专利名称：一种壳聚糖纳米纤维复合膜固定化酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖纳米纤维复合膜用于固定化酶的技术。
背景技术：
酶是由活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊蛋白质，它能特定地促成某个化学反应而本身却不参加反应，具有反应效率高、条件温和、反应产物污染小、能耗低、反应容易控制等特点，因此得到广泛的应用。但其在酸、碱、热及有机溶液等条件下易发生酶蛋白的变性，从而使酶活性降低或丧失，而且酶反应多在溶液中进行，反应完成后不易回收，反应产物分离提纯困难，且难以实现工业上的连续化、自动化生产，因此酶工程的应用发展受到了很大的限制，固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段。研究表明，虽然固定化酶能提高酶的稳定性，但与自由酶相比，固定化酶的生物活性均有所下降。其中，酶的失活部分源于载体材料表面与酶蛋白分子非生物特异性相互作用所导致的变异。由于大多数酶均是从细胞中分离出的蛋白质，在酶蛋白经固定化以后，酶与载体之间的一些非生物特异性相互作用改变了其结构和微环境，从而导致固定化酶活性有所降低甚至失活。因此，一些天然的物质如壳聚糖，由于其具有良好的生物相容性而被广泛地用作酶固定化载体。可将壳聚糖制成各种结构形态的载体材料，如薄膜、多孔膜和多孔微球等用于酶的固定化。[1]Amorim RVS，Melo ES，Carneiro-da-Cunha MG，Ledingham WM，Campos-Takaki GM.Chitosan from syncephalastrum racemosum used as a film support for lipaseimmobilization.Bioresource Technol 2003，8935-39；[2]Tan TW，Wang F，Zhang H.Preparationof PVA/chitosan lipase membrane reactor and its application in synthesis of monoglyceride.J MolCatal B-Enzym 2002，18325-331；[3]Pereira EB，De Castro HF，De Moraes FF，Zanin GM.Kinetic studies oflipase from Candida rugosa-A comparative study between free and immobilizedenzyme onto porous chitosan beads.Appl Biochem Biotech 2001，91739-752；[4]Magnin D，Dumitriu S，Magny P，Chornet E.Lipase immobilization into porous chitoxan beadsActivities inaqueous and organic media and lipase localization.Biotechnol Prog 2001，17734-737.又如CN01126606.6用珠状壳聚糖作载体材料，用于酶的固定化；CN200510045268.8是用交联剂将壳聚糖负载在硅胶上，再将其用于酶的固定化。这种天然载体材料能够在一定程度上减少酶和载体间不利的相互作用，为固定化酶提供一种生物友好的微环境，从而提高固定化酶的活性。
另一方面，固定化酶载体材料的形态结构对固定化酶的载酶量、生物活性以及催化效率亦有显著的影响。研究表明一些具有多孔结构、大比表面积的载体材料有利于提高固化酶的载酶量，并有利于底物向酶活性中心和产物向反应区域以外扩散以提高固定化酶的生物活性和催化效率。用于固定化酶载体材料形态结构种类繁多，有膜材料、微球和纳米粒子等。其中，由于静电纺纳米纤维复合膜具有大的比表面积和高的孔隙率，并且可以通过纺丝条件进行调控等优点，越来越引起人们的重视。近些年，利用静电纺丝法制备壳聚糖纳米纤维复合膜引起了许多研究者的兴趣。可将壳聚糖与聚乙烯醇或聚乙二醇的溶液混合进行静电纺丝制备纳米纤维复合膜。[5]Ohkawa K，Cha D，Kim H，Nishida A，Yamamoto H.Electrospinning ofChitosan.Macromol Rapid Commun 2004，251600-1605；[6]Li L，Hsieh Y.-L.Chitosanbicomponent nanofibers and nanoporous fibers.Carbohydrate Research 2006，341374-381；[7]Mincheva R，Manolova N，Paneva D，Rashkov I.Preparation of polyelectrolyte-containingnanofibers by electrospinning in the presence of a non-ionogenic water-soluble polymer.JBioactive Compat Polym 2005，20419-435.又如，CN 200410019230.9将壳聚糖与聚乙烯醇的混合溶液静电纺丝制备超细纤维复合膜；CN 200510014826.4将壳聚糖、聚乙烯醇和碳纳米管混合体系静电纺丝制备具有抗菌、抗静电的壳聚糖/碳纳米管超细纤维复合膜。CN200610052953.8通过静电纺丝和碱处理的方法，可以得到一种在水溶液中具有稳定形态结构的壳聚糖纳米纤维膜。这种具有稳定形态结构的壳聚糖纳米纤维膜制备技术方案操作步骤如下将壳聚糖溶于90％的乙酸和10％水组成的混合溶剂，配成重量百分比为2～5％的溶液；将聚乙烯醇溶于水中，配成重量百分比为5～10％的溶液；将壳聚糖和聚乙烯醇溶液按体积比1～5∶1混合均匀，再注入到多道静电纺丝装置中，在电压为5千伏～30千伏、喷丝头溶液流量为0.1毫升/小时～1.0毫升/小时、接收距离为5厘米～20厘米的条件下进行静电纺丝和汇集成纤维复合膜。再将所得到的壳聚糖/聚乙烯醇纳米纤维复合膜浸入0.1～5摩尔/升的强碱性溶液中，在常温中浸泡2～6小时，再用去离子水重复清洗，直至洗液呈中性，最后纳米纤维复合膜放入真空烘箱中于60℃下干燥24小时。
但是，目前还没有采用这种具有良好亲水性、生物相容性和在水溶液中具有稳定形态结构的壳聚糖纳米纤维膜用于酶固定化。所以，有必要研制一种利用具有形态结构稳定、比表面积高、空隙率大和生物相容性良好的壳聚糖纳米纤维复合膜用于酶固定化的方法，有效提高固定化酶的载酶量、消除酶催化反应时的扩散控制和提高固定化酶的催化效率；同时，壳聚糖纳米纤维复合膜为固定化酶提供一种良好的生物相容性界面，从而促进固定化酶活性和稳定性的提高。
发明内容
针对一些用于固定化酶的载体与酶之间非生物特异性的相互作用容易导致酶活性的降低，以及固定化酶的载酶量和催化效率低、固定化酶载体材料难以回收等问题，本发明提供一种具有高比表面积、高空隙率和良好生物相容性的壳聚糖纳米纤维复合膜材料的制备及其用于酶固定化的方法。
本发明的壳聚糖纳米纤维复合膜上酶的固定化技术方案如下将壳聚糖纳米纤维复合膜浸入1～20％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡2～12小时，震荡速度为20～120转/分钟；取出纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为1～20毫克/毫升的酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡1～5小时，震荡速度为20～120转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水重复清洗，共清洗3～5次，即可得到壳聚糖纳米纤维复合膜固定化酶；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
本发明的优点是1)壳聚糖来源充足，成本低廉，可用于工业化大生产。
2)壳聚糖纳米纤维复合膜的制备及其酶固定化工艺简单。
3)壳聚糖纳米纤维复合膜具有高比表面积和高空隙率，有利于提高固定化酶的载酶量、消除酶催化反应时的扩散控制和提高固定化酶的催化效率。
4)这种具有纳米尺寸纤维复合膜酶固定化的载体，易于从反应体系中回收，可以重复使用，极大地提高酶的利用率和降低生产成本。
5)壳聚糖纳米纤维复合膜具有良好的生物相容性，可以为其表面固定化酶蛋白提供友好仿生环境，有效地提高固定化酶生物活性和稳定性。
具体实施例方式
壳聚糖纳米纤维复合膜制备方法将壳聚糖溶于90％的乙酸和10％水组成的混合溶剂，配成重量百分比为2～5％的溶液；将聚乙烯醇溶于水中，配成重量百分比为5～10％的溶液；将壳聚糖和聚乙烯醇溶液按体积比1～5∶1混合均匀，再注入到多道静电纺丝装置中，在电压为5千伏～30千伏、喷丝头溶液流量为0.1毫升/小时～1.0毫升/小时、接收距离为5厘米～20厘米的条件下进行静电纺丝和汇集成纤维直径在50～1000纳米的复合膜。再将所得到的壳聚糖/聚乙烯醇纳米纤维复合膜浸入0.1～5摩尔/升的强碱性溶液中，在常温中浸泡2～6小时，再用去离子水重复清洗，直至洗液呈中性，最后纳米纤维复合膜放入真空烘箱中于60℃下干燥24小时。
壳聚糖的分子量为5～100万，聚乙烯醇的聚合度为1500～2500，醇解度为85％～99％；通过戊二醛交联法将酶固定于壳聚糖纳米纤维复合膜上，具体方法为将壳聚糖纳米纤维复合膜浸入1～20％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡2～12小时，震荡速度为20～120转/分钟；取纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为1～20毫克/毫升的酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡1～5小时，震荡速度为20～120转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水重复清洗，共清洗3～5次，即可得到壳聚糖纳米纤维复合膜固定化酶；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
固定于该种材料上酶是脂肪酶、过氧化氢酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、漆酶、脱氢酶、氧化酶的一种。
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述例不构成对本发明的限制。纳米纤维复合膜纤维直径是采用扫描电镜分析进行测定。
将壳聚糖纳米纤维复合膜作为酶固定化的载体，进行酶的固定化的实施方法例1将1克壳聚糖纳米纤维复合膜浸入2％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡3小时，震荡速度为40转/分钟；取纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为2毫克/毫升的脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡2小时，震荡速度为40转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水重复清洗，共清洗3次，即可得到脂肪酶固定化的壳聚糖纳米纤维复合；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
例2将1克壳聚糖纳米纤维复合膜浸入10％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡5小时，震荡速度为60转/分钟；取纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为6毫克/毫升的脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡4小时，震荡速度为60转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水重复清洗，共清洗4次，即可得到脂肪酶固定化的壳聚糖纳米纤维复合；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
例3将1克壳聚糖纳米纤维复合膜浸入5％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡8小时，震荡速度为80转/分钟；取纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为8毫克/毫升的过氧化氢酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡6小时，震荡速度为80转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水重复清洗，共清洗5次，即可得到过氧化氢酶固定化的壳聚糖纳米纤维复合；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
例4将1克壳聚糖纳米纤维复合膜浸入15％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡10小时，震荡速度为100转/分钟；取纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为12毫克/毫升的过氧化氢酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡4小时，震荡速度为100转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水重复清洗，共清洗3次，即可得到过氧化氢酶固定化的壳聚糖纳米纤维复合；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
例5将1克壳聚糖纳米纤维复合膜浸入10％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡12小时，震荡速度为120转/分钟；取纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为16毫克/毫升的纤维素酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡4小时，震荡速度为120转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水重复清洗，共清洗4次，即可得到纤维素酶固定化的壳聚糖纳米纤维复合；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
例6将1克壳聚糖纳米纤维复合膜浸入20％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡12小时，震荡速度为120转/分钟；取纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为20毫克/毫升的纤维素酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡6小时，震荡速度为120转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水重复清洗，共清洗5次，即可得到纤维素酶固定化的壳聚糖纳米纤维复合；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
权利要求
1.一种壳聚糖纳米纤维复合膜用于固定化酶的方法，其特征在于将壳聚糖纳米纤维复合膜浸入1～20％的戊二醛水溶液中，密封后于25℃的恒温条件下震荡2～12小时，震荡速度为20～120转/分钟；取出纳米纤维复合膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的戊二醛；将经戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为1～20毫克/毫升的酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡1～5小时，震荡速度为20～120转/分钟；从溶液中取出膜，用去离子水反复清洗3～5次，即可得到壳聚糖纳米纤维复合膜固定化酶；将固定化酶的纳米纤维复合膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下储存备用。
2.根据权利要求1所述固定化酶的方法，其特征在于，固定于该种材料上的酶为脂肪酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、漆酶、脱氢酶及氧化酶中的一种。
全文摘要
一种壳聚糖纳米纤维复合膜用于固定化酶的方法。它以壳聚糖和聚乙烯醇溶于冰醋酸和水的混合溶剂中形成透明溶液，通过静电纺丝法制成壳聚糖纳米纤维复合膜，并以其作为酶固定化的载体，通过化学键合的方法将酶固定到纳米纤维复合膜上。本发明利用纳米纤维复合膜的高比表面积、高空隙率以及壳聚糖所具有的反应性氨基和生物相容性，可以得到具有载酶量高、比活高、催化效率高的壳聚糖纳米纤维复合膜固定化酶。该固定化酶具有易从反应体系中回收、可反复多次使用、能提高酶的利用率和降低生产成本等优点，且其制备过程简单。
文档编号C12N11/00GK1948474SQ20061015456
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月8日 优先权日2006年11月8日
发明者黄小军, 徐志康 申请人:浙江大学