一种微生物发酵生产l-鸟氨酸的方法

专利名称：：一种微生物发酵生产l-鸟氨酸的方法
技术领域：
：本发明涉及微生物发酵工艺，更具体地说涉及一种采用微生物发酵生产L-鸟氨酸的方法。
背景技术：
：一、L-鸟氨酸(L-Ornithine，L-Orn)的理化性质、生理功能及在医药上的应用。L-Orn是一种人们不太熟悉的氨基酸，它不是构成蛋白质的成份，却是自然界普遍存在的氨基酸，也存在于人体中，是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成份；食物中含有L-Om，尤其是蚬贝中的含量更高，蚬贝汁是有名的对肝脏有益的物质。L-Om学名为ouS-二氨基戊酸，是1877年杰费在喂养安息香酸的鸟尿水解液中发现的，故命名为鸟氨酸，分子式C5H12N202，分子量132.16，结构式为H，C一NH,HC—NH2COOHL-Orn比旋光度[a]25D=+28.4。(C=2,0.5molHCl)或[a]25D=+12.1。(C=2,H20);L-Orn.HCl[a]23D=+11.0°(C=5.5，H2O);L-Orn.2HCl比旋光度=+16.5°(C=4，H20)。L-Orn难结晶，通常为浆状物，易溶于水、乙醇、甲醇，微溶于乙醚。其盐酸盐可形成结晶，L-鸟氨酸单盐酸盐(L-OnrHCl)易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、乙醚，其双盐酸盐(L-Onr2HCl)易溶于乙醇、甲醇。L-Om参与人体鸟氨酸循环，在体内能促进腐胺、精脒、精素(Spermine)等多胺化合物的生成，后者是促进细胞增殖的重要物质；L-Om能增强生长激素的分泌，健康男性生长激素的分泌量相应于L-Om的摄取量而提升；如果在运动时配合摄取L-Om和L-精氨酸(L-Arg)可以提高肌肉量，其除脂肪体重(指除脂肪外的的全部组织重量)增高，显示了肌肉增强的效果；此外，L-Om还具有抑制肌肉分解的作用，当作为营养补充食品被人体摄取时可以维持一定量的肌肉，这种作用不随年龄增加而减少，因此对老年人意义更大。L-Om能激活鸟氨酸循环，促进肝脏解氨毒，与L-Arg、L-瓜氨酸(L-Citrulline，L扁Cit)一起作解毒药，肝功能促进剂。L-OrnHCl是复方氨基酸输液(或注射液)成份例如14氨基酸注射液-800(别名安肝平)中含L-Orn.HCl为0.15%(见上海市药品标准1993年版234页)；国产BCAA输液对于纠正病人血浆氨基酸谱紊乱和治疗肝昏迷有良好效果(同时补充氨基酸营养成份)，为了增强输液的脱氨能力有三种BCAA配方中增加了具有脱氨能力的L-Orn、L-Arg。L-Orn是一个碱性氨基酸，其等电点PI=9.70，碱性仅次于L-Arg(PI=11.10),故可分别与诸如L-天门冬氨酸、(x-酮戊二酸等一些结晶生成具有相应保健功能的盐，此外，L-Orn衍生物还可用于抑郁症、乏力和神经的治疗，a-二氟甲基-L-Om治疗牛皮癣，对前列腺肥大和肿瘤的疗效也相当好。蛇麻草中加入适量的L-Orn可用于美容、丰胸，也可用于防治良性肿和恶性肿瘤等。椐文献报导，目前L-Om仅在日本的市场规模就达到15亿日元(超过1000万美元)，且其需求量正在不断上升。二、L-Orn的生产方法L-Om的生产方法有化学法、酶(包括菌体)法和微生物发酵法。前两者都是以价格昂贵的L-Arg为原料，后者是以廉价碳源(葡萄糖)为原料。由于微生物发酵法生产L-Om技术上有一定难度，日本直到上世纪80年代末、国内直到现在仍在采用化学法或酶法小批量生产。化学合成法以L-Arg'HCl为原料在氢氧化钡溶液中水解，水解液用盐酸中和生成L-Orn'HCl，再以乙醇沉淀而得，生成的L-OnrHCl对L-Arg.HCl的理论收率为80%。本法产量小，成本高，需耗用大量酒精，金属钡对人体有毒害。酶(菌体)转化法利用游离的(或菌体的)精氨酸酶(L-Arginase)把L-Arg'HCl转化为L-Orn'HCl:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>酶法生产L-OnrHCl近几年有专利发表如KR95-09319是固定化酶，由L-Arg转化为理论值的97%，温度2540'C，PH78，酶活性可保持6天。又如美国专利US5405761是1995年M.Kyriukos等用从牛肝中提取的酶制备多种L-Om盐等。与纯酶制剂相比，使用活菌体似乎更为可取。一般用粪链球菌如粪链球菌，L-Arg转化率为理论值的95。/。，提取收率85%，据此计算生产1吨L-Orn'HCl至少需1.51.6吨L-Arg'HCl。酶(菌体)法同样是以昂贵的L-Arg为原料，成本较高，难以大规模生产，限制了L-Orn的广泛应用。3、微生物发酵法是以廉价的碳源(葡萄糖、蔗糖蜜)、氮源(尿素、氨水)为主要原料经细菌发酵生产L-OrrrHCl。细菌在正常情况通过反馈抑制和反馈阻遏机制保持细胞内各代谢产物的平衡，而经人工诱变的突变株丧失了上述反馈抑制(阻遏)的能力，因而畸形地大量分泌特定的代谢产物，这类菌株称之为代谢调控突变株。目前国外发酵法生产L-Om，HCl产酸率约57%，糖转化率30%左右，发酵周期23天，提取精制收率7080%。
发明内容本发明的目的为提供一种微生物生产L-鸟氨酸的方法，使L-鸟氨酸的产酸率、糖转化率及收率提高。本发明利用微生物发酵，使细菌生物合成L-鸟氨酸，此过程是通过如下途径获得的一、由营养缺陷型菌株生产细菌(谷氨酸棒杆菌等氨基酸生产菌、枯草杆菌、大肠杆菌)积累L-Om的机制如图1所示终产物L-Arg对催化N-乙酰谷氨酸生成N-乙酰谷氨酰磷酸的关键酶N-乙酰谷氨酸激酶有反馈抑制作用，而Cit'」丧失了鸟氨酸转氨甲酰酶即丧失鸟氨酸合成瓜氨酸的能力，这样在细菌细胞内L-Arg的浓度不会提高，这就解除了L-Arg的反馈抑制(阻遏)作用。在发酵培养基中必须供应Cit(L-Arg可以代替)。上述Cit(一)才能生长。只要控制供给菌体生长的L-Arg处于亚适量水平，使菌体可以适度生长但又不使终6端产物L-Arg浓度高到引起反馈抑制(阻遏)的程度就能在培养液中大量积累中间产物L-Orn。二、用营养缺陷型加磺胺胍抗性菌株(SGr)生产如上所述，选育Cit(—'或(ArgH是细菌发酵积累L-Om的基本条件，但并不一定是充分条件。为了大量积累L-Om、提高产酸率还需创造条件使葡萄糖合成谷氨酸系列氨基酸的代谢流充分通畅。如上图所示，谷氨酸激酶是葡萄糖经三羧酸迥路中a-酮戊二酸加氨生成L-GA后代谢流继续下行的第一个关键酶，因此提高该酶活性对近乎末端的L-Om大量积累具有重要作用；此外ATP(三磷酸腺苷)分子中含有两个磷酸高能键，是细胞代谢必不可少的能量来源，还可供给磷酸基。文献报导谷氨酸棒杆菌SGr细胞内的L-GA激酶活性和ATP含量较之原株都成倍增加，因此选育SGr是合理的，事实上本公司实验室通过选育SGr使L-OnvHCl产量有了一定提咼°本发明的微生物发酵生产L-鸟氨酸的方法，包括菌种选育、发酵培养基和分离提取三个步骤1.菌种选育(一)菌种出发菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebaetenomglutamicam)本实验室保藏.(二)培养基及诱变方法1)完全培养基(A)的组成牛肉膏1%;蛋白胨1%;酵母膏0.5%;NaC10.5%;PH7.07.2(上海试剂四厂产PH6.48.0试纸)；配制固体培养基时加琼脂粉1.82.4%。2)基本培养基(B)的组成葡萄糖1%;(NH4)2S04:0.3%;KH2P04:0.1%;K2HP(V3H20:0.2%;MgS04'7H20:0.05%;FeS04'7H20:0.002%;MgS040.002%、VB1。HC1200微克/升、Vh50微克/升、L-Arg0.010.03°/0;PH7.07.2(用NaOH调)；琼脂粉1.51.8%。3)1/30M磷酸缓冲液的配制(PH7.0)甲液Na2HP04'12H2023.9g/l;7乙液NaH2P04.2H2010.4g/l;使用时甲液61ml加乙液39ml稀释成200ml。4)诱变处理4.1)L-瓜氨酸营养缺陷型Cit")的选出取已活化的培养基(A)的斜面菌苔(3033。C培养1824h)((pl5"50斜面试管四支)接入装30ml1/30M磷酸缓冲液及玻璃珠的250ml三角瓶中振摇15min使菌体分散成单细胞，将此菌悬液20ml置事先灭菌的平皿中，在振荡条件下紫外线照射，紫外灯15瓦，距离50cm，处理1020min，适当稀释后涂布于肉汤平板上，3(TC培养12天，照常规方法(参看《微生物诱变育种》科学出版社1972)选出Cit(一)。经摇瓶筛选出产L-OnrHCl最高的C188(48h产酸1.62.0%)。4.2)Cit(—)+SGf菌株的选出照4.1同样制备C188的菌悬液加入事先溶解的亚硝基胍(NTG)使浓度为200250ug/ml，于30。C恒温振摇1530min，处理时间30min时死亡率99.9%。处理完毕吸0.5ml菌液于培养液(A)中(250ml三角瓶盛液25ml)，3(TC振荡培养12天，待菌液明显浑浊离心收集菌体用1/30M磷酸缓冲液洗涤两次，制成菌悬液用玻璃珠分散成单细胞后不加稀释，取0.10.2ml涂布于培养基(B)(补充L-瓜氨酸或L-精氨酸0.02。/。并含SG250500微克/毫升)上，培养皿反置，30。C培养310天，把长出的大菌落转接于肉汤斜面，保藏待摇瓶发酵确证其产L-OnrHCl的能力，结果选出CS-189(Cit(—)+SGr)。2.菌种发酵(一)菌种谷氨酸棒杆菌CS-189(Cit(-)+SGr)(二)培养基及培养条件1)、斜面保藏培养基(无糖斜面)牛肉膏1%;蛋白胨1%;酵母膏0.5%;NaC10.5%PH7.07.2;琼脂粉1.51.8%;12rC灭菌20min。生产用斜面另外加葡萄糖0.10.2%(有糖斜面)。2)、一级种子培养基葡萄糖3%;脲0.25%;KH2P04:0.15%;MgS04'7H20:0.04%;蔗糖蜜0.7%;L-arg0.05%;C.S丄:3.0%;VH25微克/升;PH7.07.2(用NaOH调)装液量50ml/500ml三角瓶，115°C灭菌1015min。接种肉汤斜面活化菌苔一环，置往复式摇床，振幅90100mm，频率100r/min，3(TC培养种龄约10h，最终PH6.47.0。3)、发酵培养基葡萄糖10%;(NH4)2SO44.0%(分消);KH2PO40.02%;C.S丄3.0%;MgS04.7H200.05%;L-Arg0.010.03%;CaCo35%(分消，121。C蒸汽灭菌30min后于100120。C烘箱烘干，临接种前加入，仅摇瓶用)；2%苯酚红34滴/瓶(仅摇瓶用)；配料PH7.37.4(6.48.0试纸)；121。C蒸汽灭菌10min，摇瓶装液量20ml/500ml三角瓶，种量10%，摇床振幅8590mm，初频100r/min，培养温度为30。C。30L自控罐C.S丄2.0。/。(酸性分消)，泡敌(陶氏化学产聚醚3010)适量；初定容12L(种后)，接种量10%，种前加氨水调PH6.87.0。30L自控发酵罐发酵结果及典型批报使用一台30L罐(上海保兴生物设备工程有限公司)进行发酵条件优化试验。罐尺寸如下罐内径(D)=24cm，圆柱高(H)=62cm，上下两档搅拌为六平叶，Di=9.0cm，中间一档搅拌起纵向混合作用，档距S下中二14cm，S上中二12cm种子培养与摇瓶同，发酵培养基除特别注明外与摇瓶同。初定容12L(种后)，种量10%，在发酵过程中用1/1氨水控制PH6.77.0，通过改变搅拌转速及通气量控制溶解氧水平，(用溶解氧饱和度D.0。/。表示)当培养液糖浓度(R.G%)降到一定数值就开始持续(间歇)补糖(同时补料)为了使菌体O.D(湿菌体)保持上升势头于适当时间补充L-Arg。具体结果请参见表1:表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注1、终液量未记入取样液;2、糖转化率计算初糖(口服葡萄糖)1.5kg折纯1.35kg，补糖1.2kg折纯1.08kg扣除未补完的糖供1.944kg，L-Orn'Hcl总量为561.6g;3、分离发酵液微滤去菌体、滤清液后，上铵型强酸树脂柱用2N氨水洗脱，洗脱液减压浓縮驱氨、驱氨液用HCL调PH5.07.0，继续减压浓縮至结晶出现，继续添加驱氨液直至浓縮液呈浆状，离心分离，烘干得L-鸟氨酸盐酸盐。这里采用的是热结晶处理，迄今为止未见国内外专利、文献报道将热结晶法用于鸟氨酸提取。本发明的有益效果1、本发明用一支谷氨酸棒杆菌通过化学诱变成功筛选出精氨酸缺陷型菌种并通过加磺胺胍抗性使之产酸大幅度提高。改良后的菌种产酸达到57%，即每升发酵液含鸟氮酸5070g，糖转化率33Q/^;产酸率、糖转化率及收率都有很大提高。2、针对L-鸟氨酸是碱性氨基酸采用铵型强酸型离子交换树脂吸附洗脱、针对L-鸟氨酸盐酸盐在水中溶解度极大的难点，采用热结晶法提取，避免了使用易燃、易爆的酒精，简化了提取工艺，降低了生产成本。图1:细菌(谷氨酸棒杆菌等氨基酸生产菌、枯草杆菌、大肠杆菌)积累L-Om的机制。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。1.菌种选育(一)菌种出发菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebaetenomglutamicam)本实验室保藏(二)培养基及诱变方法1、完全培养基(A)的组成牛肉膏1%;蛋白胨1%;酵母膏0.5°/。；NaC10.5%;PH7.0(上海试剂四厂产PH6.48.0试纸)；配制固体培养基时加琼脂粉2.0%。2、基本培养基(B)的组成葡萄糖1%;(NH4)2S04:0.3%;KH2P04:0.1%;K2HP(V3H20:0.2%;MgS04-7H20:0.05%;FeS04-7H20:0.002%;MgS040.002%、VB1。HC1200微克/升、Vh50微克/升、PH7.07.2(用NaOH调)；琼脂粉1.6%。3、1/30M磷酸缓冲液的配制(PH7.0)甲液Na2HP04'12H2023.9g/l;乙液NaH2P04.2H2010.4g/l;使用时甲液61ml加乙液39ml稀释成200ml。4、诱变处理4.1.L-瓜氨酸营养缺陷型Cit'—)的选出取已活化的培养基(A)的斜面菌苔(32。C培养20小时)(cpl5xl50斜面试管四支)接入装30ml1/30M磷酸缓冲液及玻璃珠的250ml三角瓶中振摇15min使菌体分散成单细胞，将此菌悬液20ml置事先灭菌的平皿中，在振荡条件下紫外线照射，紫外灯15瓦，距离50cm，处理12min，适当稀释后涂布于肉汤平板上，3(TC培养2天，照常规方法《参看微生物诱变育种》选出Cit(—)。经摇瓶筛选出产L-OnrHCl最高的C188。4.2.Cit—)+SGr菌株的选出照4.1同样制备C188的菌悬液加入事先溶解的亚硝基胍(NTG)使浓度为2200ug/ml，于30。C恒温振摇30min，处理时间20min时死亡率99.9%。处理完毕吸0.5ml菌液于培养液(A)中(250ml三角瓶盛液25ml)，3(TC振荡培养2天，待菌液明显浑浊离心收集菌体用1/30M磷酸缓冲液洗涤两次，制成菌悬液用玻璃珠分散成单细胞后不加稀释，取0.2ml涂布于培养基(B)(补充L-瓜氨酸0.02。/。并含SG500微克/毫升)上，培养皿反置，3(TC培养5天，把长出的大菌落转接于肉汤斜面，保藏待摇瓶发酵确证其产L-Orn'HCl的能力，结果选出CS-189(Cit(一)+SGf)。2.菌种发酵(一)菌种谷氨酸棒杆菌CS-189(Cit(——)+SGr)(二)培养基及培养条件1)、斜面保藏培养基(无糖斜面)牛肉膏1%;蛋白胨1%;酵母膏0.5%;NaC10.5%PH7.0;琼脂粉1.6%;12rC灭菌20min。生产用斜面另外加葡萄糖0.2%(有糖斜面)。2)、一级种子培养基葡萄糖3%;脲2%;KH2P04:15%;MgS04'7H20:0.04%;蔗糖蜜0.7%;L-argO.05%;C.S丄:3.0%VH25微克/升;PH7.0(用NaOH调)，装液量50ml/500ml三角瓶，115。C灭菌15min。接种肉汤斜面活化菌苔一环，置往复式摇床，振幅95mm，频率120r/min，30。C培养种龄约10h，最终PH6.47.0。3)、发酵培养基葡萄糖10%;(NH4)2S04:4.0%(分消);KH2P04:0.15%;C.S丄:3.0%;MgS047H20:0.05%;L画Arg:0.03%;CaCo3:5%(分消，121。C蒸汽灭菌30mhi后于ll(TC烘箱烘干，临接种前加入，仅摇瓶用)；2%苯酚红3滴/瓶(仅摇瓶用)；配料PH7.4(6.4-8.0试纸)；121。C蒸汽灭菌10min，摇瓶装液量20ml/500ml三角瓶，种量10%，摇床振幅85mm，初频100r/min，培养温度为30。C。30L自控罐C.S丄2.0。/。(酸性分消)，泡敌(陶氏化学产聚醚3010)适量；初定容12L(种后)，接种量10%，种前加氨水调PH7.0。30L自控发酵罐发酵结果及典型批报使用一台30L罐(上海保兴生物设备工程有限公司)进行发酵条件优化试验。罐尺寸如下罐内径(D)=24cm，圆柱高(H)=62cm，上下两档搅拌为六平叶，Di=9.0cm，中间一档搅拌起纵向混合作用，档距S下中二14cm，S上中二12cm种子培养与摇瓶同，发酵培养基除特别注明外与摇瓶同。初定容12L(种后)，种量10%，在发酵过程中用1/1氨水控制PH7.0，通过改变搅拌转速及通气量控制溶解氧水平，(用溶解氧饱和度D.O。/。表示)当培养液糖浓度(R.G%)降到一定数值就开始持续(间歇)补糖(同时补料)为了使菌体O.D(湿菌体)保持上升势头于适当时间补充L-Arg。表一-<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注1、终液量未记入取样液;2、糖转化率计算初糖(口服葡萄糖)1.5kg折纯1.35kg，补糖1.2kg折纯1.08kg扣除未补完的糖供1.944kg，L-OnvHcl总量为561.6g;3、分离取表一中第三罐批次初定容10L、初糖含量为11.2%、发酵期间补糖l.lkg(折纯)，最终发酵液为11.5L、残糖量1.8%，发酵周期56小时、最终发酵液含L-鸟氨酸盐酸盐5.8iy。。糖转化率计算糖转化率=产鸟氨酸量(11500X0.0581=668g)/耗糖量(10000X0.112+1100-11500X0.018=2013)=33.18%。该发酵液11.5升含L-鸟氨酸5.81%(以鸟氨酸盐酸盐计)，经过微滤去处菌体并分三次加入合计3.45升纯水洗涤得滤清液13.8升(含量为4.78%、微滤收率约98%)，该滤清液上732强酸型离子交换树脂IOL吸附，用水洗涤至PH为7，改用2N氨水洗脱，得洗脱液7.4升含量为8。％，通过2L旋转蒸发器浓縮蒸发驱氨后用6mo1盐酸中和PH至5.3，继续减压浓縮至浓縮液呈浆状、降温到5度，经抽滤瓶抽滤得到湿结晶、母液800ml、湿结晶经烘干后得L-鸟氨酸盐酸盐294g，母液中含量为32。^、合计一次收率为49.6合并收率为70%。产品经检测分析后含量99.2%(高氯酸滴定法)旋光度23.19Ph:5.6透光率98%干燥失重0.17%灼烧残渣0.03%产品符合AJI92版标准。权利要求1.一种微生物发酵生产L-鸟氨酸的方法，包括如下步骤(1)菌种选育a)出发菌株肉汤斜面活化菌苔，接种子接种至磷酸缓冲液中振摇，使菌种分散成单细胞，将此菌种悬浊液移至灭菌皿中，振荡下紫外线照射，将上述紫外线处理过的悬浊液稀释后涂布于肉汤平板上，影印法筛选出L-鸟氨酸盐酸盐生产菌株C188L-Cit或L-Arg缺陷型；b)将事先溶解的亚硝基胍加入上述所得C188菌悬液中，30℃处理20～30分钟；将菌液接种培养基A中培养，待菌液明显浑浊，离心收集菌体涂布于含磺胺胍200～500微克/毫升的培养基B上，30℃培养3～10天，所得菌落接种肉汤斜面，选出CS-189菌种L-Cit-+SGr；(2)摇瓶用发酵培养基葡萄糖10％；(NH4)2SO44～5％；KH2PO40.1～0.15％；C.S.L玉米浆3.0％；MgSO4·7H2O0.05-0.1％；L-Arg0.01～0.03％；CaCo35％分消；VB1。HCl100微克/升、VH100r/升、蔗糖蜜1％。(3)L-鸟氨酸盐酸盐提取发酵液-微滤去菌体-滤清液-处理成铵型的强酸性离子交换树脂-吸附、洗脱-洗脱液-减压浓缩驱氨-驱氨液用盐酸调PH至4.5至5.5-热结晶-离心分离-鸟氨酸盐酸盐结晶-烘干-成品。2.根据权利要求l所述的生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，紫外线照射时采用15瓦紫外灯，距离4050cm，30°C，处理1020分钟。3.根据权利要求l所述的生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，培养基B中含有L-瓜氨酸、L-精氨酸及磺胺胍。4.根据权利要求l所述的生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，发酵培养基为葡萄糖10%;(NH4)2S04:45%;KH2P04:0.10.15%;C.S丄玉米浆3.0%;MgS04.7H20:0.050.1%;L隱Arg:0.010.03%;CaCo3:5%分消；2%苯酚红34滴每瓶；配料PH7.37.4;121。C蒸汽灭菌10min，摇瓶装液量20ml/500ml三角瓶，种量10%，摇床振幅8590mm，初频100r/min，培养温度为30。C;30L自控罐C.S丄2.0。/。酸性分消，陶氏化学产聚醚3010泡敌适量；种后初定容12L，接种量10%，种前加氨水调PH6.87.0。5.根据权利要求l所述的生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)所采用的方法为热结晶提取法。全文摘要本发明提供了一种微生物发酵生产L-鸟氨酸的方法，使用谷氨酸棒杆菌经化学处理获得CS-189(cit^(-)+SG^r)的菌种，经发酵、培养液经陶瓷膜微滤、离子交换树脂、减压浓缩热结晶法提取后，获得L-鸟氨酸盐酸盐。该方法使用的菌种为营养缺陷型加磺胺胍抗性使发酵产酸率大幅度提高，同时针对L-鸟氨酸盐酸盐在水中溶解度极大的难点，采用热结晶法，在不使用易燃易爆酒精条件下获得较好的提取收率，简化工艺并降低提取成本。文档编号C12N1/20GK101323866SQ20071004199公开日2008年12月17日申请日期2007年6月14日优先权日2007年6月14日发明者虹徐,炜李,李象洪申请人:上海聚瑞生物技术有限公司