专利名称：腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种腺苷脱氮酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定 腺苷脱氨酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。 疼豕孜不
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关 系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，
脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝 硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。
腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化
法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是
腺苷(白色结晶粉末)+水(H20 )腺苷脱氨酶肌苷(Inosine ) + 氨离子(MC)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因 此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大 小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用 专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。
检索发现，申请号为03128092.7 、申请日为2003.05.29 、名称 为《一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法》的中国专利申请公开了应 用酶反应产物氧化型烟酰氨辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法 测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰氨辅酶或其类似物，而 加入其反应产物氧化型烟酰氨辅酶或其类似物，及其相应的生成还原 型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环 还原为还原型烟酰氨辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰氨辅酶 或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定 样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。该发明的特点在于为腺苷 脱氨酶的测试提供一个内源合成腺苷脱氨酶反应所需要的还原型烟酰 氨辅酶的腺苷脱氨酶试剂。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需 要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分腺苷脱氨酶试剂(腺苷 脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应必定将还原型烟酰氨辅酶氧化成氧化型 烟酰氨辅酶)的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二 是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够 的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带 来很大的不便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法
(Enzymatic Recycling Method)、酶比色 去(Enzymatic Colorimetric
Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成
吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导
致在400—700nm波长处吸光度的上升，得以测定腺苷脱氨酶活性浓
度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断
试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分
析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、
准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明腺苷脱氨酶活性浓度测定方法原理如下 腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子
氨离子+ oc-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸
+辅酶+水
谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨离子+ a-酮戊二酸+
过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水 这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)将腺
苷酶解产生氨。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC 1.4丄3或 EC 1.4丄4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)
使氨不断地被重复循环利用，并同时不断地循环扩增产出过氧化氢。
过氧化物酶将过氧化氢与还原型色原体组合作用，最终将无色的还 原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器， 在400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染 料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)， 含量高低的光吸收大小，通过测量400^700mn (根据还原型色原体组 合的不同而定)处吸光度上升的速度，得出腺苷脱氨酶活性浓度大小 测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，如下成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂盒较为理想 缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酸脱氢酶 100000 U/L
谷氨酸氧化酶
a-酮戊二酸 过氧化物酶
8000 U/L 16 mmol/L 30000 U/L
还原型色原体组合A 6mmol/L 抗干扰剂 30 mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任-
个组合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基^^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-齊基苯胺
4- 氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
1^乙基~~>^- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2.4- 双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3.5- 双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的腺苷脱氨酶活性诊断试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、Ot-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸 氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、(X-酮戊二酸、还原型辅酶、过氧化物酶、还 原型色原体组合、抗干扰剂。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。
a-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧 化物酶、还原型色原体组合在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶。 试剂2 缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。
ot-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧
化物酶、还原型色原体组合在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以 不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液体试剂，直接使用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明,
实施例-
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂 还原型辅f
谷氨酸氧化酶
a-酮戊二酸
过氧化物酶
4-氨基抗砒
石碳酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L 150000U/L 謹0 U/L 16 mmol/L 30000 U/L 2 mmol/L 10 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，测
试主波长505nm,测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为 1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间 大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于 生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出腺 苷脱氨酶活性的浓度大小。 实施例二
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 a-酮戊二酸 过氧化物酶
2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
谷氨酸脱氢酶 120000 U/L
谷氨酸氧化酶 8000 U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用，
14
0.25 mmol/L 16 mmol/L 30000 U/L 0.2 mmol/L
在全自动生化分析仪上设定温度37。C,反应时间10分钟，测试 主波长546nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为1/20，
反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约l 分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱 氨酶活性的浓度大小。
实施例三腺苷脱氨酶诊断试剂为三试剂，包括-试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
还原型辅酶
a-酮戊二酸
50 mmol/L
0.25 mmol/L
16 mmol/L
-甲基-2-苯噻唑酮腙
0.6 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
过氧化物酶
双甲基苯胺
50 mmol/L 40000 U/L 2 mmol/L
试剂
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
50 mmol/L
100000U/L
谷氨酸氧化酶 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，测试 主波长578nm，测试副波长660nm，被测样品与试剂的体积比例为1/30, 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约l 分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于 生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出腺 苷脱氨酶活性的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好。
权利要求
1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的腺苷脱氨酶活性浓度测定方法，其方法原理如下腺苷+水 腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸+辅酶+水谷氨酸+水+氧 谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出腺苷脱氨酶活性浓度大小测定结果。腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)作为作用酶，功能为将腺苷酶解产生氨。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶，将氨不断地被重复循环利用，并同时不断地扩增产生过氧化氢。过氧化物酶作为显色酶，将过氧化氢与还原型色原体组合作用发生显色反应。
2. —种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L 稳定剂1- 50mmol/L 还原型辅酶0.1-0.35 mmol/L 谷氨酸脱氢酶 2000——500000 U/L谷氨酸氧化酶0.1-20mmol/L a-酮戊二酸 2-20 mmol/L 过氧化物酶500——500000 还原型色原体组合 0.1-20mmol/L抗干扰剂 1-50 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、过氧化物 酶(EC1.11丄7)、还原型色原体组合及抗千扰剂组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1,2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、过氧化物 酶(EC1.11丄7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成双剂试剂；试 剂l，由缓冲液、稳定剂、ot-酮戊二酸、还原型辅酶、过氧化物酶、 还原型色原体组合及抗干扰剂组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶及抗干扰剂组成。oc-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶 (glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、过氧化物酶(EC1.11丄7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱 氢酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原 体组合及抗干扰剂组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化 酶组成。a-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、 过氧化物酶及抗干扰剂在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不 限。
6. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂14000 mmol/L或0.1%-100°/。体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2'-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基-"N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2.4- 双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒3.5- 双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2'-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本发明涉及一种酶循环扩增法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、腺苷、α-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、稳定剂及抗干扰剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出腺苷脱氨酶活性浓度的大小。
文档编号C12Q1/25GK101096700SQ20061008557
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月26日 优先权日2006年6月26日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司