一种可用于丙酮丁醇梭菌基因中断的重组质粒的制作方法

专利名称：：一种可用于丙酮丁醇梭菌基因中断的重组质粒的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地说，涉及一种可用于丙酮丁醇梭菌基因中断的重组质粒pSY6。
背景技术：
：丙酮丁醇梭菌(C/oWnWwwaceto勿/"cww)是一种革兰氏阳性、可产孢子、专性厌氧的细菌，它可利用多种碳源，在发酵过程中产生溶剂丙酮、丁醇和乙醇(Abou-Zeid,A.A.，Fouad,M.，andYassein,M.ZentralblBakteriolNaturwiss1978.133:125-134)。丙酮、丁醇是具有多种用途的大宗基础原料，在染料、油漆、塑料、树脂、橡胶等化学化工领域中，可用作多种有机化合物合成的前体；是抗生素及合成药生产过程中所必不可少的溶媒；同时也是食品、香料工业的食品级抽提剂。另一方面，丁醇尚是一种辛烷值(motoroctanenumber)高于乙醇的优质燃料和燃料添加剂。研究表明，丁醇的蒸汽压和蒸发热分别为0.63psi和141.3kcalkg"，低于乙醇的2.25psi和204.1kcalkg";其高沸点(118°C)和低蒸汽压有助于汽车的冷启动；由于丁醇的疏水性比乙醇更强，因此更易于与汽、柴油烃类燃料相混溶；而丁醇的完全燃烧性，可大大降低尾气的C02排放，且不发生残留烃污染，对净化空气十分有利。显然，上述优点有可能使丁醇成为未来发动机新型绿色燃料，替代矿化燃料的可持续发展的再生能源之一。丙酮、丁醇等化学品可通过化学法和生物法生产，后者更加节能、环保。经微生物厌氧发酵生产丙酮、丁醇等溶剂的方法可追溯到上世纪初的第一次世界大战期间，当时橡胶需求激增，天然橡胶资源又相对不足的状况，推动了人工合成橡胶的研究。实践证明，以厌氧发酵产生的丁醇为起始原料来合成丁二烯橡胶是当时生产合成橡胶的最理想路线，并取得成功。因此，在合成橡胶大规模生产的同时，以产溶剂梭菌C/oW/7'力w附ace/o^0^cww为产生菌、以碳水化合物为底物的溶剂发酵得到快速发展，一度成为仅次于酒精的世界第二大生物技术产业，绵延近半个世纪之久。经过半个世纪的黄金发展期后，溶剂发酵因受到石油制品的竞争挤压和发酵原料农副产品价格上升因素的影响，于1970年代逐步退出商业性生产(Zverlov，V.V.,Berezina,O.,Velikodvorskaya，G.A.，andSchwarz,W.H.AppliedMicrobiologyandBiotechnology2006.71:587-597)。但石油毕竟是一种矿化原料，其不可再生且矿藏量受限，后石油时代迟早会到来。随着石油价格的不断上涨及其对经济发展的冲击，加快生物质能源和不依赖石油基化学品生产方法的研究开发已成为日益紧迫的课题。以微生物发酵法生产丙酮、丁醇的技术也重新引起人们的关注。为了使丙酮丁醇梭菌AB发酵法更具优势，人们希望利用代谢工程改造原始菌株，使其更符合工业生产需求。尽管国外丙酮丁醇的代谢工程研究已有十多年，但是由于丙酮丁醇梭菌遗传操作手段的缺乏，使得研究的进展比较缓慢。目前，在丙酮丁醇梭菌中过表达外源基因相对比较成功(Boynton,Z丄"Bennett，G.N.,andRudolph,F.B.柳/肠/謂Mcro編199662:2758-2766)，有许多实验室都具备这样的条件，而对于基因敲除则仍然比较困难。通常，该菌中用于基因敲除的质粒主要为两种非复制型整合载体与复制型整合载体。使用非复制型载体，已成功敲除的有buk，pta，aad，及solR基因(Green，E.M.,andBennett,G.N.J/7;7/5zoc/ze附5她c/wo/1996.57-58:213-221;Green，E.M"Boynton，Z丄"Harris,L.M"Rudolph,RB.，Papoutsakis,E.T"andBennett,G.N.M/cra6/o/ogy1996.142(Pt8):2079-2086;Nair,R.V"Green,E.M.,Watson，D.E.,Bennett,G.N.,andPapoutsakis,E.T.Jow朋/o/6a"m'o/ogy1999181:319-330.)。然而，使用这种方法的重组率非常低，低于1个转化子/ugDNA。并且，有些基因无法用该方法敲除，如spo0A。另一种方法，则是采用可在丙酮丁醇梭菌中复制的穿梭质粒来构建敲除质粒，Harris通过该方法，成功敲除了spoOA(Harris,L.M.，Welker，N.E.，andPapoutsakis,E.T.Joww"/o/6acte〃'o/ogv2002.184:3586-3597)。因为具有可复制的起点，该方法增加了同源重组的机会，然而，要筛选到双交换的重组菌，依然是比较费时费力的。最近，Minton.N.P.etal实验室报道了一种E.coli—Clostridia穿梭的targetron质粒，被命名为pMTL007(该质粒的结构示意图如图1所示)，可用于多种梭菌的基因敲除[http:〃www.clostridia.net/Marie/Events/ClosTronWorkshopManual.pdf]，该质丰立含有来源于Clostridiumbutyriomi的复制子pCB102及启动子，并且其启动子是诱导型的，受IPTG诱导。pMTL007使用来源于Ll丄trB内含子，并且在内含子的第四个结构域中插入了正选记(红霉素)，用于确定内含子是否插入到染色体基因组上。[http://hcaUottingham.ac.uk/minton.pdf]。但是，由于关于pMTL007的细节还没有公开，质粒无法获得。二类内含子LactococcuslactisLl丄trB(Klein,J.R.，andG.M.Dunny.2002.FrontBiosci7:dl843-56)已成功用于多种革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌，如Eyc/m'cWaco/Z,S啤/^/occcwsawre叫C7o欲W画(Chen，Y.，B.A.McClane,D.J.Fisher,J.I.Rood:andP.Gupta.ApplEnvironMicrobiol,200571:7542-7547;Frazier,C.L.,J.SanFilippo,A.M.Lambowitz,andD.A.Mills.ApplEnvironMicrobiol,200369:1121-1128;Karberg,M.，H.Guo:J.Zhong,R.Coon,J.Perutka,andA.M.Lambowitz.NatBiotechnol，200119:1162-1167;Yao,J.，J.Zhong,Y.Fang,E.Geisinger,R.P.Novick,andA.M.Lambowitz.Rna200612:1271-1281)。由于丙酮丁醇梭菌现有的遗传操作系统的不完善，导致基础及应用研究的不方便，因而发展一种新的遗传操作系统，来改善目前的情况，为丙酮丁醇梭菌的代谢工程研究提供便捷，其重要性日益凸显起来。
发明内容本发明的第一个目的在于克服遗传操作系统的不完善的缺陷，从而提供一种重组质粒pSY6，以将其发展成为一种新的遗传操作系统，为丙酮丁醇梭菌的代谢工程研究提供便捷。本发明的另一个目的在于，提供重组质粒pSY6的制备方法。本发明的另一个目的在于，提供重组质粒pSY6的应用。本发明的另一个目的在于，提供pSY6-buk重组质粒载体。本发明的另一个目的在于，提供重组质粒载体pSY6-buk制备方法。本发明的另一个目的在于，提供重组质粒载体pSY6-buk的应用。本发明的另一个目的在于，提供pSY6-solR重组质粒载体。本发明的另一个目的在于，提供重组质粒载体pSY6-solR制备方法。本发明的另一个目的在于，提供重组质粒载体pSY6-solR的应用。为实现上述目的，本申请的发明人以pJIR750ai质粒为模板，PCR扩增获得了Ll丄trB二类内含子，然后将Ll.LtrB二类内含子和质粒载体pIMPl-ptb质粒酶切，纯化并连接，再将获得连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞，培养，构建了了一种targetron质粒pSY6。然后，发明人以该重组质粒为出发质粒，构建了两种基因(buk和solR基因)敲除的重组质粒载体，分别命名为pSY6-buk和pSY6-solR，还进一步分别构建了buk、solR基因敲除的重组菌株，从而证实上述质粒能应用于丙酮丁醇梭菌的代谢工程改造。本发明提供的重组质粒pSY6可作为丙酮丁醇梭菌基因敲除的出发质粒，由于pSY6不含有正选标记，该质粒可在无需抗生素筛选下，进行基因连续敲除。此外，内含子的第四个结构域未插入外源片段，可提高敲除质粒的插入效率，可发展成为一种新的遗传操作系统，以改善目前丙酮丁醇梭研究中现有的遗传操作系统的不完善的情况，从而为丙酮丁醇梭菌的代谢工程研究提供便捷，重组质粒载体pSY6-buk和pSY6-solR可直接用于构建丙酮丁醇梭菌buk和solR基因的敲除的菌株。图1为质粒pMTL007的结构示意图。图2为Ll丄trB二类内含子的PCR产物电泳结果。图3为pIMPl-ptb质粒及Ll丄trB二类内含子PCR产物酶切后电泳结果。图4为pSY6重组质粒的酶切鉴定结果。图5为buk—targetron禾nsolR—targetron片段的电泳结果。图6为pSY6-buk和pSY6-solR重组质粒菌落的PCR验证结果。图7为菌落PCR验证ClostridiumacetobutylicumATCC824buk敲除突变株鉴定结果。图8为ClostridiumacetobutylicumATCC824buk敲除突变株7，20基因组PCR鉴定结果。图9为buktargetron插入ClostridiumacetobutylicumATCC824的示意图。图10为菌落PCR验证ClostridiumacetobutylicumATCC824solR敲除突变株结果。图11为ClostridiumacetobutylicumATCC824solR敲除突变株13，14基因组PCR鉴定结果。图12为solRtargetron插入ClostridiumacetobutylicumATCC824的示意图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本发明中提及的重组质粒载体pSY6-buk和pSY6-solR分别指buk基因和solR基因被敲除的重组质粒载体。本发明中提及的buk—targe加n和solR—targetron片段分别指在IBS，EBS2，EBSld位点碱基经修改后，用于敲除buk及solR基因的片段，属于Ll丄trB内含子一部分，所述的Ll丄trB二类内含子为原核二类内含子，包括ltrA基因。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人的《分子克隆实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明通过利用targetron基因敲除原理，构建了一种新的targe加n衍生质粒pSY6,利用该质粒，可以在ClostridiumacetobutylicumATCC824中进行基因敲除。本发明通过PCR，以pJIR750ai质粒为模板，扩增Ll丄trB二类内含子，经NdeI酶切，连入经同样酶切的E.coli—C.acetobutylicum穿梭载体pIMPl-ptb，得到的重组质粒载体为pSY6，pSY6可作为用于ClostridiumacetobutylicumATCC824基因敲除的targetron载体。通过PCR，扩增buk，solR的targetron片断，经Xhol及BsrGI双酶切，与同样酶切的pSY6载体连接，得到的敲除质粒pSY6-buk，pSY6-solR电转ClostridiumacetobutylicumATCC824。由菌落PCR鉴定出内含子插入的重组菌。经测序确定buk,solR位点分别插入了Ll丄trB内含子片段。本发明使用的菌株和质粒分别为质粒pIMPl-ptb，序列如SEQIDNO:22所示，为E.coliacetobutylicum的穿梭质粒；质粒pANS，序列如SEQIDNO:23所示，具有壮观霉素抗性基因和①3T3甲基化酶基因(该基西功能)；质粒pJIR750ai购自Sigma-Aldrich公司，具有Ll丄trB二类内含子；菌株E.coliER2275购自NEB公司。本发明中使用的PCR纯化Kit和DNA胶回收Kit均购自华舜生物制品有限公司，TargetronGeneKnockoutSystem(TA0100)Kit购自Sigma-Aldrich,生工基因组抽提Kit购自上海生工生物工程有限公司。本发明使用的酶和试剂为KODDNA聚合酶购自Toyobo公司，限制性内切酶，Taq聚合酶购自Fermentas公司，T4连接酶和小牛碱性磷酸酶(CIAP)均购自TaKaRa公司；琼脂购自西巴斯生物技术有限公司。其他常规试剂均为国产或进口分装。实施例1、构建pSY6质粒载体以pJIR750ai质粒为模板，通过PCR扩增该质粒所含有的Ll丄trB二类内含子及1trA基因编码的IEP片断(长度约为3.4kb)，将扩增产物经NdeI酶切后，连入经同样酶切并去磷的E.coli—C.acetobutylicum穿梭载体pIMPl-ptb中，得到的重组质粒载体，命名为pSY6，具体实验步骤如下1.1、引物设计与合成设计引物对In-l(SEQIDNO:4)和In-2(SEQIDNO:5)，在引物In-l的5，端引入NdeI和Xhol的酶切位点，在引物In-2的5'端引入Ndel的酶切位点，其中，Ndel用于构建pSY6，而Xhol则可方便后续targetron敲除片段的连接。1.2、PCR扩增以pJ限750ai质粒为模板，In-l和In-2为引物，进行PCR扩增。其中，PCR反应体系(100lU)为KOD酶KODbuffer10ul，MgCl2(25uM)10ul，dNTP(2.5uM)8nl，引物In-l(10uM)4tU，引物In-2(10liM)4ul，质粒模板2ul，ddH2061ul。PCR反应条件为95°C，5min;95°C，30s，55°C，30s，72°C，3.5min，30个循环；72°C，lOmin。取上述PCR产物，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，Lanel为L1丄trB二类内含子，约3.4kb;Lane2为1kbDNAladder。根据图2的结果，经PCR扩增得到Ll.LtrB二类内含子片段，大小为3.4kb。再将电泳后3.4kb处的产物割胶，然后参考使用手册，使用华舜公司的胶回收Kit回收，获得纯化后的Ll丄trB二类内含子，纯化后获得的Ll丄trB二类内含子进行电泳检测，结果显示仅在3.4kb大小处有一条带。1.3、构建pSY6质粒载体将纯化后的Ll丄trB二类内含子和质粒载体pIMPl-ptb质粒分别用Ndel酶切，然后使用华舜公司的胶回收Kit纯化回收，Ndel酶切后的质粒以小牛碱性磷酸酶，于37'C去磷处理半小时，然后再次使用华舜公司的胶回收Kit纯化回收去磷后的pIMPl—ptb质粒，其中电泳结果如图3所示。根据图3的结果，pIMPl-ptb质粒经NdeI酶切、去磷化、纯化后获得的片段，其大小为4.6kb;Ll丄trB二类内含子PCR产物经Ndel酶切并纯化后获得片段，大小为3.4kb。然后，将回收的酶切后的片断和pIMPl-ptb质粒载体，用T4连接酶，于16'C，连接过夜，将获得的连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞，然后，挑取重组子于含100ug/ml红霉素(Amp)的LB培养基中，37°C，培养过夜后，抽提质粒。用BamHI酶切鉴定抽提获得的质粒，结果如图4所示，其中，Lanel—9为重组质粒1，2，5，6，7为反向克隆，3，4，8，9为正向克隆;LanelO为lkbDNAladder。根据图4的结果，3，4，8，9为目的重组子，Ll丄trB二类内含子正向连接于ptb启动子下游，所获得的反向克隆子命名为pSY6质粒载体。挑取4号正向克隆子进行测序，结果显示其序列如SEQIDNO:1所示。当然，使用其他合适的载体代理pIMPl-ptb，例如，可以采用替换复制子或启动子的方法，可以构建出可替代pIMPl-ptb的合适的质粒载体，对于本领域的工作人员来说是显而易见的，因此这也属于本发明所要保护的内容。同样，根据本发明揭示的内容，使用其他的原核二类内含子代替Ll丄trB二类内含子，这对于本领域的工作人员来说是显而易见的，因此这也属于本发明所要保护的内容。实施例2、构建pSY6-buk，pSY6-solR质粒载体通过PCR，分别扩增buktargetron片断和solRtargetron片断，经Xhol及BsrGI双酶切，与同样酶切的pSY6载体分别连接，得到的敲除质粒pSY6-buk和pSY6-solR。其中，扩增buktargetron,solRtargetron的模板及引物设计源于Sigma—Aldrich公司的TargetronGeneKnockoutSystem(TA0100)Kit。具体步骤如下2.1、引物设计与合成参考TargetronGeneKnockoutSystem(TA0100)Kit提供的方法，分别设计引物buk—IBS(SEQIDNO:6)、buk—EBSld(SEQIDNO:7)和buk—EBS2(SEQIDNO:8)，用于构建pSY6-buk质粒载体；以及solR—IBS(SEQIDNO:9)、solR—EBSld(SEQIDNO:10)和solR—EBS2(SEQIDNO:11),用于构建pSY6陽solR质粒载体。另外，还需要使用由TargetronTMGeneKnockoutSystem(TA0100)Kit提供的通用引物EBS。2.2、PCR扩增参考厂商提供的方法及其提供的模板，使用Sigma—Aldrich的TargetronGeneKnockoutSystem(TA0100)Kit进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，结果如图5所示，其中，图5a为buk-targetron的片段电泳结果，图5b为solR-targe加n的片段电泳结果。根据图5结果，在350bp处有条带，说明经PCR扩增分别得到buk—targetron及solR—targetron片段。然后，使用华舜公司的胶回收Kit纯化回收PCR产物，收获buk—targetron和solR—targetron片段。2.3、构建pSY6-buk和pSY6-solR重组质粒载体将PCR纯化后获得的buk—targetron和solR—targetron片段使用Xhol及BsrGI进行酶切，同时使用XhoI及BsrGI酶切载体pSY6，酶切后产物都以华舜公司的胶回收Kit纯化回收。回收后的酶切片段分别与酶切载体，使用T4连接酶，于16'C过夜连接，连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞，在LB培养基中培养，然后对获得的重组子，采用菌落PCR验证。菌落PCR验证方法如下以buk-IBStrop(SEQIDNO:12)和buk-EBSld(SEQIDNO:13)作为引物，挑取平板上的菌落做模板，进行PCR反应，以验证pSY6-buk重组质粒；solR-IBStrop(SEQIDNO:14)和solR-EBSld(SEQIDNO:15)作为引物，挑取平板上的菌落做模板，进行PCR反应，以验证pSY6-solR重组质粒。PCR反应体系釆用与实施例1相同的反应体系。PCR反应条件95°C5min;95。C30s，55°C30s，72°C30s，30个循环；72°C2min。取上述PCR产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测结果如图6所示，其中，图6a为pSY6-buk重组质粒菌落的PCR验证结果，Lanel—10用于验证的菌落，Lanell为lkbDNAladder;Lanel2为阴性对照；Lanel3为正对照，以buk-targetronPCR产物为模板；图6b为pSY6-solR重组质粒菌落的PCR验证结果，Lanel—13用于验证的菌落，Lanel4为lkbDNAladder;Lanel5为阴性对照；Lanel6为正对照，以solR-targetronPCR产物为模板。由图6的结果可见，Lanel—lO的条带位置与正对照(LaneB)—致，说明buk—targetron，solR—targetron片段已连接于pSY6载体，连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞后获得的重组子分别含有重组质粒pSY6-buk和pSY6-solR。再从中各挑选3个菌落的重组质粒(pSY6-buk为No.1，2,3;pSY6-solR为No.l，2，3)进行测序，结果显示pSY6-buk和pSY6-solR的序列分别如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。然后，以20%甘油，—7(TC条件下，保存含有重组质粒pSY6-buk和pSY6-solR的￡.co/ZDH5a保存在一2(TC。实施例3、构建buk基因敲除的重组菌株Clostridiumacetobutylicum将pSY6-buk质粒经E.coliER2275/pANS在Cac8I位点甲基化后，电转ClostridiumacetobutylicumATCC824，复苏过夜后，取100u1细胞液涂布于Amp(25ug/ml)抗性平板，于37。C，厌氧箱内培养48-96小时后，挑单菌采用菌落PCR验证，具体步骤如下3.1、pSY6-buk质粒的甲基化pANS转化E.coliER2275，获得E.coliER2275/pANS。制备E.coliER2275/pANS的化学感受态细胞，然后将pSY6—buk质粒转化E.coliER2275/pANS，由于pANS质粒具有壮观霉素抗性，故在含有100jng/mlAmp,50pg/ml壮观霉素的LB培养基平板上过夜培养，然后挑单菌落至4ml加有100ng/mlAmp，50pg/ml壮观霉素的LB培养基中，过夜培养。参考操作手册，将获得的含pANS及pSY6—buk的E.coliER2275，用质粒抽提Kit抽提质粒，获得Cac824I识别位点已甲基化的质粒pSY6一buk。电转Clostridiumacetobutylicum时，为保证外源DNA的质量，可使用Kit抽提，为控制其浓度为200—300ug/ml,并且OD260/OD280在1.71.9之间，可用分光光度计检测质粒质量。3.2、电转pSY6—buk质粒至ClostridiumacetobutylicumATCC824挑步骤3.1中含pANS及pSY6—buk的E.coliER2275的单菌落至CGM培养基(2g(NH4)2S04，lgK2HP04，0.5gKH2PO4，0.1gMgSO4.7H20，0.015gFeSO4.7H20，O.OlgCaCl2,O.OlgMnS04.H20，0.002gCoCl2，0.002gZnSO4，2gTryptone，lgYeastExtraction,50gGlucose,溶于1L水中)，37'C培养过夜；次日，以1%比例转接至100mlCGM培养基中，于37。C培养至OD600为0.7左右，取50ml菌液，4000rpm,4'C离心10min,弃去上清；再以ETM缓冲液(270mM蔗糖，0.6mMNa2HP04,4.4mMNaH2P04，10mMMgCl2)悬浮，4000rpm，4'C离心10min，弃去上清；然后以l.OmiET缓冲液(270mM蔗糖，0.6mMNa2HPO4，4.4mMNaH2P04)悬浮；取100iU悬浮液，加入lug质粒，混匀后，加入电转杯中(2mm)，使用MicroPulserTM电转仪电转，电击条件为电压2.0kV，其余参考使用手册。电击后，再加入CGM培养基lml，37°C培养过夜，以100pl细胞液悬浮，涂布于红霉素(25Pg/ml)抗性平板，培养约2—3天，平板长出70个菌落，计算电转化率，电转化率采用如下方法计算电转化率-平板上生长菌落数X细胞液总体积/涂布于平板的细胞液体积根据该方法计算，获得电转化率为0.77Xl()S转化子/PgDNA。3.3、构建buk敲除的菌落PCR引物设计引物对buk—for和buk—rev,其序列分别如SEQIDNO:16禾卩SEQIDNO:17所示。由于buk—targetron引物设计时，预计在染色体buk基因内49-50nt之间正向插入内含子，因而选取验证的引物为buk49/50nt上下游约100左右，若有内含子插入(如图9所示)，则菌落PCR能扩增到lkb左右的条带，如果是野生型的，则扩增不到该大小的条带。3.4、菌落PCR验证以实施例3.2获得的菌落为模板，实施例3.3构建的引物对为引物，进行菌落PCR，检验实施例3.2获得的菌落中内含子的插入情况。PCR反应体系采用实施例1相同的反应体系。PCR反应条件95。C5min;95°C30s，55°C30s，72°C70s,30个循环;72°C2min。取上述PCR产物，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图7所示，Lanel以野生型ClostridiumacetobutylicumATCC824基因组为模板，Lane2为阴性对照，Lane3以pSY6一buk质粒为模板，Lane4为lkbDNAladder,Lane5-17以菌落为模板。根据图7结果，所挑选的26个丙酮丁醇梭菌中，有16个菌落能扩增到lkb左右的条带，说明该16个菌落有内含子的插入(如箭头所示)，内含子插入效率为61.5%。3.5、buk敲除的其他验证随机抽提菌落PCR中阳性重组菌7，20的基因组为模板，以PCR鉴定内含子插入情况，在该PCR过程中，使用两对引物(分别还是同时)，其中，一对引物对与鉴定菌落PCR使用的引物相同，另一对引物对为buk49/50下游引物buk—rev和intron内部引物EBS2。结果如图8所示，其中，Lanel和6以野生型ClostridiumacetobutylicumATCC824基因组为模板，Lane2和7以ClostridiumacetobutylicumATCC824buk敲除突变株No.7基因组为模板，Lane3和8以ClostridiumacetobutylicumATCC824buk敲除突变株No.20基因组为模板，Lane4和9为阴性对照，Lane5和10以pSY6—buk质粒为模板，Lanel1为lkbDNAladder;Lanel—5的PCR引物对为buk—for和buk-rev,Lane6—10的PCR引物对为buk一rev和buk—EBS2。图8结果说明重组菌7，20的buk基因内部有intron片段插入。再纯化回收由菌落PCR扩增所获得的lkb条带，并将该条带进行测序，测序结果与SEQIDNO:18所示序列相同。测序结果显示，C7oW〃W/w加""/o6wOV/a/wATCC824buk敲除突变菌株的solR基因在49/50位点正向插入了内含子片段，示意图如图9所示，使得buk基因失活，从而成功构建了buk基因敲除的重组菌株Clostridiumacetobutylicum。实施例4、solR基因敲除的重组菌株Clostridiumacetobutylicum构建将pSY6-solR质粒经E.coliER2275/pANS在Cac8I位点甲基化后，电转ClostridiumacetobutylicumATCC824，复苏过夜后，取100p1细胞液涂布Emr(25yg/ml)抗性平板筛选，37°C,厌氧箱内培养48-96小时，挑单菌采用菌落PCR验证。具体步骤如下实施例4.1与4.2采用与实施例3.1和3.2相同的方法和步骤，甲基化pSY6-solR质粒并将其电转至ClostridiumacetobutylicumATCC824,测得其电转化率为0.48X103转化子/UgDNA。4.3、引物设计设计solR敲除的菌落PCR引物对solR-for和solR-rev，其序列分别如SEQIDNO:19禾QSEQIDNO:20所示。solR—targetron引物设计时，预计在染色体solR基因内468/469nt反向插入内含子之间，所以选取验证的引物为solR468/469上下游约150左右，若有内含子插入(如图12所示)，则菌落PCR能扩增到1.2kb左右的条带，如果是野生型的，则扩增不到该大小的条带，而是300bp左右大小。4.4、SolR敲除的验证采用与实施例3.4相同的方法，以菌落PCR鉴定solR敲除的重组菌，其中，以实施例4.2获得的菌落为模板，以solR468/469上游引物solR—for和下游引物solR—rev作为引物进行PCR扩增，以鉴定插入片断；结果如图10所示，其中，图10a中，Lanel—ll以ClostridiumacetobutylicumATCC824solR敲除菌落为模板，Lanel2为lkbDNAladder,Lanel3为阴性对照，Lanel4以野生型ClostridiumacetobutylicumATCC824基因组为模板，Lanel5以pSY6—solR质粒为模板；图10b中，Lanel—13以菌落为模板，Lanel4为lkbDNAladder。根据图10结果，所挑取的24个菌中有6个有内含子片段插入solR位点，如箭头所示，内含子插入效率为25%。随机挑取菌落PCR鉴定正确的重组菌No.13，14，抽提基因组，以基因组为模板，分别以两对PCR鉴定其内含子插入与否。其中，一对引物对为solR468/469上游引物solR_for和intron内部引物EBS2;另一对引物对为与菌落PCR验证的引物相同的引物，结果如图ll所示，其中，Lanel和6以野生型ClostridiumacetobutylicumATCC824基因组为模板，Lane2和7以ClostridiumacetobutylicumATCC824solR敲除突变株No.13基因组为模板，Lane3和8以ClostridiumacetobutylicumATCC824solR敲除突变株No.14基因组为模板，Lane4和9为阴性对照，Lane5和10以pSY6—solR质粒为模板，Lanell为lkbDNAladder;Lanel—5中PCR引物为solR—for,solR-rev;Lane6—10中PCR引物为solR—for,solR—EBS2。图11的结果说明所挑取的ClostridiumacetobutylicumATCC824solR敲除突变株No.13和No.14的基因组solR位点有内含子片段的插入。再纯化回收由菌落PCR扩增所获得的的1.2kb条带，并对该条带进行测序，测序结果与SEQIDNO:21所示序列相同。测序结果说明，C/o^v'^wwflceto6w0^cwwATCC824solR敲除突变菌株的solR基因在468/469位点反向插入了内含子片段，示意图如图12所示，使得solR基因失活，从而成功构建了solR基因敲除的重组菌株Clostridiumacetobutylicum。综上所述，本发明提供的重组质粒pSY6可作为丙酮丁醇梭菌基因敲除的出发质粒，能高效(电转化率能达到数百个转化子/ygDNA)，快速地进行基因敲除，可发展成为一种新的遗传操作系统，以改善目前丙酮丁醇梭研究中现有的遗传操作系统的不完善的情况，从而为丙酮丁醇梭菌的代谢工程研究提供便捷，重组质粒载体pSY6-buk和pSY6-solR可直接用于构建丙酮丁醇梭菌buk和solR基因的敲除的菌株。序列表〈110〉中国科学院上海生命科学与技术学院〈120〉一种可用于丙酮丁醇梭菌基因中断的重组质粒pSY6〈130〉P5071045〈歸23〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉8032〈212〉DNA<213〉丙酮丁醇梭菌〈400〉1tcgagataattatccttaccagcccatagggtgcgcccagatagggtgttaagtcaagta60gtttaaggtactactctgtaagataacacagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaaa120gctgatacgggaacagagcacggttggaaagcgatgagttacctaaagacaatcgggtac180gactgagtcgcaatgttaatcagatataaggtataagttgtgtttactgaacgcaagttt240ctaatttcggttgctggtcgatagaggaaagtgtctgaaacctctagtacaaagaaaggt300aagttaagcctatggacttatctgttatcaccacatttgtacaatctgtaggagaaccta360tggg犯cg犯acgaeiagcgatgccgagaatctgaatttaccaagacttaacact犯ctgg420ggataccctaaacaagaatgcctaatag犯aggagg已a犯aggctatagcactagagctt480gaaaatcttgcaagggtacggagtactcgtagtagtctgagaagggtaacgccctttaca540tggcaaaggggtacagttattgtgtactaaaattaaaaattgattagggaggaa犯cctc600aaaatgaaaccaacaatggcaattttagaaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatata660gacgaagtttttacaagactttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcg720acgcgttgggaaatggcaatgatagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcal780tgtcatcgtcacgtgattcataaacacaagtgaatgtcgacagtgaatttttacgaacga840acaataacagagccgtatactccgagaggggtacgtacggttcccgaagagggtggtgca900犯ccagtcacagt犯tgtgaacaaggcggtacctccctacttcaccatatcattttctgc960agccccctag犯ataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatatggctagatc1020gtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatg1080caatttctatgcactcgtagtagtctgagaagggtaacgccctttacatggca犯ggggt1140acagttattgtgtact犯aattaaa^ttg3ttagggsgga犯acctcaaaatgaaacca1200acaatggcaattttagaaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatatagacgaagttttt1260acaagactttatcgttatcttttscgtccagatatttattacgtggcgtatcaaaattta1320tattccaataaaggagcttccacaaaaggaatattagatgatacagcggatggctttagt1380gaagaaaaaat犯aaaagattattcaatctttaaaagacggaacttactatcctcaacct1440gtacgaagaatgtatattgcaaaaaagaattctaaaaagatgagacctttaggaattcca1500actttcacagataaattgatccaagaagctgtgagaataattcttgaatctatctatgaa1560ccggtattcgaagatgtgtctcacggttttagacctcaacgaagctgtcacacagctttg1620aaaacaatcaaaagagagtttggcggcgcaagatggtttgtggagggagatataaaaggc1680tgcttcgataatatagaccacgttacactcattggactcatcaatctt犯aatcaaagat1740atg犯aatgagccaattgatttataaatttctaaaagcaggttatctggaaaactggcag1800tatcacaa朋cttacagcggaacacctcaaggtggaattctatctcctcttttggccaac1860atctatcttcatgaattggataagtttgttttacaactcaaaatg犯gtttgaccgagaa1920agtccagaaagaataacacctgaatatcgggagctccacaatgagataaaaagaatttct1980caccgtctcaagaagttggagggtgaagaaaaagcta犯gttcttttagaatatcaagaa2040aaacgtaaaagattacccacactcccctgtacctcacagacaaataaagtattgaaatac2100gtccggtatgcggacgacttcattatctctgttaaaggaagcaaagaggactgtcaatgg2160ataaaagaacaattaaaactttttattcataacaagctaaaaatggaattgagtgaagaa2220aaaacactcatcacacatagcagtcaacccgctcgttttctgggatatgatatacgagta2280aggagatctggaacgataaascgatctggtaaagtcaaaaagagaacactcaatgggagt2340gtagaactccttattcctcttcaagacaaaattcgtcaatttatttttgac犯gaaaata2400gctatccaaaag犯agatagctcatggtttccagttcacaggaaatatcttattcgttca2460acEigacttagaeLatcatcacaatttataattctgaactccgcgggatttgtaattactac2520ggtctagcaagtaattttaaccagctcaattattttgcttatcttatggaatacagctgt2580ctaaaaacgatagcctccaaacataagggaacactttcaaaaaccatttccatgtttaaa2640gatggaagtggttcgtgggggatcccgtatgagat幼agcaaggt犯gcagcgccgttat2700tttgc犯attttagtgaatgtaaatccccttatcaatttacggatgagataagtcaagct2760cctgtattgtatggctatgcccggaatactcttgaaaacaggtta犯agctaaatgttgt2820gaattatgtgggacgtctgatg犯aatacttcctatgaaattcaccatgtcaataaggtc2880aaaaMcttaaaggcaaagaaa犯tgggaaatggc犯tgataLgcg犯acascgtaaaact2940cttgttgtatgctttcattgtcatcgtcacgtgattcataaacacaagtgaatgtcgagc3000acccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgct3060acttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcgccaa3120gccgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaat3180a犯acga犯ggctcagtcga33gactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtg犯3240cgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttg犯cgttgcgaagcaacggcc3300cggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgcc邓gcatcaaattaagcag犯ggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttcctgtcgtcatatctacaag3420catatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgaca3480cccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacag3540acaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaa3600acgcgcgagacga犯gggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataat3660aatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcgg犯cccctatttg3720tttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgata犯t3780gcttcaataatattga犯aaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttat3840tcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagt3900aaaagatgctg犯gatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacag3%0cggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcactttt犯4020agttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcg4080ccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatct4140tacggatggcatgacagtaagag犯ttatgcagtgctgccataaccatgagtgataacac4200tgcggcc犯cttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgca4260caacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccat4320acc犯acgscg3gcgtgsc3cc3cg3tgcctgtagcastggcascseicgttgcgcaaact4380attaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggc4440ggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctga4500taaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatgg4560taagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacg4620aaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagacc已4680agtttactcatatatactttagattgattt犯aacttcatttttaatttaaaaggatcta4740ggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgsgttttcgttccs4800ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcg4860cgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccgga4920tc朋gagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaa4980tactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcc5040tacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgatetagtcgtg5100tcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaac5160ggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacct5220acagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccg犯gggagaaaggcggacaggtatcc5280ggt卿cggc鄉gtcggaacagg卿gcgcacg鄉gagcttccagggggaaacgcctg5340gtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatg5400ctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcct5460ggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtgga5520taaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcg5580cagcgagtcagtgagcgaggsagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgc5640gcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcag5700tgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaa5820cagctatgaccatgattacgccaagctttggctaacacacacgccattccaaccaatagt5880tttctcggcataaagccatgctctgacgcttaaatgcactaatgccttaaaaaaacatta5940aagtctaacacactagacttatttacttxgtaattaagtcgttaaaccgtgtgctctacg6000accaaaagtataaaacctttaagaactttcttttttcttgtaaaaaaagaaactagataa6060atctctcatatcttttattcaataatcgcatcagattgcagtataaatttaacgatcact6120catcatgttcatatttatcagagctcgtgctataattatsctaattttataaggaggaaa6180犯ateL6i3gagggtt3t犯tg犯cga^犯3atat犯犯c3cagtc3a犯ctttetttactt6240caaaacataatatagataaaataatgacaaatataagattaaatgaacatgataatatct6300ttgaaatcggctcaggaaaagggcattttacccttgaattagtacagaggtgt犯tttcg6360taactgccattgaaiatagaccataaattatgc犯aactacagaaaataaacttgttgatc6420acgataatttcc犯gttttaaac犯ggatatattgcagtttaaatttcctaaaaaccaat6480cctataaaatatttggtaatataccttataacataagtacggatataatacgcaaaattg6540tttttgatagt6Ltsgctgatgagatttatttaatcgtggaatacgggtttgct犯aagat6600tattaaatacaaaacgctcattggcattatttttaatggcagaagttgatatttctatat6660t幼gtatggttccaagsgaat3ttttcatcct3朋ccta33gtgast3gctcacttatca6720gattaaatagaaaaaastcsagastatcacac3aagata3scagaagtataattatttcg6780ttatg犯atgggtt犯caaagaatsc犯gaa犯tatttaca犯aaMc犯tttaacaatt6840ccttaaaacatgcaggaattgacgatttaaacaatattagctttgaacaattcttatctc6900ttttcaatagctataaattatttaataagtaagttaagggatgcataaactgcatccctt6960aacttgtttttcgtgtacctattttttgtgaatcgattatgtcttttgcgcattcacttc7020ttttctatataaatatgagcgaagcgaataagcgtcggaaaagcagc犯aaagtttcctt7080tttgctgttggagcatgggggttcagggggtgcagtatctgacgtcaatgccgagcgaaa7140gcgagccgaagggtagcatttacgttagataaccccctgatatgctccgacgctttatat7200agaaaagaagattcaactaggtaaaatcttaatataggttgagatgataaggtttataag7260gaatttgtttgttctaatttttcactcattttgttctaatttcttttaacaaatgttctt7320tttttttt3g犯c3gttstg3tat3gttag犯t3gttt33犯t犯ggagtg3g33333ggi7380tgaaagaaagatatgg幼cagtctataaaggctctcagaggctcatagacgaagaaagtg7440gagaagtcatagaggtagacaagttataccgtaaacaaacgtctggt犯cttcgtaaagg7500catat3tagtgc犯tt^t33gtatgttagatatgattggcggaaa犯aactt犯犯tcg7560ttaactatatcctagataatgtccacttaagt犯caatacaatgatagctacaacaagag76206Laatagcaaaagctac3ggaacaagtctacaaacagt犯taac犯cacttaaaatcttag7680aagaaggaaatattat犯aaagaaaa^ctggagtattaatgttaa3ccctgaactactaa7740tgagaggcgacgaccaaaaacaa犯atacctcttactcgaatttgggaactttgagcaag7800aggcaaatgaaatagattgacctcccaataacaccacgtagttattgggaggtcaatcta7860tgaaaatgcgattaagcttggctgcaggtcgacggatccccgggaattctat犯aatata7920aataattttctaa犯aacttaacttcatgtgaaaagtttgttaaaatatsaatgagcacg7980tt犯tcatttaacatagataattaaatagtaaaagggagtgtcgacatatgc8032<210〉2〈211〉8032<212〉DNA〈213〉丙酮丁醇梭菌<400〉2tcgagataattatccttacaactcaaattggtgcgcccagatagggtgttaagtcaagta60gtttaaggtactactctgtaagataacacagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaaa120gctgatacgggaacagagcacggttggaaagcgatgagttacctaaagacaatcgggtac180gactgagtcgc犯tgttaatcagatataaggtataagttgtgtttactgaacgcaagttt240ctaatttcggttagttgtcgatagaggaaagtgtctgaaacctct已gtacaaagaaaggt300aagttaaccaatttgacttatctgttatcaccacatttgtacaatctgtaggagaaccta360tgggaacgaaacgaaagcgatgccgagaatctgaatttaccaagacttaacactaactgg420ggataccctaaacaagaatgcctaatagaaaggaggaaaaaggctatagcactagagctt480gaaaatcttgc犯gggtacggagtactcgtagtagtctgag犯gggtaacgccctttaca540tggcaaaggggt3cagttsttgtgtact犯aatta犯犯ttgatt3gggEigga^a犯cctc600aaaatgaaaccaacaatggcaattttagaaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatata660gacgaagtttttacaagactttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcg720acgcgttgggaaatggcaatgatagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcat780tgtcatcgtcacgtgattcataaacacaagtgaatgtcgacagtgaatttttacgaacga840acaataacagagccgtatactccgagaggggtacgtacggttcccgaagagggtggtgca900aaccagtcacagtaatgtgaacaaggcggtacctccctacttcaccatatcattttctgc%0agccccctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatatggctagatc1020gtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatg1080caatttctatgcactcgtagtagtctgagaagggtaacgccctttacatggc犯aggggt1140acagttaltgtgtact幼aatt犯aaattgattagggaggaaaacctcaa犯tga犯cca1200acaatggc犯tttt3gaaagaMcagtaaaaattcacaagaB^ta^g3cg犯gttttt1260acaagactttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcgtatcaaaattta1320tattccaata犯ggagcttccacaaaaggaatattagatgatacagcggatggctttagt1380gaagaaaaaataaaaaagattattcaatctttaaaagacggaacttactatcctcaacct1440gtacgaagaatgtatattgcaaaaaagaattctaaaaagatgagacctttaggaattcca1500actttcacagataaattgatccaagaagctgtgagaataattcttgaatctatctatgaa1560ccggtattcgaagatgtgtctcacggttttagacctcaacgaagctgtcacacagctttg1620aaaacaatcaaaagagagtttggcggcgcaagatggtttgtggagggagatataaaaggc1680tgcttcgataatatagaccacgttacactcattggactcatcaatcttaaaatcaaagat1740atgaaaatgagccaattgatttataaatttctaaaagcaggttatctggaaaactggcag1800tatcacaaaacttacagcggaacacctcaaggtggaattctatctcctcttttggccaac1860atctatcttcatg朋ttggat幼gtttgttttacaactcaaastgaagtttgsccgsgaa1920agtccagaaag犯taacacctgaatatcgggagctccacaatgagataaaaagaatttct1980caccgtctcaagaagttggagggtgaagaaaaagctaaagttcttttagaatatcaagaa2040aaacgtaaaagattacccacactcccctgtacctcacagacaaataaagtattgaaatac2100gtccggtatgcggacgacttcattatctctgttaaaggaagcaaageiggactgtcaatgg2160ataaaag犯caattaa犯ctttttattcataacaagcta^aaatggaattgagtgaagaa2220aaaacactcatcacacatagcagtcaacccgctcgttttctgggatatgatatacgagta2280aggagatctggaacgat犯aacgatctggtaa^gtcaa犯agag已acactcaatgggagt2340gtagaactccttattcctcttcaagacaaaattcgtcaatttatttttgacaagaaaata2400gctatccaaaagaaagatagctcatggtttccagttcacaggaaatatcttattcgttca2460acagacttagaaatcatcacaatttataattctgaactccgcgggatttgtaattactac2520ggtctagcaagtaattttaaccagctcaattattttgcttatcttatggaatacagctgt2580ctaaaaacgatagcctccaaacataagggaacactttcaa犯accatttccatgtttaaa2640gatggaagtggttcgtgggggatcccgtatgagataaagcaaggtaagcagcgccgttat2700tttgcaaattttagtgaatgtaaatccccttatcaatttacggatgagataagtcaagct2760cctgtattgtatggctatgcccggaatsctcttgaaaacaggtta犯agct犯eitgttgt2820gaattatgtgggacgtctgatgaaaatacttcctatgaaattcaccatgtcaataaggtc2880aaaaatcttaaaggcaaaga犯aatgggaaatggcaatgatagcgaa^caacgtaaaact2940cttgttgtatgctttcattgtcatcgtcacgtgattcataaacacaagtgaatgtcgagc3000acccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgct3060acttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcgccaa3120gccgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaat3180犯犯cgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttstctgttgtttgtcggtgaa3240cgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttg犯cgttgcgaagcaacggcc3300cggagggtggcgggcaggacgcccgccstaaactgccaggcatca犯ttaagcagaaggc3360catcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttcctgtcgtcatatctacaag3420catatggtgcactctcagtac犯tctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgaca3480cccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacag3540acaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaa3600acgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataat3660aatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttg3720tttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaat3780gcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaeicatttccgtgtcgcccttat3840tcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccag犯acgctggtgaaagt3900aa犯gatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttax:atcg犯ctggatctcaacag3%0cggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaa4020agttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcg4080ccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatct4140tacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacac4200tgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgca4260caacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccgggigctgaatgaagccat4320acca犯cgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaact4380attaactggcgaactacttactct已gcttcccggcaacaattaatagactggatggaggc4440ggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctga4500taaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatgg4560taagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacg4620aaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagacca4680agtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatcta4740ggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca4800ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcg4860cgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccgga4920tcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaa4980tactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcc5040tacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtg5100tcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctg肌c5160ggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacct5220acagcgtg解ctatgag犯agcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatcc5280ggtaagcggcagggtcgg犯cagg卿gcgcacgagggagcttccaggggg犯acgcctg5340gtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatg5400ctcgtcaggggggcggagcctatgga朋aacgcc3gcascgcggcctttttacggttcct5460ggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtgga5520taaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcg5580cagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgc5640gcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcag5700tgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactt5760tatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaa5820cagctatgaccatgattacgccaagctttggctaacacacacgccattccaaccaatagt5880tttctcggcataaagccatgctctgacgcttaaatgcactaatgccttaaaaaaacatta5940aagtctaacacactagacttatttacttcgtaattaagtcgttaaaccgtgtgctctacg6000accaaaagtataaaacctttaagaactttcttttttcttgtaaaaaaagaaactagataa6060atctctcatatcttttattcaataatcgcatcagattgcagtataaatttaacgatcact6120catcatgttcatatttatcagagctcgtgctataattatactaattttataaggaggaaa6180aaataaagagggttataatgaacgagaaaaatataaaacacagtcaaaactttattactt6240caaaacst犯tat3gat3犯ataatgac犯atataagattaaatga^acatgat犯tatct6300ttgaaatcggctcaggaaaagggcattttacccttgaattagtacagaggtgtaatttcg6360taactgccattgaaatagaccata犯ttatgcaaaactacagaaaataaacttgttgatc6420acgataatttccaagttttaaacaaggatatattgcagtttaaatttcctaaaaaccaat6480cctataaaatatttggtaatataccttataacataagtacggatataatacgcaaaattg6540tttttgatagtatagctgatgagatttatttaatcgtggaatacgggtttgctaaaagat6600tatta犯tacaaaacgctcattggcattatttttaatggcagaagttgatatttctatat6660t3agtatggttccaagagaatattttcatcctaaacct犯agtgaatagctcacttatca6720gattaaatagaaaaaaatcaagaatatcacacaaagataaacagaagtataattatttcg6780tta/tgaaatgggttaacaaagaatacaagaaaatatttacaaaaaatcaatttaacaatt6840ccttaaaacatgcaggaattgacgatttaaacaatattagctttgaacaattcttatctc6900ttttcaatagctataaattatttaataagtaagttaagggatgcataaactgcatccctt6960aacttgtttttcgtgtacctattttttgtgaatcgattatgtcttttgcgcattcacttc7020ttttctatataaatatgagcgaagcgaataagcgtcggaaaagcagcaaaaagtttcctt7080tUgctgttggagcatgggggttcagggggtgcagtatctgacgtcaatgccgagcgaaa7140gcgagccgaagggtagcatttacgttagataaccccctgatatgctccgacgctttatat7200agaaaag犯gattcaactaggtaaaatcttaatataggttgagatgataaggtttataag7260gaatttgtttgttctaatttttcactcattttgttctaatttcttttaacaaatgttctt7320ttttttttagaacagttatgatatagttagaatagtttaaaataaggagtgagaaaaaga7380tgaaagaaagatatggaacagtctataaaggctctcagaggctcatagacgaagaaagtg7440gagaagtcatagaggtagacaagttataccgtaaacaaacgtctggtaacttcgtaaagg7500catatatagtgcaatt犯taagtatgttagatatgattggcggaaaaaaacttaaaatcg7560ttaactatatcctagataatgtccacttaagtaacaatacaatgatagctac犯caagag7620aaatagcaaaagctacaggaacaagtctacaaacagtaataacaacacttaaaatcttag7680aagaaggaaatattataaaaagaaaaactggagtattaatgttaaaccctgaactactaa7740tgagaggcgacgaccaa犯acaaa犯tacctcttactcgaatttgggaactttg已gcaag7800aggcaaatgaaatagattgacctcccaataacaccacgtagttattgggaggtcaatcta7860tgaaaatgcgattaagcttggctgcaggtcgacggatccccgggaattctataaaatata7920aataattttctaaaaaacttaacttcatgtgaaaagtttgttaaaatataaatgagcacg7980ttaatcatttaacatagataattaaatagtaaaagggagtgtcgac已tatgc8032〈210〉3〈211〉8032〈212〉DNA〈213>丙酮丁醇梭菌〈400〉3tcgagataattatccttaaatagctttttcgtgcgcccagatagggtgttaagtc犯gta60gttt犯ggtact3ctctgt3agat犯cacagaaaaceigcc犯cct犯ccgaa犯gcgaa3120gctgatacgggaacagagcacggttgg已aagcgatgagttaccta犯gacaatcgggtac180gactgagtcgcaatgttaatcagatataaggtataagttgtgtttactgaacgc犯gttt240ctaatttcggttctattccgatagaggaaagtgtctgaaacctctagtacaaagaaaggt300aagttattgaaaaagacttatctgttatcaccacatttgtacaatctgtaggagaaccta兆0tgggaacgaaacgaaagcgatgccgagaatctgaatttaccaagacttaacactaactgg420ggataccctaaacaagaatgcctaatagaaaggaggaaaaaggctatagcactagagctt480gaaaatcttgcaagggtacggagtactcgtagtagtctgagaagggt犯cgccctttaca540tggc犯aggggtacagttattgtgteictaaaattaaaaattgattagggaggaa犯cctc600aaaatgaaaccaacaatggcaattttagaaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatata660gacgaagtttttacaagactttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcg720acgcgttgggaaatggcaatgstagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcat780tgtcatcgtcacgtgattcataaacacaagtgaatgtcgacagtgaatttttacg犯cga840acaataacagagccgtatactccgagaggggtacgtacggttcccgaagagggtggtgca900aaccagtcacagtaatgtgaacaaggcggtacctccctacttcaccatatcattttctgc960agccccctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatatggctagatc1020gtccattccg3cagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatg1080caatttctatgcactcgtagtagtctgagaagggtaacgccctttacatggcaaaggggt1140acagttattgtgtactaaaattaaaaattgattagggaggaaaacctcaaaatgaaacca1200acaatggcaattttagaaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatatagacgaagttttt1260acaagactttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcgtatcaaaattta1320tattccaataaaggagcttccacaaaaggaatattagatgatacagcggatggctttagt1380gaagaaaaaataaaaaagattattcaatctttaaaagacggaacttactatcctcaacct1440gtacgaagaatgtatattgcaaaaaagaattctaaaaagatgagacctttaggaattcca1500actttcacagataaattgatccaagaagctgtgagaataattcttgaatctatctatgaa1560ccggtattcgaagatgtgtctcacggttttagacctcaacgaagctgtcacacagctttg1620aaaacaatcaaaagagagtttggcggcgcaagatggtttgtggagggagatataaaaggc1680tgcttcgataatatagaccacgttacactcattggactcatcaatcttaaaatcaaagat1740atgaaaatgagccELattgatttataaatttctaaaagcaggttatctggaaaactggcag1800tatcac犯aacttacagcggaacacctcaaggtggaattctatctcctcttttggccaac1860eitctatcttcatgaattggataagtttgttttacaactcaaaatgaagtttgaccgagaa1920agtccagaaagaataacacctgaatatcgggagctccacaatgagataaaaagaatttct1980caccgtctcaagaagttggagggtgaagaaaaagctaaagttcttttagaatatc犯gaa2040aaacgta犯ageLttacccacactcccctgtacctcacagacaaat犯agtattga犯tac2100gtccggtatgcggacgacttcattatctctgttaaaggaagcaaagaggactgtcaatgg2160ataaaagaacaattaaaactttttattcataacaagctaaaaatggaattgagtgaagaa2220aaaacactcatcacacatagcagtcaacccgctcgttttctgggstatgatatacgagta2280aggagatctggaacgala犯acgatctggtaaagtcaaaa3gagaacactcaatgggagt2340gtagaactccttsttcctcttcaagacaaaattcgtcaatttatttttgacaagaaaata2400gctatccaaaagaaagatagctcatggtttccagttcacaggaa3tatcttattcgttca2460acagacttagaaatcatcacaatttataattctgaactccgcgggatttgtaattactac2520ggtctagcaagtaattttaaccagctcaattattttgcttatcttatggaatacagctgt2580ctaaaaacgatagcctccaaacataagggaacactttcaaaaaccatttccatgtttaaa2640gatggaagtggttcgtgggggatcccgtstgagata犯gcaaggt犯gc3gcgccgttat2700tttgcaaattttagtgaatgtaaatccccttatcaatttacggatgagataagtcaagct2760cctgtattgtatggctatgcccggaatactcttga犯已caggttaa犯gctaaatgttgt2820gaattatgtgggacgtctgatgaaaatacttcctatgaaattcaccatgtcaataaggtc2880aa犯atcttaaaggcaaagaaaaatgggaaatggcaatgatagcgaaacaacgtaaaact2940cttgttgtatgctttcattgtcatcgtcacgtgattcataaacacaagtgaatgtcgagc3000acccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgct3060acttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcgccaa3120gccgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaat3180aaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaa3240cgctctcctgagtaggacaaatccgccgggcgg鄉gtggcgggc3gg3cgcccgccat3catcctgacggatggcctttttgcgtttctcatatggtgcactctcagtacaatctgctccccgccaacacccgctgacgcgccctgacgacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat3CgCgCg卿Cg33鄉gCCtCgtg8t3Cgaatggtttcttagacgtcaggtggcacttttttatttttctaaatacattcaaatatgtagcttcaataatattgaaaaagg犯gagtattcccttttttgcggcattttgccttcctgt犯33g3tgCtg犯g3tcaigttgggtgcscgcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgccgcatacactattctcagaatgacttggttacggatggcatgacagtaagagaattatgtgcggcc犯cttacttctgac犯cgatcggcaacatggggg已tcatgtaactcgccttgaaccaaacgacgagcgtgacaccacgatgccattaactggcgaactacttactctagcttcggat犯agttgcaggaccacttctgcgctctaaatctggagccggtgagcgtgggtctcgagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcc3300aactgccaggcatcaaattaagcagaaggc3360acaaactcttcctgtcgtcatatctacaag3420tgatgccgcatagttaagccagccccgaca3480ggcttgtctgctcccggcatccgcttacag3540gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaa3600cctatttttataggttaatgtcatgataat3660tcggggaaatgtgcgcggaacccctatttg3720tccgctcatgagacaataaccctgataaat3780gagtattcaacatttccgtgtcgcccttat3840ttttgctcacccagaaacgctggtgaaagt3900sgtgggttac3tcgaa^ctggatctc犯C3g3960agaacgttttccaatgatgagcacttttaa4020tattgacgccgggcaagagcaactcggtcg4080tgagtactcaccagtcacaga犯agcatct4140cagtgctgccataaccatgagtgataacac4200giggaccgagiggagctaaccgcttttttgca4260tcgttgggaaccggagctgaatgaagccat4320tgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaact4380ccggcaacaattaatagactgga/tggaggc4440ggcccttccggctggctggtttattgctga4500cggtatcattgcagcactggggccagatgg4560taagccctcccgtatcgtagttatctacac犯atagacagatcgctgagataggtgcctcagtttactcatatatactttagattgalttggtgaagatcctttttgataatctcatgacctgagcgtcagaccccgtaga犯agatcaacgtaMctgctgcttgcaaacaaa犯aacctcaagagctaccaactctttttccgaaggttactgtccttctagtgtagccgtagttaggtacatacctcgctctgctaatcctgttacctcttaccgggttggactcaagacgatagttggggggttcgtgcacacagcccagcttggaacagcgtgagctatgagaaagcgcc已cgctggt犯gcggcagggtcgg肌cagg卿gcggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccactcgtcaggggggcggagcctatggaa咖ggccttttgctggccttttgctcacatgtttaaccgtattaccgcctttgagtgagctgacagcgagtcagtg鄉gagg犯gcgga卿gcgttggccgattcattaatgcagctggcatgagcgcaacgcaattaatgtg已gttagcttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaatcagctatgaccatgattacgccaagctttgtttctcggcataaagccatgctctgacgctgacggggagtcaggcaactatggatgaacg4620sctgattaagcattggtaactgtcagacca4680aaaacttcatttttaatttaaaaggatcta4740caaaatcccttaacgtgagttttcgttcca4800aggatcttcttgagatcctttttttctgcg4860accgctaccagcggtggtttgtttgccgga4920aactggcttcagcagagcgcagataccaaa4980ccaccacttcaagaactctgtagcaccgcc5040agtggctgctgccagtggcgataagtcgtg5100accggataaggcgcagcggtcgggctgaac5160gcgaacgacctacaccgaactgagatacct5220tcccgaagggagaaaggcggacaggtatcc5280cacgagggagcttccagggggaaacgcctg5340cctctgacttgagcgtcgatttttgtgatg5400cgccagcaacgcggcctttttacggttcct5460ctttcctgcgttatcccctgattctgtgga5520taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcg5580gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgc5640cgacaggtttcccgactgga犯gcgggcag5700cactcattaggcaccccaggctttacactt5760tgtgagcggataacaatttcacacaggaaa5820gctaacacacacgccattcca已ccaatagt5880taaatgcactaatgccttaa犯犯acatta594033aagtct犯cacactaga^cttsttteLCttcgaccaaaagt3t犯犯cctttaagaactttcatctctcatatcttttattcaataatcgcacatcatgttcatatttatcagagctcgtgcaaataaagagggttstaatgaacg3g3aaacaaaacataatat3g3t33aa^taatgacssttgaaatcggctcagg3aaagggcattttat^CtgCC3ttg犯3t3g3CC3t3犯tt3tacgataatttccaagttttaaacaaggatacctataaaatatttggtaatataccttatatttttgatagtatagctgatgagatttatttatta犯taca犯acgctcattggcattattaagtatggttccaagagaatattttcatcg3tta犯t邓a^犯犯3tc83g33tatcacttatg犯3tgggtt犯C333g犯t3caag3ccttaaaacatgcaggaattgacgatttaattttcaatagct3taaatt3ttt犯taagtaacttgtttttcgtgtacctattttttgtgttttctatataaatatgagcga^gcgaatatUgctgttggagcatgggggttcaggggggcgagccgaagggtagcatttacgttagat3ga朋3g犯g3ttC33Ct3ggt3朋atctttaattaagtcgttaaaccgtgtgctctacg6000ttttttcttgt3犯犯犯gaaiactagat犯6060tcagattgcagtataaatttaacgatcact6120tataattatactaattttataaggaggaaa6180atataaaacacagtcaa犯ctttattactt6240atataagattaaatgaacstgataatatct6300cccttgaattagtacagaggtgtaatttcg6360gcaaaactacagaaaataaacttgttgatc6420tattgcagtttaaatttccta犯aacc犯t6480acataagtacggat已taatacgc犯aattg6540taatcgtggaatacgggtttgctaaaagat6600ttttaatggcag犯gttgatatttctatat6660ctaaacctaaagtgaatagctcacttatca6720acaaagataaacagaagt已taattatttcg67803aBtatttac犯aa犯tc^tttaac^tt6840acaatattagctttgaacaattcttatctc6900aagtt33ggg3tgcat朋3ctgcstccctt6960aatcgattatgtcttttgcgcattcacttc7020agcgtcggaa犯gcagca犯犯gtttcctt7080tgcagtatctgacgtcaatgccgagcgaaa7140aaccccctgatatgctccgacgctttatat7200aataitsggttgsgatg3t朋ggttt3t33g7260gaatttgtttgttctaatttttcactcattttgttctaatttcttttaacaaatgttctt7320ttttttttagaacagttatgatatagttagaMagtttaaaataaggagtgagaaaaaga7380tgaaagaaagatatggaacagtctataaaggctctcagaggctcatagacgaagaaagtg7440gagaagtcatagaggtagacaagttataccgtaaacaaacgtctggtaacttcgtaaagg7500catatatagtgcaattaataagtatgttagateitgattggcggaaaaaaacttaaaatcg7560ttaactatatcctagataatgtccacttaagtaacaatacaatgatagctacaacaagag7620aaatagcaaaagctacaggaacaagtctacaaacagtaataacaacacttaaaatcttag7680a站aaggaaatattataa肪3gaaaaactggagtattaatgttaaeiccctgaactactaa7740tgagaggcgacgaccaaaaacaaaaatacctcttactcgaatttgggaactttgagcaag7800aggcaaatgaaatagattgacctcccaataacaccacgtagttattgggaggtcaatcta7860tgaaaatgcgattaagcttggctgcaggtcgacggatccccgggaattctataaaatata7920aataattttctaaaaaacttaacttcatgtgaaaagtttgttaaaatataaatgagcacg7980ttaatcatttaacatagataattaaatagtaaaagggagtgtcgacatatgc8032<210>4〈211〉40<212〉廳〈213>引物〈400〉4ggaattccatatgctcgagataattatccttaccagccca<210〉5〈211〉35〈212>腿〈213〉引物<400〉5ggaattccatatgcttgtagatatgacgac鄉aagag4038<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><210>11<211〉49〈212〉腿〈213〉引物〈400〉11tgaacgcaagtttctaatttcggttctattc.cgatagaggaaagtgtct49<210>12〈211>20〈212〉DNA<213〉引物<400〉12ttatccttacaactcaaatt20〈210>13〈211>20〈212〉DNA<213〉引物〈400〉13taacagataagtcaaattgg〈210〉14<211〉27〈212〉腿〈213〉引物〈400>14cccaagcttataattatccttaaatag<210〉15<211>40〈212〉■<213〉引物〈400〉15cagattgtacaaatgtggtgataacagataagtctttttc40<210〉16〈211〉20<212>DNA〈213〉引物<400>16tactaataatcaatcctggc20〈210〉17〈211〉24<212>廳〈213〉引物<400〉17agtgttatatttttctatctcttc24<210〉18〈211〉991〈212〉DNA<213〉丙酮丁醇梭菌<400〉18gtgcgccaggitagggtgttaagtcaagtagtttaaggtactactctgtaagataacacag60aaaacagccaacctaaccgaaaagcgaaagctgatacgggaacagagcacggttggaaag120cgatgagttacctaaagacaatcgggtacgactgagtcgcaatgttaatcagatataagg180tataagttgtgtttactgaacgcaagtttctaatttcggttagttgtcgatagaggaaag240tgtctgaaacctctagtacaaagaaaggtaagttaaccaatttgacttatctgttatcac300cacatttgtacaatctgtaggagaacctatgggaacgaaa'cgaaagcgatgccgagaatc360tgaatttaccaagacttaacactaactggggataccctaaacaagaatgcctaatagaaa420ggaggaaaaaggctatagcactagagcttga8aatcttgcaagggtacgg3gt3Ctcgt3480gtagtctgagaagggtaacgccctttacatggcaaaggggtacagttattgtgtactaaa540attaaaaattgattagggaggaaaacctcaaaatgaaaccaacaatggcaattttagaaa600gaatcagtaaaaEittcacaag朋aat3t3gttttacgtccagatatttattacgtggcgaaacgtaaaactcttgttgtatgctttcattgaatgtcgacagtgaatttttacgaacgaatacgtacggttcccga卿gggtggtgcaacctccctacttcacgtatttatgacgatgattcagctg33gagataga犯aatata_acac<210〉19<211>22〈212〉腿〈213〉引物<400>19attcttggagagcctgaaagag〈210〉20〈211>21〈212〉腿〈213〉引物〈400〉20acgaaaagtatatatgagttg〈210〉21〈211〉1111<212>DNA〈213〉丙酮丁醇梭菌〈400〉21aactccagcctaatgtaggtatatcctacggcaaatacgataaggcaatagaaaactttgtactgtgactggtttgcaccaccctcttcgacgaagtttttacaagactttatcgttatc660cgcgttgggaaatggcaatgatagcgaaac720gtcatcgtcacgtgattcataaacacaagt780caataacagagccgtatactccgagagggg840accagtcacagtaatgtgaacaaggcggta900aaaagagatatttgagaagactttaagaca960t9912221agaacttagcctggttttactacttaacag60tgaagtagggaggtaccgccttgttcacat120ggaaccgtacgtacccctctcggagtatac180ggctctgttattgttcgttcgtaaaaattcactgtcgacattcacttgtgtttatg犯tc240acgtgacgatgacaatgaaagcatacaacaagagttttacgttgtttcgctatcattgcc3008tttccc朋cgcgtcgccacgt犯taa3tatctggacgts朋ag3taacgstsasgtctt360gtaaaaacttcgtctatattttcttgtgaatttttactgattctttctaaaattgccatt420gttggtttcattttgaggttttcctccctaatcaatttttaattttagtacacaataact480gtacccctttgccatgtaaagggcgttacccttctcagactactacgagtactccgtacc540cttgcaagattttcaagctctagtgctatagcctttttcctcctttctattaggcattct600tgtttagggtatccccagttagtgttaagtcttggtaaattcagattctcggcatcgctt660tcgtttcgttcccataggttctcctacagattgtacaaatgtggtgataacagataagtc720tttttcaataacttacctttctttgtactagaggtttcagacactttcctctatcggaat780agaaccgaaattaga犯cttgcgttcagtaaacacaacttataccttatatctgattaac840attgcgactcagtcgtacccgattgtctttaggtaactcatcgctttccaaccgtgctct900gttcccgtatcagctttcgcttttcggttaggttggctgttttctgtgttatcttacaga960gtagtaccttaaactacttgacttaacaccctatctgggcgcacgaaaaagctatttcca1020tgggcagtaca犯ctctgtctatagaagtttaggaattacctatgccaaaataggagatt1080ataaaaaatccgaagaatatcttaagaaagc1111<210〉22〈211〉4605〈212〉DNA〈213〉丙酮丁醇梭菌〈400〉1agcttggctgcaggtcgacggatccccgggaattctataaaatataaataattttct犯a60aaacttaacttcatgtgaaaagtttgttaaaatataaatgagcacgttaatcatttaaca120tagataattaaatagtaaaagggagtgtcgacatatggtgcactctcagtacaatctgct180ctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgac240gggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgca300tgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatac360gcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcactt420ttcgggg犯atgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaMatgt480atccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattg犯aaagg犯gagta540tgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctg600tttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaaLgatcagttgggtgcac660gagtgggttacatcg犯ctggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccg720aagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatccc780gtattgacgccgggcaagagc犯ctcggtcgccgcatscactattctcagaatgacttgg840ttgagtactcaccagtcacagaaaagc已tcttacggatggcatgacagtasgagaattat900gcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcg960gaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttg1020atcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgc1080ctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagctt1140cccggcaacaatt犯tagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgct1200cggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctc1260gcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctaca1320cgacggggagtcaggcaa<ctatggatgaacg3犯taga^agatcgctgagataggtgcct1380cactgattaagcattggt犯ctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatt1440taa朋cttcattttt朋ttt犯朋ggatctaggtgaagatcctttttgstaatctcatga1500ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatca1560aaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaac1620caccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaagg1680taactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttag1740gccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttac1800cagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagt1860taccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttgg1920agcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgc1980ttcccgaaggg卿aaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacagg卿gc2040gcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgcc2100acctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtxaggggggcggagcctatggaaaa2160acgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgt2220tctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctg2280ataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaag2340agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggc2400acgacaggtttcccgactgga朋gcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagc2460tcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaa2520ttgtgagcgg3taac犯tttcscacagg犯3cagctatg3ccatgsttacgcc犯gcttt2580ggctaacacacacgccattccaaccaatagttttctcggcataaagccatgctctgacgc2640ttaaatgcactaatgccttaaaaaaacattaaagtctaacacactagacttatttacttc2700gtaattaagtcgttaaaccgtgtgctctacgaccaaaagtataaaacctttaagaacttt2760cttttttcttgtaaaaaaagaaactagataaatctctcatatcttttattcaataatcgc2820atcagattgcagtataaatttaacgatcactcatcatgttcatatttatcagagctcgtg2880ctataattatactaattttataaggaggaaaaaataaagagggttataatgaacgagaaa2940aatata犯ac3C3gtc犯犯cttt3ttacttcaaaacataatatsg3taa犯tsatgaca3000aatataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggctcaggaaaagggcatttt3060acccttgaattagtacagaggtgtaatttcgtaactgccattgaaatagaccataaatta3120tgcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttccaagttttaaacaaggat3180atattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatatttggtaatataccttat3240aacataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagtatagctgatgagatttat3300ttaatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaaaacgctcattggcatta3360tttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttccaagagaatattttcat3420cctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaaatagaaaaaaatcaagaatatca3480cacaaagataaacagaagtataattatttcgttatgaaatgggttaacaaagaatacaag3540aaaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatgcaggaattgacgattta3600aacaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagctataaattatttaataag3660taagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttcgtgtacctattttttgt3720gaatcgattatgtcttttgcgcattcacttcttttctatataaatatgagcgaagcgaat3780aagcgtcggaaaagcagcaaa犯gtttcctttttgctgttggagcatgggggttcagggg3840gtgcagtatctgacgtcaatgccgagcgaaagcgagccgaagggtagcatttacgttaga3900taaccccctgatatgctccgacgctttatatagaaaagaagattcaactaggtaaaatct3960taatataggttgagatgataaggtttataaggaatttgtttgttctaatttttcactcat4020tttgttctaatttcttttaacaaatgttcttttttttttagaacagttatgatatagtta4080gaatagtttaaaMaagg3gtgagaaa^gatgaaagaaagatstggaacagtctataaa4140ggctctcagaggctcatagacgaagaaagtggagaagtcatagaggtagacaagttat已c4200cgtaaacaaacgtctggtaacttcgtaaaggcatatatagtgcaattaataagtatgtta4260gatatgattggcggaaaaaaacttaaaatcgttaactatatcctagstaatgtccactta4320agtaacaatacaatgatagctacaacaagagaaatagcaaaagctacaggaacaagtcta4380caaac3gt犯t犯caacacttaa^tcttagaagaagga^3t3tt3ta^S3g^aaact4440ggagtattaatgttaaaccctgaactactaatgagaggcgacgaccaaaaac犯a犯tac4500ctcttactcgaatttgggaactttgagcaagaggcaaatgaaatagattgacctcccaat4560aacaccacgtagttattgggaggtcaatctatgaaaatgcgatta4605〈210〉23〈211〉6196〈212〉DNA〈213〉丙酮丁酸杆菌〈400〉1gtcgactctagaggatcccccatatgcaagggtttattgttttctaaaatctgsttacca60attagaatgaatatttcccaaatattaaataataaaacaaaaaaattgaaaaaagtgttt120ccaccattttttcaatttttttataatttttttaatctgttatttaaatagtttatagtt180犯atttacattttcattagtcc已ttcaatattctctccaagat犯ctacgaactgctaac240aaaattctctccctatgttctaatggagaagattcagccactgcatttcccgcaatatct300tttggtatgattttacccgtgtccatagttaaaatcatacggcataaagttaatatagag360ttggtttcatcatcctgataattatctattaattcctctgacgaatccataatggctctt420ctcacatcagaaaatggaatatcaggtagtaattcctctaagtcataatttccgtatatt480cttttattttttcgttttgcttggtaaagcattatggttaaatctgaattt犯ttccttc540tgaggaatgtatccttgttcataaagctcttgtaaccattctccataaata犯ttcttgtGOOttgggagg8tgattccacggtaccatttcttgctga^itaataattgttaattcaatatatGGOcgtaagttgcttttatctcctattttttttgaaataggtctaattttttgtataagtatt720tctttactttgatctgtcaatggttcagatacgacgactaaaaagtcaagatcactattt780ggttttagtccactctcaactcctgatccaaacatgtaagtaccaataaggttatttttt840aaatgtttccgaagtatttttttcactttattaatttgttcgtatgtattcaaatatatc900ctcctcactattttgattagtacctattttatatccatagttgttaattaaataaactta960atttagtttatttatagatttcattggcttctaaattttttatctagataataattattt1020tagttaattttattctagattatatatgatatgatctttcatttccataaaactaaagta1080agtgtaaacctattcattgttttaaaaatatctcttgccagtcacgttacgttattagtt1140atagttattataacatgtattcacgaacgaaaatcgatgggctgcaggaattcgatctga1200acggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacga1260tgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttcc1320ttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcatta1380tggtgaaagttgg犯cctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgcca犯agttggcc1440cagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttcc1500gtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttag1560tgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtccctcctg1620ttcagctactgacggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcgctagcg1680gagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtg1740gcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccg1800cttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggctt1860acgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagag1920ggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctg1980acgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccc2040tggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgct2100gttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgct2160ccaagctggactgtatgc己cgaaccccccgactatcgtcttgagtccaacccggaaagacgtaattgatttagaggagttagtcttga已gacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaagacgcgcagaccaa犯cgatctcaaig犯gatatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtattgtaattctcatgtttgacagcttatcatgggttgat犯cgaagcgtcaccgtcctacaat3ggttacgagattagttggg犯gtagtacgtgagcgagtgtttatagttggtgtgcggaatccgttagaBggcgattatcagacgcgagaggtcggagaatacttctacgttaatcgggttttcggactcgaagatgtatcgccgactggttatcccggacaccctaaagacgccgataagcgccccgccgtttcaccgttcgcgaatacgtcctgccagacgatatttccttaacgggcttcgcgtgttgcgtggtatatcgggcgg3gtaattatg￡lt￡Lgat￡L￡Lg3tggttg犯8taaaaataaaatatatggaggttgtttgttggg犯ttggtgcatttgaagctgcatt犯gatttagtgaaatagstaaatatgca3tc犯attcagtccgaccgctgcgccttatccggta2220atgcaaaagcaccactggcagcagccactg2280tcatgcgccggttaaggctaaactgaaagg2340cagttacctcggttcaeiagagttggtagct2400gcggttttttcgttttcagagcaagagatt2460catcttattaatcagataaaatatttctag2520gcacctgaagtcagccccatacgatataag2580cgataagctttcgtatttgaaaacgtaaaa2640ttcgacgcacttatcgagaagtttaatgaa2700aacgcgtgggattacggagtagcgcagaaa2760aatgacctcggttttaagttcgattttccg2820gtattgcgggatgtgatcggagatctgcca2880gggggttggggtaagtgtttggtgaaaagt2940ataaaaagtcaaaacgcaaatcttcctcct3000caaatctgcaaccgaccgattagccaacaa3060gtctccgaatccaatctgcgccagacactt3120cgcagtatcggattagtcggtaacggaatt3180gcgttgcggatcaactttcatctaactgta3240attacataaaagatcaattttatttagagt3300agtaaactacgtgtaatgagcctttttagt3360aacataggcgttgattatgaactgattggc3420tcttattgtgcaattcataatgtaagtgaa3480acattgaatgttggagacataagtaaagctaagaaagataatattccatattttgatttg3540ttaacaagtggatttccttgtcccactttttcagtagccggcggccgtgatggtatggaa3600tataagtgtagcaattgttcgcacgagcatttaattacttatgaggattataagaaggga3660gtcaaatgcccgaagtgtgaagctgtttctaaggctaaagatgaacggggaacgctcttt3720tttgaaacagctttgttagcagaagagaagaagccgaaatttgtgatattagaaaatgta3780aaagggctaattaatagtggcaatggacaagtgttaagaataattagtgagactatgaac3840aatataggctataggattgacctagagctacttaattcaaagtttttcaatgttccacag3900aatcgtgaacgggtatacataattggcattagagaagatttggttgaaaatgaac犯tgg3960gttgtaggtcag犯gcga犯cgatgttctgagtaaaggtaaaaagagattgcaagaaata4020aatataaagagttttaattttaaatggcctttac犯gacactgtcacaaagaggttgaga4080gaaattcttgaggattttgttgstgagaagtattacttaaatg犯g犯犯gscg犯gaaa4140cttgttgagcaactaggaaccgcaccgctacaaaaacaag犯gtaagggagccgttaatg4200gtgggacacgtggatttaaaaggtcacgatgccatcaaaagagtttactcgcctgaaggactttcaccgacattaactacaatgggcggcggtcacagagaacctaaaatcgcagaaaag4320cagaaagaagtaagggcagtgttaacgccagaaagagaagaga犯agacsgaatggaaga4380cgttttaaagaaaacggagaaccggctttcacggttaatacaattgatcgacatggtgta4440gcaatcggagaatacccaaaatataaaattaga犯gctctctccattagaatgttggaga4500ctccaagcatttgatgacgaagattttgaaaaagcttttgcagcaggaataagtaactca4560caattatacaagcaagccggtaattcaattacagttagtgtgcttgagtctatatttcaa4620gaattaatacatacatatgttaataaagaatctgaataaaatttgtcttttaaacaaatg4680caaaataagagggattgagaggtgaggaagatggatagttacccagagtctttaaaaaga4740gagacagaggagattaaagagcgtgttaggaatggaaatatcaaag犯gacaggattaaa4800gaaattgcagaaacgacagttgagtttttgaaatcagaggagaaaagacataaatacttt4860tctgaagttgctgcagctatggcgtataacttaagtgagtttttcaaatcttatttaaaa4920ggagagtgaatatgctaactgatcagaaaaaattgacttggtaaacgctcttagaaaaaa4980aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa5040aaaaaaaaaaaaaaaaaa&aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa51003333333333333a^333a^a3sassa^sa^a^ssa<33333333￡i3333333333333338333a51GOaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa5220aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa5280aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa&aaaaaaaaaaa5340aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa5400aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa5460aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa5520aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagctt5580taatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatct5640aacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttg5700gttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagt5760cactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttctc5820ggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagcc5880actatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcctctacgccggacgc5940atcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatc6000accgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgUtcggcgtgggt6060atggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattc6120cttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggag6180tcgcat卿gg卿gc619权利要求1、一种重组质粒，其特征在于，所述质粒包含原核二类内含子片段和大肠杆菌-丙酮丁醇梭菌穿梭质粒片段，所述原核二类内含子经来源于丙酮丁醇梭菌启动子调控。2、如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述原核二类内含子为Ll丄trB二类内含子。3、如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述穿梭质粒为pIMPl-ptb。4、如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述启动子为ptb启动子。5、如权利要求1一4中任一项所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pSY6，其序列如SEQIDNO:l所示。6、如权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤A)PCR扩增，纯化制备原核二类内含子；B)酶切内含子和大肠杆菌一丙酮丁醇梭菌穿梭质粒，连接，构建穿梭质粒。7、如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述原核二类内含子为Ll丄trB二类内含子。8、如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述质粒为pIMPl-ptb。9、如权利要求7或8所述的构建方法，其特征在于，所述内含子的启动子为ptb启动子。10、如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒为pSY6，其序列如SEQIDNO:l所示。11、如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，酶切质粒步骤之后还包括纯化回收质粒的步骤。12、如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，酶切质粒步骤之后还包括质粒去磷化步骤。13、如权利要求12所述的构建方法，其特征在于，质粒去磷化步骤之后还包括纯化回收去磷化质粒的步骤。14、如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，构建穿梭质粒步骤还包括将连接产物转化感受态细胞并培养及抽提质粒的步骤。15、如权利要求l所述的重组质粒的应用，其特征在于，所述穿梭质粒用于构建丙酮丁醇梭菌的基因敲除质粒。16、如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述重组质粒为pSY6，其序列如SEQIDNO:l所示。17、如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述基因敲除质粒载体包括buk基因敲除的质粒和solR基因敲除的质粒。18、如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述buk基因敲除的质粒为pSY6-buk，其序列如SEQIDNO:2所示。19、如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述soIR基因敲除的质粒为pSY6-solR，其序列如SEQIDNO:3所示。20、一种buk基因敲除的质粒，其特征在于，所述质粒包括buk—targetron酶切后片段和权利要求1所述的重组质粒酶切后片段。21、如权利要求20所述的质粒，其特征在于，所述质粒为pSY6-buk,其序列如SEQIDNO:2所示。22、如权利要求20所述的质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤A)PCR扩增，纯化获得buk—targe加n片段；B)酶切buk—targetron片段和质粒，并连接，构建buk基因敲除的质粒。23、如权利要求22所述的构建方法，其特征在于，所述构建质粒步骤还包括纯化回收酶切后buk—targetron片段和质粒。24、如权利要求23所述的构建方法，其特征在于，所述构建质粒步骤还包括连接产物转化感受态细胞并培养和质粒抽提。25、如权利要求22所述的构建方法，其特征在于，所述质粒为pSY6-buk，其序列如SEQIDNO:2所示。26、如权利要求20所述的buk基因敲除的质粒的应用，其特征在于，所述质粒用于构建buk基因敲除的重组菌株。27、如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述buk基因敲除的质粒为pSY6-buk，其序列如SEQIDNO:2所示。28、一种solR基因敲除的质粒，其特征在于，所述质粒包括solR—targetron酶切后片段和权利要求1所述的重组质粒酶切后片段。29、如权利要求28所述的质粒，其特征在于，所述质粒为pSY6-solR，其序列如SEQIDNO:3所示。30、如权利要求28所述的质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤A)PCR扩增，纯化获得solR—targetron片段；B)酶切solR—targetron片段和质粒，并连接，构建solR基因敲除的质粒。31、如权利要求30所述的构建方法，其特征在于，所述构建质粒步骤还包括纯化回收酶切后solR—targetron片段和质粒。32、如权利要求31所述的构建方法，其特征在于，所述构建质粒步骤还包括连接产物转化感受态细胞并培养和质粒抽提。33、如权利要求30所述的构建方法，其特征在于，所述质粒为pSY6-solR，其序列如SEQIDNO:3所示。34、如权利要求28所述的solR基因敲除的质粒的应用，其特征在于，所述质粒载体用于构建buk基因敲除的重组菌株。35、如权利要求34所述的应用，其特征在于，所述solR基因敲除的质粒为pSY6-solR，其序列如SEQIDNO:3所示。全文摘要本发明提供了一种重组质粒及其制备方法和应用，以及利用该重组质粒作为出发质粒制备的两种基因敲除的重组质粒载体pSY6-buk和pSY6-solR，及重组质粒载体pSY6-buk和pSY6-solR制备方法和应用。本发明提供的重组质粒可作为丙酮丁醇梭菌基因敲除的出发质粒，能高效，快速地进行基因敲除，可发展成为一种新的遗传操作系统，以改善目前丙酮丁醇梭研究中现有的遗传操作系统的不完善的情况，从而为丙酮丁醇梭菌的代谢工程研究提供便捷，重组质粒载体pSY6-buk和pSY6-solR可直接用于构建丙酮丁醇梭菌buk和solR基因的敲除的菌株。文档编号C12N15/63GK101328486SQ20071004214公开日2008年12月24日申请日期2007年6月18日优先权日2007年6月18日发明者姜卫红,晨杨,杨蕴刘,胡世元,邵丽君,军陈,阳顾申请人:中国科学院上海生命科学研究院