专利名称：一种生物转化生产琥珀酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物法生产琥珀酸，其以菊粉植物为原料，通过预处理等 手段加工成微生物可以利用的发酵原料，再利用微生物法生产琥珀酸的技 术。
背景技术：
琥珀酸是三羧酸循环的中间产物之一，同时也是许多厌氧微生物的代谢 终产物之一。同时，琥珀酸又是一种用途广泛的重要基础化工原料。在食品领域，琥珀酸可以应用于食品添加剂和调味剂；在医药领域，它可以作 为医药制品的辅料；在化工领域，它可以作为发泡剂、清洁剂及离子螯合 剂等；在石化工业中，被用作前体化合物生产丁二醇、四氢呋喃、g-丁内酯 等重要的化工产品。目前，琥珀酸产品主要由石化产品通过化学法生产， 由于生产原料为不可再生的石油资源，导致生产成本直接受国际油价的影 响，而且容易造成环境污染问题。因此利用微生物，转化植物中丰富的碳 水化合物资源生产琥珀酸成为关注的热点。自然界中有许多微生物可在厌氧条件下利用葡萄糖、果糖、甘露糖等 糖源发酵产生少量的琥珀酸。Guettler等人从厌氧菌株A^"o6"cz7/wwcr/"oge"中筛选出抗8g/L氟代乙酸的高产琥珀酸的突变株，以葡萄糖为 底物发酵，琥珀酸的产量在发酵罐中的浓度达到110g/L。美国应用碳化学 公司于2002年，通过对大肠杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因(;^)，乳酸脱 氢酶基因(/"/0及葡萄糖磷酸转移酶基因(/^G)三个基因的失活构造出 一株工程菌AFPlll，该工程菌通过利用玉米浸渍水为营养源在有氧阶段快 速生长，然后进入无氧阶段转化葡萄糖生产琥珀酸。然而，廉价的初级生物质原料是降低发酵成本的有效途径之一。纤维 素原料成本低廉，地球上纤维素资源十分丰富，然而目前经济有效的利用 纤维素生物质原料是国际性难题之一，普遍采取的方法是采用稀酸处理纤 维素原料，然后再通过能表达纤维素酶，并能利用葡萄糖和木糖的微生物 催化剂，实现生物炼制。这种方法虽然有效，但由于纤维素处理过程中酸 的使用又不可避免的带来了环境问题。玉米淀粉是最简单易得的葡萄糖基 原料，微生物利用起来也十分的容易。但是，如果以玉米淀粉作为生物炼 制工艺的原料却不符合我国的国情。由于我国耕地面积有限，我国年产玉 米1.2亿吨，产量还不足美国的--半，人均占有不到100公斤，并且养殖消 耗占70-80%,用于工业的玉米占玉米总产量的10%左右，每年仅1000多 万吨，因此国内的— 玉米淀粉远远满足不了大规投的生物基产业的发展。发明内容本发明的目的是提供一种生物转化生产琥珀酸的方法；其生产成本低， 原料来源广泛，工艺简单，技术路线成熟，可产业化实施。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种生物转化生产琥珀酸的方法，以菊粉植物为原料，将菊粉植物富含 菊粉的器官预处理后经灭菌接入微生物，进行生物转化反应，生产琥珀酸；
产生的琥珀酸可以是有机酸的形式存在，也可以是以有机酸盐的形式存在
菊粉是指一系列果糖多聚物，末端带有一个葡萄糖残基；菊粉植物是指 在块根、块茎等器官中富含菊粉的一类植物，如菊芋、菊苣和/或大丽花等 富含菊粉的植物；所述富含菊粉的器官是指菊粉植物的块根或块茎；
所述预处理是指将菊粉植物富含菊粉的器官其通过物理，化学或生物的 方法加工成菊芋片、菊芋粉、菊粉等便于后续加工的原料；或进一步将上 述原料通过化学法如稀酸水解法，或生物法如利用菊粉酶将其降解成 为微生物可以利用的富含糖的原料。
生物转化反应包括微生物的厌氧发酵生产琥珀酸，同时也包括微生物 有氧生物转化生产琥珀酸；所述微生物是指一类可利用葡萄糖、果糖、木 糖、甘露糖等单糖，或蔗糖、麦芽糖、果寡糖等寡糖，或菊粉等多糖碳源， 生产琥珀酸的常用微生物。如野生型微生物J"flera6/w; zW〃wm
wcc/"/")^o^cmy，或通过遗传工程与基因工程改造的微生物五.co//， 5Wcc/zarawyces ce"Wc/ae, jW"o6a"7/ws wcc/"oge"es， Mww/ze/w/a swcc/m'"jwc^wcera， J加era6/o，W〃w/w swcc/m'cz) ra^cms,々mo/wowos mo6/to或乳酸菌菌株。 具体过程可为，
1) 将菊粉植物的块茎按常规方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成质量 浓度2~20%的溶液。
2) 在每升质量浓度为2 20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入 1000U 100000U单位的菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉 酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pH-4 6， 50 65。C反应2 60h，酶反应进行完全，成为微生物可以利用的富含单糖的 原料，将反应液调至中性，灭菌；
3) 将可利用菊粉的微生物接入灭菌的以菊芋粉或菊粉为主要碳源的培 养基中，菊芋粉或菊粉质量浓度为2 20%，培养温度20~60°C ，培养40 300h， 得琥珀酸。
4) 将可利用单糖碳源生产琥珀酸的常用微生物接入灭菌的菊粉酶解液 中，使培养基中糖浓度达到2%~20%，培养温度为20 6(TC，培养40 300h，
得琥珀酸。
本发明可避免出现工业生物技术产业与人畜争粮争地的局面，利用菊 芋、菊苣、人丽花等富含菊粉的植物，特别是那些可在盐碱、荒涂地生长的菊粉植物，如菊芋，通过将其预处理成菊芋片、菊芋粉、菊粉或这些 原料经进一歩加工，通过稀酸处理或菊粉酶处理，形成可供微生物利用的
发酉孝底物，通过y4"aeraZ)/o5/^W〃w;w 5^cc/w/一rofi wcera，爿"/"o6ac/〃MS swccz7wge腦，Ma朋/ze/m/a swcdm'一ra(i"cera ，co/z'， (Sacc/zara，cM ce v/5/ae， /，&他，乳酸菌等微生物，生物转化法生产琥珀酸的技术。
自然界中存在一大类富含菊粉的植物，而菊粉不仅可供某些微生物直 接利用，还可以通过水解成果糖、葡萄糖等易于微生物利用的糖。同时， 这一类植物中的菊芋等，还具有能在盐碱地、荒漠地生长，抗虫抗病的特 点。因此，利用这一类的菊粉植物对我国发展工业生物技术具有重要意义。
具体实施例方式
实施例1菊芋粉的制作
将菊芋块茎晒干，经粉碎机粉碎成粉，制成菊芋粉。 实施例2菊粉的制作
将菊芋块茎洗净，浸入90。C的5^NaOH溶液中lmin，捞出脱皮洗净， 将脱皮菊芋块茎，经4000W微波炉加热，每加热2kg需8min，将加热的菊 芋块茎放入榨汁机中榨汁，搾出的汁液经板框过滤，再经过阳离子交换树 脂柱阴、离子交换树脂柱，形成富含菊粉的澄清液体(pH5.0~8.0)，经浓縮 喷雾干燥，制成菊粉。
实施例3菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升质量浓度为2%的菊芋粉溶液中，加入1000U单位的菊粉酶的比 例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1 微摩尔果糖所需要的酶量，调pH-4.5， 6(TC反应26h，酶反应进行完全， 溶液中葡萄糖质量浓度为0.18%，果糖质量浓度为1.60%,将反应液调至中 性，灭菌；
实施例4菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升质量浓度为2%的菊芋粉溶液中，加入20000U单位的菊粉酶的 比例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产 生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pH-5.0， 55t:反应5h，酶反应进行完全， 溶液中葡萄糖质量浓度为0.08%，果糖质量浓度为1.58%，将反应液调至中 性，灭菌；
实施例5菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升质量浓度为5%的菊芋粉溶液中，加入20000U单位的菊粉酶的 比例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产 生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pH-4.8， 65t:反应8h，酶反应进行完全， 溶液中葡萄糖质量浓度为0.29%，果糖质量浓度为4.38%，将反应液调至中 性，灭菌；
实施例6菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉在每升质量浓度为10%的菊芋粉溶液中，加入IOOOOOU单位的菊粉酶
的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物
产生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pH:5.5， 5(TC反应5h，酶反应进行完 全，溶液中葡萄糖质量浓度为0.24%，果糖质量浓度为9.12%，将反应液调 至中性，灭菌；
实施例7菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升质量浓度为20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入100000U单位的 菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉酶酶活定义为每分钟水 解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pH二4.0， 6CTC反应llh，酶反 应进行完全，溶液中葡萄糖质量浓度为1.41%，果糖质量浓度为17.06%， 将反应液调至中性，灭菌；
应用例1利用大肠杆菌以菊粉为原料生产琥珀酸
取10ml粗酶液,活力单位380U/ml，加入1L质量浓度15%的菊粉溶液 (pH=4)， 65。C反应30h，经HPLC检观U，酶反应进行完全，产物中葡萄糖质 量浓度1.6%，果糖质量浓度13.2%。将反应液调至中性，12rC灭菌20min。
将基因工程改造过的大肠杆菌(保藏号KCTC0506BP)在LB培养 基中3(TC培养14h,离心获得菌体，接入100mlLB中(500ml锥形瓶》中培 养，培养温度为3(TC，培养至OD60()吸光度值达到0.6时，接入含1升LB 培养基的5L发酵罐中培养，培养温度为3(TC，培养液pH控制在6.0 (通 过lMNaOH， 1MHC1调节)，并通无菌空气搅拌培养，至OD咖值为8.5。
然后，通过发酵罐补料系统，加入灭菌的菊粉酶解液0.5L,使培养基 中糖质量浓度达到5%，同时停止供氧并通入无菌C02,培养温度为3(TC， 培养80h，得42g琥珀酸。
使用HPLC-UV系统和Hypersil BDS C18反相色谱柱检测琥珀酸的含 量，使用HPLC-脉冲安培检测器和阴离子交换柱(HAMILTONRCX-10) 检测葡萄糖，果糖浓度。
应用例2利用大肠杆菌以菊粉为原料生产琥珀酸
取10ml粗酶液,活力单位5000U/ml,加入0.5L质量浓度10%的菊粉溶 液(pH=6)， 55。C反应5h，经HPLC检测，酶反应进行完全，产物中葡萄糖 质量浓度1.1%,果糖质量浓度8.4%。将反应液调至中性，12rC灭菌20min。
将基因工程改造过的大肠杆菌(保藏号KCTC0506BP)在LB培养 基中3(TC培养14h,离心获得菌体，接入100mlLB中(500ml锥形瓶)中培 养，培养温度为3(TC，培养至OD6(K)吸光度值达到0.8时，接入含1升LB 培养基的5L发酵罐中培养，培养温度为3(TC，培养液pH控制在6.0 (通 过lMNaOH， 1MHC1调节)，并通无菌空气搅拌培养，至OD,值为6.8。
然后，通过发酵罐补料系统，加入灭菌的菊粉酶解液2L，使培养基中 糖质量浓度达到10%，同时停止供^并通入无菌CCb，培养温度为4(TC， 培养60h，得56g琥珀酸。使用HPLC-UV系统和Hypersil BDS C18反相色谱柱检测琥珀酸的含 量，使用HPLC-脉冲安培检测器和阴离子交换柱(HAMILTONRCX-10) 检测葡萄糖，果糖浓度。
应用例3利用大肠杆菌以菊芋粉为原料生产琥珀酸
取10ml粗酶液,活力单位4900U/ml，加入2L质量浓度5%的菊芋粉溶 液(pH=5)， 60'C反应3.5h,经HPLC检测，酶反应进行完全，产物中葡萄 糖质量浓度0.3%，果糖质量浓度4.6%。将反应液调至中性，12rC灭菌 20min。
将基因工程改造过的大肠杆菌(保藏号KCTC0506BP)在LB培养 基中40。C培养12h，离心获得菌体，接入100mlLB中(500ml锥形瓶)中培 养，培养温度为4(TC，培养至OD6。。吸光度值达到0，3时，接入含1升LB 培养基的5L发酵罐中培养，培养温度为40°C ，培养液pH控制在7.0 (通 过lMNaOH， 1MHC1调节)，并通无菌空气搅拌培养，至OD,值为IO。
然后，通过发酵罐补料系统，加入灭菌的菊芋粉酶解液1L，使培养基 中糖质量浓度达到6%，同时停止供氧并通入无菌C02,培养温度为32'C， 培养40h，得36g琥珀酸。
使用HPLC-UV系统和Hypersil BDS C18反相色谱柱检测琥珀酸的含 量，使用HPLC-脉冲安培检测器和阴离子交换柱(HAMILTONRCX-10) 检测葡萄糖，果糖浓度。
应用例3利用大肠杆菌以菊芋粉为原料生产琥珀酸
取10ml粗酶液，活力单位8000U/ml,加入1.5L质量浓度20%的菊芋粉 溶液(pH=4)， 5(TC反应7h,经HPLC检测，酶反应进行完全，产物中葡萄 糖质量浓度1.2%,果糖质量浓度17.7%。将反应液调至中性，121'C灭菌 20min。
将基因工程改造过的大肠杆菌(保藏号KCTC0506BP)在LB培养 基中40。C培养12h，离心获得菌体，接入100mlLB中(500ml锥形瓶)中培 养，培养温度为40°C，培养至OD,吸光度值达到0.53时，接入含1升LB 培养基的5L发酵罐中培养，培养温度为40°C ，培养液pH控制在6.5 (通 过lMNaOH， 1MHC1调节)，并通无菌空气搅拌培养，至OD鋼值为12.5。
然后，通过发酵罐补料系统，加入灭菌的菊芋粉酶解液1.5L，使培养 基中糖质量浓度达到8%，同时停止供氧并通入无菌C02,培养温度为36°C， 培养50h，得38g琥珀酸。
使用HPLC-UV系统和Hypersil BDS C18反相色谱柱检测琥珀酸的含 量，使用HPLC-脉冲安培检测器和阴离子交换柱(HAMILTONRCX-10) 检测葡萄糖，果糖浓度。
权利要求
1. 一种生物转化生产琥珀酸的方法，其特征在于以菊粉植物为原料，将菊粉植物富含菊粉的器官预处理后经灭菌接入微生物，进行生物转化反应，生产琥珀酸。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于菊粉是指一系列果糖多 聚物，末端带有一个葡萄糖残基；所述菊粉植物是指菊芋、菊苣和/或大丽 花富含菊粉的植物；所述富含菊粉的器官是指菊粉植物的块根或块茎。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述预处理是指将菊粉 植物富含菊粉的器官其通过物理，化学或生物的方法加工成片、粉、菊粉 便于后续加工的原料，或进一步将上述原料通过化学法或生物法将其降解成为微生物可以利 用的富含糖的原料。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述微生物是指一类可利用单糖、寡糖或多糖碳源生产琥珀酸的常用微生物。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述微生物是指野生型 微生物J"aera6/o，W〃wm swcc/M/一ra血cms， swcc/"ogewas或 Maw"/ze/m/a wcc/ra'c^radwcem，歳通过遗传工程与基因工程改造^微生物 ￡.co//， &cc/7ara，ces cerev/c/"e， yic"'wo6ac/〃ws swcc/"ogewas， Maww/ze/m/a swcc/"/一;-oc/wcms1， 爿Maera6/o，W〃ww si/cc/w'"^ ra^cem1， 々附owowas 附o&to或乳酸菌菌株。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体过程可为，1) 将菊粉植物的块茎按常规方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成质量浓度2~20%的溶液。2) 在每升质量浓度为2~20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入 1000U-100000U单位的菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反应液，菊粉 酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pt^4 6， 50 65"C反应2 60h，酶反应进行完全，成为微生物可以利用的富含单糖的 原料，将反应液调至中性，灭菌；3) 将可利用菊粉的微生物接入灭菌的以菊芋粉或菊粉为主要碳源的培 养基中，菊芋粉或菊粉质量浓度为2 20%，培养温度20~60°C ，培养40 300h, 得琥珀酸。4) 将可利用单糖碳源生产琥珀酸的常用微生物接入灭菌的菊粉酶解液 中，使培养基中糖浓度达到2% 20%，培养温度为20 60°C，培养40 300h，得琥珀酸。
全文摘要
本发明涉及微生物法生产琥珀酸，一种生物转化生产琥珀酸的方法，以菊粉植物为原料，将菊粉植物富含菊粉的器官预处理后经灭菌接入微生物，进行生物转化反应，生产琥珀酸。其生产成本低，原料来源广泛，工艺简单，技术路线成熟，可产业化实施。
文档编号C12R1/225GK101245358SQ20071001044
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月15日 优先权日2007年2月15日
发明者曲天明, 曹海龙, 李曙光, 杜昱光 申请人:中国科学院大连化学物理研究所