩增一种或多种靶多核苷酸以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对对每一种靶多核苷酸的第一引物；在所述流体封闭反应系统中分离有效部分的所述第一反应混合物；以及在所述流体封闭反应系统中，使用第二阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增所述有效部分中的所述一种或多种第一扩增子以形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的第一引物均嵌套在所述第一扩增子中。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述第一反应混合物处于流体封闭反应系统的第一反应室中，并且其中所述分离步骤包括，除了保留在所述第一反应室中的有效部分外，以流体形式将所述第一阶段反应混合物转移至废料容器。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述第一反应室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得当所述第一阶段反应混合物以流体形式通过所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述第一阶段反应混合物被保留在所述第一反应室中所述出口之下。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述保留在所述第一反应室中的体积包括所述有效部分。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少1分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述反应混合物具有一定体积并且其中所述有效部分是所述反应混合物的体积百分比，所述百分比选自0.5％至10％的范围。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述分离步骤包括以下步骤监测来自与所述第一反应混合物中的所述一种或多种扩增子之一相关的荧光指示剂的光信号，所述光信号与所述扩增子的数量单一相关；并且当所述光信号等于或高于预定水平时自动分离所述有效部分的所述第一反应混合物。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述预定水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1.5至25的范围。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述第一阶段扩增试剂和所述第二阶段扩增试剂包括用于进行聚合酶链式反应或NASBA反应的试剂。
71.扩增一种或多种RNA序列的方法，所述方法包括以下步骤在流体封闭反应系统中，使用逆转录酶试剂在第一反应混合物中转录一种或多种RNA序列以形成一种或多种互补单链DNA序列；在所述流体封闭反应系统中分离第一有效部分的所述第一反应混合物；以及在所述流体封闭反应系统中，使用第一阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增所述第一有效部分中的所述一种或多种互补单链DNA序列以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对所述互补单链DNA序列每一种的初始引物。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述第一反应混合物处于所述流体封闭反应系统的反应室中，并且其中所述分离所述第一有效部分的步骤包括，除了保留在所述反应室中的所述第一有效部分外，以流体形式将所述第一阶段反应混合物转移至废料容器。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述第一反应室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得当所述第一阶段反应混合物以流体形式通过所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述第一阶段反应混合物被保留在所述反应室中所述出口之下，其中所述保留体积包括所述第一有效部分。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述第一反应混合物具有一定体积并且其中所述有效部分是所述第一反应混合物的体积百分比，所述百分比选自0.5％至20％的范围。
75.如权利要求74所述的方法，还包括步骤在所述流体封闭反应系统中分离第二有效部分的所述第二反应混合物的；在所述流体封闭反应系统中，使用第二阶段扩增试剂在第三反应混合物中扩增所述第二有效部分中的所述一种或多种第一扩增子以形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对每一种所述一种或多种第一扩增子的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的所述初始引物均嵌套在所述第一扩增子中。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述第二反应混合物处于所述流体封闭反应系统的所述反应室中，并且其中所述分离所述第二有效部分的步骤包括，除了保留在所述反应室中的所述第二有效部分外，以流体形式将所述第二反应混合物转移至所述废料容器。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述第二反应混合物通过所述出口以流体形式被转移至所述废料容器，所述第二反应混合物的所述保留体积被保留在所述反应室中所述出口之下，其中所述保留体积包括所述第二有效部分。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述第二反应混合物具有一定体积并且其中所述第二有效部分是所述第二反应混合物的体积百分比，所述百分比选自0.5％至20％的范围。
79.计算机可读产品，其包含由计算机运行以控制嵌套扩增反应进行的程序，所述程序包括指令，用于(a)读取来自第一阶段扩增反应的光信号的值，所述光信号与所述第一阶段扩增反应中扩增子的数量或浓度单一相关；(b)从所述光信号的值确定是否超过阀值；(c)如果超过阀值，启动第二阶段扩增反应。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述确定是否超过阀值的步骤包括确定所述光信号的一个或多个值是否超过基于噪声的、用户定义的或默认的阀值水平。
81.如权利要求79所述的方法，其中所述确定是否超过阀值的步骤包括确定由所述光信号的值确定的增长曲线的导数是否是最大值、最小值或零。
82.如权利要求79所述的计算机可读产品，其中所述嵌套扩增反应在流体封闭反应系统中进行，并且其中所述启动所述第二阶段扩增反应的步骤包括产生指令，所述指令用于在所述流体封闭反应系统中分离有效部分的所述第一阶段扩增反应的反应混合物，以及用于在所述流体封闭反应系统中混合所述有效部分和所述第二阶段扩增反应的反应物。
83.检测样品中是否存在一种或多种靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤提供含有第一阶段扩增试剂的反应室，所述反应室与废料容器、含有样品的样品容器、以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通，每一个所述容器均为流体封闭的；将样品从所述样品容器以流体形式转移至所述反应室，以使得当所述样品中存在靶多核苷酸时使所述第一阶段扩增试剂与所述样品在扩增反应中反应以产生第一反应产物；除了保留在所述反应室中的有效部分的所述第一反应产物之外，以流体形式将所述第一反应产物转移至所述废料容器；将所述第二阶段扩增试剂从所述第二反应物容器中以流体形式转移至所述反应室，以使得当所述第一反应产物中存在所述第一扩增子时使所述第二阶段扩增试剂与所述有效部分的第一反应产物在扩增反应中反应以产生第二扩增子；以及检测所述第二扩增子以确定所述样品中是否存在所述靶多核苷酸。
全文摘要
本发明涉及用于进行多阶段扩增反应的系统、方法和设备，特别是在流体封闭条件下。一方面，本发明的方法在流体封闭反应系统中进行，所述系统使得能够分离一部分的第一(或在前)反应混合物，并且将其用作第二(或随后)反应混合物中的样品或标本，由此基本上避免仅简单地将两种反应混合物混合在一起时第一反应组分对第二反应可能造成的干扰影响。在该方面，可以将本发明的系统、方法和设备用于任何扩增反应，该扩增反应允许基于使用嵌套引物的多阶段扩增。
文档编号A21C3/04GK101068932SQ200580041553
公开日2007年11月7日 申请日期2005年10月27日 优先权日2004年10月27日
发明者罗纳德·常, 耶苏·陈, 道格拉斯·布莱恩·多利, 张建平, 詹姆士·建·全·王, 温迪·文凯·王, 肯德拉·拉腊·保罗, 鲁埃尔·凡·阿塔 申请人:塞弗德公司