专利名称：一种双酶传感器及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双酶传感器及其制备和应用，应用是指用该传感器快速检测大肠杆菌的方法，即以双酶传感器为工作电极，采用计时电流法实现对水体中大肠杆菌浓度的快速检测方法，属双酶传感器和水体的微生物学检验的技术领域。
背景技术：
大肠杆菌是一种寄居在人和动物肠道上的最常见菌群。然而，当大肠杆菌侵入肠道外的其他器官或组织时，可引起如尿道炎、膀胱炎、胆囊炎、阑尾炎等疾病；婴儿、老人或免疫功能下降的病人，大肠杆菌感染可引起败血症(导致高达30％的死亡率)。另外，大肠杆菌还可引起人类腹泻，造成大面积食物中毒。因此，大肠杆菌已经成为食品安全、公共卫生、环境保护和临床医药化学等领域中的重要检测对象。
对大肠杆菌的检测常采用美国公共卫生协会、美国FDA或AOAC规定的传统方法，主要包括多管发酵法、平板计数法和显微直接计数法等。但是这些方法存在着检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点。如多管发酵法根据大肠杆菌能发酵乳糖产酸、产CO2的特性，利用含乳糖培养基培养不同稀释度的大肠杆菌水样，经初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个检验步骤，操作过程复杂，耗时72h以上，很难满足快速检测大肠杆菌的需要。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是推出一种双酶传感器，其特征在于，该传感器由玻璃棒基底、纳米铟锡氧化物电极、辣根过氧化酶和多元酚氧化酶组成，纳米铟锡氧化物电极以薄膜形式依附在玻璃棒基底的表面，多元酚氧化酶和辣根过氧化酶以薄膜形式依次分别依附在纳米铟锡氧化物电极的表面。
所述的双酶传感器的进一步特征在于，所述的玻璃棒基底的直径为2mm。
所述的双酶传感器的进一步特征在于，所述的电极的电阻值小于40Ω/cm2。
本发明要解决的第二个技术问题是推出制备所述的双酶传感器的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。在依附有纳米铟锡氧化物电极的玻璃棒基底上，采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷分子在纳米铟锡氧化物(ITO)电极上的自组装，通过戊二醛形成席夫碱，将多元酚氧化酶和辣根过氧化酶依次化学键合在纳米铟锡氧化物电极上，制得双酶传感器。
现详细说明本发明的第二个技术方案。
一种制备双酶传感器的方法，其特征在于，具体操作步骤第一步纳米铟锡氧化物电极的制备称取10.0～11.0g的SnCl4·5H2O溶解于200mL二次蒸馏水中，得SnCl4溶液，另称取1.10～1.40g的氯化铟于3.0～4.0mL37％的盐酸中溶解，得氯化铟溶液，将氯化铟溶液倒入SnCl4溶液中，搅拌1h，用25％的氨水调节混合溶液至中性后，在3100r/min的转速下离心分离，沉淀用二次蒸馏水洗涤并离心分离，重复6次，沉淀再用异丙醇洗涤并离心分离，重复2次，将沉淀溶解在6～10g含25％四丁基氢氧化铵的甲醇溶液中，用异丙醇调节溶液的容量至100mL，搅拌12h，制成铟锡氢氧化物的溶胶溶液，将直径为2mm的玻璃棒基底放在丙酮溶液中清洗，放入于煮沸的5％草酸中浸泡1.5h，用二次蒸馏水冲洗干净，采用喷镀法在经过处理的玻璃棒基底表面均匀喷洒一层铟锡氢氧化物的溶胶溶液，室温下干燥，150℃下烘干5min，重复四次喷镀-烘干过程，400℃下灼烧2h，制得纳米铟锡氧化物电极，所述的电极的电阻值小于40Ω/cm2；第二步纳米铟锡氧化物电极的表面修饰将纳米铟锡氧化物电极在H2O2∶NH4OH∶H2O的体积比(v/v)为1∶1∶5的溶液中浸泡0.5～1.5h，在含0.5～1.5％3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中浸泡10～14h，在纳米铟锡氧化物电极的表面完成3-氨基丙基三乙氧基硅烷的自组装。将3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰好的纳米铟锡氧化物电极浸泡于0.5～1.5％的戊二醛溶液中20～40min，在含有0.5～1.5％辣根过氧化酶的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中浸泡10～30min，将辣根过氧化酶薄膜依附在纳米铟锡氧化物电极的表面，在含有0.5～1.5％多元酚氧化酶的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中浸泡10～30min，将多元酚氧化酶薄膜依附在辣根过氧化酶薄膜上，制得双酶修饰电极。
本发明要解决的第三个技术问题是推出用该传感器快速检测大肠杆菌的方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下的技术方案。以所述的双酶传感器为工作电极，采用计时电流法测量流过工作电极的电流实现对水体中大肠杆菌浓度的快速检测。
用该传感器检测多元酚时具有较高的灵敏度和较低的检测限。由于大肠杆菌在含水杨酸的培养液中代谢时产生多元酚2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHBA)，且产生的多元酚的量与大肠杆菌浓度成正比。因此，以双酶传感器为工作电极，采用计时电流法能实现对大肠杆菌浓度的快速检测，所需时间仅为3小时，线性范围为1.6×103～1.0×107cfu/mL，检测限为9.7×102cells/mL。
现详细说明本发明的第三个技术方案。
一种用所述的双酶传感器快速检测大肠杆菌的方法，需在以所述的双酶传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极的电解池中实现，其特征在于，具体操作步骤第一步大肠杆菌溶液的制备将不同浓度的大肠杆菌置于含4.0×10-4～6.0×10-4mol·L-1的水杨酸和葡萄糖的营养培养液中，37℃下培养2～3h；第二步确定大肠杆菌浓度与双酶传感器的响应电流的依从关系以双酶传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，电解池中工作电极的电压设定为-0.05V，在pH5.0～7.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中，采用计时电流法，根据电解池中每次增加一定数量的大肠杆菌而产生的电流变化做出响应电流-大肠杆菌浓度曲线将大肠杆菌浓度及其对应的工作电极响应电流的电流值所对应的坐标点描绘在直角坐标纸上，直角坐标的两个坐标分别为双酶传感器的响应电流的电流值和大肠杆菌浓度，依次逐点连接直角坐标纸上的所有坐标点，得到响应电流-大肠杆菌浓度曲线，该曲线为直线，确定大肠杆菌浓度与双酶传感器的响应电流的依从关系为线性关系；第三步大肠杆菌浓度的快速检测利用第二步确立的响应电流-大肠杆菌浓度曲线，快速检测水体中的大肠杆菌浓度，操作步骤1)量取待测水体样品10mL，过滤除去其中的悬浮固体杂质，离心沉淀，获取其中的细菌；2)将离心得到的细菌按第一步培养；3)按上述的第二步进行操作，记下双酶传感器的响应电流的电流值；4)利用第二步得到的响应电流-大肠杆菌浓度曲线和3)步得到的电流值读出该电流值对应的大肠杆菌浓度，该大肠杆菌浓度就是待测水体的大肠杆菌浓度。
本方法与背景技术相比所具有的优点1、检测所需时间短，仅为3小时。
2、操作简便。
3、检测的灵敏度高，检测限达9.7×102cells/mL，能够满足现代社会快速检测的需求，对于食品，公共卫生和环境监测等方面的大肠杆菌的快速检测有着重要的意义。
图1、图2和图3分别是显现实施例2、实施例4和实施例6的双酶传感器的响应电流与大肠杆菌浓度呈线性关系的示意图。
具体实施例方式
现通过附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。所有实施例完全按上述的操作步骤进行操作。每个实施例仅罗列每一步骤的技术参数。
实施例1制备双酶传感器在第一步中，所使用的SnCl4·5H2O，氯化铟，37％的盐酸的量分别为10.0g，1.10g，3.0mL，6g含25％四丁基氢氧化铵的甲醇溶液；第二步中，在H2O2/NH4OH/H2O的体积比为1∶1∶5(v/v)的溶液中浸泡0.5h，再在含0.5％3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中浸泡10h，然后将电极浸泡于0.5％的戊二醛溶液中20min，最后在含有0.5％过氧化酶的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min，制得双酶传感器。
实施例2用实施例1制备的双酶传感器快速检测大肠杆菌第一步中，水杨酸和葡萄糖的营养培养液浓度为4.0×10-4mol·L-1，培养时间为2h；第二步中，柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液的pH值为5.0；第三步中，实际样品得到的响应电流值对应的大肠杆菌浓度为1.7×103cfu/mL。
实施例3制备双酶传感器在第一步中，所使用的SnCl4·5H2O，氯化铟，37％的盐酸的量分别为10.2g，1.33g，3.5mL，8g含25％四丁基氢氧化铵的甲醇溶液；第二步中，在H2O2/NH4OH/H2O的体积比为1∶1∶5(v/v)的溶液中浸泡1h，再在含1％3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中浸泡12h，然后将电极浸泡于1％的戊二醛溶液中30min，最后在含有1％过氧化酶的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中浸泡20min，制得双酶传感器。
实施例4用实施例3制备的双酶传感器快速检测大肠杆菌第一步中，水杨酸和葡萄糖的营养培养液浓度为5.0×10-4mol·L-1，培养时间为2.5h；第二步中，柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液的pH为6.0；第三步中，实际样品得到的响应电流值对应的大肠杆菌浓度为2.0×103cfu/mL。
实施例5制备双酶传感器在第一步中，所使用的SnCl4·5H2O，氯化铟，37％的盐酸的量分别为11.0g，1.40g，4.0mL，10g含25％四丁基氢氧化铵的甲醇溶液；第二步中，在H2O2/NH4OH/H2O的体积比为1∶1∶5(v/v)的溶液中浸泡1.5h，再在含1.5％3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中浸泡14h，然后将电极浸泡于1.5％的戊二醛溶液中40min，最后在含有1.5％过氧化酶的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中浸泡30min，制得双酶传感器。
实施例6用实施例5制备的双酶传感器快速检测大肠杆菌第一步中，水杨酸和葡萄糖的营养培养液浓度为6.0×10-4mol·L-1，培养时间为3h；第二步中，柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0；第三步中，实际样品得到的响应电流值对应的大肠杆菌浓度为2.2×103cfu/mL。
权利要求
1.一种双酶传感器，其特征在于，该传感器由玻璃棒基底、纳米铟锡氧化物电极、辣根过氧化酶和多元酚氧化酶组成，纳米铟锡氧化物电极以薄膜形式依附在玻璃棒基底的表面，多元酚氧化酶和辣根过氧化酶以薄膜形式依次分别依附在纳米铟锡氧化物电极的表面。
2.根据权利要求1所述的双酶传感器，其特征在于，所述的玻璃棒基底的直径为2mm。
3.根据权利要求1所述的双酶传感器，其特征在于，所述的电极的电阻值小于40Q/cm2。
4.根据权利要求1所述的双酶传感器，其特征在于，所述的玻璃棒基底的直径为2mm，所述的电极的电阻值小于40Ω/cm2。
5.一种制备权利要求1所述的双酶传感器的方法，其特征在于，具体操作步骤第一步纳米铟锡氧化物电极的制备称取10.0～11.0 g的SnCl4·5H2O溶解于200mL二次蒸馏水中，得SnCl4溶液，另称取1.10～1.40g的氯化铟于3.0～4.0mL37％的盐酸中溶解，得氯化铟溶液，将氯化铟溶液倒入SnCl4溶液中，搅拌1h，用25％的氨水调节混合溶液至中性后，在3100r/min的转速下离心分离，沉淀用二次蒸馏水洗涤并离心分离，重复6次，沉淀再用异丙醇洗涤并离心分离，重复2次，将沉淀溶解在6～10g含25％四丁基氢氧化铵的甲醇溶液中，用异丙醇调节溶液的容量至100mL，搅拌12h，制成铟锡氢氧化物的溶胶溶液，将直径为2mm的玻璃棒基底放在丙酮溶液中清洗，放入于煮沸的5％草酸中浸泡1.5h，用二次蒸馏水冲洗干净，采用喷镀法在经过处理的玻璃棒基底表面均匀喷洒一层铟锡氢氧化物的溶胶溶液，室温下干燥，150℃下烘干5min，重复四次喷镀-烘干过程，400℃下灼烧2h，制得纳米铟锡氧化物电极，所述的电极的电阻值小于40Ω/cm2；第二步纳米铟锡氧化物电极的表面修饰将纳米铟锡氧化物电极在H2O2∶NH4OH∶H2O的体积比(v/v)为1∶1∶5的溶液中浸泡0.5～1.5h，在含0.5～1.5％3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中浸泡10～14h，在纳米铟锡氧化物电极的表面完成3-氨基丙基三乙氧基硅烷的自组装。将3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰好的纳米铟锡氧化物电极浸泡于0.5～1.5％的戊二醛溶液中20～40min，在含有0.5～1.5％辣根过氧化酶的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中浸泡10～30min，将辣根过氧化酶薄膜依附在纳米铟锡氧化物电极的表面，在含有0.5～1.5％多元酚氧化酶的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中浸泡10～30min，将多元酚氧化酶薄膜依附在辣根过氧化酶薄膜上，制得双酶修饰电极。
6.一种用权利要求1所述的双酶传感器快速检测大肠杆菌的方法，需在以所述的双酶传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极的电解池中实现，其特征在于，具体操作步骤第一步大肠杆菌溶液的制备将不同浓度的大肠杆菌置于含4.0×10-4～6.0×10-4mol·L-1的水杨酸和葡萄糖的营养培养液中，37℃下培养2～3h；第二步确定大肠杆菌浓度与双酶传感器的响应电流的依从关系以双酶传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，电解池中工作电极的电压设定为-0.05V，在pH5.0～7.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液中，采用计时电流法，根据电解池中每次增加一定数量的大肠杆菌而产生的电流变化做出响应电流-大肠杆菌浓度曲线将大肠杆菌浓度及其对应的工作电极响应电流的电流值所对应的坐标点描绘在直角坐标纸上，直角坐标的两个坐标分别为双酶传感器的响应电流的电流值和大肠杆菌浓度，依次逐点连接直角坐标纸上的所有坐标点，得到响应电流-大肠杆菌浓度曲线，该曲线为直线，确定大肠杆菌浓度与双酶传感器的响应电流的依从关系为线性关系；第三步大肠杆菌浓度的快速检测利用第二步确立的响应电流-大肠杆菌浓度曲线，快速检测水体中的大肠杆菌浓度，操作步骤1)量取待测水体样品10mL，过滤除去其中的悬浮固体杂质，离心沉淀，获取其中的细菌；2)将离心得到的细菌按第一步培养；3)按上述的第二步进行操作，记下双酶传感器的响应电流的电流值；4)利用第二步得到的响应电流-大肠杆菌浓度曲线和3)步得到的电流值读出该电流值对应的大肠杆菌浓度，该大肠杆菌浓度就是待测水体的大肠杆菌浓度。
全文摘要
一种双酶传感器及其制备和应用，属双酶传感器和水体的微生物学检验的技术领域。该传感器由玻璃棒基底、纳米铟锡氧化物电极、辣根过氧化酶和多元酚氧化酶组成，纳米铟锡氧化物电极以薄膜形式依附在玻璃棒基底的表面，多元酚氧化酶和辣根过氧化酶以薄膜形式依次分别依附在纳米铟锡氧化物电极的表面。在依附有纳米铟锡氧化物电极的玻璃棒基底上，采用3－氨基丙基三乙氧基硅烷分子在纳米铟锡氧化物(ITO)电极上的自组装，通过戊二醛形成席夫碱，将多元酚氧化酶和辣根过氧化酶依次化学键合在纳米铟锡氧化物电极上，制得双酶传感器。以所述的双酶传感器为工作电极，采用计时电流法测量流过工作电极的电流实现对水体中大肠杆菌浓度的快速检测。
文档编号C12Q1/10GK101078706SQ20071004200
公开日2007年11月28日 申请日期2007年6月14日 优先权日2007年6月14日
发明者张文, 金利通, 耿萍, 唐辉, 张新爱, 朱伟, 王丹, 郑娇红, 安雅睿 申请人:华东师范大学