专利名称：一种新型的doublecortin样激酶基因mRNA剪接异构体及其在神经外胚层起源癌症的诊断 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的微管相关蛋白(doublecortin)样蛋白(DCL)和一 种新型的编码DCL的mRNA剪接异构体。所提供的是编码新型DCL蛋 白的小鼠和人的核酸序列(RNA和DNA)以及小鼠和人本身的蛋白质和 变异的核酸片段和适合于治疗和诊断应用的异构体。发明进一步涉及在肿 瘤治疗中调节DCL蛋白水平的方法，尤其是神经母细胞瘤的治疗以及诊断 方法和诊断试剂盒。背景资料作为在儿童中最常见的实体瘤，神经母细胞瘤占所有儿童癌症中的8-10% (见Leeetal., 2003， Urol. Clin. N.Am.30, 881-890)。根据在加拿大、德国 和日本进行的人口筛查，每年的发病率范围从IO到15例/100，000婴儿。 神经母细胞瘤是一种异质性疾病， 一岁以下的儿童诊治后40。/^有一个非常 好的预后，其余的年龄较大的儿童和年轻成人尽管给予先进的医疗和手术 的处理也预后不佳。对于中度风险和高度风险的病人，共同的治疗是手术 后化疗。然而，彻底消除神经母细胞瘤细胞是很难达到的。因此，大多数 病人常常对常规和快速治疗有耐药性而复发。因此，通过首要治疗诱导得 到明显缓解后，就需要新的治疗策略彻底根除少数尚存的细胞，以防止复 发(Lee et al.， 2003， supra)。脑发育需要神经母细胞互相配合以及它们分裂，迁移和分化的精确的模 式(Noctor ef a/" 2001， Nature 409, 714-720', Noctor ef a/" 2004, Nat, Neuroscience 7, 136-144)。在这些过程中一个关键的事件是细胞骨架的(重 新)组织和(失去)稳定，其中包括微管和微管相关蛋白 (microtubule-associated proteins ， MAPs)。在神经元细胞发生迁移之前需 要微管和许多MAPs间精确的编排调控(见Feng and Walsh, 2001, Nat. Rev. Neurosci. 2， 408-416)。虽然涉及神经元迁移的因素已经明了，但是对于控 制象有丝分裂和神经母细胞增殖这样的早期过程的基因却知之甚少。这些因素也极有可能涉及微管和细胞骨架元素的动态调节。(Haydar e^/.， 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 2890-2895; Kaltschmidt d 2000, Nat. Cell Biol. 2, 7-12; Knoblich, 2001， Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 11-20)。最近，参与了细胞骨架重组的几个基因已经被确定，它们如果被破坏或 突变，会导致神经元移行异常(见Feng and Walsh， 2001, supra)。这些基因 其中之一是doublecortin (DCX)基因，其编码的一个含有365个氨基酸的 对新生jL大脑皮质神经元迁移起关键作用的蛋白(WO99/27089)。在人类和啮齿动物基因组中， 一个相关的基因，称作doublecortin样激 酶(doublecortin-like kinase ， DCLK)，表现出有大量的序列与DCX基因 一致。人类DCLK基因跨度超过250kb并且可以被广泛的选择性剪接，产 生多种不同的转录本编码不同的蛋白(Matsumoto et al., 1999， Genomics 56, 179-183)。其中一个主要的转录本，DCLK-长链，编码一个融合到激酶样 结构域的DCX域，其含有的氨基酸序列与(^++/钙调素依赖的蛋白激酶 (CaMK)家族的成员具有同源性。另一转录本，DCLK-短链，主要在成 人脑中表达，其缺乏DCX域并且编码CaMK样属性的激酶(Engels et al., 1999, Brain Res. 835, 365-368; Engels et al.， 2004, Brain Res. 120, 103-114; Omori et al.， 1998， J. Hum. Genet. 43， 169-177; Vreugdenhil et al., 2001, Brain Res. Mol. Brain Res. 94, 67-74)。最近的研究表明DCLK基因在钙依赖神经元可塑性和神经退行性病变中 的重要作用(Burgess and Reiner, 2001, J. Biol. Chem. 276, 36397-36403; Kruidering et al., 2001， J. Biol. Chem. 276, 38417-38425 )。DCLK-长链在早期 的发展阶段表达(Omori etal, 1998, supra)并且象DCX—样，有能力与微 管聚合(Linetal., 2000， J. Neurosci. 20, 9152-9161)。不过，DCLK基因在 神经系统发展中的确切作用还是未知数。DCLK的各种替代的剪接-变异体已经都被描述并且其中2种都被发现是 差异表达并有不同的激酶活性(Burgess and Reiner 2002， J Biol. Chem. 277, 17696-17705)。本发明的发明人克隆了并功能性的表征了一种DCLK基因 的新型剪接变异体，在这里称为doublecortin-like (DCL)，并表明DCL是 细胞骨架基因，与分裂的神经母细胞的有丝分裂纺锤体密切相关。此外， 本发明的发明人设计了新颖的癌症的治疗与诊断的方法，尤其是对神经母 细胞瘤的治疗与诊断。最近，新的治疗祌经母细胞瘤的方法已经公布，涉及针对两个不同的癌基因使用反义寡核苷酸(Pagnan et al., 2000, J. Natl. Cancer Inst. Vol 92， 253-261; Brignole et al. 2003, Cancer Lett. 197， 231-235; Burkhart et al., 2003, J. Natl. Cancer Inst. 95， 1394-1403)。第一种办法是针对c-Myb致癌基因 (Pagnan et al.， 2000, supra)。有报道在几种不同胚胎起源的实体肿瘤中有 c-Myb基因表达，包括神经母细胞瘤，它是和细胞增殖和分化联系在一起 的。结果表明互补于人的c-Myb基因mRNA的2 -9密码子的硫代磷酸寡 聚脱氧核苷酸在体外抑制神经母细胞瘤细胞的生长。当它被包被着神经外 胚层抗原双唾液酸神经节苷酯GD2单克隆抗体(mAb)的立体稳定的脂质 体运送到细胞时，其抑制效应是最大的(Pagnan etal.， 2000， supra)。虽然 在静脉注射抗GD2定位的脂质体后，药物动力学及生物分布研究已经被完 成(Brignole etal.， 2003， supra),但是在体内神经母细胞瘤模型的效果至今 并没有被证明。c-Myb反义寡核苷酸潜在的毒副作用也应被考虑，因为在 正常细胞的增殖中c-Myb蛋白发挥着根本性的作用并且在体外已经表明 c-Myb反义寡核苷酸抑制正常的人体造血作用(Gewirtz and Calabretta, 1988， Science 242， 1303-1306)。另一个反义技术是针对MYCN (N-myc)致癌基因(Burkhart et al., 2003, supra)。在神经母细胞瘤中MYCN基因的扩增只有25至30%的发生率， 但与老年疾病，快速的肿瘤进展和小于15%的存活率是相关的。互补于人 MYCN的mRNA的第一个五密码子的硫代磷酸寡脱氧核苷酸序列的作用 在小鼠的神经母细胞瘤的体内模型实验已经进行了。结果表明，进行为期 6周的经皮下植入的微型渗透泵连续引入寡核苷酸可降低肿瘤发病率并减 小植入泵旁边的肿块(Burkhart et al., 2003, supra)。虽然这种方法是非常具 有局限性，但是寡核苷酸对转移到远端器官的癌症的系统性的影响仍然保 持成立，不包括在系统性引入后对正常细胞潜在的毒副作用。此外，这种 寡核苷酸对已经确定的肿瘤的作用并没有被证明。目标基因的选择对于神经母细胞瘤有效的的治疗与诊断的发展是非常关 键的。如上所述，本发明的发明人已克隆了DCLK基因的一种新型mRNA 剪接变异体，编码新型的DCL蛋白，并已在功能上对这个剪接变异体作出 表征。令人惊讶的发现是这种剪接变异体专门在神经母细胞瘤中表达，而 不会在健康组织和细胞系中被检测到。这一发现被用来设计新的治疗和诊 断方法。定义"基因沉默"在此是指在细胞中靶蛋白产物减少(下调)或完全停止。基 因沉默可能是由于耙基因减少了转录和/或翻译。该"耙基因"保持沉默状 态。靶基因通常是一种内源性基因，但在某些情况下可能是转基因。当可 以用方法来沉默某一个基因家族的所有或几个成员时，术语"耙基因"就 可以指一个被沉默的基因家族。术语"基因"是指可以转录成mRNA分子("转录区")的核酸序列， 它可操作地将各种转录必要的序列因素联系在一起，例如转录调控序列， 增强子，5'前导序列，编码区和3'非转录序列。内源性基因是细胞内部发 现的自然基因。"有义链"是指核酸分子的编码链，如双链DNA分子的编码链或mRNA 的转录分子。"反义链"是指与有义链具有互补序列的链。反义分子可能 是反义DNA或反义RNA，即作为反义DNA与反义RNA具有相同的核酸 序列，差异在于T (胸腺嘧啶)被U (尿嘧啶)所取代。术语"包含"被解释为指定的规定部分、步骤或元件的存在，但不排除 一个或多个额外部分、步骤或元件的存在。核酸序列包含X区域，可能包 含了额外的区域，即X区域可能嵌入在一个更大的核酸区域。术语"充分相同"，"实质相同"或"基本相似"或"本性相似性"是 指两个多肽或两个核苷酸序列，当例如用程序GAP或BESTFIT使用默认 参数进行最佳排列，至少约有75%，较好至少约80%的序列相同，更好至 少约85或90%的序列相同，最好至少95%， 97%， 98%的或更多的序列 相同(例如99%序列相同)。GAP使用Needleman-Wunsch全球比对算法 排列两个序列的整个长度，最大限度计算匹配数和最小化间隙(gap)的 数目。 一般来说，程序GAP是使用的默认参数，间隙产生扣分=50 (核 苷酸)/ 8 (蛋白质)和间隙延伸扣分- 3 (核苷酸)/2 (蛋白质)。对于 核苷酸使用的默认得分矩阵是nwsgapdna并且对于蛋白质默认得分的矩阵 是blosum62 (Henikoff & Henikoff， 1992, Proc. Natl. Acad. Science 89, 915-919)。很明显当RNA序列被说成与DNA序列是基本上类似或有一定 程度的序列相同，在DNA序列上的胸腺嘧啶(T)被认为是等同于在RNA 序列上的尿嘧啶(U)。当进行序列比对时，"相同"序列上100%的核酸 或氨基酸序列相同。此外如果序列之间唯一的差别就是RNA序列在同一位置包含U而不是T，在这种情况下RNA序列与DNA序列100%相同。 序列比对和序列相同白'分比的得分可以通过使用电脑程序确定，如GCG Wisconsin Package 10.3版，可从accelrys公司购得，9685斯克兰顿道，圣 地牙哥，加州92121-3752美国。另外百分比相似性或相同度取决于搜索数 据库，如FASTA， BLAST等等。在这里涉及的"序列"或"序列片段"应被理解为具有一定核苷酸的序 列(DNA或RNA)或氨基酸分子。"严格的杂交条件"也可以被用来鉴定核苷酸序列充分相同于某一特定 核苷酸序列。严格的条件是由序列来决定的并会随着不同的情况而不同。 一般来说对于特定的序列，严格的条件是在一个确定的离子强度和pH值 的情况下选择约低于热熔点(Tm) 5'C的温度。该Tm值是指其中50X的 目标序列杂交到一个完全匹配的探针上的温度(在确定的的离子强度和pH 值下)。典型严格的条件将选择为在pH值为7时盐的浓度大约是0.02摩尔 并且温度至少60°C。降低盐的浓度和/或增加温度可以增强匹配的严格性。 例如RNA-DNA杂交的严格条件(Northern blots使用杂交探针例如100nt) 至少包括在63'C用0.2X SSC溶液或同等条件进行一次20分钟的洗涤。例 如DNA-DNA杂交的严格条件为(Southern blots使用的杂交探针例如 100nt)至少包含在温度至少有5(TC，通常大约为55。C时，用0.2X SSC溶 液或同等条件进行一次20分钟的洗涤(通常是2次)。在此"主体"是指哺乳动物主体，尤其是到人或动物主体。此处的"靶细胞"是指其中DCL蛋白水平改变(特别是减少)的细胞并 包括正常地产生DCL蛋白的任何癌细胞，特别是神经外胚层来源的肿瘤细 胞，尤其是神经母细胞瘤细胞。在靶细胞中DCL的存在可以通过本文其他 的描述来测定。下面只涉及到神经母细胞瘤的治疗和诊断，但可理解神经 母细胞瘤细胞任何涉及的参考都可类似的应用于其他类型的癌症靶细胞， 尤其是神经外胚层起源的癌症靶细胞，并且在此处包括这样的方法，用途 和试剂盒。发明内容本发明提供了在神经母细胞瘤的治疗和诊断方法中新型的核酸和蛋白质序 列的应用的方法。到目前为止DCL蛋白被发现在所有神经母细胞瘤细胞系 中能检测到细胞特异的表达(人类和老鼠细胞系)。DCL被发现可以聚合和稳定微管并且内源性DCL共定位于正在分裂的神经母细胞瘤细胞有丝 分裂纺锤体，这表明了 DCL在分裂细胞正确形成有丝分裂纺锤体中的作 用。在神经母细胞瘤细胞系中DCL基因沉默造成有丝分裂纺锤体的显著变 形或甚至缺失以及微管解体。神经母细胞瘤细胞是神经外胚层起源的。在脊椎动物中胚胎神经管(神 经外胚层)的多能干细胞产生中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS) 的主要细胞类型。这些细胞类型是指细胞来自神经外胚层或换句话神经外 胚层起源。祌经外胚层起源的肿瘤包括所有CNSandPNS肿瘤，如神经母 细胞瘤，髓母细胞瘤，胶质母细胞瘤，胶质瘤，少突胶质细胞瘤，星形细 胞瘤，纤维神经瘤，室鼓膜瘤，MPNST (恶性周围神经鞘瘤)，神经节细 胞瘤或神经鞘瘤。也有神经外胚层起源肿瘤，如横纹肌肉瘤，视网膜母细 胞瘤，小细胞肺癌，肾上腺嗜铬细胞瘤，原始的PNET (周边神经外胚层 肿瘤)，尤文氏肉瘤和黑色素瘤。由于这些肿瘤与神经母细胞瘤细胞都有着 共同的胚胎起源，DCL将是一个在这些情况下诊断和治疗的目标。根据发明所述的核酸和氨基酸序列本发明提供了新型的核酸序列，SEQIDNO:l (鼠dc/mRNA和cDNA) 及SEQ ID NO: 2 (人dc/ mRNA和cDNA)，它们分别编码SEQ ID NO: 3 (鼠DCL)和SEQ ID NO: 4 (人DCL)蛋白质。SEQ ID NO: 1禾卩2 的 mRNA序列是小鼠和人DCLK基因的新型剪接变异体。该剪接变异体 包括1至8号外显子(部分地，直到终止密码子)，其中1号外显子是非编 码的。在两条序列中，DCLK基因的第6号外显子是缺失的。在鼠mRNA 的序列中，翻译的起始密码子被发现位于189-191核苷酸，而翻译终止密 码子被发现位于1275-1277核苷酸。第2号外显子起始于169 nt， 3号外显 子起始于565 nt，第4外显子起始于912 nt，第5号外显子起始于1012 nt， 第7外显子起始于1129 nt和第8号外显子起始于1224 nt。在人类的mRNA 序列中，翻译起始密码子被发现位于核苷酸213-215 ，而翻译终止密码子 被发现位于核苷酸1302-1304。第2号外显子起始于194 nt ， 3号外显子 起始于589 nt，第4号外显子起始于936 nt ，第5号外显子起始于1036 nt， 第7号外显子起始于1153 nt和第8号外显子起始于1248 nt。鼠和人类的 DCL蛋白质在其氨基酸序列上非常类似并且双方分子量都约为40kDa。鼠 DCL蛋白包含362个氨基酸，而人DCL蛋白包含363个氨基酸。由于只表现出4个氨基酸的差异，所以它们氨基酸序列的相似度约为98%。差异是在172位氨基酸，鼠的序列中是G而人类的序列中是S，在290位氨基 酸(鼠序列中是A而人类序列中是S)，在294位氨基酸(鼠的序列中是G 而人的序列是S)并且人的序列中359位的氨基酸V在鼠的序列中缺失。 此外由于cDNA/mRNA序列的高度相似性(约90%为编码区)，无论是核 酸序列(SEQIDNO: 1或2)，或片段或其变种都可用于耙细胞基因沉默 的方法，尤其是人类神经外胚层起源的癌症细胞。此处提及RNA或mRNA 分子，然而序列描述的是DNA序列，应理解为RNA分子与DNA序列是 完全相同的，差异只是T (胸腺嘧啶)被U (尿嘧啶)所取代。除了 &/(SEQ ID NO: 1和2)完整的核酸序列，也提供了 SEQ ID NO: 1 和2有义/或反义的片段，它们适用于以A/作为靶基因的沉默方法。因此 在以下说明的任何一个基因沉默的方法中应用的片段必须是功能性的，特 别是在神经外胚层来源的癌症细胞中它们能够导致SEQIDNO:3和4的 DCL蛋白产物显著降低。"SEQIDNO: 3和4的产物显著降低"是指与 神经外胚层来源的癌症细胞(其中未导入SEQIDNO: 1和/或2的有义和 域反义片段)中发现的DCL蛋白水平相比较，在含有SEQ ID NO: 1和/ 或2的有义和/或反义片段的神经外胚层起源的癌症细胞中至少有50。Z ， 60% ， 70% ，优选至少80%， 90%或100X的DCL蛋白减少。此外，通 过显著减少或终止细胞中DCL蛋白的产生，SEQIDNO: 1和/或2的有义 和/或反义片段的导入能导致细胞表型改变。尤其是导致微管解体和有丝分 裂纺锤体的变形，神经外胚层来源的癌症细胞(如神经母细胞瘤细胞)的 增殖被显著的减少。"神经外胚层来源的癌症细胞(如神经母细胞瘤细胞) 的增殖的显著减少"是指生长(细胞分裂)的减少或完全被抑制，例如含 有SEQIDNO:l和/或2的有义和/或反义片段的神经母细胞瘤细胞。熟练 的技术人员使用本文描述的方法可以轻松方便地检验，是否SEQIDNO: 1 和/或2的有义和/或反义片段有能力造成预期的效果。检测的最容易的方 法是在体外培养的例如神经母细胞瘤细胞系中导入有义和/或反义片段并 分析在这些细胞中相比于对照细胞，mRNA和/或DCL的蛋白水平和/ 或表型的变化和/或神经母细胞瘤细胞的增殖。在体外的效果反映了有义和 /或反义片段适宜于被用来制备用于治疗例如神经母细胞瘤的组合物。原则上，SEQIDNO: 1禾卩/或2的(有义和/或反义)片段可以是SEQID NO: 1或2的任何一部分，其包括SEQIDNO: 1或2中至少10， 12 ，14 ， 16 ， 18 ， 20 ， 22 , 25 ， 30 ， 50 ， 100 ， 200 ， 500 ， 1000个 或更多的连续核苷酸，或其互补或反向互补的序列。有义和/或反义片段可 能是RNA片段或DNA片段。此外，该片段可以是单链或双链(双向)。 核酸片段也可能是与SEQIDNO: 1或2的部分非编码区(例如，SEQ ID NO: 1的1-188的核苷酸或SEQ ID NO: 2的1-212核苷酸区域)，或部分 的编码区(SEQIDNO: 1的189-1274核苷酸或SEQ ID NO: 2的213-1301 核苷酸)，或一个部分为非编码部分为编码的区域(如内含子-外显子的边 界或外显子l) 100%相同。核酸片段可以利用例如寡核苷酸合成器来从头 进行化学合成，如Applied Biosystems公司(Fosters, CA, USA)，或可以利 用标准的分子生物学方法进行克隆，如Sambrooketal.(1989)和Sambrook and Russell (2001)描述的。根据本发明的核酸片段可用于各种用途，例如 作为PCR引物，作为核酸杂交的探针，作为DNA或RNA寡核苷酸转化 到靶细胞或作为siRNA (小的干扰RNA)转化到或表达在靶细胞上。因 为不同的基因沉默方法利用不同的有义和/或反义核酸片段，这些将不局限 于本发明在下面做的详细说明的范围。此外，SEQIDNO: 1和2的变异体，如上文所述他们的互补或反向互 补序列被提供。"变异体"的核酸序列不是与SEQ ID NO: 1或2片段(或 它们的互补或反向互补)100°/。相同，但是在其核酸序列上"基本相似"。 "SEQIDNO: 1或2的变异体"包括核酸序列，其中由于遗传代码的简并， 也编码SEQIDNO:3或4的氨基酸或其片段。通过替换，删除和/或更换 一个或多个核苷酸，SEQIDNO: 1或2的变异体，它们的互补序列，反 向补充序列也包含了不同于SEQ ID NO: 1或2的序列。"SEQ ID NO: 1 和2的变异体"还包括含有或由核苷酸的模拟物组成的序列，如PNA's(肽 核酸)，LNA's(锁核酸)及其类似物或包含的吗啉，2'-0-甲基RNA或2'-0-烯丙基RNA。核酸序列的变异体可以通过例如化学合成的方法从头合成，可以通过突 变或基因改组的方法或从自然界分离来产生，例如使用PCR技术或核酸杂 交。SEQIDNO: 1或2的一个变异体也可以被界定为与SEQ ID NO: 1或 2、它们的互补或反向互补序列"基本相似"(如上所界定)的核酸序列。 特别是其中有至少75%， 80%， 85%， 90%， 95 X或以上的序列与在SEQ ID NO: 1或2整个长度的序列上相同的变异体被包含在此。在发明的一 个例子中，基本相似于SEQIDNO: 1或2的有义和/或反义片段的核酸序列被提供。当导入合适的数量到神经外胚层来源的癌细胞(如神经母细胞瘤细胞)时，所述的SEQIDNO: 1或2片段，SEQIDNO: 1或2的变 异体片段可以显著地降低DCL-蛋白的细胞水平。因此在功能上，这些变 异片段必须相当于以上描述的有义和/或反义片段，并且熟练的技术人员可 以用描述的同样的方式检测这些片段的功能。还提供了 SEQIDNO:3和SEQ ID NO: 4的分离蛋白以及它们的片段 和变异体。例如根据本发明该DCL的蛋白质(或片段或它们的变异体)可 以被用来产生抗体，如多克隆或单克隆抗体，这可以被应用在各种DCL 检测的方法，诊断或治疗的方法或试剂盒。另外，引起免疫反应的表位可 以在蛋白质范围内鉴定。DCL蛋白质、片段或其变异体可以被合成，可以 从自然界纯化或可以在重组细胞或细胞培养物中表达。DCL蛋白片段可以 是SEQIDNO:3或SEQ IDNO: 4中的任何一段片段，其中包含20， 50， 100，200个或更多的相同于或基本相似于SEQIDNO:3或4相应部分的 连续氨基酸。DCL蛋白质变异体包含与SEQ ID NO: 3或4基本相似的 氨基酸序列，例如其通过有l， 2， 3， 4， 5或更多氨基酸的置换，缺失或 插入，使得氨基酸序列不同于SEQIDNO: 3和4。变异体还包括含有肽 骨架修饰或氨基酸模拟物的蛋白质，例如非蛋白质氨基酸(如e-， Y-， 5 -氨基酸，P -， Y -， 5 -亚氨基酸)或L- a -氨基酸的衍生物。本领域技 术人员熟知大量合适的氨基酸模拟物，他们包括环己烷丙氨酸，3-环己垸 丙酸，L型金刚基丙氨酸，金刚基乙酸及其类似物等。适合于本发明多肽 的多肽模拟物在Morgan and Gainor, (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252.中有所讨论。发明方法在一个例子中，本发明提供了在靶细胞或组织中沉默A/基因的方法，特 别是在神经外胚层来源的癌症细胞中，尤其是神经母细胞瘤细胞。这些方 法共同的都是将一个或多个SEQIDNO: 1或2的有义和/或反义的核酸片 段或SEQIDNO:l或2的变异体(如上文所述)片段传递到靶细胞(神 经母细胞瘤细胞)并且导入到靶细胞，即导入到靶细胞中导致内源性基因 DCL(靶基因)的沉默，尤其是导致DCL蛋白和神经外胚层来源的癌细胞 增殖的显著减少，如神经母细胞瘤细胞增殖。各种基因沉默的方法在本技术领域中是众所周知的。 一般来说，与内源性靶基因有序列同源性的RNA或DNA被导入细胞，目的是干扰内源性靶 基因的转录和/或翻译。从而目标蛋白质的生产显著减少或最好完全停止。 已知的基因沉默的方法包括反义RNA表达(见如EP140308B1)，协同抑 制(有义RNA的表达，见如EP0465572B1)，传递或在细胞中表达小干扰 RNA (siRNA)(见WO03簡969， Fire et al. 1998, Nature 391， 806-811, WO03/099298, EP1068311, Zamore et al. 2000， Cell 101: 25-33， Elbashir et al. 2001, Genes and Development 15:188-200; Sioud 2004, Trends Pharmacol. Sci. 25:22-28)和反义寡核苷酸传递到细胞(见如WO03/008543, Pagnan et al. 2000 supra, Burkhard et al. 2003， supra)。也见基因沉默方法的综述Yen and Gerwitz (2000， Stem Cells 18:307-319)。另外，各种向靶细胞传递核酸分子的方法存在并可以在此处被使用，如 (阳离子)脂质体传递(Pagnan et al. 2000， supra),阳离子卟啉，膜融合 多肽(Gait, 2003, Cell. Mol. Life Sci. 60: 844-853)或人工病毒颗粒(见Lysik and Wu曙Pong， 2003,.Pharm. Sci. 92:1559-1573; Seksek and Bolard, 2004, Methods Mol. Biol. 252: 545-568)。鼠和人类DCL剪接异构体的克隆及表征使己知的任何基因沉默方法可 应用来显著降低体内或体外(在细胞及组织培养的)的鼠或人类的神经外 胚层来源的癌症细胞的DCL蛋白水平(或完全停止DCL蛋白产生)。特别 是DCL沉默的表型影响是被视为一种在分裂中的神经外胚层来源的癌细 胞(如神经母细胞瘤细胞)中有丝分裂纺锤体的变形，和/或神经外胚层来 源的癌症细胞(如在体内或体外培养神经母细胞瘤细胞)的增殖的显著减 少或完全抑制，。在一个例子中，提供了一个或多个SEQIDNO: 1或2的有义和/或反义 核酸片段或SEQIDNO: 1或2变异体的片段的应用，应用于为显著减少 神经外胚层来源的癌症细胞中DCL蛋白的水平的组合物的制备，以及应用 于治疗神经母细胞瘤，髓母细胞瘤，胶质母细胞瘤，胶质瘤，少突胶质细 胞瘤，星形细胞瘤，神经纤维瘤，室鼓膜瘤，MPNST(恶性周围神经鞘瘤)， 神经节细胞瘤，神经鞘瘤，横纹肌肉瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌， 肾上腺嗜铬细胞瘤，早期PNET (周边神经外胚层肿瘤)，尤文氏肉瘤和黑 色素瘤。特别是在合适的时间间隔给予合适的数量的组合物会导致神经外 胚层来源的癌症细胞减少或完全抑制其增殖。在另一例子中在体外治疗神经外胚层来源的癌症细胞的方法被提供。这种方法可以被用来测试核酸片段以及包含这些核酸片段的组合物的功能。 该方法包括a)建立神经外胚层来源的癌症细胞株的细胞培养，b)用根据 本发明的核酸片段或包含这些核酸片段的组合物处理细胞并且C)相比于对照细胞分析神经外胚层来源的癌症细胞的表型变化(使用Visual评估， 显微镜等方法检测细胞增殖，微管解体等)和/或细胞分子分析(使用例如 PCR技术，杂交，化学发光等检测方法分析^/转录的水平，DCL蛋白水 平等)。以下为适合于^/基因沉默的并与SEQIDNO: 1禾P/或2序列相同或基 本类似的有义和/或反义DNA或RNA分子的非限制性的例子1.小干扰RNAs (siRNA) 小干扰RNAs由SEQIDNO: 1或2的具有18， 19， 20， 21， 22， 23， 24，25， 30个或更多连续核苷酸的双链RNA (dsRNA)组成。通过合成短的 单链RNA寡核苷酸目的序列并对它们进行退火，这种双链RNA分子可以 很容易地合成(见例子)。优选有额外的一个，两个或三个核苷酸作为3' 突出，更优有两个胸腺嘧啶核苷酸或脱氧胸腺嘧啶核苷酸(3'-末端TT)。 这些dsRNA包括有义和反义RNA。以下的例子都是非限制性的。(siDCL画2)5,隱 CAAGAAGACGGCUCACUCCTT -3， (SEQ ID NO: 5)3，陽TTGUUCUUCUGCCGAGUGAGG -5， (SEQ ID NO: 6)(hu-siDCL-2)5，- CAAGAAAACGGCUCAUUCCTT -3， (SEQ ID NO: 7)3,- TTGUUCUUUUGCCGAGUAAGG -5' (SEQ ID NO: 8)(siDCL-3)5,陽 GAAAGCCAAGAAGGUUCGATT -3， (SEQ ID NO: 9) 3,- TTCUUUCGGUUCUUCCAAGCT -5， (SEQ ID NO: 10)(hu-siDCL-3)5，- GAAGGCCAAGAAAGUUCGUTT -3, (SEQ ID NO: 11) 3,- TTCUUCCGGUUCUUUCAAGCA -5' (SEQ ID NO: 12)如上所述，SEQIDNO:l或2的其他任何的片段,，或SEQIDNO:l或 2的变异体，都适合于被用来构建siRNA 。 siRNA分子可能还包括用于监 测和检测的标记物，如荧光或放射性标记物。方便地，siRNA也可以从DNA载体上表达。这种DNA的载体可以含有 在有义和反义片段之间的额外的核苷酸，其导致茎环结构，随后是折叠的 RNA转录子。除了向神经母细胞瘤细胞传递和导入的siRNA，这种DNA 载体可瞬时或稳定地被导入到靶细胞，使siRNA在耙细胞内部转录。举例 来说，用于基因转移的载体，譬如那些发展起来的用于基因治疗载体，可 被用来将DNA导入神经母细胞瘤细胞，从这些载体上SEQIDNO: 1或2 或SEQIDNO:l或2变异体的有义和/或反义片段被转录。例子是重组腺 相关病毒载体(AAV)，在Hirata et al.， 2000 (J. of Virology 74:4612-4620)， Pan et al. (J. of Virology 1999， Vol 73， 4: 3410-3417)， Ghivizanni et al. (2000, Drug Discov. Today 6:259-267)或WO99/61601中有所描述.无论siRNA是否适合并能有效于dc/基因沉默，熟练的技术人员可以轻 松方便地检验，通过例如向神经母细胞瘤细胞株传递分子，随后使用已知 的方法，如RT-PCR检测，Northern Blotting,核酸保护试验，免疫印迹， ELISA分析及其类似方法检测评估包含siRNA分子的细胞所产生 mRNA和/或DCL蛋白的水平。合适的神经母细胞瘤细胞系是如人 SHSY5，鼠N1E-115，鼠NS20Y或鼠神经母细胞瘤/大鼠神经胶质瘤杂交 NG108细胞系或其他。另外，^"/基因沉默对表型的影响，像对有丝分裂 纺锤体变形可以被评估，正像实施例中所描述，使用例如免疫细胞化学染 色或免疫荧光。抗-DCL-抗体可以被熟练的技术人员进行生产，例如像实 施例中所描述的，或现有的抗体(Kruideringetal. 2001, supra)，在这里被 发现对DCL有高特异性，也可使用。随着siRNA分子被导入神经母细胞瘤细胞，DCL蛋白水平相比于没有 siRNA分子导入的细胞或相比于包含阴性对照siRNA分子的细胞，如本例 子中描述的siDCL-l，最好是至少减少约50%， 60%， 70%, 80%， 90% 或100%。2)反义RNA寡核苷酸 反义RNA寡核苷酸由SEQIDNO: 1或2的约12， 14， 16， 18， 20， 22，25， 30个或更多连续核苷酸的反向互补序列构成的。这种RNA的寡核苷 酸可以很容易地被合成或从DNA载体转录。骨架修饰，如硫代磷酸寡脱氧核苷酸可用于增加寡核苷酸的稳定。其他 修饰，如2'糖配基，例如与O-甲基，氟，O-型丙基，O-烯丙基或其他基团 也可提高稳定。合适的反义RNA寡核苷酸非限制性的例子是(DCLex2C) (2'0-甲基RNA硫代磷酸)5，- GCUGGGCAGGCCAUUCACAC -3, (SEQ ID NO: 13)(hu-DCLex2C)(2'0-甲基RNA硫代磷酸)5，- GCUCGGCAGGCCGUUCACCC -3， (SEQ ID NO: 14)(DCLex2D)(2，0-甲基RNA硫代磷酸)5，画CUUCUCGGAGCUGAGUGUCU -3, (SEQ ID NO: 15)(hu-DCLex2D)(2，0-甲基RNA硫代磷酸)5，- CUUCUCGGAGCUGAGCGUCU -3， (SEQ ID NO: 16)对于siRNA分子，如上文所述熟练的技术人员可以很容易合成其他合适 的反义RNA寡核苷酸并测试其&/-基因沉默的效率。除了利用与SEQ ID NO:l或2反向互补相匹配度达到100X的连续序列，与SEQIDNO: 1或 2反向互补基本相似的序列被应用，例如通过插入，替代或缺失l， 2或3 个核苷酸。所涵盖的也包括DNA分子，尤其是能产生反义RNA寡核苷酸作为RNA 的转录子或转录的组成部分的DNA载体。当载体在合适的细胞系中存在 时，这种载体可用于生产反义RNA寡核苷酸。为了使内源性^/基因表达 沉默，DNA的载体(如AAV载体，见上文)在体内也可以被传递到神经 母细胞瘤细胞。因此除了传递反义RNA寡核苷酸，DNA载体可以被运送 到神经母细胞瘤细胞中并抑制或减少神经母细胞瘤细胞增殖。随着反义RNA寡核苷酸被导入神经母细胞瘤细胞，DCL蛋白水平相比 于没有反义RNA寡核苷酸的细胞或相比于包含阴性对照反义RNA寡核苷酸(即对DCL蛋白水平无影响)的细胞，最好是至少减少约50%， 60%, 70%, 80%, 90%或100%。 3)反义DNA寡核苷酸反义DNA寡核苷酸由SEQIDNO: 1或2的反向互补的约12， 14， 16， 18， 20， 22， 25， 30个或更多的连续核苷酸构成。这种DNA的寡核苷酸 可以很容易被合成。骨架修饰，如硫代磷酸寡脱氧核苷酸的应用可用于增加寡核苷酸的稳定。 其他修饰，如2'糖配基，例如与O-甲基，氟，O-型丙基，O-烯丙基或其他 基团也可提高稳定。合适的反义DNA寡核苷酸的非限制性的例子是 (DCLex2A) (DNA硫代磷酸)5，- GCTGGGCAGGCCATTCACAC -3， (SEQ ID NO: 17) (hu-DCLex2A) (DNA硫代磷酸)5，- GCTCGGCAGGCCGTTCACCC -3， (SEQ ID NO: 18) (DCLex2B) (DNA硫代磷酸)5，- CTTCTCGGAGCTGAGTGTCT -3， (SEQ ID NO: 19) (hu-DCLex2B) (DNA硫代磷酸)5，- CTTCTCGGAGCTGAGCGTCT -3， (SEQ ID NO: 20)对于siRNA分子和反义RNA寡核苷酸，如上文所述熟练的技术人员可以 很容易合成其他合适的反义DNA寡核苷酸并测试其&/-基因沉默的效率。 除了利用连续的与SEQ ID NO: 1或2反向互补序列相匹配度达到100% 的序列，那些基本类似于SEQIDNO: 1或2反向互补的序列也可被应用， 例如通过插入，替代或缺失l， 2或3个或更多的核苷酸。随着反义DNA寡核苷酸被导入神经母细胞瘤细胞，DCL蛋白水平相比 于没有反义DNA寡核苷酸的细胞或相比于包含阴性对照反义DNA寡核苷 酸(即对DCL蛋白水平无影响)的细胞，最好是至少减少约50%， 60%，70%， 80%， 90%或100%。可以理解的是，siRNA分子、反义RNA寡核苷酸和/或反义DNA寡核 苷酸混合物的传递亦可用于del的特效沉默。因此根据本发明的组合物包含适量的SEQIDNO: 1或2的有义和/或反 义片段或适量的与SEQIDNO: 1或2基本相似的序列和一个生理上可接 受的载体。当组合物被用于向在体外培养的神经母细胞瘤细胞导入时，组 合物也可以包括一个靶向化合物，虽然这个靶向化合物的存在不是必需的， 作为分子可以通过转染被简单地导入，使用例如转染试剂盒(如Superfect， Qiagen，Vdancia,CA)，电穿孔，脂质体介导的转染等。"靶向化合物"是 指一种化合物或分子它能够在体内向目标神经母细胞瘤细胞运输核酸片 段，即它具有细胞定位的能力。"适当的用量"或"治疗有效的用量"是指对于神经母细胞瘤细胞，这 个用量能导致DCL蛋白质水平显著减少或完全停止并造成神经母细胞瘤 细胞的增殖显著减少或完全抑制。根据描述，由一个熟练技术人员不需要 过度实验就可以很容易地确定适当的用量。有义和/或反义分子(siRNA， 反义RNA或DNA寡核苷酸)的适当的用量范围是例如从0,05taic)1到 5 Pmol/毫升并且是以1至100毫升/公斤体重的用量被注射。对于一个被给予主体而非神经母细胞瘤细胞培养物的组合物，包含一个 本发明的核酸分子的有效的治疗用量和另外一个或多个靶向化合物。这种 靶向化合物可以是例如免疫脂质体，如Pagnan et al. (2000, supra)所描述的 或Patorino et al. (Clin Cancer Res. 2003， 9(12):4595-605)所描述的。在免疫 脂质体的外表包含细胞表面导向的抗体。如对抗神经母细胞瘤细胞抗原(例 如双唾液酸神经节苷酯GD2抗原)的突起的单克隆抗体，可用于将脂质体 定位于神经母细胞瘤细胞。显然其他神经母细胞瘤细胞抗原可以被用来形 成细胞特异性抗体。核酸分子用已知的方法被包裹在免疫脂质体中并且单 克隆抗体被共价耦合到脂质体的外部(见如p254 of Pagnan et al. 2000, supra)。脂质体对神经母细胞瘤细胞的结合以及神经母细胞瘤细胞对核酸 分子的吸收可以在体外用已知的方法评估，这在Pagnan et al. (2000)中有所 描述。同样地，表型的影响和/或细胞内驻留核酸分子的影响也可以被评估。其他靶向化合物也可以是类似的抗体，例如结合了核酸分子的对抗神经 母细胞瘤细胞表面抗原的突出的单克隆抗体。例如抗转铁蛋白受体抗体可 以被应用，如嵌合大鼠/小鼠单克隆抗体ch17217，这种抗体已被证明在小鼠中，可以将细胞因子定位于神经母细胞瘤的肿瘤细胞(Dreieretal., 1998， Bioconj.Chem. 9:482-489)。这种方法已经在技术方面为人们所共知，参见 例如 Guillemard and Saragovi (Oncogene, Advanced-online publication, published 22 March 2004， Prodrug chemotherapeutics bypass p-glycoprotein resistance and kill tumors in vivo with high efficacy and target-dependent selectivity)。同样，根据本发明的核酸分子可以结合到天然或合成的配体或配体模拟 物，其可结合到目标细胞表面的受体(如神经母细胞瘤细胞表面受体)并 且可以导致核酸分子的内吞。这样配体的一个例子是转铁蛋白。己经表明 在小鼠中静脉注射转铁蛋白-聚乙二醇-聚醚酰亚胺/DNA复合物能导致基 因转移到皮下Neuro2a神经母细胞瘤肿瘤(Ogris et al., 2003, J. Controlled Release 91: 173-181)。治疗的组合物可以进一步包含其他各种成分，例如但不限于水，盐，甘 油或乙醇。另外配药学上接受的辅助物质也可存在，如乳化剂，润湿剂， 缓冲剂，紧张度调节剂，稳定剂等，例如醋酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化 钾，氯化钙，失水山梨醇单月桂酸酯和三乙醇胺油酸。其他有效的生物分 子也可以存在，例如沉默其他基因目标的核苷酸分子(如c-Myb基因)， 标记物或标记基因(如荧光素酶)，配体，抗体，药物等。治疗组合物可进行局部给予，如注射，优选是注射到靶组织，或全身注 射，例如通过流动的注射用药点滴输注或皮下缓慢释放装置来进行注射。 注射给药系统包括溶液，悬浮物，凝胶，微球和可注射的聚合物，并且可 以包括赋形剂，如溶解度-改变试剂(如乙醇，丙二醇和蔗糖)和聚合物(如 polycapiylactones和PLGA's)。进一步关于适合于不同类型给予的描述指导 在 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)可见。一个例子中，根据本发明的组合物是用来补充神经母细胞瘤的其他治疗， 如化疗，放射治疗，外科手术和/或骨髓移植。因此无论是在一个或多个常 规治疗的之前，同一时间和/或之后不久，组合物以有效的数量被给予主体， 优选每周，更优选每月。从而通过其他治疗方法不能有效地消除或根除的 任何神经母细胞瘤细胞可以由A/沉默阻止增殖。这种治疗降低了神经母 细胞瘤细胞向身体其他部位蔓延的风险(形成转移)并且阻止或至少拖延 复发，即(原发的)神经母细胞瘤的复发。DCL沉默的优势超过化疗或手术以至于它对正常组织只有低毒性和对神经母细胞瘤细胞有较高特异性。 因此似乎它最没有不良的或只有微乎其微的副作用。在另一例子中的一种治疗主体的方法被提供，即其他神经母细胞瘤的治 疗(如化疗，手术等)并未进行。该方法包括a)建立一个神经母细胞瘤 诊断，和b)给予适量的根据本发明的一个组合物，和C)在不同时间间隔 进行监测(跟进治疗)。步骤a)例如，可以通过如下说明中使用的诊断方法和试剂盒来建立诊 断。另外，神经母细胞瘤的诊断可以使用常规方法建立，如CT或CAT扫 描，磁振造影扫描，mIBG扫描(间碘苄胍)，X光检査，活检或儿茶酚胺 或它在尿液或血浆样品中的代谢物分析(如多巴胺，高香草酸，r香草基 扁桃酸)。步骤b)在本文的其他地方有所描述。步骤c)可能涉及各种后 续的检测，如下面所述的诊断检测，血液或尿液检测，CT扫描，MRI扫 描等，后续的监测目的是以确保该肿瘤细胞被彻底消灭并不会再次发生。 如果情况并非如此，则必须开始新的治疗方法。在进一步的例子中，诊断方法和诊断试剂盒被提供，它们对发生在主体 中的早期阶段的神经母细胞瘤的选择性筛选是有用。主体可能已经在一个 或多个其他神经母细胞瘤的测试中呈阳性反应，在这种情况下，本检测可 确认更早期诊断。或者他们可能没有被诊断出患有神经母细胞瘤，但他们 可能会出现神经母细胞瘤引起的的症状。依据肿瘤部位不同，症状可能差 别很大，如食欲不振，疲倦，呼吸或吞咽困难，腹部肿胀，便秘，虚弱/ 腿部摇摆等。另外还未显示任何症状的高风险主体可以使用本发明的诊断 方法进行定期预防性测试，以确保早期诊断，这大大增加了根除神经母细 胞瘤细胞的机会。离体诊断方法包括从主体内采取血液样本并检测在血清 中游离神经母细胞瘤细胞的存在或缺失。另外离体诊断的方法可通过对(假 设的)肿瘤组织样本进行活检。由于DCL蛋白和A/mRNA的表达在神经 母细胞瘤细胞中是特异的，因此通过分析样本中A/mRNA禾n/或DCL蛋 白的存在就可以检测这些细胞的存在并选择性进行定量。这是可以用在技 术方面众所周知的方法做到的，如使用特定或简并引物的(定量) RT-PCR检测，其他PCR方法，例如特异性扩增dc/基因的区域，DNA阵 列，杂交DNA探针，或检测DCL蛋白质方法，如使用A/4寺异性抗体(如多克隆或单克隆抗体)的酶联免疫检测法(ELISA )或免疫印迹。 在一个例子中，根据本发明的诊断方法和试剂盒包括抗-DCLK单克隆抗体(在Kruidering et al. 2001, supra中提到也作为抗-CaMLK)，其可以识别并 结合到人和/或鼠的DCL蛋白(检测的分子量为40 kDa)。虽然抗-DCLK 也识别其他剪接变异体，如DCLK-短链(即cpgl6 )禾BCARP，从cpgl6 和CARP的表达到DCL的时空分离，以及不同的分子量，可以用来轻松 地减少/避免假阳性。显然其他DCL特异的单克隆抗体可以被生产和使用。此外，特异针对8号外显子RNA (在DCL RNA存在，但在DCLK-短链 的RNA中缺失)的引物或探针，可用于RNA的检测方法。作为对照，例 如结合于(杂交)DCLK-短链(即cpgl6)和CARP的6号外显子RNA的 引物或探针，或结合到9至20号DCLK外显子的引物或探针可被采用， 它们在DCLRNA中缺失。可特异地检测(例如，通过序列特异性扩增，由序列特异性杂交或由特 异的结合)SEQIDNO:2的RNA或DNA的或SEQ ID NO: 4的蛋白的引 物对，探针和抗体，可以被熟练的技术人员使用下面标准教科书的参考文 献中可见的标准的分子生物学方法进行合成。引物对和探针可以在SEQID NO: 2.的基础上被合成。特异于DCL蛋白的单克隆或多克隆抗体可以用 在技术领域众所周知的方法被生产。诊断方法包括步骤a)分析主体的血液样本中SEQ ID NO: 2的RNA或 DNA存在与否和/或SEQ ID NO: 4的DCL蛋白存在与否和b)随意地量化 存在的SEQ ID NO: 2和/或SEQ ID NO: 4的数量。量化允许与神经母细 胞瘤细胞的数目直接相关，这反过来又可以显示神经母细胞瘤的发展和蔓 延的严重程度。为实施上述方法还提供了离体诊断试剂盒。因此诊断试剂盒可能包括引 物，探针和/或抗体和其他试剂(缓冲液，标记等)，适合^/基因，A/mRNA 和/或DCL蛋白检测并选择性地量化。此外，试剂盒包含说明书和如何使 用试剂(如免疫检测试剂)的说明和对照样本，例如分离DCL蛋白或^/ DNA 。以下非限制性的例子说明了新型DCL剪接变异体的鉴定，分离和表征除 非另有说明，本发明的操作中将使用标准的分子生物学，病毒学，微生物 学或生物化学的常规方法。这些技术在Sambrook and Russell (2001) Afo/ecw/a;- C7ow'"g: j丄aZ orato/^ Ma聽a/, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY， in Volumes 1 and 2 of Ausubel a/. (1994) Cw簡"f 尸ratoco/sM /ecw/a/- 5z'o/ogy， Cw;rew/ PratocoAs， USA and in Volumes I andII of Brown (1998) iVfo/ecw/ar Sw/o^丄a6Fox, Second Edition, Academic Press (UK), (9/一"wc/eo/7'(ie 1S戸f/7es7j (N. Gait editor), 7Vwc/e/c jc/t/ 场6n'(iiza^o" (Hames and Higgins, eds.义"五"2ywe /w附Mw0/7/W0c/7e附&^3/' in Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen (Elsevier 1985)中有 描述。PCR标准材料和方法在Dieffenbach and Dveksler (1995)尸O /V/柳e广 J Z^60rato7^ Afo"wa/， Cold Spring Harbor Labroatory Press, and in McPherson et al (2000)户CT 5osz.c>sv From Sac^groww/ to 5e"c/z， first edition, Springer Verlag Germany中有所描述.。制造多克隆或单克隆抗体方法在例 如Harlow and Lane, t/s/"g ^4 /a6orato^ Mawwa/， New York: ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1998， and in Leddell and Cryer "」尸rac"'ca/ GW<ie to Mwoc/owa/JwWoii/ay 〃 ， Wiley and Sons 1991中有描述。上述所有 的引述都可以作为参考。在整个说明书和实施例中所提及的序列如下SEQ ID NO 1:小鼠A/的cDNA序列SEQ ID NO 2:人A/的cDNA序列SEQ ID NO 3:小鼠DCL的氨基酸序列SEQ ID NO 4:人DCL的氨基酸序列SEQIDN0 5:siDCL-2有义RNA寡核苷酸(siRNA链)SEQ ID NO 6: siDCL-2反义RNA寡核苷酸(siRNA链)SEQ ID NO 7: hu-siDCL-2有义RNA寡核苷酸(siRNA链)SEQ ID NO 8: hu-siDCL-2反义RNA寡核苷酸(siRNA链)SEQ ID NO 9: siDCL-3有义RNA寡核苷酸(siRNA链)SEQ ID NO 10: siDCL-3反义RNA寡核苷酸(siRNA链)SEQ ID NO ll:hu-siDCL-3有义RNA寡核苷酸(siRNA链)SEQ ID NO 12: hu-siDCL-3 v脂Av(siRNA链)SEQ ID NO 13: DCLex2C反义RNA寡核苷酸SEQ ID NO 14: hu-DCLex2C反义RNA寡核苷酸SEQ ID NO 15: DCLex2D反义RNA寡核苷酸SEQ ID NO 16: hu-DCLex2D反义RNA寡核苷酸SEQ ID NO 17: DCLex2A反义DNA寡核苷酸i蹈I￡) NO 18: hu-DCLex2A反义DNA寡核苷酸SEQ ID NO 19: DCLex2B反义DNA寡核苷酸SEQ ID NO 20: hu-DCLex2B反义DNA oligonuclotide
图1-DCL的基因组结构及与DCX的比对(A) : DCLK基因的基因组结构和DCL的cDNA的克隆策略。仅标出了 DCL 局部的外显子-内含子结构，包括最近识别的编码CARP和DCL的共同3' 端的8号外显子(Vreugdenhil et al., 2001,上文)。外显子为矩形所代表并由 阿拉伯数字表示；内含子是由实线表示。DCL转录体在(DCL)基因结构 的下面所示。ORF被一个矩形所代表，非翻译序列由直线所表示。用来克 隆DCL的引物的位置是由箭头表示。(B) :DCL蛋白与DCX比对。相同的残基是深灰色与保守替代序列是浅灰 色。两个DCX域和SP丰富的域由箭头表示。图2- DCL是一个M.A.P.并且可以稳定微管 第I小组(A-C) DCL在COS-1细胞中的过度表达。 (D-F) DCL在用秋水仙素处理的COS-1细胞中的过度表达。 绿色代表DCL;红色代表a-微管蛋白并且黄色显示DCL在d-微管蛋白 上的定位。蓝色代表DNA (细胞核)。箭头表示DCL关联的连接微管束， 它们可以抵抗秋水仙素的处理。还标记了在A和B中与细胞中心体清晰的 连接。标尺是10 Mm。第II小组在体外由DCL聚合微管。不同浓度的重组DCL蛋白与纯化的 微管蛋白进行孵育并且在340 nm处对DCL/微管蛋白混合物的浊度监测30 分钟。紫杉醇用来作为阳性对照和水作为阴性对照。图表显示从多次实验 (N二4例)中得到类似结果的典型例子。 图3- DCL表达受发育调控(A) :DCX和DCLK识别抗体的交叉反应。过度表达DCL(条带4-6 )的COS-1 细胞的裂解物或两个不同的DCX变异体(条带2和条带3)与抗-DCX(上 面组)或抗-DCLK (下面组)的Western blot分析。抗-DCLK可以强烈识 别DCL (条带4-6)。(B) :在细胞胚胎形成时期，DCL和DCX蛋白的发生。用抗-DCLK和抗 -DCX染色从年龄ED8到ED18的胚胎脑组织组分和成人脑组织的免疫迹。作为CARP/DCL抗体的阳性对照，过度表达DCL的COS-l细胞提取 物被使用。(C):在各成人脑区中的DCL和DCX的免疫印迹分析。1:ED12头(阳性 对照)，M:分子量标记，2:小脑，3:脑干，4:下丘脑，5:大脑皮质，6: 海马，7:嗅球。图4-DCL在胚胎脑组织中的表达的定位和发生I.:在胚胎期(ED)第8天横向脑切片原位杂交(组A);和在EDIO和ED12(分别是组B和C )径向断面。对于ED8和EDIO，所得到的信号偏低， 但在ED12中大大增强。縮写di-间脑，lv-侧脑室，me-中脑；mo-延髓，mt -后脑,mv-mesenchephalic vesicle, nc - neopallial cortex, ne -神经上皮,rh -菱脑，te _端脑，tv-端脑囊，IVv-第四脑室。标准尺lmm;曝光时间14 days。II:在早期鼠的神经上皮中DCL蛋白的分布A:在ED 11 (径向切面)的DCL蛋白的分布。染色是限于增殖地区(分别 在左脑和右脑上的端脑和间脑)并在外层接近软脑膜以及在内心室区(箭 头；以下见较高放大倍数)被发现，而像第一鳃弓(M)的下颌骨组成部 分的非神经元组织(nonneuronal tissue)则缺乏任何信号。IV;第四脑室。 标尺代表150jim。B + C:从ED 9的早期神经上皮邻近的横向(冠状)截面为DCX (B)及DCL(C) 进行免疫组化染色。没有观察到DCX染色(在B中的箭头指向)，而DCL 无论是在内室管膜(上面2箭头)还是在外层空间边缘区域(下面箭头) 已经表达。标尺代表25tai。D: ED11的神经管的神经上皮径向截面，显示在管腔边界(箭头)有丰富 的表达，而在发展中的神经元组织中分离的分裂细胞也呈免疫阳性(箭头)。 L显示了神经管腔的神经管。标尺代表70tai.E:在神经上皮有丝分裂细胞中DCL免疫阳性反应的细节。指向卵裂面中间 线的染色体(箭头)是显而易见的。标尺代表3toi。F : ED10中端脑神经上皮的总体观察显示在心室(室管膜)层(在左边 的箭头)以及在边际/皮质板区(在右边的箭头)DCL的表达。2在中间带 分裂细胞的免疫阳性反应双重带也可以看见(箭头)。标尺代表15Pm。G + H:神经上皮皮质的横截面表明DCX和DCL分布的差异，但部分重叠。 DCX并未表达，直到EDll (G)，并主要集中皮质板的最上面部分和皮质 神经上皮的边缘/皮质板区域(箭头)。相反DCL在ED9(H)就已经表达， 并且在心室(室管膜)层(箭头指向左)中以特别高的水平表达，而在中 间和边缘区(箭头指向右)以较低的水平表达。请注意心室层(G中 asteriks )缺乏DCX信号。标尺代表5 tai。I:ED9心室区的室管膜层的细节显示DCL在从神经上皮延伸到中间带(箭 头)的纤维中表达。标尺代表12Pm。J:室管膜层的细节显示清晰的在毗邻管腔的分裂的神经上皮细胞的免疫反 应，即在细胞有丝分裂的末期(左)，后期(中)，当从管腔(右)迁移时， 在中前期DCL阳性细胞也是可见的并呈现垂直分裂(箭头)。标尺代表8 Mm。K:EDll室管膜层中的DCL免疫反应，在细胞分裂的前期和末期(箭头) 的细胞中，以及在中期/后期(箭头)的胚细胞样细胞中。标尺代表10Pm。 L:在中心体样结构(下面的箭头)2个在室管膜层的DCL免疫阳性有丝 分裂的细胞也显示了强烈的免疫反应。标尺代表1.5Pm。 M + N: 2个DCL免疫阳性反应的例子，在细胞分裂后期II /末期II(M)和在 中期/后期I的分裂细胞，染色体清晰可见(箭头)，同时也有一些微管染 色也可被观察(箭头)。标尺代表ltai。图5-在神经母细胞瘤细胞中DCL的表达 组I:A:在一些神经母细胞瘤细胞系中DCL是内源性表达的。通过Western blot 分析筛选DCL阳性细胞株。条带l: COS-l细胞，条带2: HeLa细胞， 条带3: NG108-15细胞，条带4: NS20Y细胞，条带5: N1E-115细胞， 条带6:分子量标记，条带7: SHSY5细胞。请注意，DCL在神经母细胞 瘤细胞系(条带3,4,5和7)而不在由非神经元来源的细胞系中表达(条带 1和2)。B组DCL是一个磷酸化蛋白质。NG108-15裂解物用抗-DCL染色。条带 1:未经处理的裂解物，条带2:在37t:无磷酸酶孵育的裂解液，条带3: 在37'C有磷酸酶孵育的裂解液。条带4-6与1-3类似但DCL过度表达。 请注意，在条带4-6中内源性DCL迁移并过度表达。组II:在用(1至3)和不用(4)在杜蒲(duplo)中进行的siRNA处理的N1E-115 细胞中DCL的表达的Western blot分析。三种不同的针对DCL的siRNA 分子被使用siDCL-1 (条带1)， siDCL-2 (条带2)禾B siDCL-3 (条带3)。 siDCL-2和3导致一个有效的基因沉默而siDCL-1并没有。作为参考，同 样的膜被a-微管蛋白重新染色。 组III.DCL基因沉默导致细胞间期的微管骨架的松散。抗-DCLK (绿色)染色产 生spickled模式，在非处理细胞(A-C)中这是最接近细胞核(A)。这种模式 是不会受siDCL-1 (D)的影响，但抗-DCLK染色由于siDCL-3(G)导致的 有效DCL沉默而几乎缺失。细胞骨架由cc-微管蛋白染色(B, E和H) 所表明的那样，在非治疗细胞(B)和在用Si-DCL-l (E)处理的细胞中具 有良好的迷宫结构，但由于siDCL-3的处理而变得很松散。DCL合并后的 插图及a-微管蛋白染色显示非处理细胞(C)，转染si-DCL-1 (F)的细胞和转 染siDCL-3 (I)的细胞。绿色=DCL，红色=a -微管蛋白，黄色=DCL及 a-微管蛋白的定位。标尺是10toi。 组IV:DCL基因的沉默不影响中心体结构。通过抗Y-微管蛋白染色(B，EandH) 显示Spickled抗DCLK染色(A, D, G)在中心体周围是高度浓縮的(A， D) 并且有效的DCL (G)基因沉默不导致中心体结构或形状明显的变化(I)， DCL和a-微管蛋白染色合并后的插图显示非处理的细胞(C)，转染 siDCL-1 (F)和和转染了 siDCL-3(I)的细胞。绿色DCL，红=￥-微管蛋白， 黄色二DCL和Y-微管蛋白的定位。标尺刻度是10toi。图6 - DCL的基因沉默导致有丝分裂纺锤体变形。在非处理的细胞(A-C) 中DCL (A)主要与a-微管蛋白(B)结合。合并后的图像(C)显示DCL在着 丝粒(箭头)中存在。通过a-微管蛋白染色(E)显示转染siDCL-l (D-F)并 没有导致DCL沉默(D)和也没有改变有丝分裂纺锤体变形。通过a -微管蛋 白染色(E)显示由siDCL-2 (G-I)或siDCL-3 (J-L)导致DCL(Q J)的缺失和有 丝分裂纺锤体缺失(H和)变形(K)是有效的DCL沉默。绿色二DCL，红=a-微管蛋白，黄色二DCL及a-微管蛋白的定位。标尺刻度是10Pm。图7 -在分裂的COS-1细胞中DCL的过度表达。 A-C:DCL过度表达的免疫细胞化学分析。显示了用cx-微管蛋白染色的正常分裂的COS-l细胞作为参考。通过与a-微管蛋白的共染色(B)显示DCL 的过度表达(绿色，A)导致有丝分裂纺锤体的延长，注意转染的和非 转染细胞的有丝分裂纺锤体长度的差别，通过箭头显示的。DNA是用 DAPI (蓝色)进行染色的。D-I:在COS-l细胞中DCL在细胞分裂时的过度表达的共聚焦显微镜的观 察。看起来类似(D-F)于野生COS-l细胞的一个表型，其中DCL(D)主要与 a-微管蛋白(E)结合。类似的在分裂的NlE-115细胞中DCL的内源性定位， DCL也定位于着丝粒。DCL的定位以绿色表明，与通过a-微管蛋白染色 (红色)显示的有丝分裂纺锤体重叠。观察的其他表型导致有丝分裂纺锤 体(G-I)伸长和方向的改变。绿色=DCL (A, D， G)，红色="微管蛋白 (B,E,H)，黄色DCL及a-微管蛋白的定位(C,F,I)。标尺刻度是10 tai。实施例实施例-1小鼠和人的DCL的克隆从小鼠克隆的DCL的cDNA (SEQ ID NO: 1)的DNA序列分析显示含362 个氨基酸的预测分子质量为40 kDa的开放阅读框(SEQ ID NO: 3 X图IB ) 及对于两条蛋白质整个长度有73%氨基酸相同于小鼠DCX (81%的相似 性)。对于DCX域I两个预测的DCX重复序列(Taylor etal., 2000,同上) 与小鼠DCX的对比显示甚至更高的81X氨基酸相同(89%的相似性)和 对于DCX域II有90X的氨基酸相同(99%的相似性)，强烈显示后边的 域在两个蛋白质中有类似的功能。丝氨酸/脯氨酸(SP)丰富的的C端在 很大程度上与CARP相一致(Vreugdenhil et al., 1999, Neurobiology 39, 41-50)，显示了较低的63%氨基酸的相同性，(78%的相似性)。该SP丰 富的域在DCX和DCL中都存在。这种SP丰富的域是潜在的MAP激酶基 序(Sturgill et al.， 1988， Nature 334， 715-718)，这表明C端是一个MAP激 酶基板。有趣的是，在DCX这一区域的YLPL的基序已经表明AP-1和 AP-2相互作用并被牵连在蛋白质排序和囊泡运输中(Friocourt et al., 2001， Mol. Cell Neurosc. 18， 307-319)。不过在DCL中相应的基序是YRPL，其 中的疏水性亮氨酸被碱性的精氮酸残基取代，表明DCL不太可能与AP-1 和AP-2相互作用。人类基因t/c/ cDNA/mRNA (SEQ ID NO: 2 )和蛋白质(SEQ ID NO: 4) 序列已经利用鼠的序列从人类神经母细胞瘤细胞系(SHSY5)中获得并被发现非常相似于小鼠序列，在这里其他地方所述的一样。例2—DCL是一个MAP (微管相关蛋白)并稳定细胞骨架DCX和DCLK-长链的两个DCX域都显示互相作用并且可以稳定微管结构 (Francis et al., 1999, supra; Gleeson et al., 1999 supra; Kim et al.， 2003, Struct. Biol. 10， 324-333; Lin et al., 2000, supra)。因为DCL含有于DCLK國 长链相同的DCX域，DCL被期望有对微管有类似的稳定和聚合效应。为 确认这一点，进行了三种类型的实验第一，在COS-1细胞中DCL的过 度表达产生了一个在重叠的微管分布的人体细胞中纤维染色的模式(图2.1 A)，通过与a-微管蛋白抗体(图2.IBandC)共定位所呈现。第二，为 了测试含DCL的微管束是否与DCX以及其它MAPs所了解的一样显示对 解聚作用类似的抗性，DCL转染细胞暴露于10Pg秋水仙素，这个化合物 解聚并打乱了微管蛋白。非转染细胞的显示了明显的解聚微管骨架的作用， 而所有DCL转染细胞的微管骨架能抵抗1小时秋水仙素的处理，特别是浓 縮的微管/ DCL束(图2.1 D-F)。这表明类似于DCLK-长链和DCX的DCL 能稳定微管。第三，在体外聚合实验中通过孵育不同浓度的重组非标记的 DCL与纯化的微管蛋白，DCL微管聚合反应特性被进行了检测。紫杉醇被 用来作为阳性对照，这是一个著名的微管聚合化合物。微管聚合的分光光 度法监测表明DCL聚合微管的作用呈剂量依赖性(图2.n)。总之，这些 数据表明DCL，类似DCLK-长链和DCX，可以直接聚合和稳定微管。 例3-表征DCL识别抗体。最近抗CARP抗体的产生，叫做抗-CaMKLK，已被描述(Kruidering et al.， 2001, supra)，其也被认为是其他DCLK基因剪接-变异体包括DCLK-短链(也称为cpgl6 (Silverman et al.， 1999, J. Biol. Chem. 274， 2631-2636)或 CaMKLK)。 CARP是一个具有55个氨基酸的小蛋白，其中43位氨基酸与 DCL的C端是一致的，即占70%的氨基酸序列与人类DCX有同源性(Vreugdenhil et al., 1999)。针对抗-CaMKLK的特异性，DCX和DCL在 COS-1细胞中被过度表达并通过免疫印迹分析可能的交叉反应。抗 -CaMKLK强烈识别DCL (图3A条带4-6)，而与DCX只有一些交叉反 应(图3A条带2和3)。在另一方面，DCX抗体用于此处对抗DCXC端 的17个氨基酸，可以强烈识别DCX的(图3A条带2和P 3)而不识别 DCL (图3A条带4-6)。因此，抗-CaMKLK强烈识别众多DCLK基因的剪接变异体包括DCLK-短链和DCL，因此在此称为"抗-DCLK"。此外， 抗-DCLK与DCX的一些交叉反应可能会发生，而DCX抗体是特异于DCX 而不针对于DCL。例4 - DCL在脑发育的早期阶段高效表达Western blot分析胚胎脑组织匀浆发现存在一个40 kDa免疫阳性蛋白抗 -DCLK。这种蛋白质的大小与在COS-l细胞(图3B)中过度表达的重组 DCL蛋白一致。由于没有观察到其他免疫反应带(图3B)，所以抗-DCLK 只识别在发展中的鼠脑中的DCL。虽然信号已经ED10出现，但是DCL 蛋白最高水平的免疫反应在ED12和ED14中被发现。在ED14后DCL蛋 白水平下降并且一个较弱的但清晰的40kDa的条带仍在成人脑组织中出 现。这里一个另外的53kDa的条带非常突出(图3B)。与其分子量53kDa 一致，这个条带最有可能代表DCLK-短链，它仅在成人而不在发育中的脑 组织中做丰富的表达。(Vreugdenhiletal, 2001; Omorietal., 1998)。在成人 脑组织中，DCL蛋白的最高水平在嗅球中被发现，较低水平在海马和大脑 皮质中并且非常低的水平在小脑，脑干和下丘脑中被发现(图3C)。DCX已经被报告能在发育过程中特异地表达但在成人脑组织中下降到 能够检测的水平以下(Francis et al., 1999 supra; Gleeson et al., 1999 supra)， 虽然DCX在选定的区域仍然以非常低的数量表达(Nacher et al., 2001, Eur J Neurosci 14, 629-644)。为了比较DCL的发现物，蛋白裂解物与识别C 端的DCX-特异性抗体被进一步的分析。与其他研究结果一致(Francis et al., 1999; Gleeson et al., 1999)， DCX的最高浓度在ED12中被发现并且发现之 后呈下降表达(图3B)。与DCL比较，没有DCX蛋白的表达，也经过长时间的曝光后，在ED8 和ED10胚胎头部或在成人脑组织中可以发现。但是与DCX在神经元迁 移中的作用一致，DCX免疫反应在成人嗅球(图3C条带7)中而不是在 其他脑结构被观察到(图3C条带2-6)，显示在整个大脑裂解物中低于检 测水平的DCX的稀释度。为分析DCX和DCL表达的更详细的区域差异，在早期胚胎发育期间 DCL的时空表达被采用原位杂交的方法进行研究。DCL mRNA的低水平 表达在ED8中被沿着神经上皮的长度观察(在后来的发育阶段注定要产生 中枢神经系统和大脑皮质层)(图4.IA)。在ED10中当大量的分裂开始进 行时，大量的表达在间脑，端脑和中脑中被发现(图4.1 B)。与RT-PCR和免疫印迹实验一致，在ED12中DCL表达的强度与ED 8禾B IO相比时 有强烈地增加(图4.IC)，在增殖心室区具有高水平表达。为研究DCL蛋白的时空分布，使用DCLK抗体(抗-DCLK)将从小鼠 在8， 9， 10和11日龄的胚胎的截面被进行免疫组化检测，该抗体专门识 别在这些阶段的DCL (见上文和图3B)。在ED8中没有观察到DCL染色 (数据未显示)。然而在ED9中没有DCX蛋白表达的阶段尚未发现(图 4.1IB)， DCL信号在心室壁和主要神经上皮细胞中非常突出，大量有丝分 裂和神经形成的区域界限清晰。(图4.H C和J)。在EDIO和11中， 一般利用原位杂交模式DCL蛋白质在中央和周围神经系统的增殖地区具 有高水平表达，包括端脑，中脑，神经节的横向隆起，神经管的神经上皮 细胞以及例如背根和交感神经节，然而像例如骨或肠非神经组织则缺乏任 何信号(图4.IIA和D)。早期大脑皮层更高倍显示DCL不仅在上层皮质 板而且在内心室区中间带以较低水平的表达(图4.IIF禾PI H)。特别引人注目的观察是DCL在有丝分裂的细胞中的免疫反应，如在心室 区和上皮壁(例如在图4.IIC-F,H，J-N)同时在神经管的神经上皮(图4.H D)和神经上皮皮质的中间带(图4.II F)有丝分裂细胞中也被发现DCL呈阳 性， 一般以更单独的和较低地频率发生。此外上皮细胞在同一截面的DCL 染色模式，清楚的免疫阳性双重带被观察到(图4.H D和F)。在细胞周 期的特定阶段的有丝分裂的细胞也可以被识别(图4.IIJ-N)，染色体之间 的强烈的免疫反应，甚至在中心体样结构的免疫反应都清晰可见(图4.II L)。总之，数据清楚地表明存在DCL mRNA表达的先导序列即从ED8启动 的DCX和从ED9起始的DCL蛋白。DCL mRNA和蛋白的最高表达被在 ED12和ED14中发现，分别与DCX相反，DCL的转录体及蛋白表达也 被用Western blots在成人脑组织中发现。在发育早期阶段蛋白质分布不仅 在时间而且在位置上也不同于DCX，即DCL被发现在心室区和皮质板而 非单独在皮质板(图4.H C， F-H)。最引人注目的是DCL免疫反应在神经 上皮有丝分裂的细胞中，有时在中间带被有规律发现。 例5- DCL在神经母细胞瘤细胞中内源性的表达。为了调査DCL在神经元中增殖可能发挥的作用，DCL在几种神经元细胞 系的内源性表达被进行了分析。在4种不同神经母细胞瘤细胞系中观察到 约40 kDa的DCL阳性带，这是在所研究的任何非神经母细胞瘤细胞株中缺失的(图5.IA)显示了 DCL在成神经细胞样表型的细胞的特异性表达。 筛选其他非神经母细胞瘤细胞系包括PC12细胞，未能找出任何DCL阳性 细胞系(数据未显示)。在神经母细胞瘤细胞株N1E-115中，40kDa的免 疫反应双重带与双重带共迁移是由DCL的过度表达造成(图5.IB)。这个 40 kDa的条带不能够由在N115细胞中出现的DCX解释，因为使用DCX-特异性引物和抗体，通过RT-PCR试验和免疫印迹分析都未能检测到DCX 信号(数据未显示)。因此上面的40kDa的DCL双重带最有可能代表了磷 酸化的DCL，当细胞裂解物与磷酸酶进行孵育时，这一想法被上面的DCL 内源性以及过度表达的条带的缺失所证实。这进一步表明DCL类似于 DCX ，至少在神经元细胞系中是一种磷酸化蛋白。 例六-DCL影响微结构和组织在N1E-115细胞。为了研究DCL功能和亚细胞定位，在N1E-115神经母细胞瘤细胞间期时 DCL的操纵子表达后，利用共聚焦显微镜及小的干扰(si)RNA技术进行的 免疫细胞化学实验。为建立siRNA被Nl 15细胞摄取，抗-DCL合成的siRNA 分子被Cy-5所标记并且它们在N115细胞中的存在或缺失可以通过荧光显 微镜来监测的。这些研究结果表明在大约95X的N115细胞中存在抗-DCL 的siRNA(数据未显示)。三种不同的抗DCL siRNA的分子被构建siDCL-l, 2和3. Western blot分析表明siDCL-l未能使DCL蛋白沉默(图5.II条带 1 )，这一发现可能可以通过在反义链在3'端中因缺乏TT双核苷酸来解释。 其后siDCL-l被作为一种siRNA程序的作用的阴性对照。从Western blot 分析确定，与非处理的细胞相比，siDCL-l，转染siDCL-2和Si-DCL-3分 子分别导致80%和90%的基因沉默(图5.11条带2 and 3)。随后使用抗 -DCLK和ct-微管蛋白或y-微管蛋白抗体对siRNA处理的N115细胞的 免疫细胞化学分析发现其在细胞间期微管骨架的结构深刻的影响。在非处 理的细胞中抗DCL染色通常是点状的并且在整个残余的胞体中存在(见图 5.IIIA)。和DCX形成对比，DCL似乎有选择性地存在于胞体的周边甚至 在神经元进程的末端(Friocourt et al.， 2003; Schaar et al., 2004)， DCL的免 疫反应在胞体的周边不是很强烈(图5.III A和C)而且往往显示在细胞 核的一侧或两侧的附近强度增加，(图5.niA,C,D和F)，表明DCL在中 心体周围沿着细胞骨架显著地浓縮。亚细胞定位被与中心体标记y-微管 蛋白共染色所证实(见图5.IVA-C)。与Western blot分析结果一致，siDCL-l的转染并未改变内源性DCL免疫细胞化学染色的模式。DCL的基因沉默是通过siDCL-3诱导，然而在抗 -DCLK染色下诱导几乎完全消失(见图5.IIIG)，明显表明抗-DCLK抗体 在N115细胞中以高效特异的方式识别DCL。明显地40%转染了 siDCL-2 和80%转染了 siDCL-3的细胞中细胞骨架被破坏，明显地是由于^-微管 蛋白染色模式改变和分散以及不规则的组织。转染了 siDCL-2和3的但有 正常细胞骨架的N115细胞也比异常细胞骨架的细胞显示了更多的抗 -DCLK染色。这进一步地支持了有效的DCL基因沉默和随后的微管稳定 性异常的因果关系。与非处理的细胞的正常微管骨架比较，DCL沉默后的 异常模式的特点是具有更浓縮和较少分散结构的维管束，明显地显示了较 少的分支(图5.11IHandl)。这表明DCL在微管骨架的分支和稳定性的作 用。由于DCL蛋白质在中心体周围以高浓度状态被发现分布，DCL基因沉 默可能会影响中心体蛋白复合物和随后其在细胞核的定位以及细胞骨架连 通性和(重新)组织。为了解决这一问题，DCL基因沉默在与Y-微管蛋 白染色结合下进行(见图5.IVD-I)。与N115细胞整倍体的性质一致，每 个细胞都观察到多中心体。然而尽管DCL基因沉默是有效的但在中心体的 数量上或结构上并没有明显改变，表明DCL在中心体的组织结构上不是一 个关键因素。例7- DCL是神经母细胞瘤细胞有丝分裂纺锤体形成的必不可少的。 DCL在心室区的存在(图4)与DCL在神经元增殖和祖细胞分化的作用是 一致的。因此由siRNA导致的DCL沉默后利用共聚焦显微镜分析NlE-115 细胞。DCL强烈的免疫反应在所有的在中期或早后期分裂的N1E-115细胞 中被观察(见图6A和D)。 DCL免疫反应主要定位于a-微管蛋白，显示 了与有丝分裂纺锤体的联系。然而，免疫反应梯度在所有细胞的DCL被明 显地分析，在中心体附近的较低水平和在有丝分裂纺锤体和附近着丝粒的 较高水平表明DCL在有丝分裂纺锤体的形成中的作用。与通过siDCL-2 和siDCL- 3转染导致的DCL基因沉默的显著性影响相协调，这是与有丝 分裂纺锤体的完全变形和有时缺失相关联的(图6G-L)。这个对有丝分裂 纺锤体效应被在40%的所有的分化细胞(siDCL-2)和在所有转染siDCL-3 分化细胞中发现。，由siDCL-l导致DCL基因低效率的沉默与未发生改变 的有丝分裂纺锤体共定位，而有丝分裂纺锤体外观的表型类似于非处理的 有丝分裂纺锤体(图6D-F)。因此很显然DCL是分裂的成神经细胞或神经祖细胞有丝分裂纺锤体正确的形成的必然需要。例8 _ DCL的过度表达导致有丝分裂纺锤体的伸长。增益函数通过在通常不表达DCL蛋白的COS-l细胞中过度表达DCL而被 进行研究。与上述在N115细胞中内源性DCL的表达的研究结果相一致， DCL的免疫反应与有丝分裂纺锤体共定位于分化的C0S-1细胞(见图7)。 观察到两种不同的表型第一，在20% (每组n=126)分析的分化的COS-l 细胞中，DCL过度表达与a-微管蛋白定位，类似于在分化N1E-115细胞 中内源性DCL的表达模式(图7 D-F)， DCL定位在着丝粒和有丝分裂纺 锤体。然而与N1E-115细胞不同，DCL也被发现与中心体和星形纤维相联 系。其次，在大多数的分化的COS-l细胞(80%)中，由于事实上所有 DCL表达和分化的细胞显示一种拥有扁长的有丝分裂纺锤体的不正常的 表型，DCL表达的确切的有丝分裂阶段的对照和质粒转染细胞被阻碍。最引人注目的，观察到的半个纺锤体表明DCL的过度表达影响中心体隔 离和纺锤体的方向(图7 7A-C，G-I)。此外，该有丝分裂纺锤体看起来较 对照细胞的有丝分裂纺锤体更长而且往往较厚(如比较非处理细胞的纺 锤体长度，图7B与图7C)。值得注意的是，这些DCL的影响与异常的 DNA染色和分布格局有关，如染色体在胞体中被完全置换和分散，与正常 方向有显著不同的模式(图7B)，即与中心体双极的位置垂直(与图7C 相比见参考长度)。因此，DCL在COS-l细胞中过度表达导致纺锤体的伸 长并形成半纺锤体，暗示DCL对有丝分裂纺锤体的形成和长度起着关键的 作用。例9 -材料与方法 9.1小鼠DCL的克隆本发明的发明人研制出一种反义引物1A: CTGGAATTCTTACAC TGAGT CTCCTGAG (下划线是EcoRl位点)符合于CARP特异外显子的终止密 码子区域和有义引物2S: GCAGG TTCTC ACTGA CATTA CCG符合于小 鼠DCLK基因3号外显子。利用小鼠胚胎的cDNA为模板和聚合酶PM (stratagene)进行30个PCR循环。DNA序列分析证实了 DCLK特异的 DNA序列。随后利用CCAGGATCCACCATGTCGTTCGGCAGAGATATG (下划线是BamHl位点)作为有义和1A作为反义引物，酶切位点是BamHl 禾口 EcoRl并且在质粒pcDNA 3.1 (InVitrogen, Groningen, The Netherlands )亚克隆中表达编码完整DCL蛋白的DCL cDNA被扩增。通过从pEGFP-Cl 的Smal/Kpnl位点的pcDNA3.1. DCL亚克隆KpnI/EcoRV DCL片段来 DCL-EGFP (Clontech;也见图表l)。 9.2原位杂交技术DCL mRNA包括8号外显子(图1 )，其在大多数其他DCLK转录体除CARP 中缺失。由于CARP在胚胎发育过程中以非常低的水平表达，40-mer反义 寡核苷酸被揭露(5' -TTTGC TGTTA GATGC TTGCT TAGGA AATGG GAAACCTTGA-3')互补于8号外显子的特定序列。作为一个阴性对照其 中含有6个错配(下划线)的寡核苷酸5'-TTTGA TGTTA TATGC TTGAT TAGGA CATGG GACAC CTGGA-3'被使用。根据制造商的说明利用末端转 移酶(Roche Molecular Biochemicals， Almere, The Netherlands), 将这两个 寡核苷酸用a - 33P dATP做了末端标记(NEN Life Science Products, Hoofddorp, The Netherlands, 2000Ci/mmol, 10 mCi/ml)。原位杂交技术和信 号的可视化表现如前面所描述被实施(Meijer et al., 2000, Endocrinology 141， 2192-2199)。 9.3抗体抗隱DCL抗体的产生之前已被描述(Kruidering et al., 2001, supra)。小鼠 单克隆抗a -微管蛋白抗体从81§11^购得。山羊多克隆抗(10111^(:01^11((:-18) 抗体，罗丹明-共轭二抗和辣根过氧化物酶共轭二抗由Santa Cruz生物技术 公司购得。 9.4细胞培养及处理所有细胞培养的化学品由生命科学技术公司购得，除非另有说明。所有细 胞保持在37'C， 5%二氧化碳的条件下培养。在COS-细胞培养在 Dulbecco ， s modified Eagles medium (DMEM培养液)中，辅以100单位/ 毫升青霉素，100 ug/ml的链霉素和10%的胎牛血清。NG108-15和N115 细胞在无丙酮酸钠培养液中培养，辅以100单位/毫升青霉素，IOOU g/ml 的链霉素，杂交瘤细胞(HAT)的组合物和10%的胎牛血清。瞬时转染实 验中细胞培养平板或涂以多聚赖氨酸的玻片。从新生小鼠中原代分离的神 经元在补充了 L-谷氨酰胺，100单位/毫升青霉素，100ug/ml的链霉素和 10%的胎牛血清的F-12 Ham， Kaighn， s modification (Sigma)培养基培养。 从一天龄的小鼠的海马区分离出的原代神经元在37'C胰蛋白酶溶液孵育 25min。随后用培养基洗涤细胞两次并铺在涂以多聚赖氨酸的玻片上。24小时后去掉培养基并补充的胞嘧啶-3-阿拉伯糖苷(Sigma)以减少 神经胶质细胞的数量。瞬时转染实验是利用superfect试齐lj(Qiagen, Valencia, CA)根据制造商的说明来完成的。原代神经元在分离的四后天转染。 9.5 siRNA实验在siRNA实验中采用小鼠神经母细胞瘤细胞系NIE-115 (ATCC货号 CRL-2263 )。合成RNA的寡核苷酸5， -CAAGA AGACG GCUCA CUCC-3' 和 5' -GGAGU GAGCC GUCUU CUUG-3' (annealed siDCL-l)， 5， - CAAGA AGACG GCUCA CUCCT T- 3， (SEQ ID NO: 5) 和5 ，匿GGAGU GAGCC GUCUU CUUGT T-3 ， (SEQ ID NO: 6) (annealed siDCL-2)和5 ， -GAAAG CCAAG AAGGU UCGAT T-3 ， (SEQ ID NO: 9) 和5 ， -TCGAA CCUUC UUGGC UUUCT T-3 ， (SEQ ID NO: 10) (annealed siDCL-3)，其中3'胸苷是脱氧核苷酸，是从Eurogentec公司购得，并溶解 在退火缓冲液(100mMKAc，30mMHepespH7.5,2mMMgAc)中使最终 的浓度为100 PM。 siRNA双链的形成，有义和反义寡核苷酸相等的摩尔数 量进行混合，在37oC孵育1小时后94oC加热1分钟。每孔使用最终浓度 是lOOnM的siRNA双链。在基因沉默的试验中，60 pmol的siRNA双链被 溶解在50 W优化的-MEM培养基(生命技术)中并用移液器与3W转染 试剂(Irwitrogen公司)进行混合，溶解于12W优化的-MEM培养基。孵 育20分钟后在室温下，体积增加与3214优化的-MEM培养基并且总的混 合物(100W)添加到细胞(500W)。 48小时后利用免疫印迹分析和免疫荧 光检测基因沉默。 9.6免疫细胞化学细胞培养和瞬时转染如上文所述。在预定的时间，玻片上的细胞在室温下 被80%丙酮固定5分钟。然后细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次，0.05 %吐温-20和在封闭缓冲液封闭至少1小时PBS， 0.05%吐温-20， 5%正 常山羊血清(NGS，Sigma)。 一抗被加入封闭缓冲液在室温下封闭1小时， 用PBS， 0.05%吐温-20洗涤3次并在室温封闭缓冲液中用罗丹明标记的二 抗孵育30分钟。然后在进行洗漆，将细胞核用0.21^g/ml Hoechst 33258染 色5分钟，洗涤4次并分析。图像是由奥林巴斯AX70荧光显微镜再加上 一个由分析@软件所操作的索尼3CCD彩色摄像机(Soft Imaging System, Corp.)进行获得。为了描绘DCL蛋白质分布，ED9, 10禾n 11小鼠的晶 胚的胚胎CD1在PBS中做短暂的洗涤和然后在室温下用甲醇/丙酮/水(40:40:20)中固定4小时(MAW, Franco et al, 2001 )，然后储存在70%乙 醇2周，在被嵌入蜡片之前(Kendall, Tyco Healthcare, Mansfield, MA 02048, USA)以6 厚的截面固定在SuperfrostTMPlus防脱玻片(Menzel-Gmser)。 TBS在所有下列步骤中被用来作为洗涤缓冲液。在二甲苯和梯度乙醇中清 洗后，切片在Bouin的定影液中被进行后固定，由0.1%过氧化氢处理15min 洗涤和封闭内源性过氧化物酶活性。为了减少非特异性吸附，用1%奶粉 PBS溶液(Campina, The Netherlands)作用30分钟。DCL的一抗以1: 50 加入0.25X凝胶/0.5^TritonX-100的TBS (supermix)溶液中在室温下作 用1小时，然后4'C过夜。二抗(biotinylated anti-rabbit,生物素标记的抗兔 的抗体，Amersham Life Sciences, 1:200)在室温下孵化小时30分钟在 supermix 1中，扩增亲和素-生物素((ABC) ) ( Vector Laboratories, Burlingame)，生物素化酪胺(1: 500)与ABC孵育45分钟之后，再与 0.01 %过氧化氢反应30分钟。最后在0.05 MTrisHCl缓冲液(pH7.6)中洗 涤两次，这种缓冲液也可以用来溶解(DAB)(0.05M)。切片也可以被甲酚 紫复染和用Entellan封片剂盖上盖玻片(默克公司)。作为对比，以1:75稀释度使用C-18微管相关蛋白特异性抗体(Santa Cruz Biotechnology, South Cruz CA, USA)， DCX蛋白质的分布被映射在邻 近的截面。象以上一样，使用相同的方案，除了奶粉封闭的步骤是省略的 和生物素标记的抗山羊抗体作为二抗。 9.7蛋白提取和免疫印迹分析小鼠组织和细胞溶解于溶解缓冲液(20mMtriethanolaminepH7.5, 140mM NaCl, 0.05% deoxycelate, 0,05% dodecyl sodium sulfate, 0.05% Triton X100, supplemented with Complete EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物(罗氏分子生 化)并在16,000 g离心30分钟。收集上清并使用Pierce方法测定蛋白浓度。 等量的蛋白质经SDS-PAGE分离，转移到immobilon-P的聚偏氟乙烯膜 (millipore)。杂交点与封闭缓冲液封闭1小时(Tris-buffered saline, 0.2% Tween 20 (TBST), 5%牛奶)，与一抗在封闭缓冲液中孵育1小时，用TBST 洗涤3次，辣根过氧化物酶标记的二抗在封闭缓冲液中孵育30min并用 TBST洗涤3次。通过ECL检测抗体的结合(Amersham法玛西亚生物技 术公司)。 9.8磷酸酶处理DCL转染和未转染的NlE-115细胞溶解于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH9.3， lmMMgC12, 0.1mMZnC12， 1 mM亚精胺补充Complete EDTA-free 蛋白酶抑制混合物(Roche Molecular Biochemicals)， 16,000 g离心30分钟。 收集上清并使用Pierce方法测定蛋白浓度。每个上清液分为含有为50Pg 蛋白质的三份样本。第一份个样本是未经处理的，第二份样本是在37° C 没有酶的情况下孵育30min和第三份样本与10个单位的小牛肠道碱性磷 酸酶(promega生物科学公司)孵育。样本如上文所述用免疫印迹进行分 析。9.9微管蛋白聚合试验编码被从pcDNA3.1中切除的cDNA的DCL表达建构并且使用BamHl and EcoRl连接至(JpET28。 DCL表达构建的结果被转入BL21细胞。 一个 单克隆在500毫升LB培养基终长至OD 0.7，此时IPTG以终浓度为0.4 mM 被添加到其中。诱导3小时后，收集细菌并用PBS洗涤和收集。通过重悬 重组的DCL蛋白被分离并通过高压处理后，根据制造商的说明使用 probond (Invitrogen公司)镍离子亲和树脂纯化纯化DCL集中到0.8 mg/ml 使用centricon 30浓度装置。微管蛋白聚合检测均根据Gleeson等人 (Gleeson et al., 1999, supra)使用微管蛋白聚合分析试剂盒(cat no BK006) 由细胞骨架。简单来说，1毫克微管蛋白被解散， 一点一毫升冰冷聚合缓 冲区根据制造商的指示和100 U L的，这是添加到10 u升DCL蛋白不同 浓度在96孔微板。随后，吸收在340 nm处测量为30 '在30 "间隔使用 HTS2000 (Biorad/Perkin Elmer)。Del禾n DCL序列 SEQ ID NO: 1ccacgcgtcc geggagaace gcatttcaa_t g己ggaccagc tccagcgcat cagtgeacta gcggtcgcsg cttccagacg ctcgtgctcc gcagccccag ccgcgcccag cccggcgagg 3cagctcca_g cagccggccs cagacaaccc agcctccacc cgcga_ccggt tccatsagca sgccagccst gtcgttcggc agagatatgg agttggagca ttttgatg3g cgggaca己gg cgcagaggt己 cagcaggggg tcccgtgtga atggcctgcc ca_gccccaca cacagcgcccactgeagett ctsccgcacc cgcaccctgc agacactcag ctccgagasg 3aagcca_aga aggttcgatt ctacagaaat ggtgaccgct acttcaaagg aattgtgtst gccatctccc csgaccgctt cagstctttc gaggccctgc tggctgsttt gacccgaact etcteggataatgtgwtttgccccaggggccsgcctggaccagctggtgagaagctggacagcctcccgcgcsgtgtcttctttggcc3tttcattcgscccaagctgggg33ggctgtcagaa_tcctgctgaacaagactgscsttsccga^cgctstcaagctggactatgggaagcaggtgatgtgccttca_ggactgtggaccagsgssgttccgttaccaggatgtggtgaaatc33Cttctt3Cgcccaggaccttcccggagactggt3gtc3gctctctactccacgctcggcsgga^gcctgcggssgcsgagggacctgtcaggagactcttcSEQIDNO: 2gcscstccctgcactagtggccgc33ccg3a_gcccggccccgccgccgccccccagccctcggcgaggacagcsccsggaggcggccccctctccgcggaccggtcctscttgdsgtccsagcacttcga_cgagcgggattgccg3gcccgscgcacagcgcccactgcatcsgctccg3gaagaaggcc3sga^3gttcasgggsttgtgtstgcc3tctccccsg3ccatttgacccg3sctctgtcggataacgtgaccattgatgg3tttccsgcctatgtggctcttcaagaaacggtcggtgaacgtcaagsccacctcggcttaaggaagcccttcsgsggtgtcatcagaagtggcgtgaagctcsttcctttgagcaggtcctc3ccgst3tggtgaaacgcctgtscscgttggatgggatC七3C3CC3tcgstggsctcgctstgtctgcggctccs七cgsgccctttsccaactggtcsgtgaacgtcctgccssgggtgggccttcggsggttcgggtC3CC3tC3tcagsagtgggagscggctcactccttcgagcaggttctcaccggtgtggtgaagcgcctgtsc3ctctggtttttggtgacgstg3C3tttttattgcatstttcttgctgsatgtcgsgcstcagcgtcccgcagaggcC3gcctccsccagctcagttaatggaacccgcaagtC3ccaagtccatcaccc3cc3gccsccgccccctctcgtcggstgstttggsctgdcgccgcgctccagcagctgctgccgcccgcsgccccgc3gccccggccgcgcccsgccsgcgcggccacggcggcgtctcstgtccttcggcagagac3tggagctggg3t3csgccgsgggtcgcgggtgaacggccgcttctaccgcscccgcscgctgcagacgcgtttctstcgcg3t3cttcsggttccgstcttttgaggccctgctggctg3tttgccccsgggsgtga^gstggaccaactggtggaaggagagagttstgtggagtacacC33gaatgtgctcgggcagtgtcttcwtggccactgccaaggstttcsttcggcccaagctggtcaccactgtcaggattctgctgaactcaccgatgcC3tcasgctggactcgggag33C3ggtgst 38gtgccttcaggacttttttggtgstgatgstgctsgstcatcccgcsgccaccagctccgccaagcccccctctcttccaitttttatt aagtga_atgt gagcaccacc agttsatgga a±csccc3cc ggaitgacttggc3tgtgg3c cgagtggtaa aagagcccsg scccctggt3 agcccaggaa g3ttc3gt3gsgtcc3cttc gsccgtccsg gtcsgctctc gcctgcggaaccgttscc^gtactccgcgc gcagagggacgstgatttct 3t3gcttc3t tcccctgcct tcaggcaagt ctgtsccgccSEQ ID NO: 3Met Ser Phe Gly Arg Asp Met Glu Leu Glu His Phe Asp Glu Arg Asp15 10 15Lys Ala Gin Arg Tyr Ser Arg Gly Ser Arg Val Asn Gly Leu Pro Ser20 25 30Pro Thr His Ser Ala His Cys Ser Phe Tyr Arg Thr Arg Thr Leu Gin35 40 45Thr Leu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Lys Lys Val Arg Phe Tyr Arg Asn50 55 60Gly Asp Arg Tyr Phe Lys Gly lie Val Tyr Ala lie Ser Pro Asp Arg65 70 75 80Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu Ala Asp Leu Thr Arg Thr Leu Ser85 90 95Asp Asn Val Asn Leu Pro Gin Gly Val Arg Thr lie Tyr Thr lie Asp100 105 110Gly Leu Lys Lys工le Ser Ser Leu Asp Gin Leu Val Glu Gly Glu Ser115 120 125Tyr Val Cys Gly Ser lie Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr Thr Lys130 135 140Asn Val Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser Ala Ser145 150 155 160Arg Ala Val Ser Ser Leu Ala Thr Ala Lys Gly Gly Pro Ser Glu Val165 170 175Arg Glu Asn Lys Asp Phe lie Arg Pro Lys Leu Val Thr 工le 工le Arg180 185 190Ser Gly Val195 Thr Ala His210 Lys Leu Asp 225Gin Val MetLys Pro Arg Lys Ala Val Arg 工le Leu Leu Asn Lys Lys20〇 205 Ser Phe Glu Gin Val Leu Thr Asp工le Thr Asp Ala工le 215 220Ala Cys GlySer Gly Val Val Lys Arg Leu230 235 Cys Leu Gin Asp Phe Phe Gly245 250 Pro Glu Lys Phe Arg Tyr 260 265 Glu Ser Glu Cys Arg Val Val Lys Ser Thr275 280 Ser Ala Ser Arg Arg Gly Thr Thr Lys 290 295Tyr Thr Leu Asp Gly Lys 240Asp Asp Asp工le Phe工le 255Gin Asp Asp Phe Leu Leu Asp 270Ser Tyr Thr !Lys lie Ala 285Pro Gly Pro Ser Arg ArgSer !Lys Ser Pro Ala Ser Thr Ser SerSer300 Val Asn305 310 315Gin Leu Ser Thr Pro Arg Ser Gly Lys Ser Pro 325 330 Ser Leu Arg Lys Gin Arg Asp Leu 345Ser Gly Asp Ser Val 360AspSer Pro Gly340Ser Asp Asp Leu 355SEQ ID NO: 4Met Ser Phe Gly Arg 1 5 Lys Ala Gin Arg Tyr 20Pro Thr His Ser Ala 35Thr Leu Ser Ser Glu 50Gly Asp Arg Tyr PheGly Thr Pro Gly Ser 320Ser Pro Ser Pro Thr 335Tyr Arg Pro Leu Ser 350Asp Met Glu Leu 10Ser Arg Gly Ser 25His Cys Ser Phe 40Lys Lys Ala Lys 55Lys Gly工le ValGlu HisArg Va丄TyrLys 60Arg 45 ValTyr Ala 40Phe Asp Glu Arg Asp 15Asn Gly Leu Pro Ser 30Thr Arg Thr Leu Gin Arg Phe Tyr Arg Asn lie Ser Pro Asp ArgGly65 70 75 80Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu A丄a Asp Leu Thr Arg Thr85 90 95Asp Asn Val Asn Leu Pro Gin Gly Val Arg Thr 工le Tyr Thr105 110 工le Ser Ser Leu Asp Gin Leu Val Glu Gly120 125 Ser 工le Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr 135 140 Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser150 155 Val Ser Ser Leu Ala Thr Ala Lys 165 17 0Lys Asp Phe 工le Arg Pro Lys 185Pro Arg Lys Ala Val Arg 200Phe Glu Gin Val Leu Thr 215Asp Ser Gly Val Val Lys 230Leu Gin Asp Phe250Lys Phe Arg Tyr 265Val Val Lys Ser Thr 280Ser Thr Thr Lys Ser 295Ser Thr Ser310Pro Arg Ser Gly100Gly Leu Lys Lys 115Tyr Val Cys130 Asn Val 145Arg AlaArg Glu Asn180Ser Gly Val Lys 195Thr Ala His210 Lys Leu 225Gin Val MetSerAla CysGlu SerGly260 Glu CysCys245 Pro GluArg235 Phe GlyGin275Ser Ser Ser Arg 290Ser Lys Ser Pro305Gin Leu Ser ThrArgArgAlaSerLeu Ser 工le Asp Glu Ser Thr Lys Ala Ser160Gly Ser Pro Ser Glu Val 175Leu Val Thr工le工le Arg 190lie Leu Leu Asn Lys Lys 205Asp工le Thr Asp Ala工le220Leu Tyr Thr !Leu Asp Gly Lys 240Asp Asp Asp lie Phe工le 255Asp Asp Phe Leu Leu Asp 270Ser Tyr Thr Lys工le Ala 285Pro Gly Pro Ser Arg Arg300Val Asn Gly Thr Pro Gly Ser315320Lys Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr 41325 330 335Ser Pro Gly Ser Leu Arg Lys Gin Arg Asp Leu Tyr Arg Pro Leu Ser340 345 350Ser Asp Asp Leu Asp Ser Val Gly Asp Ser Val 355 360
权利要求
1.一种SEQ ID NO1或2或SEQ ID NO1或2变异体的核酸片段在制备用于治疗癌症的组合物方面的应用，所述的核酸片段能够造成SEQ IDNO3或4的DCL-蛋白的数量的显著减少。
2. 根据权利要求1所述的应用，其中所述癌症是指神经外胚层起源的癌症。
3. 根据权利要求2所述的应用，用于治疗神经母细胞瘤，髓母细胞瘤，胶 质母细胞瘤，少突神经胶质细胞瘤，寡树突星状胶质细胞瘤，星形细胞瘤， 神经纤维瘤，室管膜瘤，MPNST (恶性周围神经鞘瘤)，神经节细胞瘤， 神经鞘瘤，横纹肌肉瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，肾上腺嗜铬细胞 瘤，原始的PNET (周边神经外胚层肿瘤)，尤文氏肉瘤和黑色素瘤。
4. 根据权利要求l-3任意一项所述的应用，其中所述核酸片段是选自反义 RNA寡核苷酸，反义DNA寡核苷酸和/或双链小干扰RNA。
5. —种SEQIDNO: 1或2的、或SEQIDNO: 1或2的变异体的有义和 /或反义核酸片段，其特征在于所述的核酸片段，当其被导入到神经外胚 层起源的癌细胞时能造成SEQ ID NO: 3或4的DCL-蛋白数量的显著减 少。
6. —种组合物，其特征在于包含一个或多个权利要求4的核酸片段和一个 生理学上可接受的载体。
7. 根据前述的任何一项权利要求所述的组合物，所述组合物进一步包含一 个或多个靶向化合物，其中所述的耙向化合物能够在体内或体外定位神经 外胚层来源的癌症细胞。
8. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述靶向化合物是一种免疫脂质体 或单克隆抗体。
9. 根据权利要求6-8任意一项所述的组合物，其中所述的组合物合适于治 疗神经外胚层起源的癌症。
10. SEQ ID NO: 3的鼠doublecortin样蛋白和SEQ ID NO: 4的人微 doublecortin样蛋白。
11. 一种诊断神经外胚层起源的癌症的方法，包含步骤a)通过分析血清样 本或一个主体的活检样本来检测SEQ ID NO: 2 RNA或DNA的存在或缺 失和/或SEQ ID NO: 4 DCL蛋白存在或缺失和b)量化样品中SEQ ID NO: 2禾口/或SEQ ID NO: 4存在的数量。
12. —种诊断试剂盒，包括引物，探针禾n/或能够探测样本中SEQIDNO:2 和/或SEQIDNO: 4的存在的抗体，以及所需要的检测试剂和使用说明书。
全文摘要
本发明涉及新型的核酸和蛋白质分子和它们在癌症的治疗和诊断上的应用。
文档编号C12N15/54GK101405392SQ200780009777
公开日2009年4月8日 申请日期2007年1月23日 优先权日2006年1月25日
发明者格拉德·约汉娜斯·普莱腾伯格, 派绰·凡·克威克-罗眉靖, 艾尔诺·维尤格登赫勒 申请人:普绕申萨公司