专利名称：富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体合成方法
技术领域：
本发明涉及一种富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体合成方法。 技术背景无机纳米生物传输系统因其超小体积、特异的性质(如荧光、磁性、致密性) 为活细胞内生化过程的获得及医用靶向药物治疗提供了新的媒介和技术手段(自然生物技术，W饥说otec/i"o/. 2001, 79,1013-1017)。其中生物分子和金纳米的杂交粒子 又以其生物相容性、独特的光学性质可以对细胞进行实时、动态的观测，因此已有 —些研究将DNA，蛋白、抗体、多聚物分子与金粒子相连接来实现跨细胞膜传输(科 学，Sci幼ce, 2006, 1027-1030;生物聚合体化学，历ocoM)"gate CAe加.2004，"， 482~4卯)。近几年多肽分子也被应用于功能化金纳米粒子，该方法可以使金纳米粒子 在水溶液中保持髙稳定性(美国化学会志，^4ot. C/jcti. Soc.， 2004， 10076-10084〉，并实现高效率的跨膜传输(美国国家科学院院刊，尸roc. W纽/. 4coc/. & S. A 2006， 703， 1215-1220)。其中，多种从病毒跨膜蛋白提取的富精氨酸多肽 不仅能够自动高效的跨膜，并且可将外源大分子传递进入细胞核(生物化学杂志，说o/. Oie加.，2001 ， 27《5836 - 5840:生物聚合体化学，说ocon乂wgate CZiem. 2004，"， 475 - 481)。然而，现有的利用肽链作为传递介质的金纳米载体的合成方法往往需 要使用高聚物或蛋白来稳定金纳米粒子，再结合传递肽链，合成过程往往非常复杂， 需要较长的反应时间，并且难以结合多种分子，实现多功能化。(美国化学会志,丄4加. C/ie附.Soc.， 2004， "6,10076-10084;生物聚合体化学，历oco"乂Mgate CAe加.2005, 76, 1176-1180)
发明内容本发明的目的是提供富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体的合成方法。多肽CALNN与金表面有很强的亲和性，能够形成致密的保护层，使金纳米粒 子溶于水溶液，并可以保持长期的稳定性。CALNN肽链N端的半胱氨酸能够以硫醇 键与金表面形成牢固的共价键，疏水性的丙氨酸和亮氨酸能够促进多肽的自组装， 在C端的两个天冬酰氨使多肽亲水。富精氨酸多肽(CALNNRg)能够高效穿透细胞 膜，并有针对性的聚集在细胞内特定位置。本发明结合这两种多肽的优势，优化合 成条件，建立了富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体的合成方法。 实现本发明的方法的具体的技术方案如下 提供了一种富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体合成方法。 首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸，制备出粒径为30 nm 金纳米粒子；使氨基酸序列为CALNN和CALNNGGRRRRRRRR(CALNNRg)的多肽混合，使 两种多肽的摩尔浓度比例分别为卯％: 10%或0%: 100%,得到多肽混合物；将该多 肽混合物加入到粒径为30 nm金纳米溶液中，使多肽的摩尔总浓度为1-1.5 mM，在 室温下静置反应1 h，将溶液的pH值调节至3-6，使金纳米粒子在溶液中保持单分 散，离心10000 rpm后抛弃上清液，然后加入与上清液等量的pH值为3-6的去离子 水，最后合成出了富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体。将培养好的细胞离心1000 ipm, 5 min富集，用0.1 M磷酸缓冲溶液(PBS)清 洗，离心1000rpm，5min富集，去除上清液，将1 ml, 0.32 nM多肽-金纳米粒子溶液 与lXl(^个细胞混合均匀反应2h，加入与金纳米溶液等量pH值相同的培养基，在 5%C02, 37。C环境下培养24小时。通过光学显微镜及暗场显微镜观察，共培养12 小时后金纳米粒子集中在细胞的特定位置，该位置呈现红色，24小时后由于大量粒
子的聚集，靶标位置呈现红黑色，细胞其它部位呈现淡红色。 本发明的有益效果明显(1) 、本发明应用多肽表面修饰法使用一种多肽稳定包裹金纳米粒子，第二 种多肽实现纳米粒子的细胞跨膜传输功能。调节反应初始混合物中稳定多肽与传输 多肽的比例，能获得不同传输能力的富精氨酸多肽多肽-金纳米载体。利用多肽CALNN稳定金纳米粒子，CALNN肽链N端的半胱氛酸能够以硫醇键 与金表面形成牢固的共价键，丙氨酸和亮氨酸能够促进多肽的自组装，在C端的两 个天冬酰氨使多肽亲水。在CALNNGGRRRRRRRR(CALNNRg)中R8作为驱动序列， 能够跨越细胞膜将金粒子传递到细胞内部。合成总时间小于两小时，两种多肽能够 在一步反应中与金纳米粒子表面结合。反应在室温下迸行，条件温和，无需特殊设 备的辅助。该合成方法操作简单，所需时间短。合成出的金纳米粒子载体细胞跨膜 传输效率高，检测方法简单直观。(2) 、载体传输效率高。富精氨酸多肽利用多肽表面正电荷与带负电荷的细胞膜 相吸附，启动细胞内吞作用，几分钟内即可完成穿膜过程。传输定位准确，多肽-金 纳米粒子可传输到细胞核或内质网的位置，并在该位置富集，使其呈现红色。随着 传递时间的增加，靶向位置由于金粒子的聚积显现黑红色，其他位置为淡红色。合 成出的金纳米粒子载体细胞跨膜传输效率高。(3) 、检测简单直观。相比较细胞载体传统检测手段——电子显微镜，荧光显微 镜等，该载体的传输功能可由普通光学显微镜观察。样品不需其他预处理，载体在 细胞内的传递位置可根据颜色判断细胞核或内质网结构显现红色，明显区别于其 他位置。检测时间短，每个小时可以检测上百个样品。金纳米粒子的显色性稳定， 不会淬灭的性质可使检测样品长时间保存。检测方法简单直观。
图1是本发明中制备的金纳米粒子的透射电镜图。金纳米粒子的平均粒径是30±3 mm图2是金纳米粒子的紫外可见吸收光谱图。其中，a线是柠檬酸钠法合成的30 nm 金纳米粒子的紫外可见吸收光谱；b线是富精氨酸多肽-金纳米粒子在pH5.5的紫外 可见吸收光谱。图3是富精氨酸多肽-金纳米粒子进入细胞的明场显微镜照片。(a)与富精氨 酸多肽-金纳米粒子共培养24小时后，大部分细胞核呈现黑红色，细胞质呈现淡红色； (b)—部分金纳米粒子未能进入细胞核，而集中在细胞质内；(c)对照组一只 用CALNN多肽包裹的金纳米粒子与细胞共培养24小时后，细胞保持透明。图4 (a)是富精氨酸多肽-金纳米粒子进入细胞的明场显微镜照片；(b)是 枏对应的暗场显微镜照片。图5 HeLa细胞与不同浓度的富精氨酸多肽-金纳米粒子共培养24小时后的活率。
具体实施方式
实施例l提供了一种富精氨酸多肽多肽-金纳米粒子细胞传输载体合成方法。首先，按照 Fre旭-Tuikevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸制备出粒径为30nm金纳米粒子；使 氨基酸序列为CALNN和CALNNGGRRRRRRRR(CALNNR8)的多肽混合，使两种多 肽的摩尔浓度比例为90%: 10%，得到多肽混合物；将多肽混合物加入到粒径为30nm 金纳米溶液中，使多肽的摩尔总浓度为1 mM，在室温下静置反应lh,将溶液的pH 值调节至3，使金纳米粒子在溶液中保持单分散，离心10000ipm后抛弃上清液，然 后加入与上清液等量的pH值为3的去离子水，最后合成出了富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体。将培养好的细胞离心1000 rp叫5 min富集，用0.1 M磷酸缓冲溶液(PBS)清 洗，离心1000ipm,5min富集，去除上清液，将1 ml, 0.32 nM多肽-金纳米粒子溶液 与lXl(^个细胞混合均匀反应2h，加入与金纳米溶液等量pH值相同的培养基，在 5%C02, 37。C环境下培养24小时。通过光学显微镜及暗场显微镜观察，共培养12 小时后金纳米粒子集中在细胞的特定位置，该位置呈现红色，24小时后由于大量粒 子的聚集，靶标位置呈现红黑色，细胞其它部位呈现淡红色。 实施例2使多肽CALNN和CALNNGGRRRRRRRR(CALNNRg)摩尔浓度比例为0%: 100%。 其他步骤同实施例l 实施例3使多肽与金纳米溶液在室温下静置反应1 h,将溶液的pH值调节至6，使金纳米 粒子在溶液中保持单分散，离心10000 rpm后抛弃上清液，然后加入与上清液等量 的pH值为6的去离子水。其他步骤同实施例1 实施例4使多肽在金纳米溶液中的浓度为1.5 mH在室温下静置反应1 h。其他步骤同实 施例l。
权利要求
1，富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体合成方法，其特征在于，步骤和条件如下首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸，制备出粒径为30nm金纳米粒子；使氨基酸序列为CALNN和CALNNGGRRRRRRRRR(CALNNR8)的多肽混合，使两种多肽的摩尔浓度比例分别为90％∶10％或0％∶100％，得到多肽混合物；将该多肽混合物加入到粒径为30nm金纳米溶液中，使多肽的摩尔总浓度为1-1.5mM，在室温下静置反应1h，将溶液的pH值调节至3-6，使金纳米粒子在溶液中保持单分散，离心10000rpm后抛弃上清液，然后加入与上清液等量的pH值为3-6的去离子水，最后合成出了富精氨酸多肽-金纳米粒子细胞传输载体。
全文摘要
本发明涉及富精氨酸多肽-金纳米载体的合成方法。本发明应用多肽表面修饰法使用一种多肽稳定包裹金纳米粒子，第二种多肽实现纳米粒子的细胞跨膜传输功能。调节反应初始混合物中稳定多肽与传输多肽的比例，能获得不同传输能力的多肽-金纳米载体。该合成方法操作简单，所需时间短，合成出的金纳米粒子载体细胞跨膜传输效率高，检测方法简单直观。
文档编号C12N15/63GK101113457SQ20071005583
公开日2008年1月30日 申请日期2007年7月4日 优先权日2007年7月4日
发明者孙琳琳, 王振新 申请人:中国科学院长春应用化学研究所