检测阿尔茨海默病的步骤和方法

专利名称：检测阿尔茨海默病的步骤和方法
检测阿尔茨海默病的步骤和方法
本申请涉及可用于检测哺乳动物尤其是人类中阿尔茨海默病的方法和 组合物。它特别描述了阿尔茨海默病的血清标记物及其在诊断步骤中的用 途。它还涉及可用于实施这些方法的工具和/或试剂盒(试剂，探针，引物， 抗体，芯片，细胞等等)及其制品和用途。本发明可用于包括在该病早期 阶段检测哺乳动物中阿尔茨海默病的存在或者进展。
阿尔茨海默病是痴呆的主要原因并且是最常见的神经退行性疾病。这 种疾病，实质上是进行性的，其特征在于记忆丧失以及语言技能、方向感 和判断力的退化。所述症状的特性经常与老年的生理毛病混淆，它们的严 重性以及它们在何种年龄出现因人而异。这导致很难在该病的早期阶段确 诊。
对患有该病患者的脑部检查显示海马区(记忆的重要中枢)和大脑皮 层(涉及推理、语言和记忆)中神经元的丢失。胆碱能神经元尤其受到这 种耗竭的影响。
在阿尔茨海默病患者脑部观察到的另一主要异常是胞内和胞外蛋白聚
集物的积聚。胞内神经原纤维tau蛋白缠结显示与痴呆程度密切相关。由淀 粉状蛋白P肽的胞内和胞外聚集形成的衰老斑构成神经元和胶质细胞改变 区域的特征。
但值得注意的是这些聚集区域不对应于突触耗竭(d6pl&ion en synapses)
部位，所述突触耗竭是认知功能减退的特征。
对遗传类型进行遗传研究已经显示了与该病发展有关的4个基因APP (淀粉状前体蛋白)，早老蛋白1和2 (PS1和PS2)以及脱脂载脂蛋白E (ApoE)。尽管这些基因中每一个中的突变或者多态性都将导致淀粉状蛋白P 肽的生成增加，但对控制突触和神经元丢失的机制了解得仍然很少。因此 在这点上，似乎同时存在与多种现象有关的数种假设和机制 1)涉及神经元和胶质细胞的纯粹脑现象
-氧化应激，其可能特别由淀粉状蛋白p肽诱导并经过胆固醇
4代谢调节；
-钙通量和兴奋毒性的变化；
2) 炎症和免疫反应现象；
3) 性激素的变化；
4) 甲状腺功能减退和胰岛素信号调节缺陷。
因此，阿尔茨海默病的特征在于各种综合系统的变化，所述综合系统 调节稳态并且攻击某些神经元，导致与免疫系统有关的炎症反应和内分泌 调节的变化。后者反过来对其他神经元的活性(activit6)和存活(viabilit6)以及
免疫功能产生影响，这类级联反应不仅在神经退行而且在阿尔茨海默病进 展中的激素调节和免疫应答中起作用。
目前还没有能够用于诊断阿尔茨海默病尤其是该病进展不同阶段的该 病有效和特异特征序列(signature)。有效诊断试验的提供尤其是早期试验 将使患者在疾病发生时接受护理，因此可以从更有效和更合适的治疗中受 益，所述治疗尤其是最优条件下的乙酰胆碱酯酶抑制剂诸如他克林 (tacrine)、多奈哌齐(donepezil)和利斯的明(rivastigmine)。
本发明满足这种需要。本发明特别描述了阿尔茨海默病血清标记物的 鉴定，允许开发出该病的存在、阶段或者患病风险的有效预测诊断法。因 此本发明描述了在阿尔茨海默病患者血液中特异性和优先表达的分子特征 序列的鉴定，所述分子特征序列尤其源于可变剪接。以一种特别出乎意料 的方式，本申请证明了阿尔茨海默病患者的血液细胞中存在体内钟调节异 常以及涉及吞噬和/或氧化应激的分子信号途径调节异常。因此本发明第一 次提供了诊断、预测和/或监测阿尔茨海默病进展的工具和方法，其基于测 量受试者血液中一或多个基因的表达，所述基因选自根据昼夜节律调节的 基因以及参与调节吞噬或者氧化应激的基因。这类基因表达调节异常的存 在能够确认阿尔茨海默病的风险或者易感性，或者证实该病在受试者中的 存在。
因此本发明的一个目的在于(体外(in vitro)或者离体(ex vivo))检测哺乳 动物中阿尔茨海默病的存在或者患病风险的方法，包括在哺乳动物生物学 样品优选在血液样品(衍生物)中检测一或多种基因或者RNA的变化，所 述基因或者RNA选自根据昼夜节律调节的基因以及参与调节吞噬或者氧
5化应激的基因，这类变化的存在是所述哺乳动物中阿尔茨海默病存在或者 患病风险的指征。
本发明的另一个目的涉及评估或者监测阿尔茨海默病治疗效果的方 法，包括在治疗期间测量一种基因或者优选数种基因表达的步骤，所述基 因选自根据昼夜节律调节的基因以及参与调节吞噬或者氧化应激的基因， 并将测量得到的表达与治疗前期测定的表达进行比较。
本发明的另一个目的涉及治疗阿尔茨海默病的改进方法，所述改进包 括在治疗前和/或治疗期间测量受试者中一种基因或者优选数种基因的表 达；所述基因选自根据昼夜节律调节的基因以及参与调节吞噬或者氧化应 激的基西。通过测量这类表达就可以根据病理进展调整治^T。所述治疗通 常利用乙酰胆碱酯酶抑制剂诸如他克林、多奈哌齐和利斯的明。
本发明的另一个目的涉及乙酰胆碱酯酶抑制剂诸如他克林、多奈哌齐 和利斯的明在制备治疗患者阿尔茨海默病的药物中的用途，所述患者的(至 少) 一种如上限定的基因的表达调节异常。
在本发明中，基因或者RNA的变化是指(i)任意表达变化，即表达(例
如转录或者翻译)水平的调节异常；剪接调节异常，导致例如特定剪接形
式的出现或者不同剪接形式的(相对)数量或者之间比例的变化；以及(ii) 产生的蛋白结构的任意变化(截短、延长或者突变形式的出现或者消失等 等)。
如同将在下文中描述的，本申请描述了在阿尔茨海默病患者血液中鉴 定参与信号级联的分子的剪接的调节异常，所述信号级联参与昼夜节律和 吞噬或者氧化应激的调节。测量血液中这些基因表达的任意分子或者技术 如核苷酸引物、核苷酸探针或者特异性抗体(它们可以于悬液中或者以固 定形式)都可以在本发明的范围内被实施，如将在下文中所详细描述的。
因此，本申请的另一个目的涉及一种包括基材的产品，在所述基材上 固定有核酸，所述核酸包括互补于和/或特异于如上限定的一种基因或者优 选数种基因或者RNA的序列。优选地，所述产品包括不同的核酸，所述核 酸包括互补于和/或特异于如上限定的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或 者更多种基因或者RNA的序列。
本申请的另一个目的涉及一种包括基材的产品，在所述基材上固定有多肽的至少一种配体，所述多肽由如上限定的基因或者RNA编码。优选地，
所述产品包括不同多肽的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或者更多种配 体，所述多肽选自上文提及的多肽。
本申请的另一个目的涉及一种包括小室或者容器的试剂盒，所述小室 或者容器包括至少一种核酸、优选数种核酸和/或如上限定的一或多种多肽 的一种配体、优选数种配体，所述核酸包括互补于和/或特异于一或多种如 上限定的基因或者RNA的序列。优选地，所述产品包括选自上文提及的核 酸和配体的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或者更多种不同的核酸和/或 配体。所述试剂盒还可以包括用于杂交或者免疫反应的试剂，以及如果需 要还包括对照和/或说明书。
太紫昍的早 一 个日的姊"加卜脲*的申品^老吝l I佥沐給测l卩击别动物
受试者优选人类受试者中阿尔茨海默病的用途。 阿尔茨海默病的血清标记物
本发明依赖于揭示和表征血清生物学事件，所述事件是人类患者中阿 尔茨海默病的特征。这些事件构成生物标记物，其在患者中的检测优选采 用组合形式甚至可以在早期阶段确定这类疾病的患病风险，这类疾病的存 在，或者该病的进展阶段。此外，本发明标记物还可以用于检测治疗效果 和/或选择候选药物。本发明标记物的组合能够区分阿尔茨海默病和其他神 经退行性疾病。
经鉴定的生物学事件通常对应于基因表达调节的变化。这有可能是基
因或者RNA表达的部分或者完全抑制，或者基因或者RNA某些形式表达 的部分或者完全抑制，基因表达的增加，或者基因或者RNA某些形式表达 的增加，基因剪接形式的出现或者消失等等。
在本发明范围内，短语"根据昼夜节律调节的基因"是指表达受体内生 物钟调节的任意基因。它尤其涉及表达或者活性根据时间节律(例如24小 时周期)调节的任意RNA或者任意蛋白。在人类中，昼夜节律由位于下丘 脑的"生物钟"(交叉上核)控制。它反过来控制其他生物钟，如那些控制 机体温度节律(rythme thermique)或者激素合成的生物钟。作为显示可用于 实施本发明的根据昼夜节律调节的基因的实例，尤其可以引用表1所列的 全部基因。因此，本发明的一个特定目的在于检测(体外或者离体)哺乳动物中阿尔 茨海默病的存在或者患该病风险的方法，所述方法包括检测哺乳动物的生
物学样品优选血液样品(衍生物)中一或多种如表1所示基因或者相应RNA 变化的存在，所述变化尤其是这类基因或者RNA剪接的变化，这类变化的 存是该哺乳动物中阿尔茨海默病的存在或者患该病风险的指征。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法包括至少检测哺乳动物生物 学样品优选血液样品(衍生物)中BMAL1或者CLOCK基因或者相应RNA 变化的存在，所述变化尤其是这类基因或者RNA剪接的变化。
在本发明范围内，短语"参与调节吞噬或者氧化应激的基因"是指表达 产物参与血液细胞中吞噬或者氧化应激机制的任意基因。吞噬是某些活细 胞吞噬并消化某些外源颗粒的机制。作为显示本发明范围内这类基因的实 例，尤其可以引用表2所列的全部基因。
因此，本发明的另一个特定目的在于检测(体外或者离体)哺乳动物中阿 尔茨海默病的存在或者患该病风险的方法，所述方法包括检测哺乳动物生 物学样品优选血液样品(衍生物)中一或多种如表2所示基因或者相应RNA 变化的存在，所述变化尤其是这类基因或者RNA剪接的变化，这类变化的 存在是该哺乳动物中阿尔茨海默病的存在或者患该病风险的指征。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法包括至少检测哺乳动物生物 学样品优选血液样品(衍生物)中L-丝束蛋白或者钙联接蛋白基因或者相 应RNA变化的存在，所述变化尤其是这类基因或者RNA剪接的变化。
优选地，本发明依赖于数种基因变化的组合检测，所述基因选自上文 提及的基因。术语"组合检测"是指为了获得评估结果测定数种基因的变化， 同时或者不同时进行所述测定。因此，本发明的特定实施方案涉及至少一 种受昼夜节律调节的基因和至少一种参与调节吞噬或者氧化应激的基因变 化的组合检测。
因此本发明依赖于检测样品中一或多种靶分子，所述靶分子有利地选
自
a) 表1和2所列基因或者相应RNA或者其具有至少15个、优选至 少16、 17、 18、 19、 20、 25或者30个连续碱基的独特片段，
b) 具有与a)中序列互补的序列的核酸，c) a)或者b)中核酸的功能类似物，或者
d) a)-c)中核酸编码的多肽。 所述耙分子可以是所述基因或者RNA或者相应蛋白的完整序列或者
其独特片段，即该片段的序列对所述基因或者RNA或者对所述蛋白质是特 异的和/或其包括代表待检测生物事件的可变结构域(剪接，缺失，多态性 等等)。
术语"功能类似物"是指来自另一哺乳动物物种的类似物。实际上，表1 和2所列的基因是人类基因，这些序列构成有效并且适用于检测人类患者 阿尔茨海默病的标记物。尽管如此，为了将本发明的方法应用于其他哺乳 动物物种，通常优选使用这些序列的功能类似物，它们被认为具有所述种 属的特征。可以通过本领域技术人员已知的任意技术鉴定这些类似物，尤 其考虑本申请提供的序列和相应基因的名称。
在一个特定实施方案中，所述方法包括检测a)-c)中至少一种核酸的存在。
在一个相当特定的实施方案中，使用所述方法检测人类受试者的阿尔 茨海默病，包括检测a)或者b)中至少一种核酸的存在。 检测基因变化的方法
如先前所述，在本发明范围内基因或者RNA的变化表示(i)任意表达变 化，即表达(例如转录或者翻译)水平的调节异常；剪接的调节异常，导致例 如特定剪接形式的出现或者各种剪接形式的量(相对)或者比例的变化；以及 (ii)产生的蛋白质结构的任意变化(截短、延长或者突变形式的出现或者消失 等等)。
在本发明中可以使用能够检测样品中核酸的各种技术，如Northern印 迹，选择性杂交，包被寡核苷酸探针的基材的使用，通过例如RT-PCR、定 量PCR或者连接PCR的核酸扩增等等。这些方法可以包括使用能够选择 性或者特异性检测样品中核酸靶的核酸探针(例如寡核苷酸)。可以利用本 领域技术人员己知的各种方法进行扩增，如PCR、 LCR、转录介导的扩增 (TMA)、链置换扩增(SDA)、 NASBA、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)的使 用、等位基因特异性扩增、Southern印迹、单链构像分析(SSCA)、原位杂 交(例如FISH)、凝胶迁移、异源双链分析等等。如果需要，可以将检测到
9的核酸数量与参照值(例如在未患阿尔茨海默病的患者中观察到的中间值 或者平均值)或者在对照样品平行测定的值进行比较。因此，能够显示表 达水平的变化。
根据一个优选的实施方案，所述方法包括通过选择性杂交或者选择性
扩增检测a)-c)中核酸的存在、缺失或者(相对)量。
通常利用核酸探针进行选择性杂交，所述核酸探针优选固定在基材上， 如具有至少一个表面(平面或者非平面)的固体或者半固体基材，以便核
酸探针的固定。这类基材包括例如带、珠、膜、滤纸、柱、板等等。它们 可以由任意相容材料制备，尤其如玻璃、硅石、塑料、纤维、金属、聚合
物等等。核酸探针可以是任意核酸(DNA、 RNA、 PNA等等)，优选是单链 的，包括特异于如上文a)-c)限定的靶分子的序列。探针通常包括5-400个 碱基，优选8-200个、更优选少于100个、甚至更优选少于75、 60、 50、 40或者甚至30个碱基。探针可以是合成的寡核苷酸，按照传统合成技术根 据本发明靶分子的序列产生。这类寡核苷酸通常包括10-50个碱基，优选 20-40个如大约25个碱基。在一个特别有利的实施方案中，使用数种不同 的寡核苷酸(或者探针)检测相同的靶分子。寡核苷酸有可能特异于相同 靶分子的不同区域或者相同区域的不同中心区域。还使用探针对，其中一 个探针与耙分子完全匹配，而另一个探针是错配的，因此允许估算背景噪 声。可以将探针设计为与外显子或者内含子的区域或者与包括外显子-外显 子、外显子-内含子或者内含子-内含子连接(jonction)的区域杂交。因此， 所述探针可以揭示和区分基因各种剪接形式。
所述探针可以事先合成，然后沉积在基材上，或者根据本领域技术人 员已知的方法直接在基材上原位合成。所述探针还可以通过遗传技术产生， 例如通过扩增、重组、连接等等产生。
如此限定的探针及其(主要在体外)检测受试者阿尔茨海默病的用途 构成本申请的另一个目的。
按照本领域技术人员己知并且可以调整的标准条件(Sambrook， Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press)进《亍 杂交。尤其是根据要求的灵敏度水平、可用材料的数量等等可以在高、中 或者低严格性条件下进行杂交。例如，合适的杂交条件包括在55"C-63'C的温度2小时到18小时。适应高密度基材的其他杂交条件例如是45°C-55°C 的杂交温度。杂交后，通常可以用包括SDS的SSC缓冲液如包括O.lx到 10xSSC和0.5-0.01% SDS的缓冲液进行各种洗涤以去除未杂交的分子。还 可以使用包含SSPE、 MES、 NaCl或者EDTA的其他洗涤缓冲液。
在一个典型的实施方案中，在65。C利用通常包含100吗/ml鲑鱼精DNA 的杂交缓冲液(Rapid Hybrid Buffer, Amersham)预杂交核酸(或者芯片或者基 材)30分钟。然后将样品核酸与探针(通常被固定到基材或者芯片)在65°C 接触2小时到18小时。优选所述样品核酸事先用任意已知的标记(放射性 的，酶的，荧光的，发光的等等)进行标记。然后在65'C用含有0.1。/。SDS 的5xSSC缓冲液洗涤所述基材，再用含有0.1% SDS的0.2xSSC缓冲液洗 涤。根据标准技术例如利用合适的设备(例如Instantlmager, Packard Instmments)测量基材上的标记来分析杂交谱。杂交条件当然可以由本领域 技术人员调整，例如通过改变杂交温度和/或缓冲液的盐浓度以及通过添加 辅助性物质如甲酰胺或者单链DNA。
因此本发明的一个特定目的在于检测哺乳动物中阿尔茨海默病的存在 或者患病风险，或者评价阿尔茨海默病治疗效果的方法，包括在允许互补 序列杂交的条件下将哺乳动物血液样品的核酸与针对之前鉴定的靶分子的 特异探针组接触获得杂交谱，所述杂交谱是该哺乳动物中阿尔茨海默病的 存在或者患病风险或者治疗效果的特征。
当样品中存在核酸靶时，优选用能够扩增所述核酸靶中任一的全部或 者部分的一条引物或者一对引物进行选择性扩增。所述引物可以特异于如 上文限定的耙序列，或者特异于样品核酸中所述靶序列侧翼的区域。所述 引物通常包括一条单链核酸，其长度有利地为5-50个碱基，优选为5-30 个碱基。这类引物及其(主要在体外)检测受试者阿尔茨海默病的用途构 成本申请的另一个目的。可以将所述引物设计为与外显子或者内含子区域 或者与包括外显子-外显子、外显子-内含子或者内含子-内含子连接的区域 杂交。因此，所述引物可以揭示和区分基因的各种剪接形式。
在这点上，本发明的另一个目的在于使用能够扩增表1和2列出的一 种基因、优选数种基因或者相应的RNA的全部或者部分的核苷酸引物或者 核苷酸引物组检测哺乳动物中阿尔茨海默病的存在或者患病风险或者评价
ii哺乳动物尤其是人类中阿尔茨海默病的治疗效果。 检测多肽的变化
在另一个实施方案中，所述方法包括检测如先前限定的基因编码的多 肽的存在或者(相对)量。可以利用本领域技术人员已知的任意技术揭示 或者分析样品中的多肽，尤其是例如利用特异性配体，如抗体或者片段或 者抗体衍生物。优选所述配体是所述多肽的特异性抗体或者这类抗体的片
段(如Fab， Fab'， CDR等等)或者这类抗体的衍生物(诸如单链抗体，ScFv)。 通常将所述配体固定在基材上，如带、珠、柱、板等等。通过检测靶和配 体的复合物如利用标记的配体、利用第二种标记的检测配体等等可以检测 样品中耙多肽的存在或者量。可以使用并且公知的免疫技术包括ELISA， RIA等等。如果需要，可以将检测到的多肽量与参照值(例如在未患阿尔 茨海默病的患者中观察到的中值或者平均值)或者与在对照样品中平行测 得的值进行比较。因此能够揭示表达水平的变化。
可以通过常规技术尤其是利用包括所述多肽(或者其免疫原性片段)的 免疫原免疫非人动物并回收抗体(多克隆)或者生成细胞(以产生单克隆抗体) 产生靶多肽的特异性抗体。用于制备多克隆或者单克隆抗体、ScFv片段以 及人的或者人源化抗体的技术例如在下列文献中描述Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, 1988; Ward et al.， Nature 341 (1989) 544; Bird et al., Science 242 (1988) 423; WO94/02602; US5,223，409; US5，877,293; WO93/01288。通过合成或者通过在合适的宿主中表达如上限 定的核酸靶可以产生所述免疫原。这类单克隆或者多克隆抗体和其具有相 同抗原特异性的衍生物以及其检测癌症的用途也构成本申请的一个目的。
还可以利用质谱分析相关领域的技术人员已知的技术检测蛋白质表达 和/或结构的变化，这类技术一般来说被分到蛋白质组分析名下，以便检测 阿尔茨海默病患者血液中的特异性特征序列。
方法实施
本发明方法用于被测哺乳动物的任意生物学样品，尤其是包括核酸或 者多肽的任意样品。有利地，可以包括下列样品血液，血浆，血小板， 唾液，尿液，大便等等，更一般来说包括核酸或者多肽的任意组织、器官 或者有利地生物体液。在优选的并且尤其有益的实施方案中，所述样品是源自血液的样品， 如血液、血清或者血浆的样品。本发明实际上依赖于阿尔茨海默病血液标 记物的鉴定，因此不需要组织活检，仅从血液样品就能够检测该病。
可以通过任意己知技术如通过采血、通过非侵入性技术从样品采集点 或者库等等获取样品。还可以预处理所述样品以增加耙分子的可接近性， 如通过裂解(机械、化学、酶裂解等等)、纯化、离心、分离等等。还可以 标记所述样品以便于靶分子存在的检测(荧光、放射性、发光、化学、酶 标记等等)。
在一个优选的实施方案中，生物学样品是全血样品，即还没有经过分 离步骤的血液，其任选可以被稀释。
优选所述方法包括组合检测5、 10、 20、 30、 40、 50或者60种如上限 定的靶分子的存在、缺失或者数量。
本申请的另一个特定目的涉及检测人类受试者中阿尔茨海默病的存 在、进展或者患病风险的方法，包括将包含核酸的受试者生物学样品与包 括基材的产品接触，在所述基材上固定有核酸，所述核酸包括互补于和/或 特异于如上限定的一种基因或者优选数种基因或者RNA的序列，并检测杂 交谱，所述谱表示所述人受试者中阿尔茨海默病的存在、阶段或者患病风 险。优选所述产品包括不同的核酸，所述核酸包括互补于和/或特异于如上 所述的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或者更多种不同基因或者RNA的 序列。
本申请的另一个目的涉及一种包括基材的产品，在所述基材上固定有 核酸，所述核酸包括互补于和/或特异于如上限定的一种基因或者优选数种 基因或者RNA的序列。优选所述产品包括不同的核酸，所述核酸包括互补 于和/或特异于如上限定的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或者更多种基 因或者RNA的序列。
本申请的另一个目的涉及一种包括基材的产品，在所述基材上固定有 多肽的至少一种配体，所述多肽由如上限定的基因或者RNA编码。优选所 述产品包括不同多肽的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或者更多种配体， 所述多肽选自上文提及的多肽。
所述基材可以是具有至少一个平的或者非平的(即二维或者三维)表面的任意固体或者半固体基材，以便核酸或者多肽的固定。这类基材包括如 带、珠、膜、滤纸、柱、板等等。它们可以由任意合适的材料制备，尤其
如玻璃、硅石、塑料、纤维、金属、聚合物、聚苯乙烯、Teflon等等。可
以通过己知技术将试剂固定在基材表面，或者就核酸来说，在基材上直接
原位合成。固定技术包括被动吸附(Inouye et al.， J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469)和共价结合。所述技术在例如WO90/03382和WO99/46403中描述。 固定在基材上的试剂可以按照预定方案排列，以便根据可变和可调整的密 度检测和鉴定形成的复合物。
在一个实施方案中，本发明产品包括多个长度为5-100个碱基、特异 于如上限定的一或多种基因或者RNA的合成寡核苷酸。
本发明产品通常包括能够校准和/或标准化结果的对照分子。 本申请的另一个目的涉及一种包括小室或者容器的试剂盒，所述小室 或者容器包括至少一种核酸、优选数种核酸和/或如上限定的一或多种多肽 的一种配体、优选数种配体，所述核酸包括互补于和/或特异于一或多种如 上限定的基因或者RNA的序列。优选所述产品包括选自上文提及的核酸和 配体的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或者更多种不同的核酸和/或配体。 所述试剂盒还可以包括用于杂交或者免疫反应的试剂，以及如果需要，对 照和/或说明书。
本发明的另一个目的涉及如上限定的产品或者试剂盒在检测哺乳动物 受试者优选人类受试者中阿尔茨海默病的用途。
根据以下实施例本发明的其他方面和优点将显而易见，所述实施例应 当被认为是说明性的，而非限制性的。
实施例1:与昼夜节律相关的阿尔茨海默病血清^HB物的鉴定
从两个方面进行遗传分析 一方面利用从阿尔茨海默病患者的血液中
提取的RNA，所述患者处在该病的不同进展程度，另一方面利用从健康对 照受试者的血液制备的RNA，所述对照受试者与患病受试者的平均年龄相 同。
通过生物信息技术分析如此获得的特征序列，使其能够鉴定阿尔茨海 默病中调节异常现象的分子基础。
这样鉴定出一个特征序列，其来自于编码BMAL1的mRNA并且对应
14于GenBank序列AB000816的核苷酸128-247。 BMAL1，与CLOCK基因 一样，编码含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)-PAS结构域的转录因子家族的转 录因子。BMAL1和CLOCK产物形成一种转录复合物，参与调节体内钟和 昼夜节律。因此，本发明第一次描述了阿尔茨海默病患者的血细胞中昼夜 节律的调节异常。哺乳动物的节律系统涉及中枢和周围振子(oscillateurs centraux etp6riph6riques)。已经证明中枢神经系统和外周组织的节律系统之 间等级控制(dominance hi6rarchique)。因此，中枢系统确保外周同步。阿 尔茨海默病期间控制所述中枢体内钟的脑区域发生变化，本发明第一次记 载了血细胞水平上体内钟调节异常结果(r6percussion)。下表1给出受昼夜节
律控制的基因列表，其构成本发明范围内的靶。;oooo7
00009
00011
00012
00014
00017
00018 00021
!00022
;00024
:00025 00026 I 00027 I 00028
;00029 00031 ;00032
00034
.......................
!00038
I 00039 J 00040
I 00043
I 00044 00045 00047
I 00051
00053
100054 I 00057
表l
BMAL1 (XOCK
!麵N:乙m隨涯: 芳烃受体核转运蛋白样
i酪蛋白激酶l,gamma2 '
i真核翻译起始因子A， X-连接
iDnaJ(Hsp40),系物，A 3E族，成 |员1
^呈g^,:;::^丄:::—:二::
L^室白^亂l， epsilon
j卜Si浆^i蛋il (输XS白)beta—1—
匿醒寧i:4::二::—:::::::一
:肌球蛋白，纖3，骨骼肌，胚胎
:神经元PAS结构域蛋白2
:^氨酸脱^酶:i二 ::—:—:
i Period同系物1 (果蝇)—
giit^sT二:二:: 二:
j蛋白酶体(前体,macropain)亚基， alpha型，4
—S收縮蛋白，alpha,红细胞1 (—椭 l圆形红细胞性贫血2) 1H5aHI^^毫白和激活
:剂
;mif two 3同系物1 (酵母)的SMT3 l阻抑基因
「g^ili旋:示-i]i^^域，bRunti关爆因手2 : ;酪蛋白激酶1， gamma3 :Clock同系物(小鼠) i孓ets成红细胞增多涵病毒E26癌 i基因同系物2(禽类)
gWiSsiT,—(抑伟u齐『)i
;核受体共激活剂4 —
:i黑i素受体iA
AB000816
17cj25
llp_15 19pl3,3
Xp22.12 9pl3—pl2
|3p26
12ql2~ql3
12q23~q24.1
;5pl5 :6p21 !5q23 ;4ql2
21q22.3
10q23j24
10qll,2
4q35.1
■.卜.
5c}〗2 22gl3.1 17q21.32 3p21
17pl3.1 2ql].2
2P—25
17p.l3,l-17f)12 22ql3.2
15g25.1
lq—21
17q1.2
2q33
i刚001088
i函001178 !丽001319
'NM 001412
j而001539 ;NM 001892 j画001894 :固002265 iNM 002375
NM 002470 .刚002518 .NM 002539 '雨002616
画002676
画002789
:麵003126
NM 003152
l觀003352
卞一
;画003670 !NM 003920 inm 004075
:NM 004168 !画004348 :NM 004384 :雇004898
画005239
NM 005398 |NM 005437 :雨005958
1600060肿瘤坏死因子，alpha-诱导蛋白214q32画006291
00062UDP葡糖焦磷酸化酶22pl4-pl3刚006759
00063Quaking同系物，KH结构域RNA
结合(小鼠) —6q26-27刚006775
00064运接因子3a,亚基3， 60kDalp34.3画006802
00066具有多种剪接的RNA结合蛋白8pl2—pllNM006867
00067RAR相关的孤儿受体B9q22函006914
00068mif two 3同系物3 (酵母)S SMT3
阻抑基闪2q22.3刚006936
00070Chromobox同系物3 (HP1 gamma
同系物，果蝇) ±游—^合 因—手—:—RNA ，合—IS——7^.2...........画007276
00072Hq21.3窗014233
00079WD ifi结构运5017q21.33訓016001
00080锌指RNA结全蛋白5pl3.3刚016107
00081Period同系物3 (果蝇)lp36.23丽016831
00082PlexinA3Xq28'-.......017514
000835-羟色胺(血清素)受体7 (腺苷酸
环化酶-偶联的)10q21^}24薩01985900084芳烃受体核转运蛋白样212pl2.2-pll.2醒020183
00085i花色素2diSi禪)—一llpll.2NM 02111700086核受体亚族1， D组，成员17qll,2画021724
00087酪蛋白激酶1， gamma 115q22.1~q22.31丽022048
00088Period同累t) 2 (桌蝇)2q37.3NM022817
ooo卯包含碱性螺旋-环-螺旋结构域，B
类，312pll.23—pl2.1丽030762
00092锌指蛋白384NM133476
00094酪蛋白激酶l， delta17q25觀139062
00102mif two 3 S^^l 2 (酵母)的SMT3
阻抑基因i 17q25.1画006937
实施例2:参与吞噬现象的阿尔茨海默病血清标记物的鉴定
一方面从阿尔茨海默病患者，另一方面从对照患者提取RNA，对所述 RNA的DATAS分析也显示参与吞噬现象的基因剪接的变化。这种现象， 受控制氧化应激的信号传导级联的调节，代表巨噬细胞以及它们对先天免 疫性的作用。
在阿尔茨海默病的某些患者中已经报道有巨噬细胞吞噬特性的降低。
17但是，还没有确定能够解释这种现象的分子基础。
本发明人进行的DATAS分析能够鉴定对应于L-丝束蛋白和钙联接蛋 白的RNA的序列。更具体地，用于鉴定L-丝束蛋白的序列对应于GenBank 序列NMJ)02298的核苷酸3249-3487，用于鉴定钙联接蛋白的序列对应于 GenBank序列NM_001746的核苷酸3764-4007。
本领域技术人员已知钙联接蛋白与早老蛋白l(PSl)相互作用，所述PS1 是一种参与阿尔茨海默病以及产生P淀粉状蛋白斑的蛋白。钙联接蛋白还 与CD14受体相互作用并参与吞噬现象。
参与吞噬现象的L-丝束蛋白更特别地参与内化之后的氧化应激的激活。
因此，本发明第一次提供了关于阿尔茨海默病患的巨噬细胞显示的吞 噬作用缺陷的分子起源的信息。
下表2给出参与吞噬和氧化应激机制的基因列表，其构成本发明范围 内的靶。
_gg__
L一丝束蛋白—GenbankNM—002298
钙联接蛋白-Genbank NM—001746
智人(Homo Sapiens) CD14分子(CD14)，转录变体l,mRNA。 登录号NM一000591
智人CD14分子(CD14)，转录变体2,mRNA。 登录号NM一001040021
智人toll样受体4 (TLR4) ， mRNA 。 登录号NM一138554
智人toll样受体2 (TLR2)， mRNA。 登录号NM一003264
智人toll样受体7(TLR7)， mRNA。 登录号NM_016562
智人趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)，转录变体2， mRNA。 登录号NM一003467
智人趋化因子(C-X-C基序)受体4 (CXCR4)，转录变体l， mRNA。登录号NM—001008540
智人干扰素，gamma (IFNG)， mRNA。 登录号NM—000619
智人趋化因子(C-X-C基序)配体3 (CXCL3) ， mRNA。 登录号NM_002090
智人干扰素，betal，成纤维细胞(IFNB1)， mRNA。 登录号NM—002176
智人干扰素调节因子3 (IRF3), mRNA。 登录号NM_001571
智人ras相关C3肉毒毒素底物l(rho家族，小GTP结合蛋白Racl) (RAC1)， Raclc， mRNA。 登录号NM—198829转录变体
智人ras相关C3肉毒毒素底物l(rho家族，小GTP结合蛋白Racl) (RAC1)， Racl， mRNA。 登录号NM_006908转录变体
智人ras相关C3肉毒毒素底物l(rho家族，小GTP结合蛋白Racl) (RAC1)， Raclb， mRNA。 登录号NM_018890转录变体
智人脂多糖结合蛋白(LBP) ， mRNA。 登录号NM_004139
智人白介素1受体样1 (IL1RL1)，转录变体2， mRNA。 登录号NM_003856
智人白介素1受体样1 (IL1RL1)，转录变体l， m腦A。 登录号NM—016232
智人toll样受体9 (TLR9)，转录变体B， mRNA。 登录号NM—138688
智人toll样受体9 (TLR9)，转录变体A, mRNA。 登录号NM—017442
智人toll样NADPH氧化酶4 (NOX4)， mRNA。 登录号NM—016931
智人白介素6(干扰素，beta2)(IL6)， mRNA。
19登录号NM一000600
智人巨噬细胞移动抑制因子(糖基化抑制因子)(MIF)， mRNA。 登录号NM一002415
智人ras同系物基因家族，成员A(RHOA)， mRNA。 登录号NM一001664
智人B细胞kappa轻链多肽基因增强子1的核因子(pl05)(NFKBl)， mRNA。 登录号NM一003998
智人白介素1， beta(ILlB)， mRNA。 登录号NM一000576
智人干扰素，alpha 1 (IFNA1)， mRNA。 登录号NM一024013
智人B细胞抑制剂中kappa轻链多肽基因增强子的核因子，alpha(NFKBIA)， mRNA。 登录号NM一020529
智人白介素4( IL4)，转录变体2, mRNA。 登录号NM一172348
智人白介素4(IL4)，转录变体l,mRNA。 登录号NM—000589
智人Tlr4相关蛋白(MGC40499) ， mRNA。 登录号NM一152755
智人tol样受体3 (TLR3), mRNA。 登录号NM一003265
智人toll样受体5 (TLR5)， mRNA。 登录号NM一003268
智人白介素1受体辅助蛋白样1 (IL1RAPL1) ， mRNA。 登录号NM一O 14271
智人toll样受体1 (TLR1)， mRNA。 登录号NM—003263
智人白介素1受体样2(IL1RL2)， mRNA。 登录号NM一00.3854
智人趋化因子(C-X-C基序)配体IO (CXCL10) ， mRNA。登录号NM_001565
智人白介素1受体相关激酶1 (IRAKI),转录变体3， mRNA。 登录号NM—001025243
智人白介素1受体相关激酶1 (IRAKI),转录变体2， mRNA。 登录号NM—001025242
智人白介素1受体相关激酶1 (IRAKI),转录变体l， mRNA。 登录号NM 001569
智人toll样受体衔接分子2 (TICAM2)， mRNA。 登录号NM—021649
智人toll相互作用蛋白(TOLLIP) ， mRNA。 登录号NM—019009
智人toll样受体8 (TLR8)，转录变体2， mRNA。 登录号NM—138636
智人toll样受体8 (TLR8)，转录变体l， mRNA。 登录号NM—016610
智人白介素1受体辅助蛋白样2 (IL1RAPL2) ， mRNA。 登录号NM—017416
智人白介素1受体相关激酶4 (IRAK4) ， mRNA。 登录号NM_016123
智人toll样受体6 (TLR6) ， mRNA。 登录号NM—006068
智人toll样受体10 (TLR10)，转录变体2， mRNA。 登录号NM—001017388
智人toll样受体10 (TLR10)，转录变体l， mRNA。 登录号NM—030956
智人白介素1受体相关激酶2 (IRAK2) ， mRNA。 登录号NM—001570
智人髓样分化初级应答基因(88)(MYD88)， mRNA。 登录号NM 002468智人CD55分子，补体衰变加速因子(Cromer血型)(CD55)， mRNA。 登录号NM 00057权利要求
1. 体外或者离体检测哺乳动物中阿尔茨海默病的存在或者患病风险的方法，包括在哺乳动物生物学样品、优选在血液样品(衍生物)中检测一或多种基因或者RNA中的变化的存在，所述基因或者RNA选自根据昼夜节律调节的基因以及参与调节吞噬或者氧化应激的基因，这类变化的存在是所述哺乳动物中阿尔茨海默病的存在或者患病风险的指征。
2. 评估或者监测阿尔茨海默病治疗效果的方法，包括在治疗期间测量 一种基因或者优选数种基因表达的步骤，所述基因选自根据昼夜节律调节 的基因以及参与调节吞噬或者氧化应激的基因，并将测量得到的表达与治 疗前期测定的表达进行比较。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述基因或者RNA中的变 化是产生的蛋白质的表达、剪接和/或结构的变化。
4. 如权利要求1或者2所述的方法，包括在哺乳动物生物学样品、优 选在血液样品(衍生物)中检测表1所列的一或多种基因或者相应RNA中的 变化尤其是这类基因或者RNA剪接中的变化的存在。
5. 如权利要求4所述的方法，包括在哺乳动物生物学样品、优选在血 液样品(衍生物)中检测BMAL1或者CLOCK基因或者相应RNA中的变化 尤其是这类基因或者RNA剪接中的变化的存在。
6. 如前述权利要求中任意一项所述的方法，包括在哺乳动物生物学样 品、优选在血液样品(衍生物)中检测表2所列的一或多种基因或者相应RNA 中的变化尤其是这类基因或者RNA剪接中的变化的存在。
7. 如权利要求6所述的方法，包括在哺乳动物生物学样品、优选血液 样品(衍生物)中检测L-丝束蛋白或者钙联接蛋白基因或者相应RNA中的变 化尤其是这类基因或者RNA剪接中的变化的存在。
8. 如前述权利要求中任意一项所述的方法，包括检测一或多种靶分子 的存在，所述靶分子选自a) 表1和2所列的基因或者相应RNA或者其具有至少15个、优选至 少16、 17、 18、 19、 20、 25或者30个连续碱基的独特片段，b) 具有与a)中序列互补的序列的核酸，c) a)或者b)中核酸的功能类似物，或者d) a)-c)中核酸编码的多肽。
9. 如前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于通过选择性杂 交、选择性扩增或者与特异性配体结合确定所述变化的存在。
10. 包括基材的产品，所述基材上固定有核酸，所述核酸包括互补于 和/或特异于权利要求4-7任一项所限定的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或者更多种基因或者RNA的序列。
11. 包括基材的产品，所述基材上固定有至少5、 10、 20、 30、 40、 50、60或者更多种不同的多肽的配体，所述多肽由权利要求4-7任一项所限定 的基因或者RNA编码。
12. 包括小室或者容器的试剂盒，所述小室或者容器包括选自权利要 求10或者11所限定的核酸和配体的至少5、 10、 20、 30、 40、 50、 60或者更多种不同的核酸和/或配体。
13. 如权利要求10-12任一项所述的产品或者试剂盒用于检测哺乳动 物受试者、优选人类受试者中阿尔茨海默病的用途。
14. 乙酰胆碱酯酶抑制剂如他克林、多奈哌齐或者利斯的明在制备治 疗患者阿尔茨海默病的药物中的用途，所述患者的基因表达调节异常，所 述基因选自根据昼夜节律调节的基因和参与调节吞噬或者氧化应激的基 因。
全文摘要
本发明涉及可用于检测哺乳动物特别是人类中阿尔茨海默病的方法和组合物。它特别描述了阿尔茨海默病的血清标记物及其在诊断步骤中的用途。它还涉及可用于实施这些方法的工具和/或试剂盒(试剂，探针，引物，抗体，芯片，细胞等等)及其制品和用途。本发明可用于包括在该病早期阶段检测哺乳动物中阿尔茨海默病的存在或者进展。
文档编号C12Q1/68GK101490280SQ200780026786
公开日2009年7月22日 申请日期2007年5月14日 优先权日2006年5月15日
发明者F·施魏格霍费尔, L·布拉科 申请人:埃克森特医疗有限公司