专利名称：：用于结合鞘氨醇-1-磷酸的组合物和方法
技术领域：
：本发明涉及结合鞘氨醇-l-磷酸(S1P)的制剂，尤其涉及在生理条件下对S1P具有特异反应性的人源化单克隆抗体、抗体片段、以及抗体衍生物。通过递送包含上述制剂的药物组合物，可利用上述制剂来治疗和/或预防各种疾病或病症。以下描述包括可能有利于理解本发明的信息。但这并不是承认，本文中提供的任何信息、或本文中具体或间接提及的任何出版物是现有技术，或甚至明显与目前要求保护的发明有关。
背景技术：
：生物活性信号脂质脂质和它们的衍生物现在被认为是用于医学研究的重要的靶标，而不<义<又是细月包力莫中的简单的结构元件或作为用于(3-氧化作用、糖酵解作用或其它代谢过程的能量来源。尤其是，某些生物活性脂质在动物和人疾病中作为重要的信号介质。虽然质"莫的大部分脂质仅仅起到结构的作用，但它们的小部分的与将胞外刺激传递到细胞内有关。"脂质信号"是指许多利用细胞膜脂作为第二信使的细胞信号转导途径的任何一种，以及是指脂质信号分子与其本身的特异性受体的直接相互作用。脂质信号通路由各种胞外刺激(从生长因子到炎性细胞因子)激活，并且调节细胞命运决定，如凋亡、分化以及增殖。对生物活性脂质信号的研究是一个热门科学研究领域，因为越来越多的生物活性脂质被鉴定并且它们的作用被表征。生物活性脂质的实例包括类花生酸类(包括大麻素类、白三烯类、前列腺素类、脂氧素类、环氧二十碳三烯酸、以及异二十烷酸类)、非类花生酸大麻素介质、磷脂及其衍生物如磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)、血小板活化因子(PAF)和心磷脂以及溶血磷脂如溶血卯磷脂(LPC)和各种溶血磷脂酸(LPA)。生物活性信号脂质介质还包括鞘脂，例如鞘磷脂、神经酰胺、神经酰胺-l-磷酸、鞘氨醇、神经鞘氨醇磷酸胆石咸、神经鞘氨醇(sphinganine)、神经鞘氨醇-l-磷酸(二氢S1P)以及鞘氨醇-l-磷酸。鞘脂类和它们的衍生物代表对重要的细胞过程具有多效性的一类月包外和月包内信号分子。生物活性信号脂质的其它实例包括磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PEA)、甘油二酯(DG)、石克苦脂、神经节苷脂、以及脑苷脂。鞘脂是一类独特的脂质，由于它们起初的神秘特性，其后被以Sphinx命名。鞘脂最初被表征为细胞膜的主要的结构成分，但最近的研究表明，鞘脂还作为细月包4言号和调节分子(Hannun,etal,Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Speigel,etal,FASEBJ.10:1388-1397,1996;Igarashi，J.Biochem122:1080-1087，1997;Hla，T.(2004).S画"CW/Dev肠/,15，513-2;Gardell，S.E.，Dubin,A.E.&Chun,J.(2006).7>emfeMo/Me《12，65-75)。鞘脂是细胞膜的主要的结构成分，其还作为细力包4言号和调节分子(Hannun和Bel，Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Igarashi,J.Biochem122:1080-1087,1997)。已经对鞘脂信号介质、神经酰胺(CER)、鞘氨醇(SPH)和鞘氨醇-l-磷酸(SIP)进行了最广泛的研究并且最近已明了它们在心血管系统、血管发生和月中瘤生物学中的4卡用(Claus,etal.，CurrDrugTargets1:185-205，2000;Levade，etal.，Circ.Res.89:957-968，2001;Wang，etal"J.Biol.Chem.274:35343-50,1999;Wascholowski和Giannis,DrugNewsPerspect.14:581-90，2001;Spiegel,S.&Milstien,S.(2003).Sphingosine-l-phosphate:anenigmaticsignalinglipid.iV"/^evM/CW/S/o/，4，397-407)。关于鞘脂代谢的综述，参见Liu等，CritRev.Clin.Lab.Sci.36:511-573,1999。关于鞘磷脂信号通路的综述，参见Hannun,etal.,Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Liu等，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.36:511-573,1999;Igarashi,J.Biochem.122:1080-1087,1997;Oral,etal.，J.Biol.Chem.272:4836-4842,1997;以及Spiegeletal"Biochemistry(莫斯科)63:69-83,1998。(Maceyka,etal.(2002),BBA，vol.1585):192-201,以及Spiegel,etal.(2003),NatureReviewsMolecularCellBiology,vol.4:397-407)。已经提出CER/SPH水平和SIP之间的平衡提供了一种可调机制(rheostatmechanism),该才几制决定细月包4皮引向死亡通^各或免于凋亡。可调机制的关键调节酶是鞘氨醇激酶(SPHK),其作用是将促进死亡的生物活性信号脂质(CER/SPH)转化成促进生长的SIP。SIP具有两种命运SIP可以被SIP裂解酶(一种酶，其将SIP裂解24成石寿酸乙醇胺和十六烷醛)降解，或4交不常见地，^皮S1P;岸酸酶水解成SPH。S1P的多效生物学活性是经由最初称作内皮分化基因(EDG)的G蛋白耦联受体(GPCR)的家族介导的。已经确定5种GPCR为高亲和力S1P受体(S1PR):S1P!/EDG-1、SlP2/EDG-5、SlP3/EDG-3、SlP4/EDG-6、以及SlP5/EDG-8,它们直到1998年才被鉴定(Lee,etal.，1998)。由SIP诱发的许多应答耦联于不同的异三聚体G蛋白(Gq_、G12_13)和Rho家族的小GTP酶(Gardell，etal"2006)。在成体中，S1P释方文自血小板(Murataetal.，2000)和月巴大细胞以产生用于促进伤口愈合并参与炎性应答的游离SIP的局部脉冲(足以超过S1PR的Kd)。在正常条件下，血浆中的总SIP相当高(300-500nM);然而，假设大多数SIP可以通过血清蛋白，尤其是通过脂蛋白(例如，HDL>LDL>VLDL)和白蛋白加以'緩沖，，以致生物有效的SIP(或SIP的游离部分)不足以明显激活S1PR(Murataetal.,2000)。^口果不是这种情况，则会导致不适当的血管发生和炎症。还已^是示了S1P的胞内作用(参见例如，SpiegelS,KolesnickR(2002),Leukemia,vol.16:1596-602;Suomalainen,""/(2005)，AmJPathol，vol.166:773-81)。细胞表面S1P受体的广泛表达使得S1P影响多种不同的细胞应答，其包括增殖、黏着、收缩、运动性、形态发生、分化、以及存活。这种应答范围似、乎取决于细月包和组织系统内的SIP受体的重叠或不同表达才莫式。此外，最近已证明S1P和生长因子信号通3各之间的交互作用(串扰，crosstalk),包括血小板衍生的生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、以及石咸性成纤维细胞生长因子(bFGF)(参见伊J^口，Baudhuin，etal.(2004)，FASEBJ，vol.18:341-3)。；步及S1P的各种细胞过程的调节尤其对于神经信号、血管紧张度、伤25口愈合、免疫细胞运输、生殖、以及心血管功能有特定的影响。这些系统内S1P的内源水平的改变会具有不利影响，从而诱发若干种病理生理4大态，其包纟舌癌症、炎症、血管发生、心脏病、嗜喘、以及自身免疫性疾病。最近治疗各种疾病和病症(包4舌心血管疾病、力*血管病、以及各种癌症)的新方法涉及单独地或连同其他治疗来降低生物可利用的S1P的水平。虽然已提出了耙向鞘脂代谢途径的关键酶(如SPHK)的基于鞘脂的治疗策略，但直到最近才强调干扰脂质介质S1P本身，主要由于难以直接緩和(mitigate)这种脂质靶标，尤其是由于难以首先提高抗体水平，然后针对S1P耙标来检测抗体。最近，已描述了对于S1P具有特异性的抗体的产生。参见例如，共有的美国专利申请系列第20070148168号；WO2007/053447。这样的抗体，其可以例如选择性地吸附来自血清的S1P,作为分子海绵来中和胞夕卜S1P。还参见共有的美国专利第6,881,546号和第6,858,383号以及美国专利申i青系歹'J第10/029,372号。SPHINGOMAB,鼠单克隆抗体(mAb)(由Lpath,Inc.开发并在以上所列的某些专利或专利申请中描述)已显示出在人类疾病模型中是有效的。在某些情况下，人源化抗体可以优选于鼠抗体，尤其用于人类的治疗应用，其中会发生人抗鼠抗体(HAMA)应答。通过中和结合活性和/或通过从体内循环中快速清除抗体，这才羊的应答可以降低抗体的有效性。在随后给予鼠抗体的情况下，HAMA应答还会引起毒性。现已开发了人源化抗S1P抗体并在本文中加以描述。就结合S1P、中和S1P和调节与S1P有关的疾病状态的岁文力而言，当用于人类时这种抗体预期具有鼠mAb的所有优点，而没有鼠mAb的潜在缺点。如在下文的实施例中所描述的，这种人源化抗体(称作LT1009或sonepcizumab)事实上在疾病的动物才莫型中已显示出比亲4戈(鼠)抗体具有更大的活性。3、定义在详细描述本发明以前，将定义在本发明的范围内4吏用的若干术语。除这些术语之外，必要时，则在本说书的其它地方对其它术语加以定义。除非本文中另有明确失见定，在本"i兑明书中所用的术语将具有
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认可的含义。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。"免疫衍生部分"包括任何抗体(Ab)或免疫球蛋白(Ig)，并且指衍生自免疫球蛋白基因的、按照免疫球蛋白基因制作的、或由免疫球蛋白基因编码的任何形式的肽、多肽，或能够结合抗原或表位的上述肽或多肽的片l殳(参见例如，Immunobiology,第5版,Janeway，Travers，Walport，Shlomchiked.(编者)，GarlandPublishing(2001))。在本发明中，抗原是生物活性脂质分子。"抗SIP抗体"或"相对于SIP具有活性的免疫衍生部分"是指结合SIP的任何抗体或抗体源性分子。如根据这些定义将明了的，抗体或免疫书t生部分可以是多克隆的或单克隆的并且可以通过各种方式来产生，和/或可以分离自动物(包括人类对象)。"生物活性脂质"是指脂质信号分子。通常，当施加其信号效应时，生物活性脂质并不存在于生物膜中，也就是"^兌，虽然这样的脂质物质可以在某个时候存在于生物膜(例如，细胞膜、细胞器膜等)中，但当伴随生物膜时它不是"生物活性脂质"而是"结构脂质"分子。生物活性脂质与结构脂质(例如，膜结合磷脂)的区别在于，它们介导胞外和/或胞内信号，因此通过调节分化、迁移、增殖、分泌、存活、以及其它过程而涉及许多类型的细胞的功能控制。在体内，生物活性脂质可以存在于细胞外液中，其中它们可以与其它分子复合，例如血清蛋白如白蛋白和脂蛋白，或具有"游离"形式，即，没有与另一种分子物质复合。作为细胞外介质，通过激活膜结合离子通道或G蛋白耦联受体，进而又激活复杂的信号系统，某些生物活性脂质可改变细力包信号传导，/人而改变细力包功能或存活。作为细月包内介质，生物活性脂质可以通过直4妄与细月包内成分(4口酶和离子通道)的相互作用来施加它们的作用。生物活性脂质的典型实例包括LPA和S1P。术语"治疗剂，，是指这样的制剂，其緩和血管发生和/或新血管形成，例如，CNV和BV成熟、水肿、血管通透性和纤维化、纤维发生和症痕，其伴随眼病和眼部病症，或者是眼病和眼部病症的部分的基本病理特4正。术语"联合疗法"是指一种治疗方案，其涉及提供至少两种不同的疗法以达到指定的治疗岁丈果。例如，l关合疗法可以涉及给予两种或更多种化学上不同的活性组分，例如，抗LPA抗体和抗S1P抗体。可替换地，联合疗法可以涉及给予相对于生物活性脂质具有活性的免疫4汙生部分以及*会予一种或多种其它化疗药物。可替才奂地，联合疗法可以涉及连同进行另一种治疗一起给予抗脂质抗体，如放射治疗和/或外科手术。另夕卜，联合疗法可以涉及给予抗脂质抗体连同一种或多种其它生物制剂(例吵口，抗VEGF、TGFP、PDGF、或bFGF制剂)、化疗药物以及另一种治疗如i文射治疗和/或外科手术。在利用两种或多种化学上不同的活性组分进行的联合治疗的范围内，应当明了，活性《且分可以作为一目同ia合物的一部分或4乍为不同的组合物来症会予。当作为分开的《且合物给予时，可以在相同或不同的时间、通过相同或不同的途径、利用相同或不同的乡会药方案来给予包含不同活性组分的组合物，其均才艮据具体情况需要并由主治医生确定。类似;也，当一种或多种抗脂质抗体物质(例如，抗LPA28抗体)单独或连同一种或多种化疗药物而与例如，》丈射治疗和/或外科手术结合时，可以在外科手术或》文射治疗之前或之后递送药物。"抗S1P剂"是指对S1P具有特异反应性的任何制剂，并且包"半抗原"是指适合于共轭于半抗原的分子，从而使半抗原具有免疫原性。典型的、非限制性类型的半抗原分子是蛋白质，其实例包4舌白蛋白、钥孑L戚血蓝素、血)疑素(hemaglutanin)、石皮伤风毒素(tetanus)、以及白候类毒素。适合于本发明使用的半抗原分子的其它类型和实例在本
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是已知的。这些以及以后发现或术语"化疗药物"是指抗癌剂和其它抗超增生剂。简而言之，"化疗药物"是指用来破坏细胞和组织的化学物质。这样的制剂包括^旦不限于(1)DNA损伤剂和抑制DNA合成的制剂蒽环类抗生素(多柔比星、柔红霉素(donorubicin)、表柔比星)、烷化剂(苯达莫司汀、白消安、卡铂、卡莫司汀、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴。秦、六曱三聚氰胺、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法仑、米托坦、丝裂霉素、哌泊溴烷、丙卡巴肼、链佐星、塞替派、以及三亚胺。秦)、铂衍生物(顺铂、卡铂、顺式二氯二氨合铂)、端粒酶和拓朴异构酶抑制剂(Camptosar)，(2)孩i管蛋白解聚剂紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛、BAY59-8862),(3)抗代谢物，如卡培他滨、氯脱氧&泉普、阿糖胞苷(以及其激活形式，ara-CMP)、阿糖胞苷、氮烯咪胺、氟尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、5-DFUR、吉西他滨、羟基脲、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、戊制菌素、三曱曲沙、以及。票p令，(4)抗血管形成药(Avastin、沙利度胺、舒尼替尼、来那度胺)，血管破坏剂(黄酮类化合物/黄酮、DMXAA、考布他汀书f生物如CA4DP、ZD6126、AVE8062A等)，(5)生物制剂，如抗体或抗体片,殳(赫赛汀(Herceptin)、阿瓦#斤汀(Avastin)、Panorex、利必妥(Rituxan)、'泽娃灵(Zevalin)、Mylotarg、Campath、Bexar、爱必妥(Erbitux)、Lucentis)，(6)内分泌治疗芳香酶抑制药(4-氢雄烯二酮、依西美坦、氨鲁米特、阿那曲哇、来曲唑)、抗雌激素药(他莫昔芬、托瑞米芬、Raoxifene、氟维斯群(Faslode))、类固醇(如地塞米+〉)，(7)免疫调节剂细胞因子如IFN-(3和IL2、整合素的抑制剂，其它黏附蛋白质和间质金属蛋白酶，(8)组蛋白去乙酰基化酶抑制剂，(9)信号转导的抑制剂如酪氨酸激酶的抑制剂如伊马替尼(格列卫(Gleevec)),(10)热激蛋白的抑制剂，(11)类一见黄醇，如全反式视黄酸，(12)生长因子受体抑制剂或生长因子本身的抑制剂，(13)抗有丝分裂化合物，如诺维本、紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春新石成、长春i也辛、以及长春瑞滨，(14)消炎药，如COX4中制剂，以及(15)细胞周期调节剂，例如，4企-验点调节剂和端粒酶抑制剂。如在本文中所1吏用的，术语"鞘脂"是指在本
技术领域：
中称作鞘脂的一类化合物，其包括但不限于以下化合物(参见http:〃www.lipidmaps.org，其为包含以下由方4舌号内的字母凄t字字符串指示的链接的网站，上述链接包含相应化合物的化学式、结构信息等)鞘氨基醇碱[SPOl]鞘氨醇(Sphing醒4-enines，Sphingosines)[SP0101]神经鞘氨醇[SP0102]4-羟双氢鞘氨醇(植物鞘氨醇)[SP0103]鞘氨基醇石咸同系物和变体[SP0104]鞘氨基醇石咸l-磷酸[SP0105]溶鞘^粦脂和溶血津唐鞘脂[SPO106]N-曱基化鞘氨基醇碱[SPO107]鞘氨基醇^威类似物[SP0108]神经酰胺[SP02]N-酰基鞘氨醇(神经酰胺)[SP0201]N-酰基神经鞘氨醇(二氢神经酰胺)[SP0202]N-酰基-4-羟基神经鞘氨醇(植物神经酰胺)[SP0203]酰基神经酰胺[SP0204]神经酰胺1^粦酸[SP0205]鞘石粦脂[SP03]神经酰胺磷酸胆碱(鞘磷脂)[SP0301]神经酰胺磷酸乙醇胺[SPO302]神经酰胺石岸酸肌醇[SP0303]磷酸鞘脂[SP04]中性鞘糖脂[SP05]筒单Glc系列(GlcCer、LacCer等)[SP0501]GalNAcbl-3Galal画4Galbl-4Glc画(Globo系列)[SP0502]GalNAcbl画4Galbl-4GIc画(Ganglio系列)[SP0503]Galbl陽3GlcNAcbl陽3Galbl-4Glc陽(Lacto系列)[SP0504]GaIbl-4GlcNAcbl-3Galbl-4Glc-(Neolacto系列)[SP0505]GalNAcbl-3Galal-3Galbl画4Glc-(Isoglobo系列)[SP0506]GlcNAcbl-2Manal-3Manbl-4Glc-(Mollu系列)[SP0507]GalNAcbl-4GlcNAcbl-3Manbl-4Glc-(Arthro系歹'J)[SP0508]Gal-(Gala系列)[SP0509]其它[SP0510]酸性鞘糖脂[SP06]神经节苷脂[SP0601]硫酸鞘糖脂(硫苷脂)[SP0602]葡糖醛酸鞘脂[SP0603]鞘糖^舞脂[SP0604]其它[SP0600]碱性鞘糖脂[SP07]两性鞘糖脂[SP08]偶砷鞘月旨(arsenosphingolipid)[SP09]如下文详细描述的，本发明提供了抗鞘脂S1P剂，其可用于治疗或预防高增生病症(如癌症和心血管或脑血管疾病和病症)以及各种眼部疾病。尤其是本发明涉及S1P以及其变体，包括但不限于鞘氨醇-l-磷酸[sphingene-l-磷酸；D-赤型-鞘氨醇-l-磷酸；鞘氨醇-l-磷酸；(E，2S，3R)-2-氨基-3-羟基-十八-4-烯氧基]膦酸(AS26993-30-6)，DHS1P一皮定义为二氢鞘氨醇-l-石粦酸[神经鞘氨醇-l-磷酸；[(2S，3R)-2-氨基-3-羟基-十八氧基]膦酸；D-赤型-二氢-D-鞘氨醇一1一磷酸(CAS19794-97-9];SPC是神经鞘氨醇磷酸胆石咸、溶鞘磷脂、革肖氛醇石粦卧臾月旦石威(sphingosylphosphocholine)、革肖氛醇石粦酸胆石威(sphingosinephosphorylcholine)、氣化三甲基按乙醜辨(ethanaminium);2-((((2-氨基-3-羟基-4-十八烯基)氧)羟基氧膦基)氧)-N,N,N-三甲基-,氯化物，(R-(R*，S*-(E)))，2-[[(E，2R,3S)-2-氨基_3-羟基-十八_4-烯氧基]-羟基-磷酰基]乙氧基-三甲基-氯化铵(CAS10216-23-6)。32当在本文中使用时，除非另有^L定，术语"表位"或"抗原决定簇"是指抗SIP剂对其具有反应性的SIP区。术语"高增生性病症"是指与不受控制的增殖细胞有关的疾病和病症，包括但不限于器官和组织细胞的不受控制的生长，从而导致癌症或瘤形成以及良性肿瘤。与内皮细胞有关的高增生性病症可以导致血管发生的疾病如血管瘤、子宫内膜异位症、肥胖症、年龄相关性黄斑变性和各种一见网力莫病、以及由于在治疗动力永粥辨_石更4匕时成纤维细胞有关的高增生性病症(例如，纤维发生)包括但不限于过度的疤痕形成(例如，纤维化)的病症，如与年龄相关的黄斑变性、心脏重塑和与心肌梗死有关的衰竭，过度的伤口愈合如由于外讦+手术或损伤、瘢痕疙疼、以及纤维瘤和内支架置入术而通常发生的。本发明的组合物用于基于鞘脂的治疗方法。"治疗"是指预防和/或治疗疾病、病症、或身体创伤。"心血管治疗，，包括心脏治疗以及预防和/或治疗与心血管系统有关的其它疾病，如心脏病。术语"心脏病"包括涉及心脏或心月几组织的任何类型的疾病、病症、创伤或手术治疗。人们对与心肌组织的缺氧和/或缺血和/或心力衰竭有关的心脏病特别感兴趣。由缺血引起的一种类型的心脏病是再灌注损伤，如当在治疗中使用抗凝剂、溶血一全剂、或抗心绞痛药时、或当通过血管成形术或通过冠状动脉拼接术打开心脏血管时可能发生的。本发明涉及的另一种类型的心脏病是冠状动脉疾病(CAD)，其会由动脉硬化，尤其是动脉粥样硬化引起，是缺血的常见原因。CAD的症状例如是稳定型或不稳定型心紋痛，并且能够导致心肌梗死(MI)和心脏性猝死。特别感兴趣的病症包括4旦不限于心肌缺血；急性心肌梗死(AMI);33冠状动脉疾病(CAD);急性冠脉综合征(ACS);心肌细胞和组织损伤，其可以在具有或不具有支架的情况下在经皮血运重建(冠状动力永血管成形术)期间或作为经皮血运重建(冠状动^永血管成形术)的结果而发生；冠状动脉旁路拼接术(CABG)或其它手术或医学操作或疗法，其可以引起人类的缺血或缺血/再灌注损伤；以及心血管创伤。术语"心力衰竭"包括急性心肌梗死、心肌炎、心肌病、充血性心力衰竭、感染性^木克、心脏创伤以及先天性心力衰竭。导致心力衰竭的各种缺血性病症称作急性冠脉综合征(ACS)。术语"心脏病治疗剂"是指用于治疗由心脏和心月几疾病和病症引起的或^半有心脏和心"几疾病和病症的疾病和病症的制剂。"脑血管病的治疗"是指涉及预防和/或治疗伴随脑缺血和/或缺氧的疾病和病症的治疗。特别感兴趣的是由完全性缺血(由心脏病引起的)所造成的脑缺血和/或缺氧，包括〗旦不限于心力衰竭。术语"鞘脂代谢物，，是指由其获得鞘脂的化合物、以及降解特定鞘脂所获得的化合物。换言之，"鞘脂代谢物"是指与鞘脂代谢途径有关的化合物。代谢物包括代谢前体和代谢产物。术语"代谢前体"是指从其获得鞘脂的化合物。特别感兴趣的代谢前体包括但不限于SPC、鞘磷脂、二氢鞘氨醇、二氢神经酰胺、以及3-酮基神经鞘氨醇。术语"代谢产物"是指由降解鞘脂而获得的化合物，如磷酰月旦碱(例如，磷酸胆碱(phosphocholine)、磷酸胆碱(cholinephosphate))、脂肪酸(包括游离脂肪酸)、以及十六烷醛(例如，十六醛)。如本文中所^吏用的，术语"治疗的"包括对疾病或病症的所有治疗。本发明的"治疗"剂可以防卫或预防的方式起作用，包括与i殳计用来把向可以;故确定为处于危险中(遗传药理学)的个体的程序相结合的方式；或以改善或治愈的方式起作用；或可以用来减緩-降治疗疾病或病症的至少一种症状的进展速率或禾呈度；或可以用来最大程度减少所需要的时间、任何不适或疼痛的发生或程度、或伴随A人疾病、病症或身体创伤恢复后的体力限度；或可以对其它疗法和治疗起到寿乾助作用。"治疗"是指治疗性治疗和预防性措施。需要治疗者包括已经患有病症者以及要予页防病症者。术语"联合疗法"是指一种治疗方案，其涉及提供至少两种不同疗法以达到指定的治疗岁丈果。例如，联合疗法可以涉及给予两种或更多种化学上不同的活性组分，例如，快速作用化疗药物和抗脂质抗体。可替换地，联合疗法可以涉及单独给予或连同另一种治疗(如方丈射治疗和/或外科手术)一起给予抗脂质抗体和/或一种或多种化疗药物。另外，联合疗法可以涉及连同一种或多种其它生物制剂(例3口，4元VEGF、TGF|3、PDGF、或bFGF剂)、4b疗药物以及另一种治疗(如放射治疗和/或外科手术)一起给予抗脂质抗体。在给予两种或更多种化学上不同的活性組分的情况下，应当明了，作为分开的组合物给予时，包含不同活性组分的组合物可以在相同或不同的时间、通过相同或不同的途径、利用相同或不同的给药方案来给予，其均才艮据具体情况的需要并由主治医生确定。类似地，当一种或多种抗脂质抗体物质(例如，抗LPA抗体)单独或连同一种或多种化疗药物而与例如，》文射治疗和/或外-牛手术结合时，可以在外科手术或放射治疗之前或之后递送药物。"单药治疗"是指基于递送一种治疗有效化合物的治疗方案，不管是作为单剂量或作为随着时间推移的若干剂量来给予。"瘤形成"或"癌症"是指异常的和不受控制的细胞生长。"新生物"、或肺瘤或癌症，是细^^生长的异常的、不受调节的、以及紊乱的增殖，并且通常称作癌症。新生物可以是良性的或恶性的。如果新生物具有破坏性生长、侵袭性、以及转移的性能，则是恶性的、或癌性的。^f憂袭性是指新生物通过浸润或石皮坏周围组织而局部扩散，通常冲破限定组织边界的基底层，从而经常进入体内循环系统。转移通常是指肿瘤细胞通过淋巴管或血管的散布。转移还指肿瘤细胞通过直4妄延伸通过浆膜腔、或蛛网力莫下隙或其它腔隙的迁移。通过转移过程，肿瘤细胞迁移到身体的其它区域，从而在远离最初出现部位的区域建立新生物。就治疗来说，"哺乳动物"是指分类为哺乳动物的任何动物，其包括人类、家养和农场动物、以及动物园动物、体育动物、或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。"天然抗体"和"天然免疫球蛋白"通常是约150,000道尔顿的异四聚体并唐蛋白，由两个相同的轻(L)《连和两个相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数目是不同的。每条重链和轻链还具有>见则间隔的链内二碌^桥。每条重链在一端具有可变结构域^(Vh),接着是若干恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)而在另一端具有恒定结构域；轻《连的恒定结构域对准(alignedwith)重链的第一恒定结构域，而轻链的可变结构域则对准重4连的可变结构i或。i人为特定的氨基酸残基在轻链可变结构i或和重链可变结构i戈之间形成界面。术语"可变"区包含骨架和CDR(在其它情况下称作高变区)并且是指以下事实在抗体之间，可变结构域的某些部分在序列方面是广泛不同的，并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并不是均匀地分布于整个抗体的可变结构域。在轻链和重链可变结构域，它均集中在三个称作高可变区的区段。可变结构域的更高保守部分被称作骨架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3以及FR4),大部分采取P-折叠构型，通过三个高可变区加以连接，该环连接卩-折叠结构形成环并在某些情况下形成(3-折叠结构的一部分。在每个链中的高可变区通过FR被紧密地保持在一起，并且与来自其它链的高可变区紧密地保持在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat，etal，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.(1991)，第647-669页)。恒定结构域并不直接涉及将抗体结合于抗原，但呈现各种效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。当在本文中使用时，术语"高可变区"是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高可变区包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如，在轻链可变结构域中的残基24-34(Ll)、50-56(L2)、和89-97(L3)，以及在重链可变结构域中的31-35(Hl)、50-65(H2)、和95-102(H3);Kabat,etal.(1991)，上文)和/或那些来自"高可变环"的残基(例如在轻链可变结构域中的残基26-32(Ll)、50-52(L2)、和91-96(L3)以及在重链可变结构域中的26-32(Hl)、53-55(H2)、和96-101CH3);ChothiaandLeskJ.Mol,Biol.196:901-917(1987))。如本文中所定义的，"骨架"或"FR"残基是那些不同于高可变区残基的可变结构域残基。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作"Fab"片段，每个具有单抗原结合位点，以及残余"Fc"片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。"Fv"是最小抗体片段，其包含完全抗原识別和结合位点。此区由紧密、非共4介締合的一个重链和一个轻链可变结构J或的二聚体37构成。正是以这种构型，每个可变结构域的三个高可变区相互作用以在Vh-Vl二聚体的表面上限定抗原結合位点。共同地，上述6个高可变区将抗原结合特异性赋予抗体。然而，甚至单可变结构域(或一半Fv,其〗又包含对于抗原具有特异性的三个高可变区)也具有识別和结合抗原的能力，虽然亲和力低于整个结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一'度定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的差别在于在重链CH1结构域(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)的羧基末端加入几个残基。本文中Fab'-SH是用于Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初产生为成对的Fab'片段，其在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学耦联也是已知的。基于恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊推动物物种的抗体(免疫球蛋白)的"轻链"可以被指定为两种明显不同类型之一，称作K和x。取决于它们重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被指定为不同的类型。目前有5种主要类型的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM,并且这些主要类型的若干种可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、以及IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为oc、S、s、y、以及p。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。术语"抗体，，在本文中是在广义上加以使用并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)。多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，抗体片l殳，以及结合剂，其采用亲代抗体的CDR(或其保留抗原结合活性的变体)。本文中抗体被定义为保留亲代抗体的至少一种所期望的活性。所期望的活性可以包括特异性地结合抗原的能力、体外抑制增殖(proleration)的能力、体内抑制血管发生的能力、以及体外改变细胞因子轮廓的能力。"抗体片段"包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变结构i或。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段；双体分子；线状抗体；单链抗体分子；以及形成自抗体片段的多特异性抗体。如在本文中所使用的，术语"单克隆抗体"是指获自基本上同型抗体的群体的抗体，例如，包含群体的个体抗体是相同的，除了可能的天然发生的突变，其可以少量存在。单克隆抗体是高度特异的，针对单抗原位点。此外，不同于常规(多克隆)抗体制剂，其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，每个单克隆抗体针对抗原上的单决定簇。修饰词"单克隆"表示抗体的特性是获自抗体的基本上同型群体，而不应看作是需要通过特定的方法来生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等，Nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法加以制备，或可以通过重纟且DNA方法力口以制备(参见例3口，美国专利第4,816,567号)。利用例如在Clackson，etal.，Nature352:624-628(1991)和Marksetal.，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的4支术，"单克隆抗体"还可以分离自噬菌体抗体文库。本文中的单克隆抗体特别包括"嵌合"抗体(免疫^^蛋白)，其中重《连和/或轻《连的一部分相同于或同源于在书f生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列，而链的剩余部分相同于或同源于在衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列，以及上述抗体的片段，只要它们呈现所期望的生物学活性(美国专利第4,816,567号；以及Morrison,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。39非人(例如，小鼠)抗体的"人源化"形式是嵌合抗体，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高可变区残基被来自非人物种(供体抗体)的高可变区残基取代，其中非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类，其具有所期望的特异性、亲和力、以及能力。在某些情况下，人免疫球蛋白的骨架区(FR)残基^皮对应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化抗体将基本上均包含至少一个、以及通常两个可变结构:威，其中所有或基本上所有的高可变区对应于非人免疫^求蛋白的那些高可变区，以及所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体可选地还将包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc),通常为人免疫主求蛋白的恒定区。关于进一步的详情，参见Jones,etal.:Nature321:522-525(1986);Reichmann,etal，Nature332:323-329(1988);以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)和Hansen,WO2006105062。"单链Fv"或"sFv"抗体片段包含抗体的Vh和VL结构域，其中这些结构域存在于单多肽链中。通常，Fv多肽进一步包含在Vh和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成所期望的用于抗原结合的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun的ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。术语"双体分子"是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含重链可变结构域(VH)，其连接于在相同多肽链(Vh-Vl)中的轻《连可变结构域(VL)。通过使用太短以致在相同链上的两个结构域之间不允许配对的接头，结构域:帔迫配对于另一《连的互补结构域并产生两个抗原结合^f立点。例如，在EP404,097、WO93/11161、40以及Hollinger,etal.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中更充分描述了双体分子。当在整个本申请中使用时，术语"线状抗体"是指在Zapata,etal.ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)中所描述的抗体。简单地i兌，这些抗体包含一对串联Fd区段(Vh-Ch1-Vh-Ch1)，其形成一对抗原结合区。线状抗体可以是双特异性的或单双特异性的。在本文中，"变异"抗鞘脂抗体是指一种分子，其在氨基酸序列方面不同于"亲代"抗鞘脂抗体氨基酸序列(借助于在亲代抗体序列中添加、缺失、和/或取—个或多个氨基酸残基)，^旦保留亲代抗结合抗体的至少一种所期望的活性。所期望的活性可以包括特异性地结合抗原的能力、体外抑制增殖的能力、体内抑制血管发生的能力、以及体外改变细胞因子轮廓的能力。在一种实施方式中，变体包含在亲代抗体的一个或多个高可变区中的一个或多个氨基酸耳又代。例如，变体可以包含在亲代抗体的一个或多个高可变区中的至少一个，例如，约一个至约10个，以及优选约两个至约5个取代。通常，变体将具有一种氨基酸序列，其与亲代抗体重链或轻4连可变结构i或序列具有至少50%的氨基酸序列同一性，更优选至少65%,更4尤选至少75%，更4尤选至少80%,更^尤选至少85%,更优选至少90%,以及最优选至少95%的序列同一性。相对于此序列的同一性或同源性在本文中^皮定义为，在对比序列和引入间隙(如果必要的话)以后(以达到最大百分比序列同一性)，在4'美选序列中相同于亲代抗体残基的氨基酸残基的百分比。N端、C端、或内部延伸、缺失、或插入抗体序列均不应i人为会影响序列同一性或同源性。变体保留结合鞘脂的能力并且优选具有所期望的活性，其优越于亲K抗体的活性。例如，变体可以具有更强的结合亲和力、增强的减少血管发生和/或停止肿瘤进展的能力。为了分析这样的所期望的性能(例如较少免疫原性的、更长的半寿期、增强的稳定性、增强全长形式和亲代抗体的全长形式，例如，因为已发现，抗鞘脂抗体的格式会影响其在本文披露的生物学活性测定中的活性。本文中特别感兴趣的变异抗体可以是这样一种变异抗体，其呈现至少一种所期望活性的至少约5%，优选至少约10%、25%、59%、或更大。4尤选的变体是这样一种变体，当和亲代抗体比较时，其具有优越的生物物理性能(如体外测得的)或优越的生物学活性(如体外或体内测得的)。本文中的"亲代"抗体是由用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，亲代抗体具有人骨架区，并且，如果存在的话，具有人抗体恒定区。例如，亲代抗体可以是人源化或人抗体。"分离的"抗体是这样一种抗体，其已被鉴定和分离和/或回收自其天然环境的成分。其天然环境的污染物成分是将干纟尤抗体的it断或治疗应用的物质，并且可以包4舌酶、激素、以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方式中，抗体将^皮纯化(1)4妄抗体的重量计达到大于95。/。，如通过劳里方法确定的，并且4姿重量计最4尤选大于99%，(2)达到这样的程度，其足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基，其中通过4吏用S走杯、序列分才/H义(spinningcupsequenator)，或(3)在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE达到同质性，其中使用考马斯蓝或优选银染。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的4元体。当在本文中使用时，术语"标记"是指直接或间接共轭于抗体的可才企测化合物或组分。标记本身可以是独自可4企测的(例如，力丈射性同位素标记或荧光标记)或，在酶标记的情况下，可以催化可才企测的底物化合物或组分的化学变化。"固相"是指非水基质，本发明的抗体可以与其勦附或抗体或其它抗-S1P结合剂可以固定在其上。本文包括的固相的实例包括部分或完全由3皮璃(例如，受控孔玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇以及聚硅氧烷形成的那些固相。在某些实施方式中，4艮据具体情况，固相可以包4舌测定4反的孔，而在其它情况下则是纯化柱(例如，亲和层析柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，如在美国专利第4,275,149号中所描述的那些不连续固相。"脂质体"是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小嚢，其可用于向哺乳动物递送药物(如本文描述的抗鞘脂抗体以及，可选地，化疗药物)。脂质体的成分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。"分离的"核酸分子是这样的核酸分子，其寻皮鉴定和分离自至少一种污染物核酸分子，在抗体核酸的天然源中分离的核酸分子通常伴随污染物核酸分子。分离的核酸分子在形式或环境方面不同于在自然界发现的核酸分子。因此分离的核酸分子不同于在天然细月包中存在的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括包含在通常表达抗体的细胞中的核酸分子，其中，例如，核酸分子所处的染色体位置不同于在天然细胞中的位置。术语"调控序列"是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必要的DNA序列。适用于例如原核细力包的调控序列包括启动子、可选的纟喿作子序列、以及核^唐体结合位点。已知真核细胞可利用启动子、多&良苷酸化信号、以及增强子。当核酸净皮置于与另一核酸序列的功能关系中时，则核酸是"可才乘作连4妄的"。例4。，如果用于前序列或分泌前导序列的DNA净皮表达为参与多肽分泌的前体蛋白，则用于前序列或分泌前导序列的DNA可才乘作地连4妻于用于多肽的DNA;如果启动子或增强子影响43序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接于编码序列；或如果核糖体结合位点一皮定位以致促进翻i,，则核糖体结合位点可操作;也连接于编码序列。通常，"可操作连接的"是指^皮连接的核酸分子是邻4妄的，并且，在分泌前导序列的情况下，是邻接的和处于读码;阶,殳。然而，增强子并不必须是邻接的。通过在方便的限制位点的连接作用来完成连接。如果这样的位点并不存在，则按照常规做法使用合成寡核苷酸衔接子或接头。如在本文中所-使用的，术语"细胞，，、"细胞系"、以及"细胞培养"可互换使用并且所有这样的名称包括子代。因此，术语"转化体"和"转化细胞"包括原代主体细胞和从其衍生的培养物，而与传递次数无关。还应当明了，由于蓄意突变(deliberatemutation)或无意突变(inadvertentmutation),戶斤有子4气可能并不具有4青确才目同的DNA含量。包括具有相同功能或生物学活性的突变子代，如在最初转化细胞中筛查的。其中使用了不同名称，根据上下文它将是清楚的。根据本发明的"具备专利性的"组合物、方法、机器、或制品是指在进行分析时其主题名称满足专利性的所有法定要求。例如，关于新颖性、创造性等，如果以后的研究指出一项或多项权利要求包含否定新颖性、创造性等的一种或多种实施方式，则由"具备专利性的"实施方式限定的纟又利要求具体地排除不具备专利性的实施方式。而且，所附权利要求将被解释为提供最广的合理范围，以及保护它们的有效性。此外，以这样的方式解释权利要求，即(l)保护它们的有效性以及(2)从本申请作为专利被提交或公开时到一项或多项所附权利要求的有效性受到质疑时，在具备专利性的一项或多项法定要求被修订或如果用于评估专利性的特定法定要求是否满足的标准发生变化的情况下提供最宽的合理解释。术语"药用盐"是指这样的盐，其保留本发明的制剂和化合物的生物有效性和性能并且其在生物上或其它方面也是需要的。在i午多情况下，借助于存在带电荷基团，例如，带电荷氨基和/或羧基基团或与其类似的基团，本发明的制剂和化合物能够形成酸式盐和/或石威式盐。药用酸加成盐可以制备自无才几酸和有才几酸，而药用石咸力口成盐可以制备自无枳〃减和有初^咸。对于药用盐的综述(参见Berge，etal.(1977)J.Pharm.ScL，vol.66,1-19)。"多个"或"多种"是指一个(种)以上。术语"分开的"、"纯化的"、"分离的"等是指包含在容纳样品的容器中的样品的一种或多种成分被或已#:从存在于容器中的一种或多种其它样品成分物理地除去，或被稀释在存在于容器中的一种或多种其它样品成分中。在分离或纯化步骤中可以被除去或稀释的样品成分包括化学反应产物、未反应的化学物质、蛋白质、石灰水化合物、脂质、以及未结合的分子。本文中所使用的术语"物种(或物质)"用于各种情况，例如，化疗药物的特定物质。在每一种情况下，该术语是指在特定范围内提及的化学上难以区分的分子的群体。"特异性地结合"和"特异性结合"等是指两种分子之间的特异的、非随机相互作用，该相互作用取决于存在使得分子之间可以发生适当的化学或分子相互作用结构、疏水/亲水、和/或静电特征。"受治疗者"或"患者，，是指需要治疗的动物，其中治疗可以通过本发明的分子来进行。按照本发明可以治疗的动物包括脊推动物，其中哺乳动物如牛、犬、马、猫、绵羊、猪、以及灵长类(包括人类和非人灵长类)动物是特别优选的实例。45"治疗有效量"(或"有效量")是指当给予受治疗者或患者时足以实施治疗的活性组分(例如，根据本发明的制剂)的量。因此，可以由本领域才支术人员容易地确定才艮据本发明的组合物的治疗有效量。在眼治疗的范围内，"治疗有效量"是这样的量，其在与眼部疾病或病症的治疗有关的一个或多个参凄t方面产生客观上测得的变化，其包括与眼部疾病或病症有关的一种或多种基因的表达的增加或减少、凋亡或其它细胞死亡通^各的诱导、症状的临床改善、异常的新血管形成或炎症的降低等。当然，治疗有效量将取决于特r治疗的特定受治疗者和病症、受治疗者的体重和年龄、疾病状态的严重性、选用的特定化合物、采用的给药方案、给予的时间、给予方式等，所有这些可以容易地由本领域技术人员确定。应当明了，在联合疗法的情况下，特定活性组分的治疗有岁文量可以与作为单药治疗(即，采用^f又一种化学实体作为活性组分的治疗方案)给予时的活性组分的治疗有效量不同。术i吾疾病或病症的"治疗"包括:予贞防或防止疾病或病症(即，使临床症状不发展)；抑制疾病或病症(即，阻止或抑制临床症状的发展)；和/或緩解疾病或病症(即，使临床症状消退)。如将明了的，并不总是可以区分"预防"和"抑制"疾病或病症，因为最终-秀导事件可以是未知的或潜在的。因此，术i吾"预防"将^皮理解为构成一种类型的"治疗，，，其包括"预防"和"抑制，，。因此术语"治疗"包括"预防"。术语"治疗方案"是指利用化疗药物、放射治疗、外科手术、基因治疗、DNA疫苗和治疗、基于反义的疗法(包括siRNA疗法)、抗血管形成疗法、免疫疗法、骨髓纟并*接、适体和其它生物制剂如4元体和抗体变体、诱骗受体、以及其它基于蛋白质的疗法对疾病或病症进行的任何治疗。
发明内容本发明涉及具备专利性的人源化抗鞘脂剂，该人源化抗鞘脂剂包括抗体和抗鞘脂抗体变体，从治疗和/或诊断角度考虑，其具有所期望的性能，包括对鞘脂的强结合亲和力，结合并中和鞘氨醇-l-磷酸(S1P)的能力，尤其是在生理范围内(例如，在活组织、血液等中)和在生理条件下，以及包4舌亚型(isoform)、变体、同分异构体、和相关化合物。尤其是，本发明涉及针对S1P的抗体，尤其是单克隆抗体，更具体地是人源化单克隆抗体以及其变体。这样的抗体和变体优选包括在药物組合物中，该药物组合物适合于给予已知或疑似需要用上述化合物进行治疗的受治疗者。除组合物之外，本发明还纟是供了包括上述组合物的试剂盒、制备上述抗S1P抗体和变体的方法，以及利用上述制剂进行治疗的方法。在一种实施方式中，提供了分离的抗S1P抗体重链和轻链，其包含新鉴定的优选序列的可变结构域，尤其是对重链而言的SEQIDNO:27和SEQIDNO:35以及》十轻链而言的SEQIDNO:30和SEQIDNO:37。在另一种实施方式中，才是供了抗S1P剂，其在生理条件下相对于鞘氨醇-l-磷酸(SlP)具有活性并且其包含至少一种CDR肽，该肽与在本文其它地方i兌明的CDR序列具有至少50%的氨基酸序列同一性，以及高达并包4舌100%的同一性。在一种实施方式中，4艮据本发明的抗鞘脂抗体具有轻链可变结构域，其包含具有以下氨基酸序列的高变互补决定区(CDR):ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10;CDRLl)、EGNILRP(SEQIDNO:ll;CDRL2)以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12;CDRL3)。优选地，重链可变结构域包含具有以下氨基酸序列的CDR:DHTIH(SEQIDNO:13;CDRH1)、GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15;CDRH3)以及CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14;CDRH2)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31;CDRH2)。在本发明的特别优选的实施方式中，一个或多个CDR以使CDR保留它们的结合并中和SIP的能力的方式而拼接到骨架。不限于以下实例，骨架可以表示紧密旁侧CDR的纟元体轻链和重链的人序列，〗旦也可以表示任何结构，其以一定的方式呈现CDR以便优化人源化抗体在其结合于S1P方面的性能特征或其它特性，其可以增强抗体的效能、稳定性、表达、生物半衰期、溶解性、免疫原性、药理分布(pharmacodistribution)、以及贝i存期卩艮。优选地，在人骨架区中具有三个重链高可变CDR区，例如，作为由下式表示的邻接序列FR1-CDRH1画FR2誦CDRH2-FR3-CDRH3-FR4。本发明进一步提供了一种抗鞘脂抗体重链可变结构域，其包含本文中由SEQIDNO:27表示的氨基酸序列。一种特别有用的重链可变结构域序列是在以下实施例12中描述的人源化抗体的重链可变结构域序列，并且包含SEQIDNO:32的重链可变结构域序列。上述优选的重链可变结构域序列可以结合于例如多肽(其包含本文中由SEQIDNO:33表示的轻链可变结构域序列)，结合于其它轻链可变结构域序列，只要获得的分子结合于鞘脂即可。在另一种实施方式中，本发明提供了一种人源化抗鞘脂抗体轻链可变结构域，其包含在本文中由SEQIDNO:17表示的氨基酸序列。在一种实施方式中，一种有用的轻《连可变结构i或序列是以下实施例12的人源化抗体的轻链可变结构域序列，并且包含SEQIDNO:30或SEQIDNO:37的轻链可变结构i或序列。在一种优选实施方式中，本发明^是供了一种人源化抗鞘脂抗体，其具有包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的轻链和包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的重链。轻链可变结构域可以包含具有以下氨基酸序列的高可变区CDRL1(SEQIDNO:10)、CDRL2(SEQIDNO:11)、以及CDRL3(SEQIDNO:12)。优选地，在人骨架区中可具有上述三个轻链高可变区，例如，作为由下式表示的邻4妄序列FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CD-RL3-FR4。本发明还提供了亲代抗鞘脂抗体的变体，优选其中亲代抗体是人源化或人抗鞘脂抗体。上述变体结合鞘脂，尤其是S1P,并且包含在亲代抗鞘脂抗体的重链或轻链可变结构域的高可变区中的氨基酸取代。上述变体优选具有在抗鞘脂抗体的一个或多个高可变区中的一个或多个取代。才艮据一种实施方式，取代是在亲代抗体的重链可变结构域中，例如，氨基酸取代可以是在重链可变结构域CDRH1和/或CDRH3中。在上述两个高可变区中均可存在取代。本文中证明了这样的"亲和力成熟的"变体比亲代抗鞘脂抗体(由其产生"亲和力成熟的"变体)更强地结合鞘脂。例如，通过亲和力成熟产生的抗体可以具有显著低于亲代抗鞘脂抗体的Kd值的Kd值。亲和力成熟的一个典型实例涉及改变人IgGKl轻链和重链骨架，其中^H妄鼠抗SIPCDR。这导致人源化抗体相对于其草巴配体(即SIP)的增加的亲和力。在其它实施方式中，不同于人IgG骨架的氨基酸序列可以支持一个或多个CDR。可以通过改变高变CDR区中的氨基酸序列来实施亲和力成熟，以改善上述抗体性能和/或特性。这种形式的亲和力成熟的一个实例在以下的实施例12中示出，其中重链CDR中的半胱氨酸残基通过定位诱变^皮改变成丙氨酸残基，从而导致S1P结合亲和力和稳定性的显著增加。在一个这样的重链变体中，可变区包括SEQIDNO:27的氨基酸序列。在CDRH2中的这才羊的重链可变结构i或序列可以可选i也结合于轻链可变结构域，例如，包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的轻链可变结构域、或优选地SEQIDNO:30的轻链可变结构域氨基酸序列。本文预期包括各种抗S1P分子。例如，抗SIP剂可以是抗体、抗体衍生物、或非抗体源性部分。例如，抗S1P剂可以是抗体，包括全长抗体(例如，具有完整人Fc区的抗体)或抗体片#爻(例如，Fab、Fab'、或F(ab')2分子)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、或亲和力成熟的抗体。不是受限于本发明，可以产生上述抗S1P剂以改善或在其它情况下改变抗体稳、定性、半衰期、岁丈能、药理分布、和/或免疫原性。例如，可以改变人源〗tFc结构i或的氨基酸组成以改善其免疫原性或其它性能特性。在其它实施方式中，抗S1P剂可以共轭于某个组成部分，如多聚体、；改射性核素、化疗药物、以及4企测剂。在某些优选实施方式中，用诸如药用载体的载体来配制抗S1P剂。在一种实施方式中，抗S1P剂结合于第二制剂，如抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体变体、不同于抗S1P剂的治疗剂，或可以结合不同于S1P的分子的制剂。本发明还4是供了分离的核酸分子，其编码抗体的各种成分、抗体变体、以及根据本发明的片段，包括各种重链和轻链序列和CDR。还提供了包含这些核酸分子的载体和宿主细胞。进一步提供了分离的多肽，其包含一种或多种优选的氨基酸序列，如CDR序列或抗体轻链和/或重链序列。在本发明的优选实施方式中，提供了分离的抗体分子，其在每个重链和每个轻链中包含精确限定的CDR序列。在一种这样的实施方式中，分离的抗体分子是人源化抗体分子。50还提供了多价结合分子，其具有对SIP具有反应性的并且包含一个或多个优选CDR序列的配体结合元件。这些多价分子可以包含至少一个、并且多达IO，OOO个或更多的对S1P具有反应性的配体结合元件。如果需要的话，还可以包4舌对不同配体具有反应性的配应性的，但在一个或多个特性(例如，分子结构、结合亲和力等)方面不同于其它S1P结合it/f牛。还提供了用于治疗或预防与异常水平、尤其是高水平S1P有关的疾病或病症的方法。通常，上述方法包4舌将本发明的抗S1P组合物之一给予需要这种治疗的受治疗者，例如人。可以通过上述方法治疗的疾病或病症包4舌癌症、炎斗生疾病、月卤血管病、心血管疾病、眼部疾病、与过度纤维发生有关的疾病和病症、以及与病理性血管发生有关的疾病或病症。还可以连同另一种治疗剂或治疗方案来绐^予抗S1P组合物。一个有关方面涉及降^氐用于治疗或f^防高增生病症的治疗方案的毒性的方法。上述方法包括在纟会予用来治疗或预防高增生病症的治疗方案之前、期间、或之后，给予高增生病症患者有效量的根据本发明的一种制剂(或多种不同制剂)。在一种优选实施方式中，抗体和治疗方案具有相加作用，并且治疗方案中加入抗体可以有助于降低治疗方案的剂量，从而降低治疗相关毒性。本发明的又一个方面涉及本发明的抗S1P剂的诊断应用。在一种诊断应用中，本发明提供了用于在样品中确定靶鞘脂存在的方法。通常，通过下述步骤来实施上述方法将怀^是包含特定鞘脂(即，"靶"鞘脂)的样品(如体液或组织活检样品)暴露于本发明的抗S1P剂如抗鞘脂抗体，然后确定在样品中是否存在异常水平(即，与疾病或病症有关的水平)的輩巴鞘脂(例如，SIP)。对于这些应用中的某些应用，提供了包括抗体及其使用说明的试剂盒。本发明的又一个方面涉及用于制备抗SIP剂的方法。这种制剂的优选实例包括抗体、抗体变体、以及抗体衍生物(例如，抗体片段)。在优选实施方式中，尤其是那些涉及包含一种或多种多肽的抗S1P剂的实施方式中，生物生产系统如细胞系是优选的。当然，也可以采用合成^b学方法。下文将更详细描述本发明的这些和其它方面以及实施方式。才艮据以下详细描述、附图、以及权利要求，本发明的前述和其它方面将变得更明显。虽然类似或等效于本文所描述方法和材料的方法和材料可以用于实施或试-验本发明，4旦下文描述了适宜的方法和材料。此外，以下的材料、方法、以及实施例仅是说明性的而不是限制性的。本申请包括至少一个彩色附图。要求并支付必要的费用时，即可提供带有彩色附图的本申请的副本。下面提供每个附图的简要介绍。图1.图1具有两个图片，A和B。图片A图示S1P、SPH、LPA、SPC、以及其它结构类似生物脂竟争生物素共轭抗S1P单克隆抗体的竟争性ELISA的结果。这些结果说明，抗体对于S1P是特异的和选择性的，并且并不识別结构类似的生物活性脂质。如在以下实施例1中所描述的，通过对小鼠或人IgG特异的、共轭于HRP的二抗来检测结合抗体。测量显色反应并报道为光密度(OD)。用于竟争的脂质浓度表示在X轴上。未能检测出二抗与仅S1P涂布基质的相互作用(凄t据未示出)。图片B示出与图片A中列出的SIP类似的生物活性脂质的结构。图2.此图示出若干嵌合和重组人源化抗SIP抗体变体的结合性能。在ELISA结合测定中，比较了嵌合抗体(pATH10+pATH50)和人源化抗SIP单克隆抗体的两个变体(pATH201+pATH308)以及(pATH201+pATH309)与SIP的结合。pATH308是在骨架区具有5个鼠回复突变的人源〗匕轻链而pATH309则是具有3个回复突变的人源化轻链。人源化重链(pATH201)在骨架区仅包含一个鼠回复突变。图3是示出SPHINGOMAB对于S1P是高度特异的曲线图。该曲线图(其数据是利用竟争性ELISA而产生)说明，与其它生物活性脂质相比，SPHINGOMAB对于SIP的特异性。SPHINGOMAB表明对于鞘氨醇(SPH)、SIP或溶血磷脂酸(LPA)的直接的代谢前体没有交叉反应性，其中溶血》粦脂酸(LPA)是一种重要的结构上和功能上类似于SIP的胞外信号分子。SPHINGOMAB并不识别其它结构类似的脂质和^R^射物，包括神经酰胺-1J粦酸(C1P)、二氢鞘氨醇(DH-SPH)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、或鞘磷脂(SM)。SPHINGOMAB确实与二氢鞘氨醇-l-磷酸(DH-SlP)进4亍交叉反应，并且在更低的程度上与鞘氨醇磷酰胆碱(SPC)进行交叉反应。SPHINGOMAB对于S1P的亲和力(Kd)小于100pM，远高于大多数治疗性抗体，尤其是其它分子海绵。图4.图4具有两个部分，图4A和图4B。产生图中所示凄丈据的实一验在以下实施例4中加以详细描述。简单地说，这些凄欠据表明，SPHINGOMAB会减少CNV和眼部病变中的瘢痕形成。用SPHINGOMAB或同种型配对非特异性单克隆抗体治疗小鼠。通过布鲁赫膜(Bruchsmembrane)的激光破裂来诱导CNV病变。示出的是来自每个治疗组的病变的图解和典型图^f象，其中用罗丹明共扼蓖麻凝集素I染色用于血管形成(A)或用马松三色(Masson，sTrichrome)染色用于胶原瘢痕形成(B)。图4A示出，在鼠CNV病变形成模型中，在布鲁赫膜的激光诱导破裂后的第14天和第28天，SPHINGOMAB显著减弱脉络膜新血管形成。图4B示出，在布鲁赫月莫的激光i秀导石皮裂后的第28天，SPHINGOMAB显著降<氐4半随CNV病变形成的纤维4匕。图5.图5具有两幅图片，图5A和图5B。在图5A中，示出了通过诱导HUVEC管形成和迁移，S1P促进新血管形成，其被SPHINGOMAB降低。图5A示出了接种在基质膜上并温育6小时的HUVEC的四张显孩t照片，以评估管形成。图5B示出了在基质膜侵入室中经1SIP±SPHINGOMAB(1昭/ml)处理6小时的HUVEC的数据。在5个独立区域中计数迁移到基质膜的细胞数目。图6.图6包括在以下实施例6中描述的实验的若干照片(A)以及图解(B和C),其中利用SPHINGOMAB进4亍实马全。SPHINGOMAB中和SIP诱导的、VEGFi秀导的以及bFGF诱导的新血管形成。图6A示出若干典型的FITC染色血管的照片，其来自基质膜栓士指定生长因子的切片。图6B示出，S1P刺激内皮细胞(EC)浸润。图6C示出来自基质膜一全(用VEGF或bFGF加以刺激的)的相对荧光的量化结果作为新血管形成的指标。当用l或25mg/kg的SPHINGOMAB系乡充治疗小鼠时，S1P、VEGF、以及bFGF的效应受到抑制。图7.图7示出了标记为图7A-图7E的5幅图，以及两幅々支彩色照片。该凄t据是利用抗S1P单克隆抗体SPHINGOMAB所产生。关于实-睑细节，参见以下实施例7。简单;也"i兌，这些凝j居表明，SPHINGOMAB可中和(或4氐消)S1P刺激的瘢痕形成。在这些实验中，成纤维细胞是无血清的，然后用0、0.1、0.5、或1|^MS1P+/-1吗/mLSPHINGOMAB处理12-24小时。翁:据表明，S1P刺激瑞士3T3成纤维细胞增殖，如通过3H-胸苷加入所测得的(A)，在划痕测定中小鼠心脏成纤维细胞迁移(B)，在来自表达胶原GFP的转基因小鼠的分离的心脏成纤维细胞中胶原基因表达(相对荧光)(C)，以及WI-38细月包分化成月几成纤维细月包，如通过降4氐的细月包增殖和增加的a-SMA表达所测得的(D)。SPHINGOMAB中和这些SIP岁丈应的每一种。在4c久性心月几梗死的小鼠才莫型中SPHINGOMAB体内降低血管周纤维化(E)。图8.图8具有三幅图片，图8A、图8B、以及图8C。这些数据表明，S1P可促进眼上皮细月包和成纤维细月包專t化成产生收缩性、瘢痕组织的肌成纤维细胞。如在以下实施例8中所描述的，斥全查了S1P对若干人眼细胞系的肌成纤维细胞转化的影响。研究发现，S1P可以刺激在人视网膜色素上皮细胞(图8A)和人结膜成纤维细胞(图8B)中a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA;—种肌成纤维细胞标记)的产生。这些凄t据首次表明，S1P属于促进眼上皮细"包和成纤维细胞转化成产生收缩性、瘢痕组织的肌成纤维细胞的因子。还检查了S1P对纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)在人结膜成纤维细胞中的表达的影响。增加的PAI-1表达与结締组织的蛋白降解降4氐有关并连同与疤痕增加有关的若干纤维变性性疾病^L正调节。如图8C所示，S1P以剂量依赖方式刺激PAI-1表达。图9.图9示出两个条形图，图9A和图9B，其示出了^f吏用称作SPHINGOMAB的抗S1P单克隆抗体所产生的实-睑数据。SPHINGOMAB体内降低了免疫细胞创伤浸润。在外科手术后48小时，使小鼠经受MI，用盐水或25mg/kgSPHINGOMAB进行治疗，然后在第4天将小鼠处死。SPHINGOMAB降低了巨喧细胞(A)和肥大细胞(B)浸润进入伤口。凄t据表示为盐水治疗值成倍下降。图10.图IO具有两幅图片，图IOA和图IOB。每幅图片示出了用于表达鼠抗SIP单克隆抗体Vl和vh结构域的克隆载体的图语。图10A是用于克隆Vl結枸域的pKN100载体的图谱。图10B是用于克隆Vh結枸域的pGlD200载体的图谱。图11.图11^是供了一些示出若千小鼠、嵌合、以及重组人源化抗S1P抗体的结合性能的数据。在ELISA结合测定中比较了小鼠(muMAbSlP;由方形数据点形成的曲线)和嵌合(chMAbS1P;由竖三角形教:据点形成的曲线)与人源化抗体的第一变体(pATH200+pATH300;由倒三角形H悟点形成的曲线)与S1P的结合。图12.图12具有两幅图片，图12A和图12B,其示出了利用若干人源化单克隆抗体变体进4亍体外细胞测定所获得的数据。图12A示出了人源化mAb能够防止SlP保护SKOV3细胞免于紫杉醇诱导的凋亡。如在以下实施例16中所描述的，在存在或没有500nMS1P的情况下用500nM紫杉醇(Tax)，用浓度为l|ag/mL的56huMAbHCLC3(309)、huMAbHCLC5(308)、muMAbS1P(muMAb)、或非特异性IgGl(NS)来处理SKOV3细胞48小时。数值表示平均值士SEM(n=3)，其中对于每个数据点进行三次。"NT"是指未处理，而"Veh"表示1X用载体进4亍处理。图12B示出了在用SIP和若干不同的抗SIP单克隆抗体之一或对照单克隆抗体处理的卵巢癌(OVCAR3)细胞中的IL-8分泌。在以下实施例16中详细描述的实马全中，IOO，OOO个OVCAR3细胞/孔饥饿过夜，然后将luMSIP单独加入培养基或用1ug/ml的非特异性抗体(NS)、pATH201+pATH309(LC3)、pATH201+pATH308(LC5)、pATH207+pATH309(cysLC3)、pATH207+pATH308(cysLC5)、以及0.1ug/ml(MO.l)、1ug/ml(Ml)或10ug/ml(M10)的抗S1P鼠抗体进行预温育。在温育22小时以后，收集细胞上清液，然后通过ELISA并利用R&D系统Quantikine人CXCL8/IL-8试剂盒来测量IL-8分泌。在图中"NT"是指未处理的细胞。图13.图13示出了在CNV动物模型中，与鼠抗S1P单克隆抗体和对照相比，若干人单克隆抗体变体的体内效力。如在以下实施例17中描述的，在这些实-验中，两次(第O天和第6天)*会予小鼠0.5ug的鼠(Mu)抗S1P单克隆抗体、若干人源化4元S1P单克隆抗体变体(即，变体LC3、LC5、HCcysLC3、以及HCcysLC5)、或非特异性单克隆抗体(NS)(通过玻璃体内给予)，然后经受布鲁赫膜的激光破裂。在激光外科手术后的第14天处死小鼠。切开巩膜-RPE-"永络力莫复合体并用罗丹明共辄蓖麻凝集素I抗体染色。CNV病变容积表示为平均值士SEM。具体实施例方式1.化合物本发明描述了某些抗SIP剂，尤其是那些为免疫衍生部分的抗S1P剂，包括抗体，其对于生物活性脂质S1P具有特异反应性；换言之，抗SIP剂与其进行反应的生物活性脂质是S1P。抗体分子或免疫球蛋白是分子量大约为150kDa的大糖蛋白分子，通常由两种不同种类的多肽链组成。一种多肽《连，称作"重"链(H)，大约为50kDa。另一种多肽链，称作"轻"链(L),大约为25kDa。每个免疫球蛋白分子通常由两个重链和两个轻链构成。两个重链通过二石克4建;波此连4妄，其中二石克4建的凄t目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间是不同的。每个轻链通过一个共价二硫4走连接于重链。在任何给定的天然存在的抗体分子中，两个重链和两个轻链是相同的，包含两个相同的抗原结合位点，因而被说成是二<介的，即，具有同时结合两个相同分子的能力。基于恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊推动物物种的抗体分子的"轻"链可以被指定为两种明显不同类型之一，卡巴(K)和入(l)。两种类型的轻链的比率随物种而不同。例如，在小鼠中K与1的平均比率为20:1,而在人类中为2:1以及在牛中为1:20。基于恒定结构域的氨基酸序列，来自4壬何脊推动物物种的抗体分子的"重"链可以被指定为5种明显不同类型(称作同种型)之一。某些同种型具有若干亚型。免疫球蛋白的5种主要类型是免疫球蛋白M(IgM)、免疫J求蛋白D(IgD)、免疫3求蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、以及免疫球蛋白E(IgE)。IgG是最丰富的同种型并且具有若干子类(在人类中为IgGl、2、3、以及4)。Fc片段和铰链区的差别在于不同同种型的抗体，从而确定它们的功能特性。然而，结构域的全部机体组成在所有同种型中是类似的。术语"可变区"是指抗体分子或其片段的N端部分。通常，四个链中的每一个具有在其氨基末端部分的可变(V)区，其有助于抗原结合位点，以及恒定(C)区，其确定同种型。通过许多非共价相互作用和通过二硫4建，轻链结合于重链，并且在抗体分子的每个^^中重链和轻《连的V区配X十以产生两个相同的抗原结合^f立点。i人为某些氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面[参见Kabat,etal.(1991),SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.andClothiaetal.(1985)，J.Mol.Biol,vol186:651]。值得注意的是，变异性并不是均勻分布于抗体的整个可变结构域，而是集中在轻链和重链可变结构域中的三个区段，称作"互补决定区"(CDR)或"高可变区"。可变结构域的更高保守部分4皮称作"骨架区"(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括通过三个CDR相连的四个FR区。在每个链中的CDR通过FR区与来自其它链的CDR紧密地保持在一起，从而形成抗体的抗原结合位点[参见Kabat，etal.(1991),SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.]。共同地，6个CDR均有助于抗体分子对抗原的结合性能。然而，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，Y又包含对抗原特异的三个CDR)也具有识别和结合抗原的能力[参见Pluckthun(1994)，ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113，RosenburgandMooreeds.，Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315]。术语"恒定结构域"是指抗体重链或轻链的C端区。通常，恒定结构域并不直接涉及抗体分子与抗原的结合性能，但呈现各种效应子功能，如在抗体依赖性细胞毒性中参与抗体。在这里，"效应子功能"是指抗体的不同生理^:应(例如，调理作用、细力包溶解、肥大细胞、嗜石咸性粒细胞和嗜伊红粒细胞脱粒作用、以及其它过程)，其是通过募集免疫细胞并通过免疫系统的Fc结构域和蛋白质之间的分子相互作用所介导的。重链的同种型决定抗体的功能特性。它们的特定的功能特性由不伴随有轻链的重链的羧基末端部分所赋予。如在本文中所使用的，"抗体片段"是指完整抗体的一部分，其包括完整抗体的抗原结合位点或可变区，其中上述部分可以没有完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(例如，CH2、CH3、以及CH4)。可替换地，恒定重链结构域(例如，CH2、CH3、以及CH4)的部分可以包括在"抗体片段，，中。抗体片段的实例是那些保留抗原结合的4元体片l殳并且包4舌Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、以及Fv片萃殳；只又体分子；三链抗体；单链抗体分子(sc-Fv);小体、纳米抗体、以及形成自抗体片段的多特异性抗体。例如，Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。术语"变体"是指一种氨基酸序列，其与抗体的天然氨基酸序列的差别在于至少一个氨基酸残基或<*饰。天然或亲代或野生型氨基酸序列是指在自然界发现的抗体的氨基酸序列。抗体分子的"变体"包括但不限于在轻链和/或重链的可变区或恒定区内的变化，包括高变或CDR区、Fc区、Fab区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、以及4交链区。术语"特异的"是指抗体选择性地结合于其耙表位。可以通过在#会定的一组条件下比專交抗体与所期望抗原的结合和抗体与不相关抗原或类似抗原或抗原混合物的结合来试-睑抗体分子的结合特异性。优选地，本发明的抗体会缺乏与不相关抗原、或甚至靶抗原的类似物的显著结合。在本文中，术语"抗原"是指由抗体分子或结合于抗原的免疫书于生部分识别和结合的分子。由抗体结合的抗原的特异性部分^皮称作"表位"。"半抗原"是指小分子，其在大多数情况下并仅当附着于载体分子时，例如，蛋白质、聚乙二醇(PEG)、60胶体金、聚硅氧烷珠等，才能诱发免疫应答(即，作为抗原)。载体还可以是并不独自诱发免疫应答的载体。术语"抗体"是在广义上使用，并且包括单克隆、多克隆、多特异性的(例如，双特异性的，其中，抗体的每个臂对不同表位或相同或不同抗原具有反应性)微型抗体、异源共轭物、双体分子、三链抗体、嵌合抗体、和合成抗体，以及特异性地结合抗原并具有所期望的结合性能和/或生物学活性的抗体片段。术语"单克隆抗体"(mAb)是指抗体、或类似抗体的群，其获自基本上同型抗体的群，并且并不认为需要通过任何特定的方法来生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过由Koher和Milstein(1975)，Nature,vol256:495-497首次描述的杂交瘤方法、或通过重组DNA方法，加以制备。术语"嵌合"抗体(或免疫球蛋白)是指包含重链和/或轻链的分子，其相同于或同源于衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列，而链的余余部分相同于或同源于衍生自另一物种或属于另一4元体类或亚类的抗体中的乂十应序列，以及上述抗体的片段，只要它们呈现所期望的生物学活性[Cabillyetal.(1984),下文；Morrisonetal,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851]。术语"人源化抗体"是指抗体形式，其包含来自非人(例如，鼠)抗体以及人抗体的序列。人源化抗体可以包括来自相同或不同物种的保守性氨基酸取代或非天然残基，其并不显著改变它的结合和/或生物学活性。这样的抗体是嵌合抗体，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、^^驼、牛、山羊、或兔的CDR并具有所期望性能的残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或在输入的CDR或骨架序列中均末发现的残基。进行这些》务饰以进一步完善和最大化抗体性能。因此，通常，人源4b抗体将包含至少一个，并且在一个方面包含两个可变结构域，其中所有或所有的高可变环对应于非人免疫^求蛋白的高可变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体可选地还将包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)、或至少一部分的人免疫球蛋白。参见例如，Cabilly等，美国专利第4，816，567号；Cabilly等，欧洲专利第0,125,023Bl号；Boss等,美国专利第4,816,397号；Boss等，欧洲专利第0,120,694Bl号；Neuberger，M.S.等，WO86/01533;Neuberger,M.S.等，欧洲专利第0，194，276Bl号；Winter,美国专利第5,225,539号；Winter,欧洲专利第0,239,400Bl号;Padlan,E.A.等，欧洲专利申请第0,519,596Al号；Queen等(1989)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,vol86:10029-10033)。术语"双特异性抗体"可以指对于至少两个不同表位具有结合性能的抗体、或单克隆抗体。在一种实施方式中，表位来自相同抗原。在另一种实施方式中，表位来自两个不同的抗原。用于制备双特异性抗体的方法在本一支术领域是已知的。例如，可以利用两个免疫球蛋白重链/轻链对的同时表达来重组产生双特异性抗体。可替换地，可以利用化学键合来制备双特异性抗体。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。术语"异源共轭抗体"可以指两个共〗介连4妄的抗体。可以利用合成蛋白质化学中已知的方法来制备上述抗体，包括使用交联剂。如在本文中所l吏用的，术语"共辄物"是指通过一个或多个抗体片^殳或结合部分共^介附着于一个或多个多聚体分子所形成的分子。术语"生物活性的"是指抗体或抗体片段，其能够结合所期望的表位并且以某种方式施加生物岁文应。生物效应包括^f旦不限于生长信号的调节、抗凋亡信号的调节、凋亡信号的调节、效应子功能级耳关反应的调节、以及其它配体相互作用的调节。术语"重组DNA"是指核酸和乂人其表达的基因产物，其已由人加以-没计、产生、或<奮饰。"重组，，多肽或蛋白质是通过重组DNA4支术产生的多肽或蛋白质，例如，乂人通过编石马所期望多肽或蛋白质的外源性DNA构成物加以转化的细胞。"合成"多肽或蛋白质是那些通过化学合成制备的多肽或蛋白质。术语"表达框"是指核苦酸分子，其能够在与序列相容的宿主中影响结构基因(即，蛋白质编码序列，如本发明的抗体)的表达。表达框包括至少一个启动子，其可操作连接于多肽编码序列，以及可选地可才喿作连接于其它序列，例如，转录终止信号。还可以使用进4亍表达所必要的或有助于表达的其他调节元件，例如，增强子。因此，表达框包括质粒、表达性载体、重组病毒、任何形式的重组"棵DNA"载体等。抗体的来源并不限于本文说明的那些来源(例如，鼠和人源化鼠抗体)。可以在许多物种中产生抗体，上述物种包括哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、骆驼、牛、山羊、马、豚鼠、仓鼠、绵羊以及兔)和鸟类(鸭、鸡)。产生的抗体可以衍生自来自动物(其中它们产生)的不同物种。例如，XenoMouseTM(Abgenix,Inc.,FremontCA)产生全人单克隆抗体。对于某些目的来说，可以使用天然人抗体，如S1P的自身抗体，其分离自可以显示出一定凌丈价的上述S1P自身抗体的个体。可^^4奐地，人抗体序列文库可以用来产生包含人序列的抗体。2.应用本发明涉及用于治疗或预防某些疾病和病症的组合物和方法，其中利用一种或多种治疗剂，其改变一种或多种不希望的生物活性脂质、或其前体或代i射物的活性或浓度。本发明的治疗方法和组合物是通过改变有效浓度，即，某些不希望的生物活性脂质的绝对、相对、有效和/或可用浓度和/或活性，来起作用。降低生物活性脂质的有效浓度可以说成是"中和，，耙脂质或其不希望的效应，包括下游效应。在这里，"不希望的，，是指生物活性脂质，其由于涉及疾病过程(例如，作为信号分子)而是有害的，或由于有害量的生物活性脂质，当过量存在时其有助于疾病。不希望受限于任何特定理论，认为不适当浓度的S1P和/或其^R:射物或下游岁丈应子可以引起或有助于各种疾病或病症的发展。因jt匕，上述纟且合物和方法可以用来治疗这些疾病或病症，尤其是通过降低特定靶脂质，例如，S1P或其变体，的有效体内浓度。尤其是，认为，本发明的组合物和方法可用于治疗至少部分地具有以下特征的疾病异常的新血管形成、血管发生、纤维发生、纤维化、疤痕、炎症、以及免疫应答。下面描述4姿照本发明可以治疗的若干类疾病的实例。应当明了，许多疾病和病症至少部分地具有多种病理性过程的特4正(例如，病理性新血管形成和症痕)并且本文^是供了分类是为了描述方便而不是限制本发明。S1P和高增生'性病症本发明的一个方面涉及用于治疗高增生性病症的方法。这些方法包括给予已知或怀疑患有S1P相关高增生病症的哺乳动物(例如，牛、犬、马、绵羊、或猪动物，尤其是人)治疗有效量的优选在药用或兽医用载体(当所期望的用途可能需要时)中的组合物，该组合物包含干护匸S1P活性的制剂。S1P相关高增生病症包括瘤形成、与64内皮细月包增殖有关的病症、以及与纤维发生有关的病症。最常见;也，瘤形成将是癌症。与内皮细胞增殖有关的典型病症是血管发生相关病症，例如，由实体肿瘤、血液肿瘤、以及年龄相关性黄J迕变性引起的癌症。与纤维发生有关的病症包括那些涉及异常心脏重塑的病症，如心力衰竭。存在许多已知的高增生病症，其中各种组织和器官的细胞呈现生长、增殖、迁移、信号、衰老、以及死亡的异常才莫式。虽然已开创了许多治疗方法来治疗这些疾病中的一些，但许多疾病仍然在很大程度上是不能用现有技术治疗的，而在其它情况下，虽然在治疗中有效的，但它们经常不是最佳的并且很少能治愈。癌症也许是最广泛i人识的一类高增生病症。癌症是-皮坏性类型的疾病，并且它们一起具有^又次于心血管疾病的死亡率。^午多种癌症并没有在分子水平上充分理解。因此，癌症是美国政府和制药公司的研究和开发计划的主要工作重点。结果是空前的R&D努力以及许多有〗介值治疗剂的生产以帮助4氐抗癌症。不幸的是，许多癌症研究还没有足以克服由癌症引起的显著损伤。《叉在美国，每年"^断有一百万以上的癌症新病例并且有五十万以上的死亡。这显著地说明，即使已进行了巨大努力来发现癌症的新疗法，但抵抗疾病的有效治疗剂仍然是难以捉摸的。目前主要用三种疗法(外科手术、》丈射治疗、以及化疗)之一或组合来治疗癌症。外科手术涉及大量除去病变组织。虽然外科手术有时可有效除去位于某些部位(例如，胸部、结肠、以及皮肤)的肿瘤，但它不能用于治疗位于其它区域(如脊柱)的肿瘤，也不能用于治疗弥散性胂瘤性病症如白血病。放射治疗涉及将活组织暴露于电离辐射，其引起所暴露细胞的死亡或损伤。i文射治疗的副作用可以是急性的和临时的，虽然其它副作用可以是不可逆的。化疗涉及细胞复制或细胞代谢的破坏。其他的危害是目前的治疗剂通过涉及对患者而言明显的缺点(毒性以及严重的副作用)。因此，许多专家小组最近已开始寻找新方式来4氏抗癌症。这些新的所谓的"创新疗法"包括基因治疗和治疗性蛋白如单克隆抗体。在临床上首次用于治疗癌症的单克隆抗体是于1997年提出的Rituxan(利妥昔单抗)，并且已i正明生物特异性单克隆抗体可用作治疗剂。因j):匕，并不意外i也，其后已i人可16种其它单克隆*元体用于临床，其中包4舌6种用于治疗癌症。这些产品的成功，以及和小分子相比，开发单克隆抗体的减少的成本和时间，已使得单克隆抗体治疗成为小分子以后的第二最大类型的药物候选物。另外，与小分子疗法相比，就效力和毒性而言，抗体的灵敏的特异性已证明是一个主要优点。〗又对于癌症来"i兌，目前有270项以上的工业抗体R&D计划，其中50家以上的乂>司参与开发新的癌症抗体治疗。因此，单克隆抗体随时准备着成为治疗癌症的主要角色并且估计它们将获得越来越大的癌症治疗市场的份额。促进肿瘤生长和存活的细胞外介质的鉴定是发现治疗性干预的关4建步骤，其中治疗性干预将降低癌症的发病率和死亡率。如下所述，鞘氨醇-l-磷酸(SlP)，鞘脂信号级联放大的一种关4建成分，被认为是多效的、致癌的生长因子。通过刺激细胞增殖、细胞存活以及转移，S1P可促进肿瘤生长。通过支持内皮细胞的迁移和存活(当它们在肿瘤内形成新血管时)，S1P还促进肿瘤血管发生。总的来说，S1P引发增生、促血管再生、以及抗凋亡事件，其有助于癌症进展。因此，调节，尤其是降低体内S1P水平的疗法将有效治疗癌症。研究表明，鞘氨醇激酶(SPHK)是一种最近证实的癌基因，该癌基因产生一种细胞外鞘脂信号分子，促进肿瘤生长的鞘氨醇-l-石粦酸(S1P)。与肿瘤细月包增殖和转移有关SIP的生长因子作用、以及SIP的促血管再生效应会直4妻和间接地促进肿瘤生长。本发明申请人已产生了一种生物特异性单克隆抗S1P抗体(抗SlPmAb),其可以用作治疗性分子海绵来选4奪性地吸收S1P，乂人而降〗氐肿瘤生长因子的胞外浓度，并预计减小肿瘤容积和转移潜能并同时阻断新血管形成，否则会给养生长中的肿瘤。上述分子吸收概念的预计的成功将是治疗癌症的创新方式。如以下,殳落将i兌明的，本发明的申"i青人已开发了一种mAb,其抵抗一种重要的肿瘤生长因子，鞘氨醇-l-磷酸(S1P)。本发明的申请人相信，这种抗体可以有效降低与许多癌症类型有关的增殖、转移潜能以及血管发生，从而降低一般的癌症以及伴随上述疾病的肿瘤血管发生。鞘磷脂酶(nSMase)的中性形式是鞘脂信号通路的关键早期成分(Chatterjee,Adv.LipidRes.26:25-46,1993;Liu,Obein,andHan薩，Semin.CellDev.Biol.8:311-322,1997)。nSMase仅是已鉴定的至少5类SMase之一，其包括石威性的、酸性的、酸性锌依赖性的、中性4美依赖性的、以及与中性4美无关的(Liu，Obein,andHannun，Semin.CellDev.Biol.8:311-322,1997)。nSMase类通常与表面膜有关(Das,Cook,andSpence，BiochimBiophysActa777:339-342,1984;Dobrowsky,CellSignal12:81-90，2000)并且可以由各种刺激来激活以引起凋亡，如促炎细胞因子、肿瘤坏死因子ot(TNFa)(Segui,etal,J.Clin.Invest.108:143-151，2001)、T细胞受体(Tonnetti,etal.，J.Exp.Med189:1581-1589,1999)、电离辐射(Haimovitz-Friedman，etal.，J.Exp.Med180:525-535，1994)以及蒽3不霉素4元月中瘤药(Andrieu國Abadie，etal"FASEBJ.13:1501-1510,1999)。在许多细月包类型中，包4舌癌细月包系(Andrieu-Abadie,etal.,FASEBJ.13:1501-1510,1999;HamumandObein,TrendsinBiol.Sci.20:72-76，1995;Kolesnick，trendsBiochemSci24:224-5,1999;Obeid，etal"Science259:1769-1771，1993)、肺瘤坏死因子ot(TNFa)是众所周知的nSMase(Adam，etal"J.BioChem271:14617-14622,1996;Dressier,Mathias，andKolesnick,Science255:1715-1718,1992;Kim,etal"J.Biol.Chem.266:1:484-489,1991;Kronke，ChemPhysLipids102:157-66.,1999;YanagaandWatson，FEBSLetters314:297-300,1992)、CER生产(Kronke,ChemPhysLipids102:157-66.,1999)以及凋亡(RathandAggarwal,J.Clin.Immimo.19:350-364,1999;Robaye，etal"AmJPathol138:447-453，1991;Takedaetal"Int.Immunol.5:691-694，1993)的激活剂，并且已表明nSMase的激活对于TNFa诱导凋亡是关键的(Luberto,etal"J.Biol.Chem.277:41128-41139，2002;Segui，etal"J.Clin.Invest.108:143-151，2001)。因jt匕，nSMase也已成为药4勿研发的目才示(WascholowskiandGiannis，DrugNewsPerspect.14:581-90,2001)。通过鞘氨醇激酶(SPHK)的作用，由SPH产生鞘脂信号分子，S1P。已鉴定了上述酶的两种亚型，SPHK1和SPHK2(Liu,JBiolChem275:19513-20,2000;Nava，etal,ExpCellRes281:115-127，2002)。虽然CER和SPH通常与凋亡有关，但相反地SIP是细胞增殖和生存途径激活的介质(An,AnnNYAcadSci905:25-33,2000;Maceyka,etal"BBA1585:193-201，2002;Zhang，etal"J.CellBiol.114:155-167,1991)。最近已明了它作为一种细胞外介质，可以激活属于S1P/LPA受体家族的一组G蛋白耦联受体(GPCR),以前称作Edg受体(An,AnnNYAcadSci905:25-33,2000;An,Goetzl,andLee，J.cellbiochem30/31:147-157，1998;Lee,etal.，Science279:1552-1555,1998;Okamoto,etal"Biochem.Biophys.Res.Commun.260:203-208，1999);然而，也已指出了SIP的月包内作用(VanBrocklyn，etal.,J.CellBiol.142:229-240,1998)。jt匕夕卜，已4是示，CER/SPH水平与SIP之间的平纟軒可4是供一种可调才几制，其决定细胞被送入死亡通路或免于凋亡(Kwon，etal"JBiolChem276:6810627-10633，2001;Maceyka,etal.,BBA1585:193-201，2002;Pyne，BiochemJ.349:385-402,2000)。可调机制的关4建调节酶是SPHK,其作用是将促进死亡的鞘脂(CER/SPH)转化成促进生长的S1P。首次提出SPHK作为癌基因的划时代的研究由来自阿德莱德(Adelaide)的小组发表，其证明了用激酶稳定转染的NIH-3T3成纤维细力包呈现增强的细力包增殖并〗半随增加的S1P产生(VadasandGamble,Circ.Res.79:1216-1217,1996;Xiaetal"CurrBiol10:1527-1530，2000)。此夕卜，SPHK过表达逃逸的接触抑制，一种由转化细胞通常呈现的性能。此观测结果与最近的报道一致，该报道表明S1P可增强所选人癌细胞系的转移潜能(Igarashi,Ann.N.Y.Acad.Sci.845:19-31，1998;Takuwa，BiochimBiophysActa.1582:112-120,2002)。此外，当皮下注入NOD/SCID小鼠中时，转染子产生肺瘤。在一项研究中最近i正实了这些结果，该研究表明腹腔内给予SPHK的小分子抑制剂可以使接受皮下注射JC乳腺腺癌细胞的SCID小鼠体内的月中瘤容积减小(French,etal,CancerRes63:5962-5969,2003)。显著地，SPHK可以是新的致癌基因的观点由以下发现得以巩固SPHK在许多实体肿瘤中被过表达，如胸部、结肠、肺脏、卵巢、胃、子宫、肾、以及直肠的那些实体肿瘤(Frenchetal.(2003),上文)。此外，已证明，当用SPHK小分子抑制剂治疗时若干人肺瘤源性细力包系可以#1驱动到凋亡，并且可以通过它们降低S1P水平的能力来说明它们的有效性。总的来说，这些发现证明了一种重要的观点SIP是可能由肿瘤细胞本身产生的生长因子，以及降低SIP的浓度可以引起在生长因子撤除后所观测到的凋亡。SIP和肿瘤血管发生血管发生是一种过程，借助于该过程新血管形成自存在的脉管系统。血管发生在若干生理过程中具有关4建作用并且与各种病症(包括肿瘤生长、侵袭以及转移)的发病机制有关。与实体和循环肺瘤有关的血管发生过程(肺瘤血管发生)被认为是肿瘤发生和疾病发展的关键组成部分，其中与非癌性细胞相比，新血管为肿瘤细月包才是供生长优势。因此，对于治疗癌症和其它血管发生相关性疾病来说，血管发生的临床控制是关键组成部分。抗血管形成治疗是人们特别关注的，因为血管内皮细胞(EC)并不和癌细胞一样容易突变；因此与癌细胞相比，EC获得对长期治疗的抗性的可能更小，/人而4吏它们成为治疗的良好的;昝在目标。若干生长因子与癌性血管发生有关。研究发现，生物脂鞘氨醇-l-磷酸(SIP)是对于癌症来说重要的许多细胞过程的介质。作为G蛋白耦联受体家族的特异性配体(称作SlPw)而施加其大部分效应。这些受体调节血管发生和血管成熟、细力包运动、以及'淋巴细月包运输。与S1P相反，S1P的前体，鞘氨醇和神经酰胺，与生长停滞和凋亡有关。最后，在S1P和其它促血管再生生长因子(如VEGF、EGF、PDGF、bFGF以及IL-8)之间存在复杂的通讯。通过结合于受体SlPpS1P反式激活生长因子受体酪氨酸激酶，如在VEGFR、EGFR、以及PDGFR上发现的生长因子受体酪氨酸激酶。S1P在血管发生相关性肿瘤中的重要性使得S1P成为癌症治疗的特定目标。基于这些观测结果，用来中和胞外S1P的抗体方式可以导致在人类中癌症发展的显著降低，这是由于血管形成的抑制以及支持肿瘤生长所需要的营养物和氧的伴随损失。此外，最近的研究指出，许多血管发生抑制剂还可以作为还能够有助于緩解癌症扩散到远离最初肿瘤的部位的抗4曼袭和反转移化合物。涉及S1P作为最有效的促血管再生剂之一的最近的证据来自直接比较S1P与制剂如VEGF和bFGF的研究。S1P刺激人静脉内皮细胞(HUVEC)的DNA合成和趋化能动性，同时诱导多细胞结构的分化，所有这些都暗示了S1P在早期血管形成中的作用(Argraves,etal.，2004;Leeetal.,1999;Liu，etal"2000)。jt匕夕卜，S1P促进骨髓源性EC前体迁移到新血管形成部位(Annabi,etal.,2003))。过表达SIP!的细胞对抗血管形成剂沙利度胺和新伐司他具有4元斗生(Annabietal.,2003)。ot匕夕卜，已i正曰月，在S1P和其它促血管再生生长因子(3口VEGF、EGF、PDGF、bFGF以及IL-8)之间存在显著的通ifl。侈'W口，S1P反式5致5舌EGF(Shida，eta1.，2004)和VEGF2受体(Spiegel&Milstien,2003)，以及VEGF正调节SlPi受体表达(Igarashi，etal.，2003)。l匕夕卜，4昔Ji力于S1P!和"VEGF轴"起作用的S1P是下月支血管发生和新血管形成所需要的(Chae,etal.,2004)。最近FDA批准的抗血管形成药，贝伐单抗(Avastin⑧，Genentech)，作为细胞毒性化疗的添加剂来治疗结肠癌，治疗癌症的抗血管形成方式已获得很大进展。最近开发了抗SlP小鼠MAb，LT1002,其对于S1P具有高结合亲和力和特异性。研究表明，在人癌症的若干动物模型中LT1002可显著放慢胂瘤发展和伴随的血管发生。此外，在年龄相关性黄斑变性(AMD)的血管发生的既定模型中，LT1002减弱脉络膜新血管形成(CNV)病变形成。CNV发生在其中存在布鲁赫膜和视网月莫色素上皮的异常的疾病中。这种类型的最常见疾病是AMD，在老年患者中严重视力丧失的最常见的原因。这些结果表明，LT1002具有若干作用机制，包括(1)对肿瘤细胞生长的直接影响，(2)对血管内皮细月包的间^妻抗血管生成效应，以及(3)防止其它促血管再生生长因子释方文和作用的间*接抗血管形成效应。S1P有助于胂瘤血管发生的最直接的体内证据来自我们最近的集中于小鼠单克隆抗体(mAb)的出片反物，其中，通过分子p及收，小鼠单克隆抗体(mAb)用来中和胞外S1P(Visentin,etal.，2006)。在利用HUVEC进行的各种体外测定中，抗S1PmAb中和管形成、血管内皮细胞的迁移以及4吏细胞免于死亡的保护，其中的每一种都是SIP诱导的。SIP增加新的毛细血管生长进入植入小鼠体内的基质才全(Matrigel^全)，一种通过系统纟会予4元S1PmAb力口以中和的#丈应。在鼠Matrigel栓子试验中，上述mAb基本上中和bFGF诱导以及VEGF诱导的血管发生，并且抗体緩和的S1P刺激体外和体内从肿瘤细胞释》文促血管再生细胞因子(VEGF、IL-8、IL-6)。重要的是，在用抗SlPmAb进行治疗的情况下，用位于同位的人癌细胞异种拼接的小鼠呈现肿瘤进展的显著迟緩。这在人乳腺癌、卵巢癌以及肺癌的小鼠模型中以及在小鼠黑素瘤一种同种异体拼接模型中得到证明(Visentin，etal.，2006)。用单克隆抗体(mAb)来治疗性治疗各种疾病和病症正快速增加，这是因为它们已显示出是安全且有效的治疗剂。认可的治疗性mAb包4舌Avastin⑧、Erbitux⑧、以及Rituxan⑧。另夕卜的mAb处于针对各种疾病的临床开发的不同阶段，其中大多数靶向各种形式的癌症。通常，在非人哺乳动物中产生单克隆抗体。然而，鼠单克隆抗体的治疗效用是有限的，主要由于以下事实病人利用(mount)他们自身对鼠抗体的抗体反应。这种反应，所谓的HAMA(人抗鼠抗体)反应，导致鼠mAb的最终中和和迅速消除。通过开发称作鼠抗体的"人源化"方法已克服了这种限制。人源化大大地减轻了相对于给予的治疗性mAb的免疫应答的发展，乂人而避免因HAMA而引起的半衰期的缩短和治疗效力的降低。在大多数情况下，人源化方法包4舌将鼠互补决定区(CDR)4并*接到人免疫3求蛋白的骨架区(FR)。这种策略称作"CDR拼接"。在人FR中的所选残基"回复突变"到小鼠氨基酸残基是经常需要的以恢复在最初拼接构造物中丧失的亲和力。mAb的制造是一个复杂过程，其起因于蛋白质本身的变异性。mAb的变异性可以净皮局限于蛋白质主链和/或石灰水化合物部分。异质性可以归因于可替换的二疏4建配对的形成、脱酰胺和异天冬氨酰残基的形成、蛋氨酸和半胱氨酸氧化作用、N端谷氨酰胺残基环化成焦谷氨酸以及通过哺乳动物羧肽酶的C端赖氨酸的部分酶裂解。通常对抗体分子进行设计以改善它们的性能，如增强的稳定性、对蛋白酶的抗性、聚集行为，以及增强在异源系统中的表达水平。在本文中，描述了小鼠MAb相对于S1P的人源化。总策略包括将来自LT1002的6个CDR拼接到人骨架。进一步的修饰用来进一步完善和优化抗体性能。人源化MAb呈现和LT1002相同的特性，因此适用于在临床试验中进行试验。S1P和纤维4匕在响应细胞损伤和炎症的瘢痕形成中，成纤维细胞，尤其是肌成纤维细胞，是关4建细胞元件[Tomasek，etal.(2002),NatRevMolCellBiol,vol3:349-63，以及ViragandMurry(2003)，AmJPathol，vol163:2433-40]。通过肌成纤维细胞的胶原基因表达是重建标志并且是瘢痕形成所还需要的[SunandWeber(2000),CardiovascRes,vol46:250-6，以及SunandWeber(1996),JMolCellCardiol,vol28:851-8]。通过激活成纤维细"包迁移和增殖同时增加"交原生产，SIP可以促进伤口愈合[Sun,etal.(1994)，JBiolChem,vol269:16512-7]。由受损细力包局部产生的SIP可能是与重建和瘢痕形成有关的不适当伤口愈合的原因。因此i人为，SIP抑制剂可用于治疗至少部分地特4正为异常的纤维发生或纤维化的疾病或病症。在本文中，"纤维发生，，#1定义为成纤维细^>的过度活性或过多凄1目，以及"纤维化"被定义为过度活性或过多数目的成纤维细胞，其导致过度或不适当的"交原生产和疤痕、生理组织结构的》皮坏和/或基质的不适当收缩，其引起这样的病理特征如视网膜脱落或导致损害器官功能的其它过程。SIP和成纤维细胞胶原表达SIP促进休眠成纤维细胞分化成活性肌成纤维细胞，其在瘢痕形成期间呈现增强的胶原表达[Umta,etal.(2005)，KobeJMedSci，vol51:17-27]。成纤维细胞增殖和迁移到疤痕区的同时，肌成纤维细胞沉积主要由骨桥蛋白和纤连蛋白构成的临日寸茅贞斗立网纟各[SunandWeber(2000)，CardiovascRes,vol46:250-6]。当重建进行时，临时基质被吸收并建立起胶原网络[SunandWeber(2000),CardiovascRes，vol46:250-6]。我们已i正明了，SIP促进通过肌成纤维细胞的胶原生产。已表明，TGFp,—种众所周知的纤维变性介质，正调节若干促纤维化蛋白、将成纤维细胞转化成肌成纤维细胞以及刺激炎性蛋白表达(可能通过SIP的作用)[Squires,etal.(2005)，JMolCellCardiol，vol39:699-707以及Butt，LaurentandBishop(1995),EurJCellBiol,vol68:330-5]。TIMP1(与将成纤维细力包TGFp刺激分化成力几成纤维细力包有关的一种信号分子)的正调节^皮4十对SPHK1的siRNA阻断[Yamanaka,etal"JBiolChem.2004Dec24;279(52):53994-4001],这^是示抗SIP抗体的人源化变体可以i爰解TGFP的促纤维化效应以及纟爰和SIP本身的纤维发生岁文应。将不适当^痕降低到最小程度被认为可用于治疗纤维变性性疾病和病症，包括]旦不限于眼和心血管疾病、伤口愈合、以及石更皮病。用于治疗》更皮病的抗SIP抗体本发明的组合物和方法将可以用于治疗这样的病症和疾病，其至少部分地特征为异常的新血管形成、血管发生、纤维发生、纤维化、疤痕、炎症、以及免疫应答。一种这样的疾病是硬皮病，其还称作系统性硬/化病。74石更皮病是一种自身免疫病，其引起疤痕或皮月夫增厚，并且有时涉及身体的其它区域，包括肺脏、心脏、和/或肾。石更皮病的特4正在于在身体的皮肤和器官中形成瘢痕组织(纤维化)，其可以导致所涉及区域的增厚和坚实，以及随之发生的功能降低。4艮据美国硬皮病基金会(SclerodermaFoundation)的统计数据，目前有约300,000美国人患有-更皮病。三分之一或更少的受感染的患者患有普遍疾病，而其余的三分之二主要具有皮肤症状。当该疾病侵袭肺脏并引起疤痕时，呼吸可能会受到限制，这是因为肺脏不再能如它们应该的那样进行扩张。为了测量肺活量，医生使用了一种用来估计用力肺活量(FVC)的装置。在FVC小于50%的预期的人群中，起因于石更皮病相关的肺部疾病的10年死亡率为约42%。死亡率如此高的一个原因是目前没有有效的治疗方法。如在本申请的实施例中所描述的，现有证据表明，S1P是一种促纤维化生长因子，其可以有助于成纤维细胞激活、增殖、以及增加的与不适当症痕和重建有关的成纤维细胞活性。此外，已证明了S1P在皮月夫和其它类型成纤维细月包的活性中的潜在作用。例如，已表明，生物活性脂质可刺激鼠皮肤成纤维细胞的迁移(Hama,etal,JBiolChem.2004Apr23;279(17):17634-9),以及人皮月夫成纤维细月包表达若干SIP受体亚型(Zhang,etal.，Blood.1999Mayl;93(9):2984-90)。除SIP对成纤维细胞活性的许多直接影响之外，SIP还可以具有对成纤维细l包活性的许多潜在的间4妄影响。例如，SIP可以促进其它众所周知的促纤维化因子的作用，如TGF-P和血小板衍生生长因子(PDGF)。TGF-J3是纤维化的最广泛研究和识别的促成因素之一(Desmouliere,etal.,/Ce〃122:103-111，1993)。TGF-卩正调节SphKl表达和活'性，导致金属蛋白酶1(TIMP-1)的组织抑制剂的表达增加，金属蛋白酶1(TIMP-1)是一种抑制ECM降解的蛋白质(Yamanaka，etal.，/5/o/CTzew279:53994-54001,2004)。TIMP-1的表达增加与心力衰竭患者的间质纤维化和舒张功能不全有关(Heymans,etal,AmJ/^Ao/166:15-25,2005)。相反地，S1P刺激TGF画(3的表达和释》文(Norata，etal.,CV"w/"/,'ow111:2805-2811,2005)。还存在S1P和PDGF之间交互作用的不同证据。S1P直接刺激PDGF的表达(Usui，etal,/C/zem279:12300-12311,2004)。此外，SlPi受体和PDGF受体彼此结合并且它们的締合是下游信号的PDGF激活所必须的，其中下游4言号有助于各种细力包类型的增殖和迁移(Long,etal.，/Vostag/amZ/m1(9AerZ^/iMWaZ80:74-80,2006;Baudhuinetal"FasebJ18:341-343,2004)。因ot匕，TGF-p和PDGF只t纟千纟lM匕的f》响可以部分地起因于与S1P信号通3各的交互作用。因此，本发明的组合物和方法可以用来治疗石更皮病，尤其通过降^f氐特定草巴脂质(例如S1P)的有岁丈体内浓度用来治疗石更皮病。人们认为相对于PDGF受体的刺激性自身抗体会加剧系统性硬皮病(Baroni，etal"NEnglJMed.2006v354(25):2667-76)，并且在硬皮病成纤维细胞响应TGF-j3中，PDGF受体被正调节(Yamakage，etal.，JExpMed.1992Mayl;175(5):1227-34)。由于SIP、PDGF以及TGF-P信号系统之间显著的交互作用，用抗S1P剂(例如，抗SIPmAb)阻断SIP生物活性可以间接緩和PDGF和TGF-j3的促石更化效应。此夕卜，用这4羊的抗SIP剂进行治疗可以有益于硬皮病患者，其中通过S爰和S1P》十皮肤和其它形成的成纤维细月包(其有助于疾病进展)的直接影响。SIP和目艮部疾病以及病症病理性或异常的血管发生/新血管形成、异常的重建、纤维化和疱痕以及炎症的发生伴有视网膜和眼部疾病，如年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性^L网膜病(DR)、以及早产儿视网膜病(ROP)和其它发育障石寻[Eichler，etal.(2006),CurrPharmDes,vol12:2645-60]，并且是眼部感染和机械损伤的结果[Ciulla,etal.(2001),CurrOpinOphthalmol,vol12:442-9以及Dartetal(2003),Eye,vol17:886-92]。人们认为，针对SIP的抗体将可用于治疗这样的眼部疾病，其中病理性或异常的血管发生/新血管形成、异常的重建、纤维化、以及疱痕或炎症是组成部分。眼部的血管发生/新血管形成在各种临床病症中，病理性眼血管发生是失明的主要原因。脉络膜新血管形成(CNV)发生在许多眼部疾病中，其中最常见的是、渗出性或"湿，，形式的AMD。由于老年人口增加，在西方国家的60岁以上的患者中，AMD是一种现代流行病并且是失明的主要原因。尽管由AMD引起的流行的视力减退，但仅有几种疗法，大部分是基于抗VEGF,可以放缓AMD的发展并且仅有甚至更少的疗法可以逆寿争^L力减退[BylsmaandGuymer(2005),ClinExpOptom,.vol88:322-34,Gryziewicz(2005)，AdvDrugDelivRev，vol57:2092-8,以及LiuandRegillo(2004)，CurrOpinOphthalmol,vol15:221-6]。因此，研发用于病理性新血管形成的新治疗方法是非常重要的。在描述与异常的血管发生/新血管形成、异常的重建、纤维化和宛痕、以及炎症有关的眼病症中，本文中的AMD仅用于说明的目的，上述病症存在于其它眼部疾病和病症中(如本文中4皮露的并要求夂f呆护的)。AMD涉及年龄相关病理性变4匕[Tezel，Bora，andKaplan(2004),TrendsMolMed,vol10:417-20以及Zarbin(2004)，ArchOphthalmol,122:598-614]。尽管存在多种理论，《旦AMD的确切病因和发病^L制仍然不十分明了。老化与累积性氧化损伤、布鲁赫膜增厚以及玻璃疣形成有关。氧化应激导致对视网膜色素上皮(RPE)细胞并且在某些情况下导致对脉络膜毛细血管层的损伤[Zarbin(2004)，ArchOphthalmol,vol122:598-614，以及Gorin,etal.(1999),MolVis,,vol5:29]。对RPE的损伤可能在布鲁赫膜和脉络膜内诱发寸曼性炎性应答[Johnsonetal.(2000)，ExpEyeRes，，vol70:441-9]。通过刺激CNV和萎缩，这种损伤和炎症会助长并增强(potentate)一见网月莫损伤[Zarbin(2004),ArchOphthalmol,vol122:598-614，以及Witmer,etal.(2003),ProgRetinEyeRes,vol22:1-29〗。CNV导致缺损和、渗漏的血管(BV)，其可能一皮识别为伤口[KentandSheridan(2003),MolVis，vol9:747-55]。伤口愈合源于脉络膜并通过布鲁赫膜和RPE侵入视网膜下腔。伤口愈合反应的特征在于典型的早期炎性应答，显著的血管源性应答以及组织形成，接着是所有参与要素的终末期成熟。伤口重建会不可逆地损害光感受器和RPE，/人而i正明需要用比抗血管形成疗法更多的疗法来治疗CNV[LaCour，Kiilgaard，andNissen(2002),DrugsAging,vol19:101-33.12]。由CNV相关纤维化、水胂以及炎症(单独地或累加地)所引起的正常视网膜和视网膜下结构的改变导致AMD相关^L觉丧失[TezelandKaplan(2004),TrendsMolMed，vol10:417-20，以及Ambati,etal.(2003),SurvOphthalmol,vol48:257-93]。与渗出性AMD有关的多种细胞和细胞因子相互作用使有效治疗方法的寻找更加复杂化。虽然通过抗VEGF疗法可以部分地控制CNV和7jc肿，^旦还没有适当地4是出可能的治疗方法来1￡和瘢痕形成和炎症[BylsmaandGuymer(2005)，ClinExpOptom，vol88:322-34，以及Pauleikhoff(2005),Retina,vol25:1065-84]。只要新生血管复合体仍然是完整的，如在用抗VEGF剂治疗的患者中似乎就是这种情况，视网膜下纤维化和未来的视力减退的潜力就会持续。抗VEGF-A疗法是治疗渗出性AMD的最近的显著的进展。然而，用哌加他尼(PEGAPTANIB)(—种高亲合力适体，其选择性地抑制VEGF-A的165亚型)进行的第三阶段视觉试验证明，一般患者会继续丧失视力而仅少部分患者获得了视觉[Gragoudas，etal.(2004)，NEnglJMed,vol351:2805-16]。用抗体片段78RANIBIZUMAB抑制VEGF-A的所有亚型(全VEGF抑制)产生了令人印象更为深刻的结果[Brown，etal.,NEngMed(2006),vol.355:1432-44，Rosenfeld，etal.NEngJMed(2006)，vol.355:1419-31]。2年MARINA试-验和1年ANCHOR试-验i正明，大约40%的患者获得一些一见力增加。虽然这些结果表示在我们治疗^l^出性AMD的能力方面的较大进展，但这也证明了60%的患者并没有视力改善。此外，这些患者必须满足严格规定的选择标准和淘汰标准。在更大患者群体中的结果不那么有效。仍然存在意义明确的需要来开发靶向CNV发展中的其它步骤以及最终导致光感受器破坏过程的其他治疗剂。首先，脉络膜BV的生长涉及许多介质(并不只是VEGF)之间的协调的相互作用，这提供了一种调节或抑制整个过程的机会[Gragoudas，etal.(2004),NEnglJMed，vol351:2805-16]。其次，渗出性AMD由血管成分和血管外成分组成。血管成分涉及血管内皮细胞(EC)、EC前体以及周细胞。容积上似乎是最大成分的血管外成分由炎性细胞、神经胶质细胞、以及4见网膜色素上皮(RPE)细胞和成纤维细胞组成。组织损伤可以起因于4壬4可一种成分。目前的抗VEGF治疗并没有着眼于病理过禾呈的这些其它方面。輩巴向与AMD有关的生血管级联反应的另外的要素可以提供一种更有效和协同的治疗方式[Spaide，RF(2006)，AmJOphthalmol,vol141:149-156]。目艮部疾病中的炎症越来越多的证据表明，炎症，具体地说巨噬细胞和补体系统[Klein，etal.(2005),Science,vol308:385-9;以及Hageman，etal.(2005),ProcNatlAcadSciUSA,vol102:7227-32]在渗出性AMD的发病机制中具有重要作用。手术切除的脉络膜新生血管膜的组织病理学i正明了巨p藍细月包几乎普遍存在[Grossniklaus，etal.(1994)，Ophthalmology,vol101:1099-111，以及Grossniklaus,etal.(2002),MolVis,vol8:119-26]。越来越多的i正据表明，巨噬细月包可以通过多种步文应在介导CNV形成和增殖中发4军积才及作用[Grossniklaus,etal.(2003)，MolVis,vol8:119-26;Espinosa-Heidmann,etal.(2003),InvestOphthalmolVisSci，vol44:3586-92;Oh，etal.(1999)，InvestOphthalmolVisSci,vol40:1891-8;Cousins,etal.(2004)，ArchOphthalmol,vol122:1013-8;Forrester(2003),NatMed,vol9:1350-1，以及Tsutsumi,etal.(2003),JLeukocBiol，vol74:25-32]0，这些效应包括分泌酶，该酶可以损伤细胞并降解布鲁赫膜以及释放促血管再生细月包因子[Otani,etal.(1999)，OphthalmolVisSci，vol40:1912-20,以及Amin，Puklin,andFrank(1994),InvestOphthalmolVisSci，vol35:3178-88]。在损伤部位，巨噬细胞呈现激活的樣i形态迹象，如脱粒作用[Oh,"(1999)，InvestOphthalmolVisSci,vol40:1891-8,以及Trautmannaa/.(2000)，JPathol，vol190:100-6]。因此，认为限制巨噬细胞浸润进入脉络膜新生血管复合体的分子可以有助于限制CNV形成。在眼部疾病中的脉络膜新血管形成和血管成熟血管发生是正常伤口愈合的必不可少的组成部分，因为它将氧和营养物质递送到炎性细胞并帮助碎片清除[Lingen(2001),ArchPatholLabMed，vol125:67-71]。进行性血管发生由两种不同的过程组成阶_歐1:响应附近刺^t,血管EC迁移到毛细血管的尖端，在这里它们增殖并形成腔结构；以及阶段II:修剪血管网络和优化脉管系统[Guo,etal.(2003),AmJPathol,vol162:1083-93]。阶段I:新血管形成。血管发生通常有助于伤口愈合。然而，当新血管不受4空制时，则通常是缺损的并会加剧、渗漏、出血、以及炎症。已证明通过靶向促血管再生GF来减少失调的和渗漏的BV具有一定的放緩AMD发展的能力[Pauleikhoff(2005),Retina,vol25:1065-84.14,以及糧Wijngaarden，Coster,andWilliams(2005)，JAMA，vol293:1509-13]。阶革殳II:血管成熟和药物脱4文作用。全-VEGF抑制似乎大部分借助于抗渗作用(其导致一见网膜内和一见网膜下水胂的消退)来发挥其有益^丈应，因为实际CNV病变并没有显著退4b。击夬少显著的CNV退化可以部分地是由于新形成血管的成熟(起因于周细胞覆盖)。周细胞在血管组织的发展和维持中具有关键作用。周细胞的存在似乎贝武予对抗VEGF剂的抗性并减损它们抑制血管发生的能力[BergersandSong(2005)，Neuro-oncol，vol7:452-64;YamagishiandImaizumi(2005)，IntJTissueReact,vol27:125-35;Armulik，AbmmssonandBetsholtz(2005)，CircRes,vol97:512-23;Ishibashietal.(1995)，ArchOphthalmol,vol113:227-31]。只十周细月包募集具有抑制效应的制剂可能会石皮坏血管通道装配和脉络膜新血管通道的成熟，乂人而保全它们对抗血管形成剂的壽文感性。血管网络的重建涉及调节血管(BV)密度以满足营养需要[GarianoandGardner(2005)，Nature,438:960陽6]。BV不成熟期对应于其中新血管发4军作用并还没有获得周细月包涂层的时期[Benjamin，Hemo，andKeshet(1998)，Development,125:1591-8，以及GerhardtandBetsholtz(2003),CellTissueRes，2003.314:15-23]。这种延迟对于提供可塑性窗口是必要的，其中该可塑性窗口用于根据视网膜或脉络膜的营养需要来微调正在发展的脉管系统。生物活性脂质鞘氨醇-l-磷酸(SlP)、VEGF、PDGF、血管生成素(Ang)以及其它生长因子(GF)可增加血管生长并将平滑月几细胞(SMC)和周细胞募集到初生血管，其促进正在形成的血管的重建[AllendeandPraia(2002)，BiochimBiophysActa,vol582:222-7;GarianoandGardner(2005),Nature,vol438:960-6;Grosskreutz,etal.(1999),MicrovascRes,vol58:128-36;Nishishita,andLin(2004),J81CellBiochem，vol91:584-93,以及Erber,etal.(2004),FASEBJ，vol18:338-40.32]。最可能在EC发芽时通过间充质前体的原位分化产生的或产生自动力永平滑力几细胞的迁移和去分化的周细胞紧密地结合并鞘化(ensheath)EC，从而导致总血管成熟和存活[Benjamin,Hemo,andKeshet(1998)，Development,vol125:1591國8]。最近的研究已i正明，S1P、以及S1P1受体，参与细J包表面运输和细月包-细月包教着分子N-钙黏着蛋白的激活[Paik，etal.(2004),GenesDev,vol18:2392-403]。N-4丐凝着蛋白是EC、周细胞和壁细胞之间的相互作用所必要的，该相互作用促进稳定血管床的发展[GerhardtandBetsholtz(2003),CellTissueRes，vol314:15-23]。S1P1基因的整体缺失导致异常的壁细l包鞘化(或包盖，ensheathment)新生BV，其是在胚胎发育期间BV稳定化所需要的[AllendeandPraia(2002)，BiochimBiophysActa,vol1582:222-7]。在胂瘤异种拼接才莫型中，将siRNA局部注射到S1P1可抑制血管稳定化[Chae，etal.(2004),JClinInvest,vol114:1082-9]。转基因鼠研究已i正明，VEGF和PDGF-B可促进#斤BV的成fl;和牙急定[Guo,etal.(2003)，AmJPathol,162:1083-93,以及GarianoandGardner(2005)，Nature,vol438:960-6.50〗。VEGF正调节Ang-l(mRNA和蛋白质)[Asahara,etal.(1998)，CircRes，vol83:233-40]。Ang-1在由周细月包募集和维持周围的血管内皮载体中发4军主要作用[Asaham,etal.(1998),CircRes,vol83:233-40]。目艮内注射VEGF加速了EC丛的周细月包覆盖[Benjamin,Hemo,andKeshet(1998)，Development,vol125:1591-8]。PDGF隱B缺陷小鼠胚胎缺少微血管周细胞，这会导致水肿、孩史动脉瘤以及致命性出血[Lindahl，etal.(1997),Science,vol277:242-5]。鼠产前研究已证明，为了血管床成熟的完全的VEGF刺激和PDGF刺激，需要另外的信号。基于上述SIP的反式激活，此因子可以是SlP[Erberetal.(2004)，FASEBJ，vol18:338-40]。血管的稳定和成熟伴随可塑性的损失和缺少消退到VEGF和其它GF撤除以及对抗血管生成疗法的抗性[Erber，etal.(2004),FASEBJ,vol18:338-40，以及HughesandChan-Ling(2004),InvestOphthalmolVisSci，vol45:2795-806]。BV对生血管抑制剂的抗性是由最初稳定成熟血管和在治疗后^皮募集到未成熟血管的周细胞所赋予的[Erber,etal.(2004),FASEBJ，vol18:338-40]。在鞘化未成熟EC以后，周细胞表达补偿性生存因子(Ang-1和PDGF-B),其保护EC免受促凋亡剂的影响。在眼部疾病中的水肿和血管通透性CNV月莫由有孔血管EC组成，其倾向于使它们的血管内内含物渗漏进入周围的腔隙，从而导致视网膜下出血、渗出物和液体积聚[GerhardtandBetsholtz(2003),CellTissueRes，vol14:15-23]。多年来CNV组织本身，以及最近^L网膜内新血管形成，^皮认为是与AMD有关的^见力下降的原因。然而现在认为，由血管通透性(VP)的增加和其后血液一见网膜屏障(BRB)的击穿所引起的黄斑7jc肿在与AMD和其它眼部疾病(包4舌与#唐尿病有关的失明)有关的^L力减退中具有主要作用[HughesandChan-Ling(2004),InvestOphthalmolVisSci,vol45:2795-806;FelinskiandAntonetti(2005)，CurrEyeRes,vol30:949-57;Joussen,etal.(2003)，FASEBJ，vol17:76-8，以及Strom，etal.(2005),InvestOphthalmolVisSci，vol46:3855-8]。尤其是，糖尿病性视网膜病(DR)和糖尿病性黄斑水肺(DME)是糖尿病患者的常见孩支血管并发症并且是津唐尿病相关性失明的最常见原因。DME起因于增加的樣史血管通透性。Joussen,etal.(2003),FASEBJ,vol17:76-8。这些是工作年龄群体中新失明的最常见原因。我们认为，化合物如靶向SIP的抗体将可用于治疗这些病症。下文4笛述4姿照本发明可治疗的若干类眼部疾病的实例。应当明了，许多疾病和病症至少部分地特征为多发性病理性过程(例如，病理性新血管形成和疤痕)，并且本文才是供的分类是为了描述方侵_而不是限制本发明。a.缺血性3见网膜病，其与病理性新血管形成和特征为^见网膜前和/或视网膜下膜形成的疾病有关缺血性视网膜病(IR)是一类病症，其特征在于视网膜血流量受到损害。IR的实例包括糖尿病性视网膜病(DR)、早产儿视网膜病(ROP)、镰状细胞视网膜病以及视网膜静月永闭塞性疾病。所有这些病症可以4半随VEGF驱动的病理'性—见网月莫娘斤血管形成的增殖，其可以最终导致眼内出血、视网膜前膜形成以及牵拉性—见网膜脱离。原发性视网膜前膜(ERM)，还称作黄斑皱褶或玻璃纸样^L网膜病变，可以引起视网膜结构变形之后继发的一见力减小。尽管进行了手术切除，但这些膜有时会复发，并且有时伴随视网膜缺血。VEGF以及其受体位于ERM。在伴随增生性糖尿病性视网膜病、增生性玻璃体视网膜病、以及黄斑皱褶的膜中VEGF的存在进一步暗示，这种细胞因子在缺血性^L网膜病的血管发生中以及在增生性玻璃体视网膜病的膜生长中具有重要作用。此外，还在ERM中的细胞上鉴定了VEGF受体VEGFR1和VEGFR2。这些数据表明，VEGF可以是自分泌和/或旁分泌刺j:敫剂，其可以有助于血管禾口无血管ERM的发展。PDGF和其受体[Robbins，etal.(1994)，InvestOphthalmolVisSci;vol35:3649-3663]已在患有i曽生'性一见网膜病的眼中加以描述[Cassidy,etal.(1998),BrJOphthamol;vol82:181-85,以及Freyberger,etal.(2000),ExpClinEndocrinolDiabetes,vol108:106-109]。这些发现暗示了PDGF配体和受体广泛分布在不同来源的增生性视网膜膜中，并且暗示了PDGF的自分泌和旁分泌刺激可能参与ERM发病机制。转化生长因子-p(TGF-|3)参与ERM的形成[Poumaras，etal.(1998),KlinMonatsblAugenheilkd，vol212:356-358J,如通过TGF染色和免疫反应活性所"i正明的。此夕卜，TGF-J3受体II表达在糖尿病和PVR膜的ERM的肌成纤维细胞中。这些结果暗示，在视网膜和ERM的多种细胞类型中产生的TGF-P是用于治疗PVR、糖尿病以及继发性ERM的有吸引力的靶。已才艮道，在增生性糖尿病性视网膜病(PDR)的人玻璃体中白细胞介素-6(IL-6)增力口[LaHeij，etal.(2002),AmJOphthal，134:367-375]，以及在一项研究中100。/。的所研究的^f唐尿病ERM表达IL-6蛋白质[Yamamoto，etal.(2001)AmJOphthal,vol132:369-377]。已表明，外源性给予碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可诱导内皮增殖和VEGF表达[Stavri，etal.(1995),Circulation,vol92:11-14]。与这些7见测结果一致，在来自PDR患者的玻璃体冲羊品中bFGF浓度会增加[Sivalingam,etal.(1990)，ArchOphthalmol,vol108:869-872,以及Boulton，etal.(1997),BrJOphthalmol,vol81:228-233]。bFGF还参与ERM的形成[Hueber，etal.(1996)，Int.Ophthalmol,vol20:345-350]，戈口在所研究的10个PDR月莫中的8个PDR膜中的bFGF所i正明的。此外，这些研究者发现相应受体FGFR1的阳性染色。在非血管性原发性ERM中还已证明了对于bFGF的免疫反应活性。这些结果意p木着bFGF参与血管和无血管ERM的开j成。Harada，etal.(2006),ProginRetinalandEyeRes,vol25;149-164。在ROP患者的血清中还已^r测到升高的bFGF(Becerril,etal.(2005),Ophthalmology,vol112,2238]。鉴于SIP的已知的多效性以及它与VEGF、bFGF、PDGF、TGF-P以及IL-6的相互作用，我们认为结合、拮抗、抑制SIP的效应或生产的制剂将有效抑制在缺血性视网膜病和后节疾病(特4正在于血管或无血管ERM形成)中的病理性视网膜新血管形成。至少部分地特4正为异常的新血管形成或血管发生的其它眼病症包4舌年龄相关性黄斑变性、角膜拼接排斥反应、新生血管性青光眼、隐形眼镜超戴症、角膜感染，包括单純疱渗、带状疱渗以及原虫感染、翼状胬肉、感染性葡萄膜炎、慢性视网膜脱离、激光损伤、镰状细胞视网膜病、静脉闭塞症、脉络膜新血管形成、视网膜血管瘤增殖、以及原发性息肉样脉络膜血管病。b.增生性玻璃体一见网膜病(PVR)在原发性孔源性视网膜脱离以后和在创伤性一见网膜脱离以后，观观'JPVR。它是视网膜脱离外科手术失败的主要原因。它的特征在于在一见网膜两侧、在3皮璃体后表面和玻璃体基底部上细力包"莫的生长和收缩。在目艮中这种过度的瘢痕组织发展会导致牵拉性视网膜脱离的发展，因此针对防止或抑制增生性玻璃体视网月莫病(PVR)的治疗是处理一见网力莫脱离的合理原则。组织病理学上PVR的4争4i在于过度的月交原生产、收缩以及细月包增殖[Michels，RetinalDetachment2ndEdition.WilkinsinCP,RiceTAEds,Complicatedtypesofretinaldetachment,pp641-771，MosbyStLouis1997]。在PVR膜中鉴定的细胞类型主要包括视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、巨p藍细胞以及血管内皮纟田胞[Jerdan,etal(1989),Ophthalmology,vol96:801-10，以及Vidinova，etal(2005)，KlinMonatsblAugenheilkd;vol222:568-571]。这种过度的疤痕反应的病理生理学似乎是由许多细胞因子介导，其中细胞因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)p、石咸性成纤维细月包生长因子(bFGF)、白细月包介素-6(IL-6)、以及白细月包介素-8(IL-8)[Nagineni，etal(2005),JCellPhysiol,vol203:35-43;LaHeij,etal(2002),AmJOphthalmol,134:367-75;Planck,etal(1992),CurrEyeRes;vol11:1031-9;Canatarogluetal(2005)OculImmunolInflamm;vol13:375-81,以及Andrews,etal(1999)，OphthalmolVisSci;vol40:2683-9]。这些纟田胞因子的抑制可以有助于防止PVR的发展(如果及时给予)或限制其严重性[Akiyama，etal(2006)，JCellPhysiol,vol207:407-12，以及Zheng，etal(2003),JpnJOphthalmolm，vol47:158-65]。鞘氨醇-l-磷酸(SIP)是具有多效性的生物活性;容血脂质(lysolipid)。它是促血管新生的、促炎性的(刺激巨噬细胞和月巴大细胞的征集)以及促纤维化的(刺激瘢痕形成)。SIP通常刺激细月包增殖和迁移并且是4元凋亡的。SIP通过其与i午多细力包因子和生86长因子的相互作用来实现这些生物多样性的功能。已证明借助于单克隆抗体(SPHINGOMAB)来抑制SIP可以阻断血管内皮生长因子(VEGF)、bFGF、IL-6、以及IL-8的功能[Visentin，Betal.(2006),CancerCell,vol9:1-14]。SIP与SIP!受体的结合还可以增力口PDGF生产，因而结合SIP的制剂也将预期会减少PDGF生产[MilstienandSpiegel(2006)，CancerCell,vol9:148-150]。如在以下实施例中所说明的，现已证明，在体外SIP将人RPE细胞转化成类似于在PVR中所看到类型的肌成纤维细胞样表型。鉴于在PVR中所看到的最终导致过度的疤痕的病理生理学以及SIP对这些相同关键介质的已知效应，可以认为结合、拮抗、或抑制SIP的效应或生产的制剂将有效地消除或最大程度降低PVR的发展以及其对眼的严重损害效应。c.葡萄膜炎葡萄膜炎是眼葡萄膜的一种炎性疾病。它可以侵袭眼的前部或胁视力。原发性葡萄膜炎已与前房中增加的CD4+表达有关[Calder,etal.(1999)，InvestOphthalmolVisSci,vol40:2019-24]。数据还提示，T'淋巴细J包和其趋4匕因子IP-10在葡萄膜炎的发病才几制中的病J里'〖生4乍用[AbuEl-Asrar(2004),AmJOphthalmol,vol138:401-11]。在急性前葡萄膜炎中的其它趋化因子包括巨噬细胞炎性蛋白、单核细胞趋化蛋白-1以及IL-8。这些细胞因子可能在急性前葡萄膜炎的白细胞募集中起关4建作用。Verma，etal.(1997),CurrEyeRes;vol16;1202-8。鉴于S1P信号级耳关;改大的意义深远的多效性，i人为降低生物活性脂质有效浓度的SPHINGOMAB和其它免疫部分^1夸作为一种有效的方法来降低或调节与葡萄膜炎有关的眼内炎症。d.屈光外科手术角膜伤口愈合反应特别相关于屈光外科手术，因为它是安全和效力的主要决定因素。进行这些手术以治疗近—见、远视以及散光。激光原位角膜磨削术(LASIK)和屈光性角膜切除术(PRK)是最常见的屈光手术，然而已开发了其它手术以试图克服并发症。这些并发症尤其包括矫正过度、矫正不足、消退以及基质浑浊化。许多反应。在角膜生物学中最大的挑战之一是借助于再生而不是纤维化来促进组织1"奮复。i/w为再生和纤维化之间的选4爭在于成纤维细胞;敫;舌的4空制[Stramer，etal(2003),InvestOphthalmolVisSci;vol44:4237-4246，以及Fini(1999)ProgRetinEyeRes,vol18:529-551]。在外科手术或损伤后1-2周，在上皮下基质中可以出现称作肌成纤维细胞的细胞。肌成纤维细胞可能在TGF-p的影响下衍生自角膜细月包[Jester,etal.(2003)，ExpEyeRes，vol77:581-592]。角月莫〉'昆浊和基质^痕的特征在于降j氐的角膜透明度并且可以伴随成纤维细胞和月几成纤维细胞生成。原位和体外研究已提示，TGF-P和PDGF在刺激肌成纤维细胞分化中是重要的[Folger，etal.(2001),InvestOphthalmolVisSci;42:2534-2541]。在某些情况下，在LASIK以后，可以在中心界面观测到混浊。这些混浊包括弥漫性板层角膜炎、环形(甜甜圈形，donut-shaped)皮瓣、以及上皮石卒片保留在界面。它们的每一种都可能伴有TGF-p从上皮细胞增加进入激活的角膜细月包[Netto,etal.(2005),Comea，vol24:509-522]。消退很可能是由于提高的上皮-基质伤口愈合相互作用如通过角膜成纤维细胞和/或肌成纤维细力包的上皮调节生长因子的产生增加[Netto，etal.(2005)，上文]。已表明，用局部的抗TGF-p抗体4卬制TGF-p结合于受体可减少由PRK"i秀导的混浊[Jester,etal.(1997),Comea,vol16:177-187]。鉴于抗生物活性脂质抗体对纤维化进程和TGF-p的已知效应，我们认为，它可以有助于治疗屈光外科手术的某些并发症如混浊、基质疤痕以及消退。e.青光眼过滤外科手术的调节青光眼通常被认为是一种高眼内压引起对^L神经的损伤并最终使视野和/或视敏度受到损害的疾病。存在其它形式的青光眼，其中一见神经损伤可以发生在常压环境中或所谓的"正常眼压性青光眼"。对于许多患者来说，药物能够控制它们的病情，4旦对于其它患者而言则需要实施青光眼滤过术，乂人而在眼中手术产生的瘘使流体可以排出。这可以通过小梁切除术、植入医疗装置或外一牛干预的其它方法来实现。由于特征在于成纤维细月包增殖的伤口愈^^过程而导致青光眼滤过术失败并最终留下疤痕。抗代i射物如5-氟尿嗜啶和丝裂霉素C可以减少术后的疤痕；然而，甚至是在术后长期使用这些药物的情况下，手术失败仍然是严重的临床问题[MutschandGrehn(2000)，GraefesArchClinExpOphthalmol;vol238:884-91,以及Fontana,etal.(2006)，Ophthalmology,vol113:930-936]。人Tenon嚢成纤维细月包的研究i正明了它们能够合成bFGF和PDGF以及TGF-p并且这些生长因子参与青光眼滤过术后的组织修复过程，其促成了手术的失败。Trpathi，etal.(1996),ExpEyeRes，vol63:339-46。另外的研究还涉及在后滤过伤口反应中的这些生长因子[Denk，etal.(2003),CurrEyeRes;vol27:35-44]，结i仑是PDGF的不同同种型是在青光眼滤过术以后Tenon嚢成纤维细胞增殖的主要刺激剂，而TGF-P是Tenon嚢成纤维细胞转化成肌成纤维细胞所必需的。我们已证明，SIP存在于人Tenon嚢/结膜成纤维细胞中以及SIP在伤口愈合反应中被强烈表达。SIP还刺激多种成纤维细胞细胞类型的促纤维变性功能和转化成力几成纤维细"包表型以及胶原生产。鉴于SIP的特定的多效性以及其与bFGF、PDGF、以及TGF-p的已知的相互作用，i人为结合、拮抗、抑制SIP的效应或生产的制剂将有效调节伤口愈合和/或纤维变性反应(其导致青光眼外科手术的失败)并且将是增加成功的手术结果的有效治疗方法。设想，可以例如借助于玻璃体内注射或结膜下注射或局部地给予上述制剂。89f.角膜拼接角膜拼接(穿透角膜拼接术(PK))是在人类中最成功的组织拼接手术。然而每年在美国进行的47,000例角膜拼接中，角膜异体拼接物反应仍然是角膜拼接失败的主要原因[Ing，etal.(1998),Ophthalmology,vol105:1855-1865]。虽然免疫抑制和免疫调节可以是一种有希望的方式，但目前还没有足够的能力来避免异体拼接物反应。最近已发现，在角膜异体拼接物的排斥中，CD4(+)T细胞直接作为效应细胞而不是辅助细胞。Hegde，etal.(2005),Transplantation,vol79:23-31。鼠类研究已表明角膜基质中增加数目的中性粒细胞、巨噬细胞以及肥大细胞经受排斥。巨噬细胞是主要的浸润细胞类型，接着是T细胞、肥大细胞以及中性粒细胞。在高风险角膜拼接中的早期趋化因子表达是IL-8的小鼠同源物(巨噬细胞炎性蛋白-2)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)[Yamagami，etal.(2005),MolVis，vol11，632-40]。FTY720(FTY)是一种新的免疫抑制药物，其通过改变、淋巴细胞运输来起作用；导致外周血淋巴细胞减少和淋巴结中增加的淋巴细胞计数。通过结合于在淋巴细胞上表达的一些S1P受体，FTY介导其免疫调节作用[Bohler，etal.(2005),Transplantation,vol79:492-5]。口服给予药物并且单口服剂量降低外周淋巴细胞计数30-70%。在FTY降低T细胞亚群中，CD4(+)细胞多于CD8(+)细胞。Bohler,etal.(2004)，NephrolDialTransplant,vol19:702-13。当口月良给予时，经FTY治疗的小鼠显示出原位角膜拼4^存活显著延长。Zhang,etal.(2003)，Transplantation,vol76:1511-3。在角膜异种拼接的大鼠-小鼠模型中，FTY口服治疗还显著延迟排斥并降低其严重性[Sedlakova,etal.(2005)，Transplantation,vol79,297-303]。鉴于异体拼接物反应的已知发病机制并结合数据(其提示调节SIP信号的效应可以改善角膜*醉接存活)，认为降低生物活性脂质(例如，90SPHINGOMAB)的有岁文浓度的免疫部分也将可用于治疗免疫病症如异体拼接物反应，例如通过减弱免疫应答，因此将可能改善PK以后的角膜4并4妄存活。上述药物还可以具有另外的优点，即除系统《合予之外，可以局部主合予，例如，4昔助于局部眼周或眼内递送。具有炎症或免疫组成部分的其它眼部疾病包^^曼性^皮璃体炎，感染，其包括单纯疱渗、带状疱渗、以及原虫感染，以及眼组织月包浆菌病。g.以症痕为特征的前节病还i人为，用把向生物活性脂质的抗体进行的治疗可以有益于特征为眼前部疱痕的若干病症。这些病症包4舌i.创伤作为眼最前部结构的角膜暴露于各种有害物，从气载碎片到钝性外伤，其可以产生自机械损伤。眼的角膜和前部表面还可以被暴露于其它由外科手术形成的创伤、以及化学(如酸和碱)灼伤。这些类型的损伤的结果可以是破坏性的，经常导致角膜和结膜疤痕睑球粘连形成。此外，可以接着发生角膜新血管形成。释放白三烯的中性粒细月包积累，以及白细月包介素-1和白细胞介素-6的存在，起到连续不断;也募集炎性细月包的作用[Sotozono,etal.(1997),CurrEyeRes,vol19:670-676],炎性细胞浸润角膜并释放蛋白水解酶，这导致角膜组织和角膜熔体的进一步损害和破坏。此外，角膜和结膜成纤维细胞被激活并侵入，从而导致胶原沉积和纤维化。TGF-P会促进过度炎症和疤痕的不期望的效应。Saika,etal.(2006),AmJPatholvol168,1848-60。该过程导致角膜透明度的损失和^L力受损。减少的炎症，包括降低的中性粒细胞浸润和降低的纤维化，导致在碱烧al.(2005),OphthalmolVisSci,vol46:4097-106]。ii.眼瘢痕性类天疱瘙(OCP)OCP是一种慢性结瘢(瘢痕形成)自身免疫病，其主要侵袭结膜。此病是不可逆地进4亍性的并且预后相当差。在其最后阶段，结月莫疤痕和伴随的角膜病变导致双侧失明。组织学上结膜显示粘膜下症痕和慢性炎症，其中肥大细胞参与程度非常高[Yao,etal.(2003)，OculImmunolInflamm,vol11:211-222]。自身抗原导致形成自身抗体。在浸润T淋巴细胞的情况下，自身抗体与自身抗原的结合会启动一系列复杂的事件，其中CD4(辅助)细胞远远多于CD8(抑制)细胞。巨噬细胞和肥大细胞浸润也接着发生以及促炎和促纤维化细胞因子的释放。结果是细胞因子诱导的结膜成纤维细胞增殖和激活，并发生上皮下纤维化(参见以下实施例)。研究已表明在OCP患者中TGF-(3和IL-1在结月莫纤维4匕中的作用[Razzaque，etal.(2004)，I画stOphthalmolVisSci，vol45:1174-81]。iii.史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)和中毒性表皮坏死溶解症(TEN)SJS和TEN是的威胁生命对药物的不良反应。上述两种相关病症的眼后遗症可以是严重的并且涉及延髓和睑结膜、眼睑、以及角膜的病理性变化。药物和感染是最常见的参与因素。由于最初的炎性过程，慢性眼结果包括疱痕、睑球粘连形成、以及结膜的瘢痕形成。这导致睑内翻形成、倒睫、以及泪膜的不稳定。眼表面的破坏导致角膜疤痕、新血管形成、以及在严重情况下导致角质化。如在OCP中，则发生结膜的上皮下纤维化。人们i人为，对药物或感染的剧烈的自身免疫淋巴细胞反应在SJS/TEN的发展中起作用。Harilaos:etal.(2005),ErythemaMultiforme,StevensJohnsonSyndrome,andToxicEpidermalNecrolysis,inCornea2nedition.Krachmer,Mannis，Hollandeds.ElesevierMosbyPhiladelphia。在SJS中的浸润细月包群包括巨p藍细胞、CD4阳性T细胞、以及CD8阳性T细胞。该细胞群类似于在化学灼伤中所看到的那些细胞群。Kawasaki,etal.(2000),JOphthalmol,vol84:1191-3。iv.翼状胬肉临床上翼状胬肉表现为肉样、血管团，其发生在睑间裂隙中。翼状胬肉的主体是肉样纤维血管团。活性翼状胬肉的特征在于显著的血管充血和进行性生长。它们被坚固地恭附眼球。在晚期的情况下翼状胬肉侵害角膜并且会S1起在视轴内角膜透明度损失之后的视觉损失或不规则散光。在症状上，患者会感到有异物感、撕裂感以及^L力才莫糊。组织病理学"i正明了固有质的上皮下结締组织的透明样变化、成纤维细胞的数目增加以及肥大细胞的增加。Butrus,etal.(1995)，AmJOphthalmol,vol119:236-237。翼4犬胬肉的处J里仍然是个问题。经常进行手术切除，然而复发率较高[Krag,etal.(1992)，ActaOphthalmol,vol70:530]。为了有助于降低翼状资肉的复发率，已采用各种药理佐剂，如丝裂霉素C和柔红霉素。虽然这些药理佐剂可以是有帮助的，4旦长期数据有限并且它们可以伴随巩力莫变薄和角膜熔化。Dougherty等[(1996)，Cornea,vol15:537-540，以及Lee，etal.(2001)，Cornea,vol20:238-42]首先证明了，在翼状胬肉的发展中VEGF可以具有重要作用以及鉴定了翼^)犬胬肉上皮中的VEGF和一氧化氮。这些研究者假设，这些以及其它细胞因子是翼状胬肉的纤维血管向内生长特性的原因。已证明在在原发性或复发性翼状胬肉中均存在石威性FGF和TGF國pi[Kira,etal.(1998)，GraefesArchClinExpOphthalmol,vol236:702-8]并且发表的形态计量和免疫组织化学证据进一步支持这样的观点，即血管发生可以在翼状胬肉的形成中发4军作用[Marcovich,etal(2002),CurrEyeRes，vol25:17-22]。其它研究已指出IL-6和IL-8以及VEGF作为介质，可以与翼状胬肉发展有关[DiGirolamo,etal.(2006),InvestOphthalmolVisSci,vol47:2430-7]。抵抗翼状箭肉形成和生长的有效制剂可以减少对外科干预的需要或降低复发率。伴随纤维发生、纤维化或疤痕组成部分的其它眼部疾病和病症包括AMD、糖尿病性一见网膜病、早产儿一见网膜病、镰状细胞视网膜病、缺血性视网膜病、视网膜静脉闭塞性疾病、以及隐形眼镜超戴症。总之，过度的疤痕是许多眼和非眼部疾病和病症的病理生理学的基本组成部分。生物活性脂质如SIP在此过禾呈中具有作用并且用来减少这些制剂的浓度的抗体相关治疗将可能对4妄受该治疗的患者产生治疗效果。在一种实施方式中，我们i人为，生物活性脂质的抑制剂，尤其是针对SlP和/或其变体的单克隆抗体，可用于调节手术反应和创伤性伤口愈合反应。纤维化、纤维发生以及瘢痕形成视网膜下纤维化的形成导致对光感受器的不可逆转的损害以及永久性一见力减退。只要新生血管复合体仍然是完整的，如在用抗VEGF剂治疗的患者中似乎是这种情况，视网膜下纤维化的潜力和未来一见力减退会持续。在RANIBIZUMAB(Lucentis)的PRONTO研究的最新才艮导中，发现，由于视网膜下纤维化或RPE撕裂，那些失去视力的患者确实如此。可以减少成纤维细胞浸润和月交原沉积程度的制剂将是有价值的。成纤维细力包，尤其是力几成纤维细力包，在响应细爿包损伤和炎症的瘢痕形成中是关4建细月包元件[Tomasek,etal.(2002),NatRevMolCellBiol,vol3:349-63，以及ViragandMurry(2003)，AmJPathol,vol163:2433-40]。通过肌成纤维细胞的胶原基因表达是重建的标志并且是瘢痕形成所必要的[SunandWeber(2000)，CardiovascRes，vol46:250-6，以及SunandWeber(1996),JMolCellCardiol,vol28:851-8]。通过激活成纤维细月包迁移和增殖同时增加月交原生产，SIP可促进伤口愈合[Sun,etal,(1994)，JBiolChem，vol269:16512-7]。由受损细"包局部产生的SIP可以是造成伴随重建和瘢痕形成的不适当伤口愈合的原因。因此，认为，SIP抑制剂可用于治疗至少部分地特征为异常的纤维发生或纤维化的疾病或病症。视网膜下纤维化的形成导致对光感受器的不可逆转的损害和永久性视力减退。只要新生血管复合体是完整的，如在用抗VEGF剂治疗的患者中似乎是这种情况，则视网膜下纤维化和未来视力减退的可能性就会继续。通过中和SIP来最大程度降低不适当瘢痕形成可以是有益的并且通过限制视网膜下纤维化和其后光感受器损伤的程度可以防止一见力的不可逆丧失。越来越多的i正据表明SIP可以有助于早期和后期阶^:的伴随渗出性AMD的不适当的i见网膜重建。SIP具有明显的非VEGF依赖性促血管再生效应。SIP还刺激多种细胞类型的迁移、增殖以及存活，包括成纤维细胞、EC、周细胞以及炎性细胞一参与渗出性AMD和其它眼部疾病的多种不适当过程的相同细胞。SIP与参与渗出性AMD的发病机制的VEGF、bFGF、PDGF、以及其它生长因子(GF)的生产和激活有关。最后，SIP可以调节初生"永管系统的成熟，该过程导致损失对抗血管形成剂的壽文感性。4中制SIP的作用可以是用于渗出性AMD的有岁文的治疗性治疗，其可以4是供相对于<又<又抗VEGF方式的显著优点或可以与它们协同作用以解决最终导致AMD相关性—见觉损失的复杂过程和多个步骤。目前偏爱的用于AMD的治疗方法包4舌Lucentis⑧和冲亥准适应症外l吏用(off-lableuse)的Avastin(Genentech，Inc.),两者均輩巴向单个生长因子(VEGF-A)并且似乎4昔助于抗、渗作用来施加大部分它们的有益岁文应，其导致4见网膜下和^L网力莫内7jc肿的消退，因为实际的脉络膜新生血管(CNV)病变并没有显著地退化。然而，渗出性AMD相关的视力减退并不《叉起因于CNV诱导的视网膜下和视网膜内水肿。由CNV、—见网膜下纤维化、7K肺以及炎症一起共同引起的视网膜和视网膜下结构的病理性破坏和重建导致伴随AMD的一见力损失。可用的治疗方法(包括LucentisTM)并没有针对这些多种原因。因此，可以治疗多种机制(其引起视力减退)的治疗剂将具有很大的价值，作为单药治疗或连同另一种制剂，如抗VEGF剂(侈'Ji口，Lucentis⑧或Avastin)。因此，不希望受限于任何特定理i仑，i人为不受欢迎的鞘脂如SIP、和/或它们的一种或多种代谢物的水平51起或有助于各种眼部疾病和病症的发展，其中不适当的炎症、纤维化和/或血管发生参与疾病的发病才几制。目艮的疾病和病症(其中抗SIP抗体可能是临床上有用的)包括糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、糖尿病性黄斑水月中、PVR、前4史病以及年龄相关黄斑水月中，湿型和干型，以及手术后如青光眼的d、梁切除术或瓣膜拼接术。用于治疗》更皮病的抗SIP抗体本发明的组合物和方法将可用于治疗至少部分i也特4正为异常的新血管形成、血管发生、纤维发生、纤维化、疤痕、炎症、以及免疫应答的病症和疾病。一种这样的疾病是》更皮病，其还称作系统性-更4b病。硬皮病是一种自身免疫病，其引起疤痕或皮肤增厚，并且有时涉及身体的其它区域，包括肺脏、心脏、和/或肾。硬皮病的特征在于在身体的皮肤和器官中形成瘢痕组织(纤维化)，其可以导致所涉及区域的增厚和坚实，以及随之发生的功能降低。根据美国硬皮病基金会的统计数据，目前有约300,000美国人患有硬皮病。三分之一或更少的受侵袭患者患有普遍疾病，而其余的三分之二主要具有皮月夫症状。当该疾病4曼袭肺脏并引起疤痕时，呼吸可能会受到限制，这是因为肺脏不再能如它们应该的那样进行扩张。为了测量肺活量，医生使用了一种用来估计用力肺活量(FVC)的装置。在FVC小于50%的预期的人群中，起因于硬皮病相关的肺部疾病的10年死亡率为约42%。死亡率如此高的一个原因是目前没有有效的治疗方法。不希望受限于<壬<可特定理_沦，i人为脂质如S1P和/或其代i射物的不适当的浓度会引起或加剧硬皮病的发展。因此，本发明的组合物和方法可以用来治疗石更皮病，尤其是通过降〗氐特定革巴脂质例如S1P的有效体内浓度。如在本申i青书中其它地方所描述的，现有"i正据表明，S1P是一种促纤维变性生长因子，其可以有助于成纤维细胞激活、增殖、以及获得伴随不适当疤痕和重建的增加的成纤维细胞活性。人们认为，具有生物活性的S1P和抗S1P剂(例如，抗SlPmAb)能够间4妄纟爰和PDGF和TGF-p的促石更化效应。此夕卜，用这才羊的抗S1P剂通过緩和S1P对皮肤和其它形式的成纤维细胞(其有助于疾病进展)的直接影响而进行的治疗能够有益于硬皮病患者。心血管和"亩血管病不希望受限于任何特定理论，不期望的鞘脂如CER、SPH、或S1P、和/或一种或多种它们的代谢物的水平可能是造成心功能不全(心月几缺血期间或以后如再灌注损伤期间)以及得到的心脏重塑和心力衰竭的直4妄原因。由于鞘脂(如SIP)参与肝组织的纤维发生和伤口愈合(Davailleetal"J.Biol.Chem.275:34268-34633,2000;Ikeda，etal"AmJ.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol279:G304-G310，2000)，受伤脉管系纟充的愈合(Lee,etal"Am.J.Physiol.CellPhysiol.278:C612-C618，2000),以及其它疾病4犬态，或与这才羊的疾病有关的事件，i口癌症、血管发生和炎症(Pyne,etal,Biochem.J.349:385-402,2000),所以本发明的组合物和方法不仅可以用来治疗这些疾病而且还可以用于治疗心脏疾病。这表明，来自心脏或其它非脑源的鞘脂可能有助于卒中。因此，干扰鞘脂生产和/或作用可以有益于緩和卒中，尤其是由外周血管疾病引起的卒中、动脉粥样石更化、以及心脏疾病。最近的证据表明，外源性给予的SIP会穿越血脑屏障并促进脑血管收缩(Tosaka，etal.，Stroke32:2913-2919.2001)。已表明，在心月几在夬血(即，供应到心脏的血液在夬乏)期间，一个早期事件是由心肌过量产生天然存在的化合物鞘氨醇，以及由心脏组织本身或由血液成分产生其它代谢物，尤其是S1P，这是作为在血液中心肌鞘脂生产和其后转化的结果。本发明提供了用特异性人源化单克隆抗体来中和SIP的方法。因此本发明提供了人源化抗鞘脂抗体和有关的组合物和方法来降^f氐关4建鞘脂(SIP)的血液和组织水平。这样的抗体可用于，例如，结合并因此降低全血中不希望存在的鞘脂的有效浓度。本发明的治疗方法和组合物被描述成是"基于鞘脂的"以表明这些疗法可以改变某些不希望的、毒性或心脏毒性鞘脂的相对、绝对或可用浓度。"毒性鞘脂"是指任何鞘脂，其可以引起或增强细^^的坏死和/或凋亡或在其它情况下损害器官或组织的功能(例如，通过过度纤维化)，在某些情况下包括在特定组织或器官中发现的特定细胞类型。"心脏毒性鞘脂"是毒性鞘脂，其通过不适当的疤痕(纤维发生)直接或间接促进心力衰竭，引起负变力状态或引起或增强在心脏中或伴随心脏发现的细胞(包括^旦不限于心脏细胞、心脏一申经元等)的坏死和/或凋亡，和/或可以引起心脏功能的丧失失，这是由于鞘脂和/或它们的代谢物的负变力效应、心律失常冠状动月永血管收缩/痉挛效应。"不期望的鞘脂"包4舌毒性和心脏毒性鞘脂，以及代谢物，尤其是毒性和心脏毒性鞘脂的代谢前体。特别感兴趣的不希望的心脏毒性和/或毒性鞘脂包括^f旦不限于神经酰胺(CER)、酰基神经鞘氨醇-l-磷酸(ClP)、鞘氨醇-l-磷酸(S-l-P)、二氢S1P(DHS1P)、神经鞘氨醇磷酸胆石咸(SPC)、鞘氨醇(SPH;D(+)-赤型-2-氨基-4-反式-十八烯-l,3-二醇、或神经鞘氨醇)以及各种代谢物。心肌细胞对缺氧和再氧合的最早反应之一是中性鞘磷脂酶的激活和神经酰胺的蓄积是已知的。Hernandez,etal.(2000),Circ.Res.86:198-204，2000。据称SPH涉及介导各种细胞类型中细胞凋亡的早期4言号事4牛(Ohta，etal.,FEBSLetters355:267-270,1994;Ohta，etal"CancerRes.55:691-697,1995;Cuvlilier,etal"Nature381:800-803,1996)。々i定缺氧的心脏毒性效应可以部分地来自鞘脂生产和/或来自其它代谢物(例如，质子、钓、以及某些自由基)或信号分子(例如，MAP激酶、胱冬裂酶)的不适当产生，则会对心脏功能产生有害影响。SIP被存储在血小板中并且是人血浆和血清的正常組分(Yatomi,etal.,J.Biochem.121:969-973,1997)。SIP是一种冠状动月永血管收缩剂并且乂十犬心脏具有其它生物岁文应。Sugiyama,etal.(2000)，CardiovascularRes.46:119-125。已经4,定了SIP在动乐:K粥才羊石更化中的作用(Siess,etal.，IUBMBLife49:161-171，2000)。这已获得其它资料的支持，包括以下证据HDL的保护作用起因于阻断SIP生产(Xia，etal.，PNAS95:14196-14201，1988;Xia,etal.,JBiolChem274:33143-33147,1999)。已报道，鞘磷脂(其为神经酰胺的代谢前体)在经受缺氧的实马全动物中会增力口(Sergeev，etal.，Kosm.Biol.Aviakosm.Med.(Russian)15:71-74,1981)。其它研究已才艮道，肌细胞的内膜包含大量的SPH和革肖石痒月旨(Sumnicht,etal.，Arch.Biochem.Biophys.215:628-637,1982;Sabbadini,etal"Biochem.Biophys.Res.Comm.193752-758，1993)。用串珠镰孢菌素B真菌毒素治疗实验动物导致增加SPH和DHSPH的血清水平(未测量S1P),并同时对心脏发生负变力效应(Smithe,etal"ToxicologicalSciences56:240-249,2000)。其它疾病或病症由于在许多过程(包括新血管形成、血管发生、异常的纤维发生、纤维化和疤痕、以及炎症和免疫应答)中涉及生物活性脂质信号，所以认为，这些生物活性脂质的抑制剂将有助于与一种或多种这些过禾呈有关的各种疾病和病症。这样的疾病和病症可以是全身的(例如，全身性硬皮病)或位于一个或多个特定身体系统、部分或器官(例如，皮肤、肺脏、心血管系统或眼)。在患者中控制不受欢迎的鞘脂量的一种方式是通过提供一种组合物，其包含一种或多种人源化抗鞘脂抗体以结合一种或多种鞘脂，从而作为治疗性"海绵"，其可以降低游离的不受欢迎的鞘脂的水平。当化合物3皮称作"游离的"时，则该化合物不以任何方式净皮限制达到它施加其不受欢迎的效应的部位。通常，游离化合物存在于血'液和组织中，其是或包含游离4匕合物的作用部4立，或从其一种化合物可以自由地迁移到其作用部位。一种游离化合物还可以用于被4壬何酶作用，其中酶将化合物转化成不期望的化合物。100不希望受限于^f壬^T特定理"i仑，i人为，不受欢迎的鞘脂如SPH或S1P、和/或一种或多种它们的代j射物的水平引起或有助于心脏和心月几疾病和病症的发展。因为鞘脂还涉及肝组织的纤维发生和伤口愈合(Davaille，etal.,J.Biol.Chem.275:34268-34633,2000;Ikeda，etal.，AmJ.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol279:G304-G310,2000)、受伤脉管系统的愈合(Lee,etal"Am.J.Physiol.CellPhysiol.278:C612-C618，2000)，以及其它疾病状态或病症，或与上述疾病或病症有关的事件，如癌症、血管发生、与过度纤维^b和炎症有关的各种眼部疾病(Pyneetal.，Biochem.J.349:385-402,2000)，所以本发明的纟且合物禾口方法可以用来治疗这些疾病和病症以及心脏和心力几疾病禾口病症。基于鞘脂的疗法的一种形式涉及操作鞘脂的代谢途径，以降低不受欢迎的毒性鞘脂的实际、相对和/或可用体内浓度。本发明提供了用于治疗或预防疾病、病症或身体创伤的组合物和方法，其中将人源化抗鞘脂抗体给予患者以结合不受欢迎的毒性鞘脂、或其代谢物。这样的人源化抗鞘脂抗体可以被配制在药物组合物中，其可以用于各种目的，包括治疗疾病、病征或身体外伤。可以将包含本发明的一种或多种人源化抗鞘脂抗体的药物组合物结合于用于上述治疗的试剂盒和医疗装置。医疗装置可以用来将本发明的药物组合物给予对其有需要的患者，并且根据本发明的一种实施方式，提供了包括上述装置的试剂盒。上述装置和试剂盒可以用于常规给予(包括自我给予)本发明的药物组合物。上述装置和试剂盒还可以在紧急情况下使用，例如，在救护车或急诊室中，或在外科手术期间，或在可能发生损伤^旦不能立即获得充分的医疗条件的活动中(例如，4走步旅行和野营，或战斗环境)。给予方法本文描述的疾病和病症的治疗可以通过各种途径、采用不同的剂型和装置来给予本发明的制剂和组合物加以实现。适宜的药用稀释剂、载体、以及赋形剂在本
技术领域：
中是众所周知的。本领域技术人员将明了，对于^f壬^r特定治疗方法所给予的量可以容易地确定。适宜的量可以预期为10pg/剂量至10g/剂量，优选为10mg/剂量至1g/剂量。可以通过本4支术领域已知的方法来乡合予原料药，包括4旦不限于全身给予、皮下给予、皮内给予、粘膜给予(包括通过吸入)、以及局部给予。粘膜是指上皮组织，其沿着身体的内腔。例如，粘膜包括消化道，其包括口、食管、胃、小肠、以及肚门；呼吸道，其包括鼻通道、气管、支气管、以及肺脏；以及外生殖器。对本"i兌明书来说，粘膜还包括眼的外表面，即角膜和结膜。局部给予(与系统给予相反)可以是有利的，因为这种方式可以限制潜在的全身副作用，而仍然可以获得治疗效果。在本发明中使用的药物组合物包括但不限于溶液、乳浊液、以及包含脂质体的剂型。这些组合物可以产生自各种成分，其包括但不限于预制液体、自乳化固体以及自乳化半固体。在本发明中使用的药剂剂型可以按照制药行业熟知的常规技术来制备。这样的技术包括使活性组分与药物载体或赋形剂结合的步骤。优选的载体包括那些药用载体，尤其是当组合物用于人类的治疗应用。对于非人类治疗应用(例如，用于伴侣动物、家畜、鱼、或家禽的治疗)，可以采用兽医用载体。通常，剂型的制备如下均匀地和紧密地4吏活性组分締合于液体载体或精细分割的固体载体或两者，然后如果需要的话，使产品成形。200780048665.8本发明的组合物可以配制成许多可能剂型的任何一种，如^f旦不限于片剂、胶嚢剂、液体糖浆剂、软明胶胶嚢、栓剂、以及灌肠剂。本发明的组合物还可以配制成在含水、非含水或混合介质中的混悬剂。含水混悬剂可以进一步包含增加悬浮液粘度的物质，其包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或右旋糖酐。该混悬剂还可以包含稳定剂。在一种实施方式中，该药物组合物可以#皮配制并用作泡沫。药物泡沫包括的剂型例如是，但不限于，乳剂、微乳剂、乳膏剂、胶冻剂、以及脂质体。虽然特性基本类似，^L这些剂型在最终产品的组分和稠度方面会有所不同。关于上述组合物和剂型的制备的专门技术通常是制药和配制领域的技术人员已知的并且可以用于本发明的组合物的配制。在一种实施方式中，可以〗昔助于，例如，局部用滴剂或库欠膏剂、眼周注射、前房内进入前房或玻璃体，^昔助于才直入长效制剂、或系统注射或口服，将免疫衍生部分递送到眼部。所用抗体的量可以容易地由本领域」技术人员确定。将疗法递送到眼部的传统方式包4舌局部施加、系统乡会予以后再分布到眼部或直4妄眼内/目艮周注射[Sultana，etal.(2006),CurrentDrugDelivery,vol3:207-217;GhateandEdelhauser(2006)，ExpertOpinion:vol3:275-287;以及KaurandKanwar(2002),DrugDevelopIndustrialPharmacy,vol28:473-493]。抗SIP或其它抗生物活性脂质抗体治疗可以和任何这些方式一起4吏用，虽然均具有某些发觉的优点和缺点。局部用滴剂是方便的，但主要起因于鼻泪引流的流失经常将少于5%的所施加药物递送到眼的前部并且甚至将上述剂量的更小部分递送到眼球后节。除滴剂以外，喷雾剂还提供了另一种局部给予的方式。第三种方式是眼用软膏剂或乳剂，其可以用来延长剂型与眼表面的接触时间，虽然视力模糊和眼睑无光泽可能是令人烦恼的。上述局部方式仍然是伊C选的，因为治疗眼部疾病的疗法的系统给予会将全身暴露于药物的潜在毒性。眼后节的治疗在医学上是重要的，因为在美国和其它发达国家，年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、后葡萄膜炎、以及青光眼是一见力衰退的主要原因。Myles,etal.(2005)，AdvDrugDelivRev;57:2063-79。将药物递送到后节的最有效方式是通过3皮璃体的玻璃体内注射。然而，直接注射需要熟练的医生来实施递送并且许多患者会对其产生治疗受限的忧虑。与玻璃体内注射相比，眼周注射(其包括结膜下注射、球后注射、眼球周注射以及后眼球筋膜下注射)的侵入性稍少一些。重复的和长期的玻璃体内注射会引起并发症，如玻璃体出血、视网膜脱离、或眼内炎。还可以利用專交新的眼递送系统中的一种来给予抗生物活性脂质4元体治疗[Sultana,etal.(2006)，CurrentDrugDelivery,vol3:207-217;以及GhateandEdelhauser(2006),ExpertOpinion,vol3:275-287],其包括持续或受控释放系统，如(a)眼用膜剂(可溶的、可侵蚀的、不可侵蚀的或基于水凝胶的)、角膜罩，例如基于胶原的绷带和隐形眼镜，其将药物受控递送到眼部，(b)原位胶凝系统，其便于以滴剂形式给予，其中滴剂在眼中被转化成凝胶形式，从而提供药物在眼中的某种持续效应，(c)泡状系统如脂质体、类脂嚢泡/discomes等，其提供以下优点靶向递送、生物相容性以及免于视力模糊，(d)粘膜粘附系统，其提供在眼中的更好保留，(e)前药，(f)渗透增强子，(g)冻干载体系统，(h)颗粒，(i)亚孩i乳，(j)离子渗入疗法，(k)树技状聚合物，(l)微球，包括生物粘附微球，(m)纳米球和其它纳米颗粒，(n)collasomes，以及(o)药物递送系统，其包括一种或多种上述系统以提供另外的、甚至协同的有利影响。大多数这些104方式靶向眼的前革爻并且可以有益于治疗前^:病。然而，这些方式的一种或多种仍然可以有利影响眼后区中的生物活性脂质浓度，因为脂质的相对较低分子量将可能允许脂质在眼中的大量流动。此外，引入眼前区中的抗体可以能够在整个眼中迁移，尤其是如果它^皮制备成更低重量抗体变体如Fab片段。还可以采用用于后节的持续药物递送系统如那些批准的或开发中的持续药物递送系统(参见上文的参考文献)。如前所述，后部视网膜、脉络膜、以及黄斑的疾病治疗在医学上是非常重要的。在这方面，经巩』莫离子导入[Eljarrat-BinstockandDomb(2006),ControlRelease,110:479-89]是一种重要进展并且可以3是供有效的方式来将抗体递送到眼后节。还可以将各种赋形剂加入配制的抗体以改善治疗性能，4吏治疗更方便或明显确保配制的抗体仅用于其所期望的、认可的目的。赋形剂的实例包括用来控制pH的化学制品、抗微生物剂、用来防止抗体潜能损失的防腐剂、用来确定仅眼用的剂型的染料、用增加剂型中抗体浓度的增溶剂、渗透增强子、以及用来调节等渗性和/或粘度的制剂的使用。可以加入例如蛋白酶的抑制剂，以延长抗体的半衰期。在一种实施方式中，在包含磷酸緩冲盐溶液的溶液中并在对眼适宜的pH下，通过if皮璃体内注射将抗体递送到眼部。抗S1P剂(例如，人源化抗体)还可以4皮化学4奮饰以产生在前述剂型或装置之一中给予的前药。然后通过内源性酶的作用来释放抗体的活性形式。在本申请中所考虑的可能的眼酶是各种细胞色素p450、醛还原酶、酮还原酶、酉旨酶或N-乙酰-P-葡萄并唐胺酶。对抗体的其它〗匕学^^饰可以增力口其分子量，从而增加4元体在眼中的4亭留时间。上述化学修饰的一个实例是聚乙二醇化[HarrisandChess(2003)，NatRevDrugDiscov;2:214-21]，一种过禾呈，其可以是通用于或专用于官能团如二石克化物[Shaunak,etal.(2006)，NatChemBiol;2:312-3]或硫醇[Doherty,etal.(2005)，BioconjugChem;16:1291-8]。本文以下实施例描述了从治疗角度考虑具有所期望性能(包括与鞘脂的强结合亲和力)的人源化和变体抗鞘脂抗体的生产。尤其是，本发明涉及S1P以及它的变体，其可以包括S1P本身，定义为鞘氨醇-l-磷酸[sphingene-l-磷酸；D-赤型-鞘氨醇-l-磷酸；鞘氨醇-l-磷酸；(E，2S,3R)-2-氨基-3-羟基-十八-4-烯氧基]膦酸(AS26993-30-6)，DHSIP被定义为二氢鞘氨醇-l-磷酸[神经鞘氨醇-l-磷酸；[(2S，3R)-2-氨基-3-羟基-十八氧基]膦酸；D-赤型-二氢-D-鞘氨醇-l-磷酸(CAS19794-97-9];SPC是神经鞘氨醇磷酸胆碱、溶鞘磷脂、鞘氨醇磷酸胆碱、鞘氨醇磷酸胆碱、三乙基苯酚乙铵盐；2-((((2-氨基-3-羟基-4-十八烯基)氧基)羟基氧膦基)氧基)-N，N,N-三甲基-氯化物、(R-(R、S、(E)))，2-[[(E，2R，3S)-2-氨基-3-羟基-十八-4-烯氧基]-羟基画磷酰基]乙氧基國三曱基-氯化铵(CAS10216國23-6)。抗体生成和表征如在以下实施例中所描述的，可以确定抗体亲和力。优选的人源化或变体抗体是那些抗体，其结合鞘脂并且Kd值不大于约lxl(T7M，^f尤选不大于约1x10—8M，并且最^尤选不大于约5xl(T9M。除与鞘脂具有强结合亲和力的抗体之外，还希望选择从治疗角度考虑具有其它有益性能的人源化或变体抗体。例如，抗体可以是降低血管发生并改变肿瘤进展的抗体。优选地，抗体具有不大于约10ug/ml的有效浓度50(EC50)值，优选不大于约1ug/ml，以及最优选不大于约0.1ug/ml,如用直接结合ELISA测定所测得的。优选地，抗体具有不大于约10ug/ml的有效浓度值，优选不大于约1ug/ml,以及最优选不大于约0.1ug/ml,如在有1uMS1P存在的条件下用细力包测定所测;得的，例如，在那些浓度下，坑体能够体外抑制鞘脂-诱导的IL-8释放至少10%。优选地，抗体具有不大于约10ug/ml的有效浓度值，优选不大于约1ug/ml，以及最优选不大于约0.1ug/ml，如在CNV动物才莫型中在激光烧伤以后所测得的，例如，在那些浓度下抗体能够体内抑制鞘脂-诱导的新血管形成至少50%。用于确定本发明的抗鞘脂抗体的活性的测定包4舌如在下文实施例中所说明的ELISA测定。优选地，在将治疗有效量的抗体给予病人以后，人源化或变异抗体没有诱发免疫原性应答。如果免疫原性反应^皮"i秀发，优选地，该应答将是这样的以致抗体仍然向用其治疗的患者提供治疗效果。才艮据本发明的一种实施方式，人源化抗鞘脂抗体结合如在本文中所定义的"表位"。为了筛选结合于被感兴趣的抗体(例如，那些阻断抗体结合于鞘脂的抗体)结合的鞘脂上的抗体的表位，可以进行如在Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所描述的常^见交叉阻断测定(cross-blockingassay)。可4#才灸;也，可以进4亍表位作图，例如，如在Champe，etal.[J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)]中所描述的，以确定抗体是否结合感兴趣的表位。本发明的抗体具有重链可变结构域，该结构域包含由下式表示的氨基酸序列FR1画CDRH1画FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4，其中"FR1-4"表示抗鞘脂抗体重链可变结构i或的四个骨架区而"CDRH1-3"则表示三个高可变区。FR1-4可以书f生自如在以下实施例中的"共有序列"(例如人免疫球蛋白的重链或轻链的类、亚类或亚组的最常见氨基酸)或可以衍生自个别人抗体骨架区或衍生自不同骨架区序列的组合。例如上文中的Kabat,etal.已搜集了许多人抗体骨架区序列。在一种实施方式中，由人免疫球蛋白亚組(如由上文的Kabat，etal.所4臾集的)的共有序列纟是供了重《连可变FR。优选地，人免疫J求蛋白亚组是人重链亚组III(例如，如在SEQIDNO:16中)。人重链可变FR序列优选其中具有一个或多个取代基，例如，其中人FR残基被相应的非人残基所替换("相应的非人残基，，是指当对人和非人序列进行序列对比时，和感兴趣的人残基具有相同Kabat位置编号的非人残基)，但用非人残基的替换并不是必要的。例如，可以通过噬菌体展示来选4爭不同于相应的非人残基的替4奐FR残基。可以被取代的典型的重链可变FR残基包括任何一种或多种FR残基号37H、49H、67H、69H、71H、73H、75H、76H、78H、以及94H(本文采用的Kabat残基编号)。优选地，这些残基的至少两个、或至少三个、或至少四个祐JpM戈。FR取^的一种4争别优选的组合是49H、69H、71H、73H、76H、78H、以及94H。关于重链高可变区，优选具有在以下表2中所列的氨基酸序列。本文的优选实施方式的抗体具有轻链可变结构i或，其包含由下式表示的氨基酸序列FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4,其中"FR1-4"表示抗鞘脂抗体重链可变结构域的四个骨架区而"CDRL1-3"表示三个高可变区。FR1-4可以书于生自"共有序列，，(例如，人免疫5求蛋白的重链或轻链的类、亚类或亚组的最常见氨基酸)(如在以下实施例中)或可以衍生自个别人抗体骨架区或衍生自不同骨架区序列的组合。在一种优选实施方式中，由人免疫J求蛋白亚组(如由Kabat,etal.汇编的，上文)的共有序列提供轻链可变FR。^尤选i也，人免疫J求蛋白亚组是人k轻链亚组I(例3口，如在SEQIDNO:17中)。人轻链可变FR序列优选在其中具有取代，例如，其中人FR残基被相应的小鼠残基所替换，但用非人残基的替换并不是必要的。例如，可以通过噬菌体展示来选择不同于相应的非人残基的替换残基。可以被取代的典型的轻链可变FR残基包括任何一种或多种FR歹戈基号，其包4舌^f旦不卩艮于F4、Y36、Y49、G64、S67。关于CDR,优选具有在以下表2中所列的氨基酸序列。下文详细说明用于产生感兴趣的人源化抗鞘脂抗体的方法。A,抗体制备在以下实施例中描述了用于对非人抗鞘脂抗体进行人源化并产生抗鞘脂抗体的变体的方法。为了使抗鞘脂抗体人源化，制备了非人抗体起始材料。在要产生变体的情况下，制备了亲代抗体。将在以下部分描述用于产生上述非人抗体起始材并+和亲代抗体的示例性纟支术。(i)抗原制备用于生产抗体的鞘脂抗原可以是，例如，完整鞘脂或部分鞘脂(例如，包含"表位"的鞘脂片段)。可用于产生抗体的其它形式的抗原对于本领域技术人员而言将是显而易见的。在以下实施例中描述了用来产生抗体的鞘脂抗原。在一种实施方式中，抗原是衍生形式的鞘脂，并且可以伴随有载体蛋白。(ii)多克隆抗体优选在动物中通过多次皮下(sc)或腹腔内(ip)注射有关抗原和佐剂来产生多克隆抗体。利用双功能或衍生剂，例如，马来酰亚胺苯甲酰疏代丁二酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基的共轭作用)、109N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R/N二C-NR,其中R和Ri是不同的烷基基团，它可以用于将有关抗原共辄于在要免疫的物种中为免疫原性的蛋白，例如，钥孔戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛曱状球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂。通过结合例如100ug或5ug蛋白或共轭物(分别用于兔或小鼠)与三容积的弗氏完全佐剂并在多个部4立皮内注射该溶液，来相对于抗原、免疫原性共辄物、或衍生物对动物进行免疫。一个月以后，在多个部位，通过皮下注射，将在弗氏完全佐剂中的0.1至0.24咅的最初量的肽或共辄物纟会予动物。7至14天以后，对动物进4亍方文血并测定血清的抗体滴度。动物被增加直到滴度达到稳定状态。优选地，用相同抗原、但共轭于不同蛋白的共轭物和/或通过不同的交联试剂来对动物追加剂量。还可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合来制备共辄物。此外，聚集剂如明风可以适当地用来增强免疫应答。(iii)单克隆抗体可以利用首先由Kohler,etal.，Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法、或通过其它适当方法，包4舌通过重《且DNA方法(参见例如，美国专利第4,816,567号)来制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，小鼠或其它适合的宿主动物，如仓鼠或猕猴，被免疫(如上文所述)以诱发淋巴细胞，其产生或能够产生将特异性地结合于用于免疫的蛋白的抗体。可替换地，可以体外免疫淋巴细胞。然后利用适宜的融合剂，如聚乙二醇，将淋巴细胞融合于骨髓瘤细胞，以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986))。将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长在适宜的培养基中，其中培养基优选包含一种或多种物质，其抑制非融合、亲代骨髓瘤细月包110的生长或存活。例如，如果亲^骨髓瘤细力包缺少次黄"票呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤细胞的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、以及胸苷(HAT培养基)，这些物质可防止HGPRT击失少细力包的生长。优选的骨髓瘤细胞是那些细胞，其有效融合、支持抗体的稳定的高水平生产(通过所选的抗体生成细胞)，并且对培养基如HAT培养基是敏感的。其中，优选的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，如那些布亍生自MOP-21和M.C.-11小鼠月中瘤的骨骨逸瘤细月包系，其可获自SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA,以及SP-2或X63-Ag8-653细月包，其可获自AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Md.USA。还描述了人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细i包系，用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur，etal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。对其中正生长杂交瘤细胞的培养基测定其针对抗原的单克隆抗体的生产。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。单克隆才元体的结合亲和力可以，例^(口，通过Mimson，etal.,Anal.Biochem.，107:220(1980)的其斤卡查《急分4斤法(Scatchardanalysis)力口以确定。在鉴定了产生所期望的特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞以后，可以通过有限稀释程序和通过标准方法的生长来亚克隆无性系(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第59-103页(AcademicPress,1986))。用于此目的适宜培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，如动物中的腹水瘤，可以体内生长杂交瘤细月包。通过常规免疫球蛋白纯化程序如，例如，A蛋白-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析，从培养基、腹水、或血清，适当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。可以容易地分离编码单克隆抗体的DNA并利用常规程序进行测序(例如，通过使用寡核普酸探针，其能够特异性地结合于编码单克隆抗体的重链和轻链的基因)。杂交瘤细胞作为上述DNA的优选来源。分离后，可以将DNA放入表达载体，然后被转染进入，不产生免疫球蛋白的宿主细胞如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中以在重组宿主细月包中合成单克隆抗体。下面将详细描述抗体的重组生产。(iv)人源化和氨基酸序列变体以下实施例12描述了用于抗鞘脂抗体的人源化的程序。用于人源化的一般方法在，例如，US5861155、US19960652558、US6479284、US20000660169、US6407213、US19930146206、US6639055、US20000705686、US6500931、US19950435516、US5530101、US5585089、US19950477728、US5693761、US19950474040、US5693762、US19950487200、US19950484537、US2003229208、US20030389155US19950372262、US6350861、US19970862871、US19950458516、US5834597、US19960656586、US19960621751、US5932448、US19910801798、US19970934841、US6129914、US19950397411、US6329511、US19990450520、US2003166871、US20020078757、US5225539、US19910782717、US6548640、US19950452462、US6180370、US5714350、US5777085、US5882644、US6013256、US6210671、US5624821、以及US19950479752中已经描述过了。在某些实施方式中，可以希望产生这些人源化抗体的氨基酸序列变体，尤其是可12描述了用于产生抗鞘脂抗体的氨基酸序列变体的方法，其中氨基酸序列变体相对于亲代抗体具有增强的亲和力。通过将适当的核苷酸变化引入抗鞘脂抗体DNA、或通过肽合成，来制备抗鞘脂抗体的氨基酸序列变体。这样的变体包括，例如，在本文实施例的抗鞘脂抗体的氨基酸序列内缺失残基、和/或插入残基和/或取代残基。进行缺失、插入、以及取代的任何组合以获得最终构造物，只要最终构造物具有所期望的特性。氨基酸变化还可以改变人源化或变体抗鞘脂抗体的翻译后加工，如改变糖基化位点的凄t目或位置。可用于鉴定抗鞘脂抗体的某些残基或区(其是用于诱变的优选位置)的方法:帔称作"丙氨酸扫描诱变，，，如由CunninghamandWellsScience,244:1081-1085(1989)所描述的。在这里，鉴定了残基或目标残基纟且(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys、以及glu)并由中性或带负电荷氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以影响氨基酸与鞘脂抗原的相互作用。然后通过在取代位点、或为取代位点引入另外的或其它变体来完善那些对取代显示功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然用于引入氨基^列变化的位点是预定的，但突变本身的特性无需预定。例如，为了分析在给定位点的突变性能，在靶密码子或区进行ala扫描或随机诱变，并且对表达的抗鞘脂抗体变体筛选所期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基末端融合和/或羧基末端融合，长度范围是一个残基至包含一百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗鞘脂抗体或融合于附加表位的抗体。抗鞘脂抗体分子的其它插入变体包括融合于酶或多肽的抗鞘脂抗体的N端或C端，其可以增加抗体的血清半寿期。另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体具有至少一个在抗鞘脂抗体分子中的氨基酸残基被除去并且不同的残基一皮插入在其位置。用于取代诱变的最感兴趣的位点包括高可变区，<旦还设想FR改变。保守取代是优选的取代。如果上述取代导致生物学活性的变化，那么更显著的变化，称为以下所列的"典型的"取代，或如以下参照氨基酸类型进一步描述的，可以被引入并且产物被筛选。表1:典型的氨基酸残基取代典型的取/f戈Ala(A)val;leu;ilevalArg(R)lys;gin;asnlysAsn(N)gin;his;asp,lys;ginargAsp(D)glu;asngluCys(C)scr;alascrGin(Q)asn;gluasnGlu(E)asp;ginaspGly(G)alaalaHis(H)asn;gin;lys,argargHe(I)leu;val;met;ala;leuphe;正亮氛酸Leu(L)正亮氛酸；ile;val;ilemet;ala;pheLys(K)arg;gin;asnargMet(M)leu;phe;ileleuPheCF)leu;val;ile;ala;tyrtyrPro(P)^aleiSer(S)thrthrThr(T)ssrssrTrp(W)tyr;phetyrTyr(Y)trp;phe;thr;serpheVal(V)ile;leu;met;phe;leuala;正亮氛酸114抗体生物学特性的大量修饰是通过选4奪这样的取代来完成，其在它们对保持下述的影响方面显著不同(a)在取代区域中多肽主链的结构，例如，作为片层或螺旋构象，(b)在靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)大部分的侧链。基于常见的侧链特性，将天然存在的残基分为若干组；(1)疏水的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中4生亲7jc的cys、ser、thr;(3)酉吏'I"生的asp、glu;(4)威性的asn、gln、his、lys、arg;(5)影响链取向的残基gly、pro;以及(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守取代将引起这些类型的一类的成员交换另一类的成员。不参与维持人源化或变体抗鞘脂抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，以改善分子的氧化稳定性以及防止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键加入抗体以改善其稳定性(尤其在抗体是抗体片段如一种Fv片段的情况下)。一种类型的耳又代变体涉及取代亲代抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一种或多种高可变区残基。通常，所获得的选择用于进物学特性。用于产生上述取代变体的一种方便的方式是利用噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，若干高可变区位点(例如，6-7个位点)被突变以在每个位点产生所有可能的氨基取代。如此产生的抗体变体以来自丝状噬菌体颗粒的单价方式被展示为与包装在每个颗粒内的Mi3的基因nn产物的融合。然后，如本文中所^皮露的，筛选噬菌体展示变体的生物学活性(例如，结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高可变区位点，可以进4亍丙氨酸扫描诱变，以鉴定显著有助于抗原结合的高可变区残基。可替换地，或此外，可能有益的是，分析抗原-抗体复合体的晶体结构以鉴定抗体和鞘脂之间的接触点。根据本文详细说明的技术，这样的接触残基和邻近残基是用于取代的候选物。在产生上述变体以后，如本文所述对这批变体进行筛选并且在一种或多种有关测定中具有优越性能的抗体可以选择用于进一步发展。抗体的另一类型的氨基酸变体可以改变抗体的最初糖基化才莫式。改变是指删去存在于抗体中的一种或多种>^水化合物部分，和/或添力口一种或多种在抗体中并不存在的糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的和/或O-连接的。N-连接的是指石灰水化合物部分附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，是最常见的用于》友水化合物部分酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列的任何一种的存在会产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。可以通过改变氨基酸序列来方便地将糖基化位点加入抗体，以致它包含一种或多种上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点))。还可以通过在起始抗体的序列中添加、或耳又^一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行这种改变(用于O-连接的糖基化位点)。编码抗鞘脂抗体的氨基酸序列变体的核酸分子是通过本才支术领域已知的各种方法加以制备。这些方法包括但不限于分离自天然源(在自然发生氨基酸序列变体的情况下)或通过抗鞘脂抗体的早116先制备的变体或非变异变体的寡核苷酸介导(或定位)诱变、PCR-秀变、以及盒式"i秀变加以制备。(v)人抗体作为人源化的替代，可以产生人抗体。例如，现在可以产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫以后在没有内源性免疫球蛋白生产的情况下能够生产全套人抗体。例如，已描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合子缺失导致内源性抗体生产的完全抑制。在上述种系突变小鼠中人类种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在抗原挑战以后人抗体的生产。参见例如，Jakobovits，etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:2551(1993);Jakobovits,etal，Nature,362:255-258(1993);Bruggermann,etal.，Yearinlmmuno.，7:33(1993);以及美国专利第5,591,669号、第5,589,369号和第5,545,807号。人抗体还可以衍生自噬菌体展示文库(Hoogenboom，etal"J.Mol.Biol,227:381(1991);Marks,etal"J.Mol.Biol,222:581-597(1991)以及美国专利第5,565,332号和第5,573,905号)。如上所述，还可以通过体外激活的B细胞(参见例如，美国专利第5,567,610号和第5,229,275号)或通过其它的方法来产生人抗体。(vi)抗体片段在某些实施方式中，人源化或变体抗鞘脂抗体是抗体片段。已开发了用于生产抗体片段的各种技术。通常，借助于完整抗体的蛋白酶消4b来书亍生这些片^殳(参见例如、Morimoto,etal.,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);以及Bre麵n,etal"Science229:81(1985))。然而，通过重组宿主纟田胞，玉见在可以直4妄生产这些片,殳。例如，Fab'-SH片,殳可以直4妄回收自大肠杆菌并且^皮化学耦耳关以形成F(ab')2片,殳(Carter,etal.，Bio/Technology10:163-167(1992))。在另一种实施方式中，利用亮氨酸拉链GCN4来促进F(ab')2分子的装配从而形成F(ab')2。根据另一种方式，Fv、Fab或F(ab')2片段可以直接分离自重组宿主细胞培(vii)多特异性抗体在某些实施方式中，可以期望产生对于至少两种不同表位具有结合特异性的多特异性的(例如，双特异性的)人源化抗体或变体抗鞘脂抗体。典型的双特异性抗体可以结合于鞘脂的两种不同的表位。可替换地，抗鞘脂臂可以结合与结合不同分子的臂。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片,殳(例如，F(ab')2双特异性抗体)。才艮据用于制备双特异性抗体的另一种方式，一对抗体分子之间的界面可以用来最大化异二聚体的百分比，其中异二聚体回收自重组细胞物。优选的界面包含抗体恒定结构域的至少一对CH3结构域。在此方法中，用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一抗体分子的界面的一种或多种较小氨基酸侧链。通过用较小氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)代替较大氨基酸侧链，可以将相同或类似大小的补偿性"孔穴"产生在二抗分子的界面上。这提供了一种增加异二聚体的产率的机制(相对于其它有害的最终产物如同二聚体)。参见例如，美国专利第5，731，168号。双特异性抗体包括交联或"异源共辄物"抗体。例如，在异源共轭物中的抗体之一可以耦联于抗生物素蛋白，另一种抗体则耦联于生物素。可以利用任何方便的交联方法来制备异源共轭物抗体。适宜的交联剂在本
技术领域：
是众所周知的，并且披露在，例如，美国专利第4,676,980号中，连同若干交联技术。在文献中还已描述了用于乂人抗体片4史产生双特异性抗体的冲支术。例如，可以利用化学4定合来制备双特异性抗体。Brennan，etal.，Science229:81(1985)描述了一种程序，其中完整抗体^皮蛋白酶切割以产生F(ab')2片段。在有双硫醇络合剂亚砷酸钠存在的条件下还原这些片段以稳定邻位双硫醇以及防止形成分子间二硫化物。然后将产生的Fab'片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺进行还原，将Fab'-TNB衍生物之一再转化成Fab'-石克醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB书f生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作用来选择性地固定酶制剂。在又一种实施方式中，直4妄回收自大肠4干菌的Fab'-SH片,殳可以体外-坡化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby,etal，J.Exp.Med.175:217-225(1992)。还已经描述了直4妾从重组细胞物制备和分离双特异性抗体片,殳的各种4支术。例如，已利用亮氨酸4立链产生了双特异性抗体。Kostelny，etal.，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合，将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接于两种不同抗体的Fab'蛋白。在铰链区还原抗体同二聚体以形成单体，然后^皮再氧化以形成抗体异二聚体。这种方法还可以用于生产抗体同二聚体由Hollinger，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)描述的"双特异抗体"技术已提供一种用于制备双特异性抗体片段的可替换机制。这些片段包括重链可变结构域(Vh)，其通过接头连接于轻链可变结构域(V。，其中接头太短以致不允许在相同链上两个结构域之间进行配对。因此，一个片段的Vh和Vt结构域被迫使配对于另一片段的互补VL和Vh结构域，从而形成两个抗原结合位点。还已经报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见例如，Gruber，etal.，J.Immunol.152:5368(1994)。可替换地，双特异性抗体可以是"线性抗体"，如在Zapata，etal.ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)中所描述的。还预期具有两价以上的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tuttetal"J.Immunol.147:60(1991)。本发明的抗体(或多聚体或多肽)，其包括一种或多种结合位点/其臂或片段，将在本文中称作"多价"抗体。例如本发明的"二价"抗体包含两个结合位点/其Fab或片段，而本发明的"三价"多肽包含三个结合位点/其Fab或片段。在本发明的多价多聚体中，两个或更多结合位点/Fab可以结合于相同或不同的抗原。例如，在本发明的多价多肽中的两个或更多结合位点可以针对相同抗原，例如针对所述抗原的相同部分或表位或针对所述抗原的两个或更多的相同或不同的部分或表4立，和/或可以4十只于不同4元原；或它们的《且合。因此，本发明的二价多肽例如可以包含两个相同的结合位点，可以包含针对抗原的第一部分或表位的第一结合位点，以及针对所述抗原的相同部分或表位或4十对所述抗原另一部分或表位的第二结合位点；或可以包含针对抗原的第一部分或表位的第一结合位点和针对不同抗原的第二结合位点。然而，如才艮据上文描述将明显的是，本发明并不限于此，这是基于以下意义上讲本发明的多^f介多肽可以包含针对相同或不同抗原的任何数目的结合位点。本发明的抗体(或多聚体或多肽)，其包含至少两个结合位点/其Fab或片段，其中至少一个结合位点是针对第一抗原以及第二结合位点是针对不同于第一抗原的第二抗原，还将称作"多特异性的"。因此，"双特异性"多聚体包含至少一个针对第一抗原的位点以及至少一个41"对第二抗原的第二^f立点，而"三特异的，，是一种多聚体，其包含至少一个针对第一抗原的结合位点、至少一个针对第二抗原的结合位点以及至少一个4十对第三抗原的结合位点，等等。因此，在它们的最筒单形式中，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(每个Fab)。然而，如按照上文描述将明显看到的，120本发明并不限于此，这是在下述意义上讲本发明的多特异性多肽可以包含针对两种或更多种不同抗原的任何数目的结合位点。(viii)其它修饰可以i殳想人源化或变体抗鞘脂抗体的其它i^饰。例如，本发明还涉及免疫偶联物，其包含本文描述的共轭于细胞毒性剂的抗体，其中细胞毒性剂如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(例如，放射性共轭物)。利用各种双功能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基双硫醇)丙酸酯(SPDP)、巯醇亚胺(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺4义己二酸二曱酯盐酸盐)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、二叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如曱苯2,6-二异氰酸酯)、以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)来制备共扼物。本文4皮露的抗鞘脂抗体还可以配制成免疫脂质体。包含抗体的脂质体是通过本领域已知的方法加以制备，如在Epsteinetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang,etal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA77:4030(1980);以及美国专利第4,485,045号和第4，544，545号中所描述的方法。具有增强的循环时间的脂质体4皮露在美国专利第5,013,556号中。例如，可以通过反相蒸发法来产生脂质体，其中脂质成分包含磷脂酰胆碱、胆固醇以及PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。通过失见定孔径的过滤器挤压脂质体以产生具有所期望直径的脂质体。借助于二石克互换反应，本发明的抗体的Fab'片|殳可以共扼于月旨质体，3口在Martin,etal.,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所描述的。另一种活性组分可选地包含在脂质体中。通过本领域众所周知的4支术如4吏用上述异双功能交联剂，可以将酶或其它多肽共价结合于抗鞘脂抗体。可替换地，利用本技术领i或众戶斤周^口的重纟且DNA4支术(参见命'H口，Neuberger，etai.,Nature312:604-608(1984)),可以构造融合蛋白，其包含至少本发明的抗体的抗原结合区并连接于至少本发明的酶的功能活性部分。在本发明的某些实施方式中，可以期望使用抗体片段，而不是完整抗体，以增加例如輩巴组织和细力包的、渗透。在这种情况下，可以期望〗奮饰抗体片,殳以增加其血清半衰期。这可以例如通过将补救受体结合表位加入抗体片段来实现(例如，通过抗体片段中适当区域的突变或通过将表位加入肽标记，其然后在任一端或在中部融合于抗体片,殳，例如，通过DNA或肽合成)。参见例如，美国专利第6,096,871号。人源化或变体抗鞘脂抗体的共fH，务饰也包括在本发明的范围内。如适用的话，可以通过化学合成或通过抗体的酶促或化学裂解来进行共价修饰。通过抗体的定向氨基酸残基与有机衍生剂(其能够与所选侧链或N端或C端残基起反应)进行反应，可以将抗体的其它类型的共价修饰引入分子。多肽的典型的共价修饰描述在美国专利第5,534,615号中，其以引用方式结合于本文。抗体的优选类型的共价修饰包括，以在美国专利第4，640，835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号或第4,179,337号中所陈述的方式，将抗体连接于各种非蛋白质多聚体之一，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯。B.载体、宿主细力包以及重组方法
技术领域：
：本发明还提供了编码人源化或变体抗鞘脂抗体的分离的核酸、载体和宿主细月包(包含核酸)、以及用于生产抗体的重组4支术。为了抗体的重组生产，可以分离编码它的核酸并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在另一种实施方式中，可以通过同源重ia来制备4元体，例3口，3口在美国专利第5,204,244号中所描述的。利用常规4i序(例如，通过4吏用寡核苷酸探针，其能够特异性地结合于编码抗体的重链和轻链的基因)，可以容易地对编码单克隆抗体的DNA进行分离和测序。许多载体是可用的。载体成分通常包括但不限于下述的一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、以及转录终止序列，例如在美国专利第5,534,615中所描述的。用于在本文的载体中克隆或表达DNA的适宜宿主细胞是上述原核细胞、酵母菌、或高等真核细胞。用于此目的的适宜的原核细胞包括真细菌，如革兰阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌如埃希氏菌属，例如，大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形菌属、沙门氏菌属(例如，鼠伤寒沙门氏杆菌)、沙雷氏菌属(例如，粘质沙雷氏菌)、和志贺氏菌属，以及杆菌如枯草杆菌和地衣芽3包杆菌(例如，地衣芽；包杆菌41P),4叚单胞菌属如绿脓杆菌，以及链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠才f菌294(ATCC31，446),虽然其它菌抹如大肠杆菌B、大肠杆菌XI776(ATCC31,537)、以及大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是适宜的。这些实例是说明性的而不是限制性的。除原核细胞以外，真核孩史生物如丝状真菌或酵母菌也是用于编码抗鞘脂抗体的载体的适宜的克隆或表达宿主。在低等真核宿主孩史生物中，S良酒酵母、或常见的面包酵母，是最常孑吏用的。然而，在本文中许多其它属、物种、以及菌株是通常可用的和有用的，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母宿主如，例如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、K.wickeramii(ATCC24,178)、瓦尔净争克鲁维123酵母(ATCC56,500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及乳清酵母；耶氏酵母(EP402,226);巴斯德毕赤酵母(EP183,070);念J朱菌属；里氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234);4且并造月7;K孑包霉；"i午旺酵母属如西方许旺酵母；以及丝状真菌，例如，脉孢菌属、青霉属、弯颈霉、以及曲霉属宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。用于表达糖基化抗鞘脂抗体的适宜宿主细胞衍生自多细胞生物。脊推动物细胞的实例包括4i物细胞和昆虫细胞。已鉴定了许多杆状病毒菌林和变体以及相应的允许昆虫宿主细胞，其来自宿主如草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)、以及家蚕。各种各样的用于转染的病毒林是公开可获得的，例如，苜蓿银紋夜蛾NPV的L-l变体和家蚕NPV的Bm-5林，并且根据本发明在本文中上述病毒可以用作病毒，尤其用于草地夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄、以及烟草的才直物细月包;咅养物也可以用作宿主。然而，最感兴趣的是脊^^动物细力包，并且在培养(組织培养)中脊推动物细月包的增殖已变成一种例^亍禾呈序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40(COS-7,ATCCCRL1651)转化的猴肾CV1系；人类胚胎肾系(293或293细胞，亚克隆用于在悬浮培养物中的生长，Graham，etal,J.GenVirol.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞ADHFR(CHO，Urlaub，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾纟田胞(CV1ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细月包(HELA,ATCCCCL2);犬肾细月包((MDCK，ATCCCCL34);布法罗大鼠肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138，ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺肺瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI细胞(Mather,etal.，A醒lsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5细月包；FS4细月包；以及人肝癌系(HepG2)。用上述用于抗鞘脂抗体生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养，其中常规营养培养基被改进成适用于诱导启动子、选择转化体、或对编码所期望序列的基因进行扩增。用来产生本发明的抗鞘脂抗体的宿主细月包可以在各种培养基中力口以i咅养。商业上可获4寻的i咅养基^口Ham'sF10(Sigma)、才及P艮必需培养基((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、以及Dulbecco改良的Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，在Ham,etal.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes,etal.,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4，927，762号、第4,560,655号、或第5,122,469号，WO90/03430,WO87/00195，或U.S.Pat.Re.30,985中所描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。必要时，任何这些培养基可以补兖以激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、氯化4丐、氯化镁、以及磷酸盐)、緩冲剂(如HEPES)、核香酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为无机化合物，其终浓度通常在微摩尔范围)，以及葡萄糖或等量能源。还可以包括适当浓度(其是本领域技术人员已知的)的任何其它必要的补充物。培养条件，如温度、pH等，是先前用于宿主细胞(选择用于表达)的那些培养条件，并且对于普通才支术人员而言将是显而易见的。当使用重组技术时，可以在细胞内、在细胞周质腔中产生抗体，或抗体,皮直4妄分泌进入培养基。如果细胞内产生抗体，作为第一步骤，除去颗粒石卒片(宿主细胞或溶解片革史)，例如，通过离心或超125滤。Carter,etal，Bio/Technology10:163-167(1992)描述了一种禾呈序，其用于分离被分泌到大肠杆菌的细胞周质腔的抗体。简单地说，在有乙酸钠(pH3.5)、EDTA、以及苯甲基磺酰氟化物(PMSF)存在的条件下融化细胞糊约30分钟以上。可以离心除去细胞碎片。在抗体4皮分泌进入培养基的情况下，通过利用可商购的蛋白质浓缩过滤器，例如，Amicon或MilliporePellicon超滤装置，首先浓缩来自上述表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制齐'J如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止偶然污染物的生长。可以利用，例如，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、以及亲和层析，对制备自细胞的抗体成分进行纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。A蛋白作为亲和配体的适合性取决于在抗体中存在的任何免疫J求蛋白Fc结构域的种类和同种型。A蛋白可以用来纯化基于人重链的4元体(Lindmark，etal.，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。G蛋白^皮推荐用于所有小鼠同种型和用于人y3(Guss,etal.,EMBOJ.5:1567-1575(1986))。亲和配体附着的基质往往是琼脂糖，但也可以使用其它基质。和琼脂糖相比，机械稳定基质如受控孔je皮璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以实现更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，BakerbondABXtm初于脂(J.T.Baker,Phillipsburg，N丄)可用于纯化。取决于要回收的抗体，还可以使用蛋白质纯化的其它技术，如离子交换柱分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、碰胶层析、肝素SEPHAROSETM层析、阴离子或阳离子交换树脂层析(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。在任何初步纯化步骤以后，可以对包含感兴趣的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，其中使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱緩冲液，并且优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。C.药剂剂型通过混合具有所期望纯度的抗体和可选的生理用载体、j陚形齐寸、或3急定剂(参见，H口，Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol，A.Ed.(1980))来制备具有冻干制剂或水溶液形式的、用于存储的本发明的抗体或免疫衍生部分的治疗配方。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓度对于受体是无毒的，并且包括緩冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、以及其它有机酸；抗氧化剂，其包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二曱基千基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、千索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；羟苯烷基酯如羟苯曱酯或羟苯丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲苯酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水多聚体如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、以及其它碳水化合物，其葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA;糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子如钠；金属复合物(例如，锌蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂3口TWEENtm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。必要时本文中的剂型还可以包含用于特定;f寺治疗适应i正的一种以上的活性化合物，优选那些具有并不4皮此有害地影响的互补活性的活性化合物。这样的分子的适宜用量是对于所期望的目的有效的量。活性组分还可以被截留在微胶嚢中，其中微胶嚢是例如通过凝聚才支术或通过界面聚合加以制备，例如，分别在月交体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒以及纳米嚢)或在粗乳状液中的羟曱基纤维素或明胶-微胶嚢以及聚曱基丙烯酸曱酉旨微月交嚢。在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol，A.Ed.(1980)中描述了上述技术。用于体内给予的剂型必须是无菌的。这可以容易地例如借助于通过无菌过滤力莫的过滤来实现。可以制备緩释制剂。緩释制剂的适宜实例包括包含抗体的固体疏水多聚体的半透基质，该基质具有成形物件的形式，例如，薄膜、或微胶嚢。緩释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙蹄酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LupronDepotTM(可注射微球，由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成)、以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然多聚体如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释力丈分子100天以上，但某些水凝胶释放蛋白质更短的时间。当包胶抗体长期保留在体内时，由于在37°C下暴露于水分的结果，它们可能会变性或聚集，这导致生物学活性的损失以及免疫原性的可能的变化。取决于所涉及的机制，可以设计合理的稳定策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物交换的分子间S-S键形成，则可以通过修饰巯基残基、冷冻干燥自酸性溶液、控制水分含量、使用适当的添加剂、以及开发特定的多聚体基质成分，来实现稳定。D.^t体的非治疗应用本发明的抗体可以用作亲和纯化剂。在此过禾呈中，利用本^支术领域众所周知的方法，抗体^皮固定在固相上如Sephadex树脂或滤纸。使固定抗体接触包含待纯化鞘脂的样品，其后用适宜的溶剂洗涤载体，其中适宜的溶剂将基本上除去样品中除鞘脂之外的所有材料，其中鞘脂结合于固定抗体。最后，用另一种适宜溶剂，如甘氨酸緩冲液，例如在pH3至pH5.0之间，来洗涤载体，其将从抗体释放鞘脂。抗鞘脂抗体还可以用于鞘脂的i貪断测定，例如，；险测其在特定细月包、组织(如活才企才羊品)、或体液中的表达。上述i貪断方法可以用于i貪断心血管或"亩血管病或病症。为了it断应用，抗体通常将^^皮标记有可才佥测部分。许多标记是可用的，其可能通常分为下列几类(a)放射性同位素，如35S、14C、1251、3H、以及1311。可以利用侈'J3口在CurrentProtocolsinImmunology,Volumes1and2，Coligenetal.，Ed.Wiley-Interscience,NewYork,N.Y.,Pubs.(1991)中所4苗述的技术，用》文射性同位素标记抗体，并且可以利用闪烁计数来测量放射性。(b)荧光标记如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素以及其衍生物、罗丹明以及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白以及得克萨其斤纟工是可用的。侈'H口，禾'J用在CurrentProtocolsinImmunology(上文)中披露的技术可以将荧光标记共轭于抗体。利用荧光计可以量化荧光。(c)各种酶底物标记是可用的。例如，美国专利第4,275,149号4是供了某些酶底物标记的综述。酶通常催化发色底物的化学变化，其可以利用各种l支术加以测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，其可以用分光光度法加以测量。可^辜换地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。以上描述了用于量化荧光变化的技术。通过化学反应，化学发光底物变成电子激发的，然后可以发射可以测量的光(例如，利用化学发光计)或将能量给予荧光受体。酶标记的实例包括荧光129素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4，737，456号)、萤光素、2,3-二氢氮杂萘二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、^威性磷酸酶、p-半乳if唐苷酶、糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳4唐氧化酶、以及葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、樣么过氧化物酶等。在O'Sullivan,etal.,MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,inMethodsinEnzym.(edJ.Langone&H.VanVunakis),Academicpress,NewYork,73:147-166(1981)中描述了用于将酶共轭于抗体的技术。酶底物组合的实例包4舌，例如(i)具有氢过氧化物酶作为底物的，束才艮过氧化物酶(HRPO)，其中氢过氧化物酶氧化染泮牛前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3'，5,5'-四甲基联苯胺化盐酸(TMB));(ii)具有对硝基苯磷酸酯作为发色底物的碱性磷酸酶(AP);以及(iii)具有发色底物(例如，对硝基苯基-P-D-半乳糖苷酶)或荧光发生底物4-甲基伞形基-(3-D-半乳糖苷酶的P-D-半乳糖苷酶((3-D-Gal)。本领域技术人员可以使用许多其它酶底物组合。关于这些酶底物组合的一^殳综述可以参见美国专利第4,275,149号和第4，318，980有时，将标记间接共辄于抗体。技术人员将明了用于实现上述的各种技术。例如，可以将抗体共辄于生物素并且可以将上述三大类标记的任何一种共轭于抗生物素蛋白，反之亦然。生物素选择性地结合于抗生物素蛋白，因此可以以这种间接方式将该标记共轭于抗体。可替换地，为了实现标记与抗体的间接共辄作用，将抗体共轭于小半抗原(例如，地高辛)以及将上述不同类型的标记之一共轭于抗半抗原抗体(例如，抗i也高辛抗体)。因此，可以实现j示记与4元体的间^妄共辄作用。在本发明的另一种实施方式中，抗鞘脂抗体无需#:标记，并且其存在可以利用结合于抗鞘脂抗体的标记抗体加以;险测。可以以任何已知测定方法来使用本发明的抗体，如竟争结合测定、直4妄和间*接夹心测定、以及免疫沉淀测定。参见例如，Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158(CRCPress,Inc.1987)。竟争结合测定依赖于标记标准与试样分析物竟争结合于有限量抗体的能力。试样中鞘脂的量与结合于抗体的标准的量成反比。为了Y更于确定已结合的标准的量，在竟争以前或以后抗体通常是不溶性的，以致结合于抗体的标准和分析物可以方便地分离自仍然未结合的标准和分冲斤物。夹心测定涉及使用两种抗体，每种能够结合于待4企测蛋白的不同免疫原性部分、或表位。在夹心测定中，固定在固体载体上的一抗结合试样分析物，其后二抗结合于分析物，因而形成不溶性的由三部分组成的复合体。参见例如，美国专利第4,376,110号。二抗可以本身^皮标记有可检测部分(直接夹心测定)或可以利用标记有可4企测部分的抗免疫^求蛋白抗体加以测量(间4矣夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定是ELISA测定，在这种情况下可检测部分是酵。只寸于免疫组织4b学，例如，血液或纟且织才羊品可以是新鲜的或冰冻的或可以#:包i里在石蜡中并用防腐剂如福尔马沖木加以固定。抗体还可以用于体内i貪断测定。通常，抗体祐:才示记有》文射性核素(如mIn、"Tc、14C、131I、1251、3H、32P、或35S)以致可以利用免疫闪烁显像来定位结合的耙分子。E.i會断试剂盒为方便起见，可以将本发明的抗体提供在试剂盒中，例如，预定量的试剂的包装组合，并带有用于进行诊断测定的i兌明书。在用酶标记抗体的情况下，试剂盒将包括底物以及酶所需要的辅因子(例如，底物前体，其提供可检测的发色团或荧光团)。此外，可以包括其它添加剂如稳定剂、緩沖剂(例如，阻断緩冲剂或裂解緩冲剂)等。各种试剂的相对量可能相差很大以提供基本上优化测定敏感性的试剂溶液的浓度。尤其是，试剂可以提供为通常冻干的干粉，包括赋形剂，其在溶解以后将4是供具有适当浓度的试剂〉容液。F.4元体的治疗应用为了治疗应用，以药用剂型如上述那些药用剂型，将本发明的抗鞘脂抗体给予哺乳动物，优选人，其中药用剂型包括可以作为大丸剂以静脉内方式或通过经一段时间的持续输注、通过肌内途径、腹腔内途径、脑脊内途径、皮下途径、关节内途径、滑膜腔内途径、鞘内途径、口服、局部途径、或吸入途径，来给予人的那些药用剂型。为了预防或治疗疾病，抗体的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型(如上述所定义的)、疾病的严重性和病程、纟会予抗体是用于预防或治疗目的、以往治疗、患者的临床病史和对抗体的反应、以及主治医生的判断力。一次或经一系列治疗将抗体适当地*合予患者。取决于疾病的类型和严重性，给予患者的起始候选剂量是约1ug/kg至约50mg/kg(例长口，0.1-20mg/kg)的4元体，侈)H口，通过一次或多次分开给予、或通过持续输注。取决于上述因素，典型的每日或每周剂量可以是约1jag/kg至约20mg/kg或更多。对于经若千天或更长时间的重复给予(取决于病症)，重复治疗直到出现对疾病症状的所期望的抑制。然而，其它剂量方案可以是有用的。可以通过常规技术和测定，包括，例如，放射线成像，来容易地监测这种疗法的进展。根据本发明的另一种实施方式，可以例如通过按顺序或连同另一种制剂(其可有效用于那些目的，如化疗抗癌药物)给予抗体来改善抗体预防或治疗疾病的有效性。上述其它制剂可以存在于要给予的组合物中或可以分开给予。可以按顺序或连同其它制剂适当地给予抗体。G.制备的物件在本发明的另一种实施方式中，提供了制备的物件，其包含可用于治疗上述疾病的材料。制备的物件包括容器和标记。适宜的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、以及试管。这些容器可以形成自各种材料如玻璃或塑料。容器容纳可以有效治疗病症的组合物并且可以具有无菌入口(例如容器可以是输液袋或小瓶，其具有可以通过皮下注射针刺穿的塞子)。组合物中的活性剂是抗鞘脂抗体。在容器上或伴随容器的标签指明组合物用于治疗所选的病症。制备的物件可以进一步包括第二容器，其包含药用緩冲液，如磷酸緩冲盐溶液、林格氏液以及葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和使用者角度所期望的其它材料，其包括其它緩冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、包装插件、以及使用说明书。通过参照以下实施例将可以更好地理解本发明，其中所述实施例4又用于说明目前已知的用于实施本发明的最好方式，但本发明的范围并不限于此。实施例实施例1:SlP(SphingomabTM;LT1002)的鼠单克隆抗体一种类型的治疗性抗体特异性地结合不受欢迎的鞘脂以获得有利影响如，例如，(l)降低不希望具有的、毒性鞘脂(和/或它们的代谢前体的浓度)的有效浓度，其中鞘脂将促进不受欢迎的效应如心脏毒性、致癌的、或生血管效应；(2)抑制不希望具有的、毒性的、致癌的、或生血管鞘脂结合于细胞受体，从而，和/或降^f氐可用于结合上述受体的鞘脂的浓度。上述治疗效果的实例包括但不限于使用抗S1P抗体来降低可用的S1P的有效体内血清浓度，从而阻断或至少限制S1P的致癌和生血管效应以及其在后MI心力衰竭、癌症、或纤维发生疾病中的作用。合成了石危醇化S1P以包含反应基团，其能够将S1P的必要的结构特征交联于载体分子如KLH。在免疫以前，利用标准试-验失见程并借助于IOA或SMCC交联将硫代S1P类似物共轭于蛋白质载体(例如，KLH)。SMCC是一种异双功能交耳关剂，其与伯胺和巯基基团反应，并且是一种优选的交联剂。经两个月时间通过注射用50(ig免疫原(硫醇化1和KLH的SMCC易化共扼物)免疫瑞士韦伯斯特(SwissWebster)或BALB-C小鼠四次。在第二、第三、以及第四次免疫的两周后收集血清样品，并通过直接ELISA筛查抗S1P抗体的存在。按照标准融合程序，来自动物并呈现抗体的高滴度的脾脏随后用来产生杂交瘤细月包。使获得的杂交瘤细力包生长至汇合，其后收集细"包上清液供ELISA分析。在经免疫的55只小鼠中，8只是良好的反应者，其呈现乂tSlP具有反应性的抗体的显著血清滴度。随后，按照已建立的程序，利用那些小鼠的脾脏和骨髓瘤细胞进行融合。然后通过直接ELISA筛查获纟寻的1,500个杂交瘤细月包，产生287个阳性杂交瘤细胞。在通过直接ELISA筛查的这些287个杂交瘤细胞中，159个细月包显示出显著的滴度。然后将159个杂交瘤细胞和每一个扩大进入24孔板。然后再筛查经扩大的杂交瘤细胞的细J包条件培养基以鉴定能够分泌感兴趣的抗体的稳定的杂交瘤细胞。对60个最高滴度的稳定的杂交瘤细胞进行竟争性ELISA。在筛查的55只小鼠和几乎1，500个杂交瘤细胞中，发现一个杂交瘤细胞呈现这样的性能特点，其i正明有限稀释法克隆是正当的，如最终产生真正的单克隆抗体所需要的。此过程产生47个无性系，其大部分被认为对于产生S1P抗体是阳性的。在这些47个无性系中，6个被扩大进入24孔板并随后通过竟争性ELISA加以筛查。从仍然阳性的4个无性系中，选择一个来引发S1P单克隆抗体的大规模生产。用这些细胞注射SCID小鼠并且获得的腹水是A蛋白，其经纯4匕(产率为50%)并用于分才斤内毒素水平(<3EU/mg)。为了一轮腹水生产，注射50只小鼠，产生总共125mL腹水。抗体被同种型为IgGlK，并且通过HPLC认为纯度〉95。/。。将抗体制备在包含150mM氯化钠(pH7.2)的20mM磷酸钠中并存储在-70。C。这种抗体称为LT1002或SphingomabTM。阳性杂交瘤细胞克隆(称为克隆306D326.26)保藏在ATCC(安全保藏4诸藏号SD-5362),并且该克隆是针对S1P的第一鼠mAb。该克隆还包含抗体重链和轻链的可变区，其可以用于生成"人源化，，抗体变体，以及构造嵌合抗体所需要的序列信息。通过直接ELISA并利用碌u醇化SIP类似物作为抗原来篩查血清和细胞上清液的SIP特异性抗体。如下文所述，进行标准ELISA,不同之处在于，在最初温育期间，用等容积的PBS/O.1%吐温-20(PBST)稀释50ul样品(血清或细胞上清液)。在涂布有O.l昭化学合成的石克醇化SIP的96孑L高结合ELISA板(Costar)中进行ELISA，其中硫醇化SIP被共轭于结合緩冲液(33.6mMNa2C03、lOOmMNaHC03;pH9.5)中的BSA。在ELISA才反孔中，碌iJ享化SIP-BSA在37。C下温育1小时，然后在4。C下温育过夜。然后用PBS(137mMNaCl、2.68mMKCl、10.14mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)对一反洗涤洗涤四次并在室温下用PBST阻断1小时。关于最初温育步骤，用稀释在PBST中的25uL的O.lug/mL抗SIPmAb温育75uL样品(包含待测量的SIP)，然后被加入ELISA斗反的孔中。在一式三分的孔中对每种才羊品进4亍处理。在室温下温育1小时以后，用PBS洗;条ELISA4反四次，然后在室温下用100ul/孑L的0.1ug/mLHRP羊才元鼠二#元(secondary)(JacksonImmunoresearch)温育1小时。然后用PBS洗涤4反四次并暴露于四甲基联苯胺(Sigma)1-10分钟。通过加入等体积的1MH2S04来终止冲企测反应。通过利用EL-X-800ELISA平板读耳又器(Bio-Tech)在450nm处的测量确定了样品的光密度。关于交叉反应性，如上所述，进行竟争性ELISA,不同之处在于以下改变。最初温育包括竟争剂(S1P、SPH、LPA等)和生物素共專厄的抗S1PmAb。利用EZ-LinkSulfo-NHS-Biotinylation试剂盒(Pierce)进4亍经纯化单克隆抗体的生物素化。按照试剂盒试验身见禾呈确定生物素摻入并且其范围为7至11个生物素分子/抗体。竟争剂的制备如下超声处理脂质原液，然后在DPBS/BSA[在DPBS(Invitrogen14040-133)中的lmg/ml没有月旨肪酸的BSA(Calbiochem)]中重建以前在氩气下干燥。必要时，将经纯化的抗SIPmAb稀释在PBS/0.5%TritonX-100中。将竟争剂和抗体溶液混合在一起以便产生3份竟争剂与1份抗体。HRP-共轭的链霉亲合素二抗(JacksonImmunoresearch)用来产生信号。竟争性ELISA凄t据(示在图1中，图1A)的另一个方面是，它表明抗SIPmAb不能区别硫醇化SIP类似物与在竟争实-睑中加入的天然S1P。它还i正明了，4元体并不识别<壬何氧4匕产物，因为构造的类似物没有任何双键。还相对于包含双键的天然产物试-验了抗S1PmAb，其允许在室温下放置48小时。按照先前报道的方法(Deutschman，etal.(July2003),AmHoartJ.，vol.146(1):62-8)进行天然S1P的反相HPLC,并且结果表明保留时间没有差异。另夕卜，示于图1的图片A的单克隆抗体与各种脂质的结合特性的比较表明，由抗体识別的表位并不涉及在天然SIP的双4建区中的烃《连。另一方面，由单克隆抗体识别的表位是包含在鞘氨醇石威基主链上的氨基醇加上游离磷酸盐的区域。如果游离磷酸盐被连接于胆碱(如同SPC的情况)，那么结合被稍微减少。如果氨基基团被酯化成脂肪酸(如同C1P的情况)，则^L测不到抗体结合。如果用甘油主链替换鞘氨醇氨基醇主链(如同LPA的情况)，则S1P特异性单克隆没有呈现任何结合。这些表位作图数据表明，在由单克隆抗体识别的S1P上^又存在一个表位，并且此表位由S1P的独特的极性首基加以限定。在利用ELISA测量的类似实验中，评估了适宜的对照材^F以确4呆这种4元S1P单克隆抗体并不识别蛋白质载体或交I关剂。例力口，在将^5克醇化S1P共轭于BSA作为ELISA中的沉积材料时，通常的交联剂SMCC交换IOA。当使用IOA时，抗体的结合特性几乎相同于当使用BSA-SMCC-硫醇化S1P时的抗体的结合特性。类4以地，KLH交换BSA作为蛋白质，而BSA复合于石克醇化S1P作为沉积材料。在此实验中，抗体的结合特性也没有显著差异。结合动力学由于脂质的特性，S1P与其受体或其它部分的结合动力学传统上是成问题的。许多问题与脂质的不溶性有关。对于BIAcore测量，这些问题是通过4寻SIP直4妄固定于BIAcore芯片来克服。然后使抗体沿芯片表面流动并测量光密度变化以确定抗体与S1P的结合特性。为了绕过抗体的二价结合特性，以低密度将S1P;余布在芯片上。另外，用各种密度的S1P(7、20、以及1000RU)涂布芯片并且抗体结合数据总体上适合于1:1相互作用模型。图2所示的结果说明了由于单克隆抗体结合于S1P(在三种不同密度的S1P的情况下)所引起的光密度变化。总的来说，单克隆抗体与S1P的亲和力^皮确定为非常高，在大约88皮摩尔(pM)至99nM的范围内，其取决于单价或二价结合;^莫型用来分析结合数据。实施，J2:ELISA测定1.定量ELISA在37°C下用稀释在1M碳酸盐緩沖溶液(pH9.5)中的兔抗鼠IgG、F(ab')2片萃殳特异性抗体(Jackson，315-005-047)涂布MicrotiterELISA板(孩史量滴定ELISA板)(Costar，CatNo.3361)1小时。用PBS乂于4反进4亍洗涤并在37°C下用PBS/BSA/吐温-20阻断1小时。为了最初温育，非特异性小鼠IgG或人IgG的稀释，将要测量的整个分子(用于4文准曲线)和样品加入孔中。对寿反进行洗涤并在37。C下用稀释为1:40,000的100ul/孑L的HRP共辄羊抗鼠(H+L)(Jackson，catNo115-035-146)温育1小时。洗涤以后，用四曱基耳关苯胺(Sigma，catNoT0440)4企测酶促反应并通过力。入1MH2S04来终止。利用ThermoMultiskanEX在450nm处测量光密度(OD)。将原始数据传送到GraphPad软件供分析。2.直接ELISA2在37°C下用稀释在1M》友酸盐《爰冲溶液(pH9.5)中的LPA-BSA涂布MicrotiterELISA板(Costar,CatNo.3361)1小时。用PBS(137mMNaCl、2.68mMKC1、10,1mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)对^反进4亍洗涤，然后用PBS/BSA/Tween-20在室温下阻断1小时或在4°C下阻断过夜。将待试验的样品稀释为0.4ug/mL、0.2ug/mL、0.1ug/mL、0.05ug/mL、0.0125ug/mL、以及Oug/mL,然后将100ul力口入每个孑L。对4反进4亍洗涤并在室温下用100ul/孑L的HRP共辄羊才元鼠(1:20,000稀度)(Jackson,cat.no.115-035-003)温育1小时。洗涤以后，用四曱基联苯胺(Sigma，cat.no.T0440)斥企测酶促反应并通过加入1MH2S04来终止。利用ThermoMultiskanEX在450nm处测量光密度(OD)。将原始数据传送到GraphPad软件供分析。3.竟争测定用ELISA测定试'验了mAb的特异性。在37°C下用稀释在1M碳酸盐緩沖溶液(pH9.5)中的18:0LPA-BSA涂布MicrotiterELISA斥反(Costar，CatNo.3361)1小时。用PBS(137mMNaCl、2.68mMKCl、10.1mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)对板进行洗涤，然后用PBS/BSA/Tween-20在37。C下阻断1小时或在室温下阻断过夜。为了最初温育，将0.4ug/mL抗LPAmAb和指定量(14:0、16:0、18:0、18:1、18:2以及20:4)的LPA、DSPA、18:1LPC(;容血石岸脂酰月旦石咸)、S1P、神经酰胺以及神经酰胺-l-石粦酸加入ELISA4反的孔中，然后在37。C下温育1小时。对^反进^f亍洗涤，然后在37GC下用稀释为1:50,000的100ul/孑L的HRP共辄羊抗鼠(1:20,000稀度)(Jackson,catNo115-035-003)或HRP共4厄羊抗人(H+L)(Jackson，catNo109-035-003)温育l小时。；先涤以后，用四曱基联苯胺4企测酶促反应并通过力口入1MH2S04来终止。利用ThermoMultiskanEX在450nm处测量光密度(OD)。将原始tt据传送到GraphPad软件供分析。实施例3:SPHINGOMAB小鼠mAb对于SIP是高度特异的和其它生物活性脂质相比，竟争性ELISA说明了SPHINGOMAB对于SIP的特异性。SPHINGOMAB对于鞘氨醇(SPH)并没有显示交叉反应性，其中鞘氨醇是SIP或溶血磷脂酸(LPA)的直接的代谢前体，一种重要的胞外信号分子，其结构和功能上类^以于S1P。SPHINGOMAB并不i。、别其它结构类似、的脂质和代谢物，其包括神经酰胺-l-磷酸(C1P)、二氢鞘氨醇(DH-SPH)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、或鞘石岸脂(SM)。SPHINGOMAB确实与二氢鞘氨醇-l-磷酸(DH-S1P)、并且在更小的程度上与鞘氨醇磷脂酰胆碱(SPC),进行交叉反应(图3)。实施例4:在CNV的小鼠模型中SPHINGOMAB显著降4氐CNV和瘢痕形成使雌性C57BL6/J小鼠经受布鲁赫膜的激光诱导破裂，然后给予稀释在2jil生理盐水中的0.5昭的Sphingomab或同种型-配对的非特异性(NS)抗体。在激光破裂后的第14和第28天处死小鼠。为了诱导CNV病变，用眼用托吡卡胺(0.5%)和去氧肾上腺素(2.5%)扩张瞳孔。将盖玻片放置在眼上。联接于裂隙灯(其设置为递送150mW的100毫秒月永冲，光斑大小为50jam)的OculightGL532nm(IridexCorporation,MountainView,CA)用来在右目艮的三个象限(位于离^L盘大约50pm,并成相对的9、12以及3点的位置)破裂布鲁赫膜。在所有情况下左眼作为未损伤对照。分析中排除与气泡没有关系的任何病变或成为融合的病变。为了测量CNV病变大小，制备了巩膜-脉络膜-RPE复合体的脉络膜扁平封装并染色脉管系统(蓖麻凝集素I;红色)和周细胞(CD140b;绿色)。利用落射焚光ZeissAxioplan2以及RGBSpot高分辨率数码相才几和激光扫描共聚焦显孩吏镜(BioRadMRC1024，BioRadCorporation,Temecula,CA)来捕获凄t字图亏象。对于容量分析，使用了z系列捕获并且整个z系列的病变面积的和乘以z厚度(4|^m)以获纟寻病变容积。为了评估胶原沉积，用马+>三色染色巩膜-脉络膜-RPE复合体。将巩膜-脉络膜-RPE复合体包埋在石蜡中，然后按顺序被切片成6微米的厚度。评价了大约30个切片/病变。以和针对CNV病变容积所描述的相同方式，计算了月交原沉积的容积。利用ImageJ软件(ResearchServicesBranch,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD)形态计量上评价了捕获的tt字图像。图4A示出在布鲁赫膜的激光诱导石皮裂以后的第14和第28天SPHINGOMAB显著减弱月永纟各月莫新血管形成。图4B示出在布鲁赫膜的激光诱导石皮裂以后的第28天SPHINGOMAB显著减少与CNV病变形成有关的纤维化。实施例5:通过多种机制，包括内皮细胞迁移和管形成的抑制，SPHINGOMAB4卬制新血管形成SIP促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移，以及在基质膜和其它测定中促进体外从头BV形成的形成；SPHINGOMAB可以中和SIP的这些-丈应。i口由Visentinetal.(CancerCell2006Mar;9(3):225-38)所描述的，进行实验。图5A中的数据表明在有SIP存在的条件下接种到GF-减少基质膜上的HUVEC形成了多种毛细血管样结构，以及在没有SIP存在的条件下或当与SPHINGOMAB和SIP共同温育时，则没有形成毛细血管冲羊结构。图5B中的数据说明了，相对于非治疗HUVEC、或在基质膜化学侵入测定中与SPHINGOMAB共同温育的HUVEC,0.1-1jiMS1P能够刺激HUVEC迁移达2-2.5倍。合起来讲，这些研究说明了，SPHINGOMAB可以有效地緩和SIP对EC的促血管再生影响。实施侈'j6:通过多种才几制，包4^体内緩解S1P、VEGF以及bFGF的影响，SPHINGOMAB抑制新血管形成基于体内研究，其表明S1P增加了内皮毛细血管生长进入皮下植入基质栓，我们推测SPHINGOMAB可以减少体内/人头BV形成。为对此进行研究，我们采用了用于新血管形成的体内基质栓测定。在一组实验中，与lpMSlP、0.5吗/mLbFGF或1pg/mLVEGF—起补充基质胶，然后I.P.注射进入小鼠体内(n=4)。在10天后，将小鼠肝素化并被注射荧光凝集素、异凝集素B4-FITC,其结合于由形成生长中的BV的血管EC表达的黏着分子。然后^f全^皮切除，冰冻在OCT中，切片并观测FITC染色的BV。图6A中的凄t据表明，S1P是比bFGF或VEGF更有效的体内新血管形成的剌激剂[Lee,etal，(1999),BiochemBiophysResCommun,.vol264:743-50]，如由以下事实所i正明的与包含bFGF或VEGF的栓相比，在包含SIP的才全中有大量的FITC染色的BV。然后用苏木素和伊红对栓的切片进行染色，用于评估EC浸润(图6B)。EC的浸润是新血管形成中的关键步骤。和仅栓的基质膜相比。包含S1P的栓具有3倍增加的EC浸润。假定细胞浸润是EC,虽然我们知道其它细胞类型如免疫细胞也可以-故染色。甚至当SIP被加入基质膜4全时，每48小时系统给予SPHINGOMAB的小鼠(在^全4直入前1天开始)也显示出减少量的EC浸润。这些结果说明了SPHINGOMAB体内抑制EC浸润的能力。来自血液和周围症且织的内源性SIP可以向伤口^是供促血管再生刺S敫。研究了在伤口中SPHINGOMAB减少内源性SIP的能力。将最佳刺激的栓(基质月荑，补充有0.5pg/mLbFGF或10mg/mLVEGF)植入小鼠。在基质膜植入前l天开始，每48小时小鼠接受i.p.注射25mg/kgSPHINGOMAB或盐水。每个治疗组(基质月莫、基质力莫加上GF或基质力莫加上GF和纟会予的SPHINGOMAB)包括至少6只小鼠。在10天以后，用肝素治疗小鼠，注射异凝集素B4-FITC,将栓切除，包埋在OCT冷冻介质中并切片。通过凝集素-FITC染色血管来定性了解微血管密度，如图6C所示。在对照(未治疗)栓中BV染色是偶尔发生的，而包含bFGF或VEGF的栓呈现显著的血管形成的i正据。和来自经盐水治疗的小鼠的bFGF或VEGF栓相比，来自经SPHINGOMAB治疗的小鼠的栓呈现出BV形成的显著减少。染色血管的量化揭示了，与用盐水治疗的动物相比，来自用SPHINGOMAB治疗的动物的包含VEGF或bFGF的栓分别减少5至8.54咅的新血管形成(图6C)。这种估计进一步i正明了内源性血清和组织SIP增强孩史血管形成的能力以及SPHINGOMAB中和内源性SIP的促血管再生效应的能力。实施例7:SPHINGOMAB4卬制体内瘢痕形成通过激活成纤维细胞迁移、增殖以及"交原生产，S1P对于伤口愈合具有深远的贡献；SPHINGOMAB则中和这些影响。利用多种类型的成纤维细胞进行的若干研究证实了SIP促进伤口愈合的能力1)S1P增加了Swiss-3T3成纤维细胞增殖，如通过311-胸普掺入并利用标准方法所测得的(图7A)，2)在标准4爪伤伤口愈合测定中S1P促进心脏成纤维细月包的迁移(图7B);3)S1P促进了分离自转基因小鼠(具有月交原laGFP受体)的心脏成纤维细胞的月交原表达，如通过免疫荧光显微镜所指明的(图7C);以及4)S1P诱导WI-38肺成纤维细胞分化成肌成纤维细胞(在瘢痕重建中具有活性的细胞)，如由肌成纤维细胞标记蛋白、平滑肌肌动蛋白的增加的表达所指明的，其中使用了免疫印迹分析(图7D)。在每种这些测定中，SPHINGOMAB均中和S1P的效应。预计眼成纤维细胞将类似地回应S1P和SPHINGOMAB。已注意到心血管疾病和AMD的新生血管病变(包括瘢痕重建和其后不适当的纤维组织形成)之间的类合乂'〖生(Vine，etal.(2005),Ophthalmology,vol112:2076-80以及SeddonandChen(2004),IntOphthalmolClin,,vol44:17-39);因此，i人为SPHINGOMAB对眼新血管形成和疤痕的影响类似于它对心血管系统的影响。研究评价了在小鼠中在借助于左冠状动脉前降支的连接作用永久性心月几梗死(MI)以后SPHINGOMAB减少心脏瘢痕形成的效力。在外-+手术后48小时，开始系统乡会予25mg/kg的SPHINGOMAB或盐水。选择在48小时给予抗体以使正常的修复性瘢痕形成可以在早期重建阶萃殳发生并且在MI后立即允"i午有益的S1P刺激的血管发生。梗塞后两周，将小鼠处死并通过心脏组织的马松三色染色来了解纤维化。接受SPHINGOMAB治疗的动物呈现出几乎完全消除了血管周纤维化(图7，图片)。作为任何非特异性伤口-愈合反应的对照，使假动物经受没有冠状动脉结扎飞开胸术(图7E)。实施例8:SIP促进眼上皮细胞和成纤維细胞转化成产生收缩性瘢jU且织的肌成纤维细胞在许多眼部疾病中，病理性组织纤维化(瘢痕形成)是主要的促成因素，其中眼部疾病包4舌年龄相关性黄斑变性、并唐尿病性一见网膜病、早产儿视网膜病、增生性玻璃体视网膜病以及青光眼外科手术的后果。在i午多这些疾病中，循环生长因子和趋化因子会促进正常眼细刀包转化成产生纤维收缩性瘢痕组织的细力包，其称作"肌成纤维细胞"。通常，肌成纤维细胞负责组织修复一部分作为损伤后伤口愈合反应。然而"几成纤维细力包凄t目和功能的改变与一些疾病有关，这些疾病的特征在于肝脏、皮肤、肺脏、肾、心脏以及眼中的病理性瘕痕组织形成。在眼中，视网膜色素上皮(RPE)细胞转化成肌成纤维细胞表型涉及纤维收缩膜的形成，其引起视网膜脱离以及随后的祸」觉在夹陷。此外，在眼损伤以后，眼成纤维细月包的月几成纤维细月包转化可以导致产生异常的瘢痕组织，,人而导致随后的^L力减退。虽然已鉴定了在眼中促进肌成纤维细胞形成的许多循环蛋白因子(circulatingproteinfactor)，^f旦并不^口道〉容月旨质^口SIP在jt匕过禾呈中的作用。因此，我们检查了S1P对若干人眼细胞系的肌成纤维细胞转化的影响。如图8所示，S1P刺激在人^L网膜色素上皮细胞(图8A)和人结月莫成纤维细月包(图8B)中产生a-平滑月几月几动蛋白(a-SMA;—种肌成纤维细胞标记)。这些教:据首次说明了，S1P处于循环4匕学因子的环境中，这些循环化学因子促进眼上皮细月包和成纤维细"包转^f匕成产生收缩性、瘢痕组织的"几成纤维细力包，其可以有助于视网膜脱离、目艮纤维化以及随后的视觉缺陷。在这些实验中，S1P促进a-SMA表达的能力以浓度依赖性方式在一见网膜色素上皮细胞和结膜成纤维细胞之间有差异。如所示，在上皮细胞中在0.001pM浓度下观测到a-SMA表达的显著增加，其然后降低到在10(nM浓度下的基础水平。与此相反，在结膜成纤维细胞中4又在10|liM浓度下观测到a-SMA表达的显著增加。认为这种差异起因于，与成纤维细月包相比，在上皮细月包中增加的S1P受体表达。由于增加的S1P受体表达水平，视网膜色素上皮细胞可能对低浓度的S1P更敏感。与此相反，在高S1P水平下，受体变得敏感或可能甚至内在化，从而导致S11P的降低的刺激。145胶原是主要结构蛋白之一，其支持体内的所有组织并且是瘢痕组织的主要成分之一。在非病理性环境中，借助于通过成纤维细胞的月交原生产和通过某些酶的降解之间的平#f来维持组织内的总胶^原含量。许多涉及增加水平的瘢痕组织的疾病部分起因于生理及分子过程，其抑制瘢痕形成所需要的胶原的降解。据推测，S1P促进瘢痕组织形成的能力可能起因于其抑制胶原降解的能力，从而导致器官内瘢痕组织的净增加。因此，检查了在人结膜成纤维细胞中S1P对纤:;容酶原激活物^^卩制剂(PAI-1)的表达的影响。增加的PAI-1表达与结締组织的蛋白降解的降低相关并且伴随若干纤维变性疾病(其涉及增加的疤痕)；故正调节。如图8C所示，S1P以剂量依赖性方式刺激PAI-1表达。这些数据表明，通过刺激抑制其降解的蛋白质的表达也可以促进瘢痕组织形成，这4是示S1P是通过多种途径来发4军4乍用，以促进和维持与眼部疾病有关的病理性疤痕。实施例9:SPHINGOMAB4卬制炎'性和免疫细胞浸润炎症是重建过程中的第一反应。它由缺血和由细胞损伤所触发并且导致细胞因子表达的正调节，其刺激巨嗟细胞和中性粒细胞迁移到受伤区域以吞噬死细胞，以及进一步正调节炎性应答[Jordan，etal.(1999),CardiovascRes,,vol43:860-78]。月巴大细胞也是炎性应答的重要细胞介质。由肥大细胞释放的S1P是在炎症的实验动物模型中看到的"i午多不良反应的原、因[Jolly,etal(2004),JExpMed,，vol199:959-70以及Jollyetal(2005),Blood，，vol105:4736-42]。基于在CNV和CVD中免疫和炎性应答的类似性，用鼠梗塞模型评价了SPHINGOMAB緩和免疫细胞浸润进入伤口的效力，作为在AMD期间SPHINGOMAB緩和这些损伤的潜在效应的指征[Vine:etal.(2005)，Ophthalmology,vol112:2076-80;以及SeddotiandChen(2004),IntOphthalmolClin，，vol44:17-39〗。MI四天后，分另'J矛J用146MAC-1和MCG35抗体评价了在危险区域内巨噬细胞和肥大细胞浸润。SPHINGOMAB显著减小炎性巨噬细胞(图9A)和肥大细胞(图9B)的密度，这提示了SPHINGOMAB可以中和AMD期间的免疫和炎性损害。实施例10:SIP小鼠单克隆抗体(LT1002;SDhingomab)的可变结构域的克隆和表征此实施例净艮道了相对于SIP的小鼠mAb的克隆。整体策略包^括克隆轻链(VL)和重链(VH)的小鼠可变结构i或。306DVH的共有序列显示，恒定区片段是与丫2b同种型一致的。连同轻链的恒定结构域(CL)和连同重链的恒定结构域(CH1、CH2、以及CH3)一起来克隆鼠可变结构i或，乂人而导致嵌合抗体构造物。1.鼠mAb的克隆使来自抗S1P杂交瘤细胞系306D326.1(ATCC#SD-5362)的克隆在DMEM(Dulbecco改良的4尹格尔培养基，包含GlutaMAXI、4500mg/LD画葡萄沣唐、丙酮酸钠；Gibco/Invitrogen，Carlsbad,CA，111-035-003)、10%FBS(SterileFetalCloneI,PerbioScience)、以及IX谷氨酰胺/青霉素/链霉素(Gibco/Invitrogen)中生长。利用基于RNeasyMini"i式剂盒(Qiagen,HildenGermany)的一呈序，总RNA分离自107个杂交瘤细力包。按照制造商的"i兌明，RNA用来产生第一《连cDNA(第一链合成i式齐'J盒，AmershamBiosciences)。通过PCR并利用MHV7引物(MHV7:5'國ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT-3'[SEQIDNO:I])连同IgG2b恒定区引物MHCGl/2a/2b/3混合物(MHCG1:5'-CAGTGGATAGACAGATGGGGG隱3'[SEQIDNO:2];MHCG2a:5'-CAGTGGATAGACCGATGGGGC-3[SEQIDNO:3];MHCG2b:5'-CAGTGGATAGACTGATGGGGG画3'[SEQIDNO:4];MHCG3:5'-CAAGGGATAGACAGATGGGGC画3'[SEQIDNO:5])来扩增免疫球蛋白重链可变区(VH)cDNA。利用TOPO-TAcloning⑧试剂盒和序列将反应产物连4妄于pCR2.1⑧-TOPO⑧载体(Invitrogen)。然后通过PCR从此载体扩增重链的可变结构域并作为HindIII和ApaI片段插入，接着连接于表达性载体pGlD200(参见美国专利第7,060,808号)或pG4D200(同上)，其包含HCMVi启动子、前导序列、以及y-1恒定区，以产生质粒pGlD200306DVH(图10)。306DVh的共有序列(如下所示)显示恒定区片,殳是与y2b同种型一致的。类似地，利用MKV20引物(5'-GTCTCTGATTCTAGGGCA画3'[SEQIDNO:6])连同k恒定区引物MKC(5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'[SEQIDNO:7])来扩增免疫J求蛋白k链可变区(VK)。利用TOPO-TA^011^^@试剂盒和序列将此反应的产物连接于pCR2.1⑧-TOPO⑧载体。然后通过PCR来扩增轻链的可变结构域，接着作为BamIII和HindIII片段插入表达性载体pKNIOO(参见美国专利第7,060,808号)，其包含HCMV启动子、前导序歹ll、以及人k恒定结构i或，乂人而产生质并立pKN100306DVK。将重链和轻链质粒pGlD200306DVH加上pKN100306DVK转化进入DH4a细菌并贮存在甘油中。如由制造商(Qiagen,没有内毒素的MAXIPREPTM试剂盒)所描述的，来制备大型质粒DNA。利用ABI3730x1自动测序〗义，其还将荧光信号翻译成它们的相应的才亥》威基序歹'J,乂于矛J用Qiagen'sQIAprepSpinMiniprepKit或EndoFreePlasmidMega/MaxiKit力口以纯4b的DNA才羊品进4亍测序。将引物设计在5'和3'端，以致获得的序列会发生重叠。引物的长度是18-24个碱基，并且优选地它们包含50%GC含量以及没有预测的二聚体或二级结构。来自SphingomabTM的用于小鼠Vh和Vl結构域的氨基酸序列分别是SEQIDNO:8和9(表2)。在表2中，CDR残基(参见Kabat,EA(1982)，PharmacolRev,vol.34:23-38)-波下划线，并且分别示于以下的表3中。表2:来自小鼠mAb,Sphingomab,的Vh和Vl結枸域OAHLOOSDAELVKPGASVKISCKVSGFIFIDHTIHWMKOR小鼠VHPEOGLEWIGCISPRHDITKYNEMFRGKATLTADKSSTTAYISEQID结构域OVNSLTFEDSAVYFCARGGFYGSTIWfDFWGOGTTLTVSNO:8小鼠VLETTVTOSPASLSMAIGEKVTIRCnTroiDDDMNWFQOKPGEPP结构域NLLISEGNILRPGWSRFSSSGYGTDFLFnENMLSEDVADYYCLQSDMJFTFGSGTKLEIK表3:小鼠VH和VL结构域的小鼠SphingomabCDR序列VtCDRCDRITTTDIDDD画(SEQIDNO:10)CDR1EGNILRP(SEQIDNO:11)CDR2LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)CDR3VnCDRDHTIH(SEQIDNO:13)CDR1CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)CDR2GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)CDR3在表4中比较了若干嵌合抗体可变(VH和VO结构域的氨基酸序列。将这些变体克隆到Lonza表达载体中。小鼠VH和VL结构域的序列用来构造分子才莫型以确定应爿夺哪些骨架残基加入人源化抗体。149<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table>相应的核苷酸序列示在表5中表5:pATH和CDR序歹'〗<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table>2.嵌合抗体的表达和结合性能将pGlD200306DVH加上pKN100306DVK的重链和轻链质粒转化到DH4a细菌并贮存在甘油中。如由制造商(Qiagen，没有内毒素的MAXIPREPTM试剂盒Cat.No.12362)所描述的，制备大型质粒DNA。对于在非人哺乳动物系统中的抗体表达，通过电穿孔(0.7ml,1(f个细胞/ml)并利用10ug的每种质粒，将质粒转染到非洲绿猴肾成纤维细胞细胞系COS7。在8ml生长培养基中平皿培养经转染的细胞4天。在瞬时共转染COS细胞条件培养基中，以1.5pg/ml表达嵌合306DH1x306DVK-2抗体。利用SIPELISA测量了此抗体与S1P的结合。用定量ELISA确定嵌合抗体的表达水平，具体如下。用稀释在PBS中的100(ill等分部分的0.4(uig/ml羊抗人IgG抗体(Sigma，St.Louis,MO)〉余布樣史量滴定^反(NuncMaxiSorp多孑14反，Invitrogen)，然后在4。C温育过夜。然后用200pl/孔的洗涤緩沖液(1xPBS、0.1%TWEEN)洗涤滴定一反三次。将等分部分的200的每种稀释的血清样品或融合上清液转移到涂布有毒素的滴定板，然后在37°C下温育1小时。在用洗涤^1冲液洗涤6次以后，以1:5000稀度将羊抗人k轻链过氧化物酶共辄物(JacksonImmunoResearch)力口入每个孑L。在室温下进行反应1小时，用洗涤緩冲液洗涂滴定板6次，然后在每孔中加入150]LiL的K-BLUE底物(Sigma)，在室温下并在黑暗中温育10分钟。通过加入50(il的REDSTOP溶液(SkyBioLtd.)来纟冬止反应，然后利用MicroplaterReader3550(Bio-RadLaboratoriesLtd.)在655nm处测定吸收。来自抗体结合测定的结果示在图11中。3.293F表达将重链和轻链质粒转化到Top10大肠杆菌(OneShotTop10化学上能胜任的大肠杆菌细胞(Invitrogen,C4040-10))并5&存在甘油中。如由制造商所描述的(Qiagen,没有内毒素的MAXIPREPTM试剂盒CatNo12362),制备大规才莫质粒DNA。》于于在人体系乡充中的4元体表达，利用293fectin(Invitrogen)和利用用于i咅养的293F-FreeStyleMedia(Invitrogen),3寻质并立4争染到人类胚胎肾细胞系293F(Invitrogen)。均以0.5g/mL转染轻链和重链质粒。以1(^个细胞/mL的细胞密度进行转染。转染3天后，在25GC下，离心(1100rpm)收集上清液5分钟。通过定量ELISA来量4t表达水平(参见先前实施例)，并且对于嵌合抗体，表达水平为~0.25-0.5g/mL。4.抗体纯化借助于使培养上清液以0.5mL/分钟通过A蛋白/G蛋白柱(Pierce,Cat.No53133)以从培养上清液纯化单克隆抗体。流动相包括IXPierceIgG结合緩冲液(Cat.No21001)和O.lM甘氨酸pH2.7(Pierce,ElutionBuffer,CatNo21004)。用IM石舞酉交盐纟爰冲液，pH8.0，对在0.1M甘氨酸中的抗体收集物稀释10%(v/v)，以中和上述pH。合并IgG!收集物，并相对于IXPBS(PierceSlide-A-LyzerCassette,3,500MWCO，Cat.No66382)充分透析。利用CentriconYM-3(10,000MWCOAmiconCat.No4203)并通过在2,500rcf下离心1小时来浓缩洗脱液。通过如上所述的定量ELISA并利用商用骨髓瘤IgGi贮存液作为标准来确定抗体浓度。通过ELISA并利用单克隆4元体同种型i式剂盒(MonoclonalAntibodyIsotypingKit,Sigma,ISO-2)来确定mAb的重链类型。5.抗体变体与SIP的比较结合下表6示出了突变体与嵌合抗体的比较分析。为了产生这些结果，通过对于小鼠或人IgG特异的并共辄于HRP的二抗来检测结合的抗体。测量显色反应并才良告为光密度(OD)。抗体小组(panelofantibody)的浓度为0.1ug/ml。没有冲金测到二抗与仅涂布SIP的基质之间的相互作用。表6:比较结合于嵌合抗SIP抗体的变体上的SIP可变域突变质粒结合嵌合pATH50+pATH101.5CysAlapATH50+pATH112HCCysSerpATH50+pATH120.6CysArgpATH50+pATH140.4CysPhepATH50+pATH162IXpATH53+pATH101.66.通过表面等离子体共4展(SPR)来确定结合动力学用Biacore2000光学生物传感器(BiacoreAB,UppsalaSweden)收集所有结合数据。将SIP耦联于马来酰亚胺CM5传感器芯片。首先，用NHS/EDC的等量混合物激活CM5芯片7分钟，接着用乙二胺进行7分钟阻断步骤。接着，使石黄基-MBS(PierceCo.)以在HBS流动緩沖液(10mMHEPES、150mMNaCl、0.005%p20、pH7.4)中的0.5mM的浓度通过表面。将S1P稀释到HBS流动緩沖液中至O.lmM的浓度并注射不同长度的时间，以产生两种不同密度的S1P表面(305和470RU)。4妄着，收集mAb的结合数据，其中<吏用34咅稀释系歹0，只t于小》鼠、201308、201309、以及207308*1体分别开始于16.7nM、50.0nM、50.0nM、16.7nM、以及16.7nM。重复试验每个浓度。用50mMNaOH来再生表面。所有数据是在25。C下收集。利用参考表面以及空白注射来处理反应数据。将数据集(来自两个表面的反应并且每种变体试验两次)适合于相互作用模型以获得结合参数。利用1:1(小鼠)或1:2(变体)相互作用模型总体上拟合来自不同mAb浓度的数据，以确定表观结合速率常数。圓括号内的数目表示在最后一位数的误差。实施例11:与S1P的嵌合mAb如在本文中所使用的，术语"嵌合"抗体(或"免疫球蛋白")是指一种分子，该分子包含重链和/或轻链，其相同于或同源于在衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列，而链的其余部分相同于或同源于在彩t生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列，以及上述抗体的片段，只要它们呈现所期望的生物学活性(Cabilly，etal.,上文；Morrisonetal，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851(1984))。利用可变区(Fv),从包含人IgGl免疫球蛋白的Fc区的特定的杂交瘤细胞(ATCC安全保存保藏号SD-5362)产生与SIP的嵌合抗体，其中可变区(Fv)包含鼠抗体的活性SIP结合区。Fc区包含人抗体的CL、ChL、以及Ch3结构域。不受限于特定的方法，嵌合抗体还可以产生自人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、或IgM的Fc区。如那些本领域技术人员将明了的，可以通过4并接鼠抗S1PmAb的互补决定区(CDR,例如，CDR1-4)来产生"人源化，，抗体，其中鼠抗SlPmAb包含人抗体骨架区(例如，Frl、Fr4等)，如IgGl的骨架区。图11示出了在利用石克醇化S1P作为沉积材一牛的直4妾ELISA测量中嵌合的以及全小鼠mAb的结合。对于图11所示的直接ELISA实验，与S1P的嵌合抗体具有与全小鼠单克隆抗体类似的结合特性。在结合纟爰沖液(33.6mMNa2C03、lOOmMNaHC03;pH9.5)中，并在96孑L高结合ELISA平板(Costar)中实施ELISA,其中平板涂布有0.1ug化学合成的、共轭于BSA的石克醇化S1P。在ELISA平板中，在37°C下温育硫醇化S1P-BSA—'h时，或在4。C下温育过夜。然后用PBS(137mMNaCl、2.68mMKCl、10.14mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)洗涤平4反四次，4妄着在室温下用PBST阻断1小时。对于最初温育步骤，用在PBST中稀释的25jaL的0.1jag/mL抗SIP单克隆抗体温育75uL样品(包含待测量的SIP),然后将其加入ELISA平板的孑L中。在三个孔中对每个样品进行测试。在室温下温育1小时以后，用PBS洗涤ELISA平板四次，然后在室温下用100ul/孔的0.1ug/mL的HRP羊4元鼠二4元(JacksonImmunoresearch)S显育1小时。然后用PBS洗涤平板四次并暴露于四曱基联苯胺(Sigma)1-10分钟。通过加入等容积的lMH2S04来终止^r测反应。利用EL-X-800ELISA平才反读取器(Bio-Tech)在450nm处进4亍测量以确定才羊品的光密度。而且，测量免疫动物血清或产生抗体细"包如杂交瘤细"包的细胞条件培养基(例如，上清液)中的抗体滴度的优选方法涉及用靶配体(例如，S1P的疏醇化类似物、LPA等)涂布ELISA平板，其中该輩巴配体已共^f介连4妄于如BSA的蛋白质载体。不受特定的方法或实施例的限制，可以相对于其它脂质輩巴如LPA、PAF、神经酰胺、石危普脂、脑苷脂、心磷脂、石粦脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、类花生酸、以及其它白三烯等来产生嵌合抗体。另外，如果需要的话，许多这些脂质还可以#皮糖基化和/或乙酰化。实施例12:人源4匕抗S1P单克隆抗体LT1009(Sonepcizumab)的产已表明特异性地结合S1P的鼠抗S1P单克隆抗体306D(LT1002;Sphingomab)可以在各种动物才莫型中有效地抑制血管发生和肿瘤生长。如下所述，利用序列同一性和同源性搜索将小鼠CDR拼接到其中的人骨架和用来指导某些骨架回复突变的计算机生成的才莫型来对LT1002进4亍人源化。两种变体，HuMAbHCLC(LT1004)(在轻链中具有3个回复突变)和HuMAbHCLCs(LT1006)(在轻链中具有5个回复突变)，在纳摩尔范围内呈现结合亲和力。进行进一步的设计以努力改善人源化变体的生物物理特性和生物学特性。人源4b变体HuMAbHCCysAlaLC3(LT1007)和HuMAbHCCysAlaLC5(LT1009),其中HCDR2中的游离半胱氨酸残基被丙氨酸替换，在皮摩尔范围内呈现结合亲和力。所有人源化变体在年龄相关性黄斑变性(AMD)的力永络力莫新血管形成(CNV)模型中抑制血管发生，其中和亲代鼠抗体相比，HuMAbHCCysAlaLC5(LT1009)呈现优越的稳定性和体内效力。变体huMAbHCcysalaLQ(LT1009)称作SonepcizumabTM。a.用于抗SIP抗体的人源化设计借助于CDR拼接来人源化小鼠mAbLT1002(Sphingomab)的可变结构域(Winter美国专利第5,225,539号)。如Kabatetal.1991所描述的，基于序列高变性而鉴定CDR残基。在此研究中，基于利用结构序列对比程序(SRv7.6)在IMGT和Kabat数据库中进行的人抗体的同源性搜索来选择适宜的受体结构。最初步骤是分别用LT1002VH和VL蛋白质序列查询这些人重链可变(VH)和轻链可变(VL)序列数据库，以鉴定在FR中、在Vernier(Foote，J.&Winter，G.Antibodyframeworkresiduesaffectingtheconformationofthehypervariableloops.JMol.Biol.224，487-499(1992))、Canonical(Morea,etal.，Antibodymodeling:implicationsforengineeringanddesign,Methods20,267-279(2000))以及VH-VL界面(Chothia，C,NovotnyJ.,Bruccoleri，R.,&Karplus,M.Domainassociationinimmunoglobulinmolecules.Thepackingofvariabledomains.JMol.Biol.186,651-663(1985))残基处具有高序列同一性以及具有相同标准类和/或长度的CDR的人骨架(FR)。利用上述程序计算了此文库的每个成员与鼠抗体的单个序列对比残基的同一性。鉴定了那些人序列，其具有大部分相同于小鼠FR的FR序列，从而产生人"受体，，序列的最初短清单。还计算了在《鼓调(Vernier)、标准(Canonical)以及VH-VL界面(VCI)残基处与鼠抗体具有最大同一性的那些序列。在人和d、鼠之间在这些位置的差异分为保守取代和非保守取代，从而最好的骨架选择将具有与LT1002的最小凄t目的非4呆守VCI差异。LT1002的CDR环L3和HI可以分为典型结构。这些L3和HI结构用来选4奪具有相同典型结构的人抗体FR。对于未分类的CDR，则试图选择具有相同于鼠抗体的CDR长度的人骨架。基本理由在于，CDR环结构不仅取决于CDR环序列本身而且还取决于基础的骨架残基(典型残基)。因此，具有匹配的典型的CDR结构和/或CDR长度的人骨架可以以最合适的取向容纳拼接的小鼠CDR,以保持抗原结合亲和力。对于除CDRH3之外的所有CDR，这可以通过选择人骨架序列来实现。另外，在可能的情况下，排除具有异常半胱氨酸或月甫氨酸残基的骨架。分别对重链和轻链序列进行这些计算。最后，在整个骨架区，比较了在最好匹配序列中的单个序列差异。在最适合上述比專交计算的人抗体中，分別选才奪抗体AY050707和AJ002773作为轻链和重链的最合适的人骨架提供者。第二步骤是产生LT1002的可变区的分子模型以及鉴定FR残基，其可能影响抗原结合但并不包括在Vernier、Canonical以及界面残基的组中。检查了拼接供体和受体可变结构域的许多结构特征，以更好地理解各种FR残基如何影响CDR环的构象，并且反之亦然。按照Vernier和Canonical定义(参见上文)鉴定了在LT1002中可能影响CDR的非保守FR残基，由此将人FR的若干残基恢复到原来的小鼠氨基酸(回复突变)。b.诱变寿ll用QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene,Catalog#200524)在可变结构域序列内产生突变。用50ng双链DNA冲莫板、2.5U的PfuUltreHFDNA聚合酶和其相应的纟爰冲液(Stratagene,Catalog#200524)、10mMdNTP混合物和125ng每种再悬浮在5mMTris-HCl(pH8.0)中的诱变寡核苷酸、以及0.1mMEDTA进行个别反应。在95°C下进行预变性30秒，4妄着进行16次扩增循环95。持续C30秒，55°C持续60秒以及68。C持续8分钟。在温度循环以后，然后在37。C下借助于Dpnl消化而消化最终反应1小时以除去甲基化亲代DNA。将获得的突变体转化成感受态的XL1-Blue大肠杆菌并平皿培养在包含50昭/ml氨爷西林的160LB-琼脂上。然后通过测序来4企查集落。然后将每种突变体在1升摇并瓦中；咅养并利用来自Qiagen的EndoFreePlasmidPurificationKit(catalog#12362)力口以纯化。c.人源化抗体变体的生成通过将LT1002的可变结构域克隆到载体来构建小鼠-人嵌合抗体(chMAbSlP),其中载体包含k和重链的人恒定区以^f吏全长抗体可以表达进入哺乳动物细月包。人源化重链的产生是KabatCDR1、2以及3从LT1002VH拼接到AJ002773的受体骨架的结果。AJ002773的最近的种系基因是VH5-51,其前导序列净皮结合到人源化重链变体中作为前导序列。表4示出了pATH200的蛋白质序列、LT1002VH的第一人源化变体，并具有VH5-51前导序列。在LT1002的VH结构域的情况下，在位置2、27、37、48、67以及69处的残基是Vernier残基或在Vh和VL结构域界面处的残基，由此可能影响CDR耳又向。位置37对于Vh和VL结构域之间的界面似乎是关4建的。在人骨架中在这些位置的残基与存在于相应位置的鼠残基发生回复突变。逐个地试验了突变V37M、M48I以及Y27F。一种变体(pATH205)包含所有3种突变连同V67A加上I69L,而另一种变体(pATH206)包含所有5种突变加上V2A。人源化轻链的产生是KabatCDR1、2以及3从LT1002Vl掛接进入AY050707的受体骨架的结果。AY050707的最近的种系基因是Lll，其前导序列被结合到人源化轻链构建体中。pATF300(LTl002轻链)的蛋白质和DNA序列分别是SEQIDNO:17和28(关于氨基酸序列，参见表4)。在VL的情况下，选择四个非保守Vernier位置4、36、49、64用于回复突变到鼠残基，因为它们参与支持CDR环的结构。LT1002的分子才莫型的检查表明，Tyr67靠近CDR表面并取向于抗原结合平面并且能够与S1P相互作用。因此，将S67Y回复突变也加入到之后的人源化变体中。分别引入两种突变以产生包含Y49S或Y36F的两种变体。〗昔助于突变的以下《且合产生了若干变体(Y49S,F4V)、(Y49S，Y36F)、(Y49S,Y36F，F4V)、(Y49S,G64S)、(Y49S，Y36F,F4V,G64S)、(Y49S，Y36F，F4V，G64S，S67Y)、(Y49S，G64S，S67Y)。d.人源化前导候选物的选择将基本拼接本(basicgraftedversion)(pATH200和pATH300)和所有包含回复突变的变体的可变区克隆到包含人VH或VL恒定区的表达性载体中。在与嵌合(chMAb)抗体相同的条件下在哺乳动物细胞中产生所有人源化变体，然后通过ELISA试验与S^P的结合。对于人源化变体，产率为大约10-20mg/l，而对于chMAbSlP，产率则为0.3-0.5mg/1。在还原条件下的SDS-PAGE揭示了在25kDa和50kDa处并具有高纯度(>98%)的两个条带，其与轻《连和重链的预期质量一致。在非还原条件下观测到预期质量约为~150k的单条带。在人源化抗体结合测定中使用chMAb作为标准，因为它包含与亲4义鼠抗体相同的可变区并且携带与人源4b抗体相同的恒定区，因而可以利用相同的ELISA试-验失见程加以一佥测。最初的人源化抗体，其中将6个鼠CDR^H妄到未突变的人骨架中，该抗体并不显示与SIP的任何可检测的结合(图11)。包含4个回复突变(Y49S、Y36F、F4V以及G64S)的K轻链，连同嵌合重链，呈现与S1P的次优结合(如通过ELISA测得的)。在位置Y67结合另外的突变可显著改善结合。包含回复突变Y49S、Y36F、F4V、G64S以及S67Y的变体pATH308以及包含回复突变Y49S、G64S以及S67Y的变体pATH309,连同嵌合重链，均产生抗体，其与嵌合抗体类似地结合S1P(如通过ELISA确定的)。从SIP结合的角度考虑，并不认为两个突变Y36F和F4V是回复突变所必需的。需要在VL骨架中设计3至5个回复突变以恢复活性。Vernier回复突变V37M连同嵌合轻链结合到重链的人骨架中，足以恢复类似于嵌合抗体的结合特性(图11)。总之，LT1002VH结构域的人源化仅需要来自鼠类骨架序列的一个氨基酸，而鼠VL骨架结构域，必须保留三个或五个鼠类残基以实现相当于鼠亲代LT1002的结合。e.人源化前导候选物的优化鼠抗S1P抗体包含在重链的CDR2(Cys50)中的游离半胱氨酸残基，其能够潜在地引起抗体分子的某种不稳定性。利用定点诱变，并通过用丙氨酸(huMAbHCcysalaLC)(pATH207)、甘氨酸(huMAbHCcysalaLC3)、丝氨酸(huMAbHCcysserLC3)、以及苯丙氨酸(huMAbHCcyspheLC3)来取代半胱氨酸残基乂人而产生pATH201的变体。还用包含5个回复突变(huMAbHCcysalaLC5=LT1009)的人源化轻链(pATH308)测试了半胱氨酸突变重链。将变体在哺乳动物细胞中表达，然后用一小组体外测定加以表征。重要的是，人源化变体的表达率显著高于chMAbS1P。f.人源化前导候选物的深入表征i.特异性。相对于S1P和若千其它生物脂类,用竟争性ELISA测定测试了人源化变体的特异性(图1)。这种测定具有i更于表位作图的另外益处。人源化抗体LT1009表明对于鞘氨醇(SPH)，S1P的直接代谢前体，或LPA(溶血磷脂酸)没有交叉反应性，其中LPA是一种重要的胞外信号分子，其结构和功能上类似于S1P。此外，rhuMAbSIP并不识别其它结构类似的脂质和代谢物，包括神经酰胺(CER)、神经酰胺-l-磷酸酯(C1P)。然而，正如所预期的，LT1009确实与鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)交叉反应，鞘氨醇磷酸胆碱是一种脂质，其中S1P的游离磷酸基团连接于胆碱残基。重ii.结合亲和力。如图11所示，IgG结合于S1P涂布芯片的Biacore测量结果表明变体LT1004或LT1006在4氐纳摩尔范围内(类似于chMAbS1P)呈现结合亲和力。其中半胱氨酸残基被丙氨酸替换的人源化变体LT1007和LT1009在皮摩尔范围内呈现结合亲和力，其类似于小鼠亲代LT1002(SphingomabTM)。稳定性。在高温刺激以后，测试人源化变体的稳定性。通过使上清液经受60至74°C的温度范围，确定每种人源化变体的热解折叠转变温度(rM)和适当的中点。这些温度的选择是基于在50和80。C之间的專交宽温度范围内在热攻击以后针7于鼠抗体分子所7见测到的变性轮廓。在热攻击前后确定每种变体的结合性能。鼠抗体呈现65。C的rM。和所有其它变体相比，变体huMAbHCcysalaLC5(LT1009)呈现优越的rM。表7示出前导人源化候选物以及它们的特性。表7:前导人源4匕SIPmAb4吳选物和^i指出在重链和轻链中的突变数目。i兌明栏给出重链和轻链的同一性。<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table>iv.序列如同天然存在的抗体一样，在每两个轻链多肽和每个重链多肽(其包含每种抗体分子)中LT1009包括三个互补决定区(每个"CDR")。下面提供了这些6个CDR的每一个的氨基酸序歹'J("VL，，表示免疫J求蛋白轻链的可变区，而"VH"表示免疫球蛋白重链的可变区)CDR1VLCDR2VLCDR3VLCDR1VH165:ITTTDIDDD画[SEQIDNO:10]:EGNILRP[SEQIDNO:11]:LQSDNLPFT[SEQIDNO:12]:DHTIH[SEQIDNO:13]CDR3VH:GGFYGSTIWFDF[SEQIDNO:15]CDR2VH:AISPRHDITKYNEMFRG[SEQIDNO:31]LT1009的重《连和轻链多肽的核苷酸和氨基酸序列列于如下可变结构域的LT1009HC氨基酸序列[SEQIDNO:32]:1mewswvflfflsvttgvhsevqlvqsgaevkkpgeslkiscqsfgyifid51htihwmrqmpgqglewmgaisprhditkynemfrgqvtisadkssstayl101qwsslkasdtamyfcarggfygstiwfdfwgqgtmvtvss可变结构j或的LT1009LC氨基酸序列[SEQIDNO:33]:imsvptqvlgilllwltdareettvtqspsflsasvgdt:vtiteitttdid51.cidmnwfqqepgkap.kllisegnilrpgvpsrfsssgygt.dftltisklqp10iedfatyyclqsdnlpftfgqgtkleik1661aagettgrecgeeac:c;at:gga51cgtgaccdcaggcgtgcatt101aggtgaaaa.agcccggggag151.tscatc;tttategaeeatae20.1a.gg'ectgg的tggatggggg25ia.caatgagatgttcaggggc301agcaccgcct.acttgcagtg351gtatttctgtgega，gggg40itttggggccaagggacd:atg451ecatcggtcttceccctgge5G1agcggccctgggctgectgg551tgtcgtgga:actcaggcgcc601gtcctac:agtcct.caggact651ctccagcagcttgggcaccc701ccagcatacatGcaaggtggee751，ga冊gtgtctgctggaag801cc;ggctatgcagtcccagteS5ittcacccggaggcctctgcc901ctggetttttecdcaggcte351c.aggccctgcaeacs歸ggg1001catatccgggaggaccctge1051etct.ec;3etc;cctC3ge七cgllOl.cteccaatcttctctctgca1151tgcccacGgtg'cccsggtaa1201gcgggacaggtgc.cctagag1251.gg'tgctgacacgtccacctcI30igggaccg'tca.gtc.tt.cctct1351tctcccgga.c.ccctgaggtc1401gacec'tgaggtea'ag'ttcaa1451tgecaagacaaagcegcggg1501teagegtecteaecgtectg1551aagtgcaaggtctccaac.aa160:1ctccaa.agccaaag:gtggga165iggccggctcggcccaecctc1701tgtccetac'agggcagccec175icccgggagga.诉tg'accaagggcttctatcccagcgacat1851ggagaacaactacaagacca1901tcttcctcta:tagcaagcte1951.aacgtcttctcatgctccgt2001gcagaagagectctccctgtat的agctgggtgttcctgttctttctgtectgaggtgcagc.tggtgcdgtctggagctetctgaagatctcctgtcagagttttggatatteaet的atgcgccagatgccc萌gcaetatttcteecagacatgartattactaaatcaggtcaccatctcagccgacaagtccagc■gagcagcctgaaggcctcggracaccgccat的ttetac的tagtactatctgg比tgactgtcaccgtG仁cttcagcctccaccaagrggcacectcctccaagagpcacetct的gggcactcaaggactacttccccgaaceggt.gacggctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctetactcccteagcagcgtggtgaccgtgccagacctacatctgcaacgtgaatc'acaagcaagag恩gttggt:gagraggc:cagedc呵ggacca鄉ctcagcgctcctgcctggacgcatccagggcageaaggcaggccccgtctgcctccgccccacitcat.gctcagg'gagagggtct.ttgggeaggeacaggctaggtgeceetaaccgcaggtgctgggctc的acctgccaagagcccctgacctaa.gcccaccccaaaggccaaagaeaccttctcteeteec改gattceagtaag:ageec歸atcttgtgacaaaacteacacagccdgcccsggcctcgccctccagctcaagtag.cctgcatccagggacaggccccagccgc.atctcttcctcagc:acctgaactcctgggtcccccc歸aac.cc歸ggaeaccetcatgaacatgcgt冊tggtggacgtgagcc.acgaactg'gtacgtggaGggcgtgga.ggtgcataaagga'gcagtac'aacagcacgt'accgtgtggeaecaggae.tggetgaatggeaa的agtaeagccctccc.agccccestcgagaa縣ccatcccgt.ggggtgcgag，ccatcatggacagatgccctgagagftgaccgctgt.acca,acetcgaga.aceacaggtgtacaceetgeccccatMeeagg'tcagcctgacctgcctggtc歸acgccgtggag'tgggagagcaatgggcagc:cegcetcccgtgctggac'teegacggctcc;taccgtggacaagagcaggtggcageagggggatgcatgaggctctgcaeaaecactacacctccgggt.綠atagLT1009HC氨基酸序列[SEQIDNO:35]:■mewswvflfflsvttgvhsevqlvqsga.evkkpgesl'kiseqsfgyifi(i■51hti.hw匿qmp10]，sslfeasdl:151lapsskstsg201glyslsswt251fppkpkdtlm301eeqynstyrv351pi:epqvytip401ttp.pvldsdg451l邻g'ka,fcarggfgtaalgelvkvpsssigtqtvsvltvlhqdpsreemtknqsfflyskltvsprhciitkynygstiwfdfwyicnv油kps■vvdvshedpewlngke.ykck柳frgqvtisgqgt醇t.vsswnsgaltsgvntkvdkr-va'pvkfrjwyvclgvv.snkaipapifscsvmheslhtfpaviqsseliggpsvf1evhnaktkprektiskakgqsngqpe加ykhnhytqkslsLT1009LC核普酸序列[SEQIDNO:36〗:1aagcttgccg51gctgtggctg101ccttcctgtci51accact.gata■201a.gcccct站g■251catcaa.gatt.301agc餘Attge351taacttacca401cggt.ggctgc451aaatctggaa501agaggcc33a.551cccaggagagSOIagcagc.aecc651cgcctgcgaa.;'01tcaaca.ggggccaccatgtcacagacgccctgcatctgtattgatgatgactcctgatctcagcagcagtagectgaagattcactttcgacc改.tctgtcctgcctctgtgtacagtggatgtcacagagtgacgctgaggtcacccatcagagtgtt.agtgtgcctscc.getgtgaaacg'gragac'agagtatgaactggggatatg'gcattttgcaact.gccaagg'gacttcstcttcctgtgtgcctgaggtggat為acaggacagcacaggtgctgggacagtgacgtcscc3tcacttccagcaggtattcttcgteaga.tttcactattaetgttcaa.gctggagcgccatctg3ctgaataa.ctaggacagcactacgagaaacctc.gcccgtc■gactgctgctca.gtctccattt.gcataaccaaccagggaacetggggtcctCtC3CC3tCtgcagagtgatgagcagttgtc'tatcccatgtegggtaactctacagcctcacaaagtctaacaaag'agctLT1009LC氨基酸序列[SEQIDNO:37]:.1msvptqvlgllUwltciarc:ett:vtqspsfisasvgdrTrtitcitttdid51dW啦wfqqepgkapkllisegniirpgvpsrfsssgygtclftlt.isklqp101edfaty:yelqsdnlpftfgqgtkieikrtvaapsvfifppsd夠lksgta151svvcll加fypreakvqwkvdnalqsgnsq;esvteqdskcistyslsstlt201lsikadyekhkvyace'vt.hqglsspvtksfnrgec实施例13:人源化SIPmAb的生产和纯化此实施例描述了重组人源化单克隆抗体(LT1009;SonepcizumabTM)的生产，其高亲和力地结合于生物活性脂质鞘氨醇-l-磷酸(SlP)。LT1009是全长IgGlk同种型抗体，由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，并且总分子量为150kDa。重链包含N连接的糖基化位点。寡糖结构的特性还未确定，但预计是具有核心岩藻糖的复合双触角结构。目前并不知道将占主导地位的糖型的特性。由于在重链的恒定结构域中存在赖氨酸残基，预计会存在某种C端异质性。两个重链通过两个链间二硫键彼此共价耦联，其与人IgGl的结构是一致的。LT1009最初来源于鼠单克隆抗体(LT1002;Sphingomab),其是利用杂交瘤细il包所产生，其中杂交瘤细^^产生自用S1P免疫的小鼠。鼠抗体的人源化涉及插入6个鼠CDR来代^,人抗体骨架的CDR，其选用是基于与鼠亲代抗体的结构类似性。在骨架中进行了一系列取代以设计人源化抗体。这些取代称作回复突变并且用鼠残基代替人残基，其中鼠残基在抗体与抗原的相互作用中具有重要作用。最后的人源化变体包含在重链的可变结构域的人骨架中的一个鼠回复突变和在轻4连的可变结构域的人骨架中的五个鼠回复突变。此外，在重链的CDR#2中存在的一个残基一皮替换为丙氨酸残基。这种取代显示可增加抗体分子的稳定性和潜能。将人源化可变结构域克隆到Lonza的GS基因表达系统以产生质粒pATH1009。该表达系统由携带抗体基因的恒定结构域的表达性载体和选择标记谷氨酰胺合成酶(GS)构成。GS是负责从谷氨酸酯和氨生物合成谷氨酰胺的酶。携带抗体基因和选择标记的载体被转染到适合于在无血清培养基中生长的专有的中国仓鼠卵巢(CHOK1SV)宿主细胞系并为细胞在没有外源性谷氨酰胺的情况下的存活提供足够的谷氨酰胺。此外，在培养基中补兖特异性GS抑制剂，蛋氨酸亚石风亚胺(MSX)，以抑制内源性GS活性，以致仅由载体提供的具有GS活性的细胞系可以存活。根据在有MSX存在的条件下在无谷氨酰胺培养基中的生长能力来选择转染细胞，并169且依据活性LT1009的高水平分泌来选4奪分离才朱。然后产生用于毒理学研究和临床开发的材料，用于毒性和临床开发。ATCC保藏包含pATH1009质粒的大肠杆菌StB12保藏在美国典型i备养物4果藏中心(AmericanTypeCultureCollection,4呆藏号PTA-8421)。用DNA质粒pATH1009转染的CHO细胞系LH1275也保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,保藏号PTA-8422)。实施例14:人源4匕mAb的制备通常，生产过程涉及三个阶段种子繁殖(seedtrain)、接种繁殖(inoculumtrain)、以及生产培养。所有阶賴使用无血清试剂和低蛋白细胞培养生长培养基。为了引发种子繁殖，使用了来自工作细胞库的细胞；传代培养细胞每次三至四天并且在种子繁殖培养物规定时间以后，引发接种繁殖。非选择性培养基(无MTX培养基)优选用来扩大细胞，用于引入生产阶段。通过连续移种将细胞扩大进入增加容积的血管。在接种物繁殖的一定天数，引发生产阶4殳。在容积为200L、400L、2000L、或20000L的生物反应器进4亍生产培养。以下描述生物反应器的一个实例。生物反应器的实例从2L生物反应器的按比例增加将首先开始于Applikon15L搅拌槽，然后顺序地进行到50L生物反应器、200L生物反应器并且最后是2000L生物反应器(均建造成相同规模)。这些槽的特性如下制造商ABEC,Inc.4要照ASME,SectionVIIIPressureVesselCode加以制造。4姿触表面是316LSS。底部偏置,驱动，ABECi殳计低剪切叶轮316LSS，抛光到15-20微英寸并钝化。直径约血管直径的1/2。4空制AllenBradleyControlLogicPLC,具有Versa查看才乘作者界面。搅拌AllenBradley传感器，A-BPLC控制输出，用于RPM<控制的VFI。温度双重控制100欧姆铂RTD传感器，A-BPLC控制热、冷和蒸汽阀w/循环泵。生物反应器为空的情况下，自动消毒周期。pH:Ingold传感器，凝胶填充，可力口压的，A-BPLC控制C02喷射。溶解氧Ingold极谱电极传感器，A-BPLC控制02喷射。空气和气体流量传感器是FourBrooksThermalMassFlowmeters,用于空气02、N2以及C02喷射，还提供Brooks热质量，用于空气覆盖，A-BPLC控制气体流量，用于pH自动、DO自动或手动控制通过A-BPLC的总气体流量。容器压力传感器是Rosemount卫生膜片式传感器，控制是传感器的A-BPLC控制，其中使用背压控制阀。可编程逻辑控制器(PLC):AllenBradleyControlLogixSystem,当指示时，用于过程的连续环控制。软件PLC编程是利用RockwellSoftware(AllenBradley)RSLogix5000。人才几界面(HMI):局部才喿作员界面是AllenBradleyHMIVersoViewIndustrial计算机，其具有集成FPD/触摸屏输入，以通过以太网与PLC通讯。库欠件是RockwellSoftwareRSView32。生产过程的实例。搅拌不锈钢生物反应器，同时控制温度、溶解氧以及pH。确定接种密度，以获得最优产率。通常使用无血清培养基。通常使用分批补料过程。通常具有温度变化。在生物反应器中的培养持续时间预期是8至14天。在规定收获时的生存力。将通过过滤来澄清收获物。在澄清以后并在纯化以前，收获物将^皮存^f诸在2-8。C。实施例15:人源化mAb的:Ui^纯化药物物质净化工艺通常由四个步骤构成A蛋白层片斤、阴离子交换层析(Q琼脂糖凝胶)、阳离子交换层析(CM琼脂糖凝胶)、以及超滤/渗滤(UF/DF)。亲和柱通常是收获和澄清后的第一步骤。该柱通常采用固定A蛋白树脂。亲和步骤可以相对于宿主细胞蛋白和DNA来纯^:抗体。为了灭活潜在的病毒，洗脱液经常经受病毒灭活过程，4妄着是阴离子交换层析步骤，以减少宿主细胞蛋白、DNA、A蛋白、以及潜在病毒。接着，阳离子交换层析步骤通常用来进一步减少残余量的宿主细胞蛋白和抗体聚集物。最后，对池进4亍'渗滤并进一步;农缩。典型的纯4b工艺在A蛋白柱以前，可以对收获物进行浓缩和緩冲液交换。上述工艺的下一步骤是A蛋白柱亲和层析。用^f氐pH值緩沖液对结合抗体进行洗脱。保持A蛋白洗脱液一,殳时间以灭活病毒。172上述工艺的下一步骤可以是在其中抗体产物流过而污染物如DNA和宿主细胞蛋白结合于树脂柱的条件下用Q(+)柱进行离子交换层析。上述工艺的下一步骤可以是在其中污染物流过柱的条件下用S(-)柱进4亍第二离子交才奂层析。可以〗吏用疏水相互作用柱步骤来代替S(-)柱步骤。上述工艺的下一步骤可以是纳滤病毒清除步骤，其中使用DV20或Planova过滤器。产物流过过滤器。上述工艺的最后步骤是渗滤进入最后药物物质配制緩沖液并超滤以获得目标蛋白浓度。实施例16:鼠抗S1P抗体的人源z化变体的生物学活性体外细力包测定试验了在有化疗药物存在的条件下，人源化抗体改变肿瘤细胞存活的能力，如图12所示。将SKOV3肿瘤细胞暴露于泰素，一种化疗药物，通过激活凋亡^5M于剂，胱冬裂酶-3，其i秀导肿瘤细月包死亡。与作为^t照的未经处理的细力包相比，S1P能够降j氐泰素"i秀导的月光冬裂酶-3;敫活和/或细月包死亡。二換照制造商的建"i义(Promega，Cat.NoG7792)进4亍凋亡测定。简单地说，将A549纟田胞(2500个细胞/孔)接种到96孔板并在处理以前允许生长至80°/。汇合。然后用和不用0.1-1|iM紫杉醇(Sigma，Cat.NoT7409)、0.1-1S1P以及l|ig/mL的抗S1PmAb,并在McCoy培养基中，处理细月包48小时。48以后，将胱冬裂酶测定緩沖液加入细胞。通过Apo-OneHomogeneousCaspase-3/7Assay试剂盒(Promega,Cat.NoG7792)并按照制造商的议定书，测得在上清液中的胱冬裂酶-3活性。胱冬裂酶-3/7活性表示为相对于经赋形剂处理的细胞的荧光信号的倍数增力口。173在有SIP存在的条件下，抗SIPmAb的力。入增力o了胱冬裂酶-3激活，这4是示抗体对SIP的选择性吸收消除了SIP的^f呆护性抗凋亡效应。和LT1002相比，人源化抗体变体，huMAbHCLC3(LT1004)和huMAbHCLC5(LT1006)，均呈现优越的活性。同时，试验了所有变体对从癌细胞的S1P诱导的细胞因子释放的影响。已知SIP会诱发IL-8从癌细胞显著释放进入细胞条件培养基。小鼠对照抗SIPmAb的加入以浓度依赖性方式减少从卵巢癌细胞的IL-8释放。和HuMAbHCLC3(LT1004)和huMAbHCLQ(LT1006)相比，两种人源4匕变体huMAbHCcysalaLC3(LT1007)和huMAbHCcysalaLC5(LT1009)呈5见IL-8释》丈的更大减少。实施例17:在新血管形成的动物模型中，鼠mAb(SDhingomab)与人源化mAb(Sonencizumab)的体内效力月永络膜新血管形成(CNV)是指在眼中来自l永络膜的新血管通过布鲁赫膜的破碎而生长进入视网膜下色素上皮(sub-RPE)或视网膜下腔隙。CNV是黄斑变性和其它眼病症中一见觉损失的主要原因。在此实施例中，CNV的小鼠模型用来相对于SlP对mAb进行评估。在AMD的CNV动物模型中比较了人源化抗体变体和鼠抗体的抑制新血管形成的能力，如图13所示。通过玻璃体内给予，两次(第0天和第6天)给予小鼠0.5ug的鼠(Mu;LT1002)、人源化变体[LC3(LT1004)、LC5(LT1006)、HCcysLC3(UT1007)以及HCcysLC5(LT1009)]或非特异性mAb(NS),然后受到布鲁赫膜的激光破裂。激光外科手术后第14天处死小鼠。用含水緩沖液(PBS)或同种型配对的非特异性抗体治疗对照小鼠。如通过测量CNV面积所评估的，三种人源化变体对血管发生的抑制基本上等效于鼠抗体。CNV病变容积表示为平均值土SEM。在轻链中包含5个回复突变以及在重链的CDR2中包含半胱氨酸突变的人源化变体(huMAbHCcysLC5;LT1009)显著地抑制新血管形成。这种差异是高度统计上显著的。为了诱导CNV,用在无菌盐水中的氯胺酮(14mg/kg)和赛拉。秦(30mg/kg)的混合物以5|_iL/20g体重的剂量腹腔内给予来麻醉小鼠。然后用各一滴眼用托吡卡胺(0.5%)和去氧肾上腺素(2.5%)来扩张它们的瞳孔。然后用连接于裂隙灯(用来递送150mW的100毫秒脉冲，光斑大小为50nm)的氩绿眼用激光器(OculightGL532nm,IridexCorporation,MountainView,CA)在右目艮的三个象卩艮(大约位于离视盘50(am处并在相对的9、12以及3点钟的位置)破裂布鲁赫膜。在所有情况下，左眼作为未损伤对照。形态计量和容积CNV病变的测量如下。激光诱导CNV两周后，通过过量的氯胺酮-赛拍秦混合物z使动物安乐死，然后借助于心脏穿刺并用在PBS中6ml4%多聚甲醛，pH7.5(固定液)进4亍全身灌注，如先前所描述的(Senguptaetal,2003)。然后将眼摘除，用27g4十并在》彖后面1mm处穿刺，并在室温下浸没在固定、液中1小时，然后通过浸没在PBS中30分钟加以洗涤2X。然后将眼切开以分离后节，其由视网膜色素上皮、脉络膜毛细血管层以及巩膜构成。然后渗透此组织并与罗丹明共辄蓖麻凝集素I(VectorLaboratories,Burlingame,CA)进4亍反应以4企测CNV病变，4o先前所描述的(Senguptaetal，2003;Senguptaetal，2005)。然后后尖被切割成4-7个4圣向4刀片，并扁平安力丈在含有一滴Vectashield抗4逸色介质(VectorLaboratories,Burlingame,VT)的显孩吏4竟载3皮片上，用于通过落射荧光ZeissAxioplan2(带有RGBSpot高分辨率数码相机)和激光扫4笛共聚焦显樣H竟(BioRadMRC1024,BioRadCorporation,Temecula,CA)进行数字图像采集。利用ImageJ软件(ResearchServicesBranch,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)对捕获的数字图4象进行形态计量评价。图像^皮分成分开的RGB通道，用于分析红色和绿色通道如下1)进行用于特定物镜和显微镜的校准以设置像素与长度之比；2)利用Otsu算法施加阈值；3)图像将被制成二值的；4)画出感兴趣区域(ROI)的轮廓以包括整个病变区；5)进行颗粒分析以量化在ROI内在阈值水平以上的像素面积。对于容量分析，方法类似于上述方法，不同之处在于使用了z系列捕获。然后在整个z系列的病变区的总和乘以z厚度(通常为4|im)以获得病变容积。用此模型试验的药物产品是LT1002(相对于SIP的小鼠mAb;Sphingomab);LT1004(人源化mAb)、LT1006(人源化mAb)、LT1007(人源4bmAb)以及LT1009(人源4bmAb;SonepcizumabTM)。还包括盐水赋形剂和非特异性抗体(NSA)对照。如图13所示，小鼠mAbLT1002(Sphingomab)和人源化mAbLT1009(Sonepcizumab)在CNV的此小鼠模型中均显著使病变的大小减小。所有试^r的mAbs都显示大约80-98%的病变大小的减小，在所有情况下，其都是显著的(p<0.001，相对于盐水)。此外，和非特异性抗体对照相比，LT1007和LT1009还显示显著的抑制(p<0.05)。病变大小的抑制百分比对于LT1002(小鼠)大约为80%,对于LT1004(人源化)为82%，对于LT1006为81%以及对于LT1009为990/。。因此，在新血管形成的此体内才莫型中，LT1009是最具有活性的人源化mAb变体。实施伊J18:Sonepcizumab剂量^^的多角定在布鲁赫膜的激光诱导破裂前一天，小鼠(n=10)接受单次、乂又侧3皮璃体内注射逐步增力口剂量的sonepcizumab(0.05、0.5、1.0或3.0吗/目艮)或高剂量非特异性(NS)抗体(3.0lag/目艮)。激光破176裂后14天，小鼠^皮麻醉并灌注荧光素标记右祷^唐酐，然后制^f月永络月莫扁平封装，用于分析CNV病变大小。在此研究中，利用量化CNV面积的另一种得到验证的方法(其中在处死前动物4皮灌注荧光素才示i己右4^f唐酐)才全查了sonepcizumab剂量和剂量间隔对CNV抑制的的影响。Sonepcizumab诱导CNV面积的剂量依赖性减少，在3.0(Lig/眼的剂量下，产生约50%的最大抑制。这种减小是显著的(pO.OOOl，和非特异性抗体对照相比，使用非配对t4企-睑)。在用药频率研究中，在用Sonepcizumab治疗的组之间，在14天研究期间在单时间点(第0天)或在多个时间点(第0天和第7天)，观测到类似效力。用Sonepcizumab治疗(3.0ug/眼)所看到的大约50%的最大抑制有利地相比于先前用相同才莫型和由相同研究者所发表的数据，其表明通过VEGF-Trap(4.92昭/眼)可以减小CNV面积。Saishin，etal.JCe〃P/z戸o/，2003.195(2):p.241画8。"Traps"(RegeneronPharmaceuticals,Inc.)是两种不同受体成分和抗体分子的Fc区(称4乍Fc区)之间的融合并且Regeneron正寻求VEGF-Trap用于目艮部疾病和癌症。上述两项3虫立研究的比较i曷示了，通过Sonepcizumab所获得的CNV病变大小的减小比用VEGF-Trap所，現测到的高20个百分点。因此，这些数据不仅证实我们的初步调查结果(在CNV的小鼠才莫型中抗S1P疗法减少病变形成的能力)，而且它们证明了人源4b4元体，sonepcizumab,承卩制CNV病变形成的增力。的凌文力，并且提供了对抗渗效果的深入了解。实施例19:在早产JL^见网膜病的小鼠模型中Sonepcizumab在减少3见网膜新血管形成的;^方面的效力在降生的第7天将C57BL/6小鼠(n=7)放置在75%氧气中，以及在降生的第12天恢复为室内的空气，并在一只眼中眼内注射3昭的sonepcizumab而在对侧眼给予赋形剂。在第17天，小鼠接受眼内注射标记有FITC的抗PECAM抗体，并在8小时以后，使小鼠安乐死，将眼摘除并在室温下固定在PBS1￡沖的福尔马林中5小时。切开4见网膜并用含有0.25%TritonX-100的磷酸緩冲盐溶液洗f条，然后全部去于固。用NikonFluorescenceMicroscope7见察载iE皮片并通过图像分析来测量视网膜NV的面积/视网膜。与在小鼠激光-皮裂才莫型中所)現测到的CNV的减小一致，我们还观察到在早产儿视网膜病(ROP)的小鼠模型中CNV的显著减小。与盐水对照相比，玻璃体内给予Sonepcizumab(3.0昭/眼)导致视网膜新血管形成减小大约4倍。这些数据证实了在视网膜和脉络膜血管床中sonepcizumab抑制病理性眼部血管发生的效力(不论是否经由缺血或布鲁赫膜的破裂所诱导)。实施例20:在J^"膜栓测定中Sonepcizimiab对VEGF-i秀导血管发生的影响矛J用^口在Staton,etal,IntJExpPathol,2004.85(5):p.233-48中所描述的GFR基质膜栓测定进行体内新血管形成。在4-6周龄nu/nu小鼠的左胁腹注射500uL冰冷的GFR基质膜。仅注射GFR基质膜(对照)或在添加补兖有100ug/ml肝素的10ug/mLVEGF以后注射GFR基质膜。《且包4舌用于对照和sonepcizumab治疗的3只动物。在才直入GFR基质月莫前一天用盐水或sonepcizumab(10mg/kg)治疗动物，并在实验期间每72小时i.p.给予剂量。在12天以后，处死动物；将对全切除并立即固定在没有锌和福尔马林的固定液中过夜，包埋在石蜡中并切片(5um)。然后石蜡包埋的切片一皮染色用于CD31(Pharmingen)。通过数码相机以20xit大率获取图Y象(9个图4象/切片，3个切片/栓)，然后通过PhotoShop6.0禾呈序量化CD31正染色并通过ImageJ表示为血管发生得分U象素2)。178在此基质力莫神全测定中sonepcizumab的抗血管形成岁文应是明显的。如预期的，在补充有10ug/mlVEGF的基质膜栓中诱导了广泛新血管形成(大约是在缺少VEGF或sonepcizumab的未治疗对照中所看到的5.75倍)。重要的是，在基质月莫注射前，用sonepcizumab进行的全身i.p.治疗可防止几乎80%的这种VEGF刺激的细胞结构和微血管密度的增加。这种减小是显著的(p<0.05,和单独的VEGF相比)并且i正实了当全身《会予动物时sonepcizumab的有效的抗血管生成活性以及强烈提示sonepcizumab能够显著抑制VEGFi秀导的血管发生。此发现是与来自Lpath的肺瘤研究计划的数据一致的，其中在小鼠原位乳腺癌模型中S1P抗体降低了若干生血管因子(包括VEGF)的血清7jc平。与AMD有关的血管生长的主要成分是周细胞的征集，其鞘化,口支持生长的内皮管。Jo,etal.，AmJPathol,2006.168(6):p.2036-53。转基因小鼠研究已表明，VEGF和PDGF-B是主要因子，其刺激周细胞的浸润和分化，从而导致血管成熟和稳定。Guo，etal.,AmJPathol，2003.162(4):p.1083-93;Benjamin,L.E.，I.Hemo，andE.Keshet,Development,1998.125(9):p.l591國8。重要的是，SIP促进VEGF和PDGF的反式;敫活。因此，sonepcizumab间4秦中和这些生长因子的能力提示son印cizumab可以在AMD期间防止异常的血管生长。实施例21:Sonepcizumab显著减少布鲁赫膜的激it^皮裂以后的血管渗漏用布鲁赫膜的激光破裂的小鼠^t型评价了给予用来抑制血管》参漏(除4。上所述水卩制新血管形成之夕卜)的sonepcizumab的岁丈力。在每只眼的3个位置C57BL/6小鼠(n=10)经受布鲁赫膜的激光石皮裂并在一只眼中眼内注射3jig的sonepcizumab而在只十侧目艮中则眼内注射赋形剂。在激光破裂后一周，对小鼠腹腔内注射12pl/g体重的1。/。荧光素钠并在5分钟以后被安乐死。将眼除去并在室温下固定在PBS緩冲的福尔马林中5小时。然后切开碎见网膜，洗涤，并用一级抗PECAM-1加以温育。然后洗涤一见网膜，用二抗(羊抗鼠IgG,共轭于罗丹明)温育，^接着扁平封固。通过PECAM-1染色来测量CNV病变面积。通过焚光素钠染色来测量血管渗漏的量。从CNV的渗漏总面积-CNV+渗漏(绿色)-CNV面积(红色)。数值表示r^lO小鼠/组的平均值士SEM。脉络月莫襟斤血管形成(由PECAM-1染色)的面积只于于用LT1009治疗的动物大约是0.015mm2，而对于经盐水治疗的对照动物则大约是0.03mm2。这是新血管形成减少50%(p-0.018)。从脉络膜新血管形成(用荧光素染色)的渗漏面积对于用LT1009治疗的动物大约是0.125mm2,而对于经盐水治疗的对照动物则大约是0.2mmo这是血管'渗漏的大约38%的减小(p-0.017)。在用3.0吗/眼的Sonepcizumab或PBS对照治疗的小鼠中，脉络膜新血管形成和血管渗漏的减小的典型的免疫组织化学图像是与这些结果一致的。因此，除减少CNV之外，sonepcizumab还显著减小布鲁赫膜视网膜水胂的激光破裂以后的血管渗漏，其在视力损失中具有主要作用，并且与下述有关(i)在AMD中的脉络膜新脉管系统渗漏(ii)在糖尿病中血视网膜屏障的击穿。Gerhardt，H.andC.Betsholtz，CellTissueRes,2003.314(1):p.l5-23。Sonepcizumab可以减少眼中病理性血管形成以及导致视网膜水肿的血管渗漏。这些发现是与乂人CNV面积量化实-验所产生的数据一致的，其中小鼠祐L灌注焚光素标记的右礎j唐肝。4昔助于这种方法的CNV量化确实受到血管通透性的影响。这些高度有利的结果支持在脉络膜血管床中的抗渗效果。鉴于这些lt据，我们认为sonepcizumab具有作为单药180治疗的潜力。还存在与目前的泛VEGF-A阻断剂的协同效应的可能性。实施例22:在用相对于SIP的抗体i^阡治疗以后，减小在浮见网膜中的巨虔细胞浸润年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种与老化有关的疾病，其中老化会逐渐^皮坏壽文锐的、中央—见觉。存在两种主要类型的黄斑变性。干燥或萎缩形式，其占AMD病例的85-90%，而AMD的湿形式的特点在于异常血管的生长。当黄色斑点(称作玻璃疣)开始积累自来自日益恶化组织(主要在黄斑区域)的沉积物或石卒片时，则诊断为干黄斑变性。可以发生逐步中央^L力减退。对于AMD的最流4亍的萎缩性(干)形式，目前没有有效的治疗方法。萎缩性AMD是由^L网膜色素上皮(RPE)的异常所触发，其中^L网膜色素上皮位继发于RPE功能障碍，黄斑棒和纟见锥会退化，^人而导致不可逆转的碎见力丧失。氧化应激、缺血、玻璃疣的形成、脂褐素的蓄积、局部炎症以及反应性胶质增生是涉及萎缩性AMD的发病机制的病理性过程。在这些过程中，炎症成为组织损伤的关4建促成因素。巨噬细胞浸润进入干AMD患者的黄斑已证明是破坏性炎性应答的重要组成部分。因此，可以緩和巨噬细胞浸润的制剂将是有价值的治疗剂，因为巨噬细胞浸润的抑制将可能减少黄斑组织损伤。这样的制剂还可以降^f氐干AMD转化成湿AMD的速率。在缺血性和炎性视网膜病变的模型中，现已证明，在用抗S1P抗体治疗以后，可以抑制巨噬细胞浸润55%。这些数据是利用已4艮好确立的小鼠氧诱导视网膜病变模型(还称作早产儿视网膜病(ROP)模型)所产生。具体来说，在生活的第7天将C57BL/6小鼠;故置在75%氧气中，以及在生活的第12天^皮恢复到房间空气，并在一只眼中眼内注射3fxg的人源化抗SIP抗体(LT1009，SonepcizumabTM)而在》于侧眼中给予1!武形剂。在生活的第17天，小鼠接受眼内注射相对于F4/80(泛巨噬细胞标记)的FITC标记的抗体，并在8小时以后，使小鼠安乐死。将眼球除去并在室温下固定在PBS乡爰冲的福尔马;f木中5小时。切开^见网膜并用含有0.25%TritonX-100的石粦酸緩冲盐溶液洗涤，然后全部封固。用NikonFluorescenceMicroscope观察载玻片并量化视网膜巨噬细胞。结果示在以下的表8中。表8:通过用相对于S1P的人源化单克隆抗体进行处理来减小视网膜中的巨噬细胞浸润<table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table>基于这些数据和巨噬细胞在干AMD的发病4几制中的已知作用，认为抗SIP抗体是用于治疗干AMD的有效治疗剂。实施例23:在棵NCr小鼠中SCCOLO205结肠直肠肺瘤异种^f接对用25-75mg/kgLT1009(单独以及连同阿瓦斯汀或紫杉醇)治疗此研究的目的是确定LT1009(单独和连同其它抗癌剂)延緩人结肠直肠(COLO205)癌肿瘤进展的效力，其中上述癌肿瘤是皮下(sc)拼接的并且确立在雌性Ncr(nu/nu)小鼠中。在右胁腹附近，从体内通道，棵鼠#皮sc植入一卓爻/小鼠的COLO205肺瘤。当在每项实-验中60只小鼠的确立的肿瘤大小为大约100至200mm3的当天，开始所有治疗。然后用25mg/kg的LT1009、50mg/kg的LT1009、40mg/kg阿瓦^t汀、50mg/kg的LT1009加上40mg/kg阿瓦斯汀、15mg/kg紫杉醇或赋形剂(盐水)对小鼠(11=10/组)进4亍治疗。在实'险期间每三天ip给予25或50mg/kgLT1009和盐7K—次，容积为0.1mL/20g体重。基于q7d计划表，以40mg/kg/剂量的剂量iv给予阿瓦斯汀，注射容积为0.1mL/20g体重。基于qldx5计划表，以15mg/kg/剂量的剂量iv主合予紫杉醇(阳性;寸照)，注射容积为0.1mL/10g体重。在第21天，在研究期间，将25mg/kgLT1009的剂量增加到75mg/kgLT1009。每天》见测动物的死亡率。乂人治疗的第一天开始并且包纟舌研究终止曰，每周两次收集肿瘤尺寸和体重。当在每项研究中用U武形剂治疗的对照组中的正中肺瘤达到大约4，000mg时，终止研究。收获来自每只动物的肺瘤，记录湿重，对肺瘤进行处理，以通过CD-31染色来确定孩i血管密度(MVD)。利用用于椭球的方程(/xw2)/2=mm3来计算肿瘤重量(mg)，其中/和w是指在每次测量时收集的更大和更小尺寸并且假设单位密度(1mm3=lmg)。表9:发现的4fet值总结-Co10205治疗贝武形剂50mg/kgLT100925/75mg/kgLT幽9阿瓦斯汀阿瓦斯汀+50mg/kgLT簡9紫杉醇最终肺瘤重量(mg)3047.252071.172465.601967.901614.400和赋形剂治疗小鼠;t目比，^小％32%20%35%48%100%如通过最终肿瘤重量所测得的，当和来自盐水治疗动物的肿瘤相比时，50mg/kgLT1009显著抑制肿瘤进展(p<0.018),为32%。25/75mg/kgLT1009也有效降低最终肿瘤重量20%;然而，这种降4氐并不是统计显著的。50mg/kgLT1009和阿瓦斯汀一样有效降《氐最终肺瘤重量(分别为降低32%和35%)。LT1009和阿瓦斯汀的组合比任何单独的制剂更有效，并显示当和盐水治疗动物相比时肿瘤重量减少48%。因此，LT1009和阿瓦斯汀的效应似乎是累积的。阳性对照，紫杉醇，完全消除了预先确定的胂瘤。实施例24:在棵NCr小鼠中SCHT29结肠直肠肿瘤异种^f接对用50mg/kgLT1009(单独以及连同阿瓦斯汀和5-FU)所J^f亍治疗的反应此研究的目的是相对于sc植入雌性无胸腺HCr-nu/nu小鼠中的人HT29结肠肺瘤异种拼接评估LT1009(单独和连同其它抗癌剂)的抗胂瘤效力。在右胁腹附近，从体内通道，棵鼠被sc植入一革殳/小鼠的HT29肿瘤。当在每项实-验中60只小鼠的确立的肿瘤大小为大约100至200mm3的当天，开始所有治疗。每治疗组有IO只小鼠。在实验期间每两天ip给予50mg/kgLT1009和盐水一次，容积为0.1mL/20g体重。q4d，以75mg/kg/剂量和20mg/kg/剂量的的剂量分别ip和iv给予75mg/kg5-FU和20mg/kg阿瓦斯汀，注射容积为0.1mL/10g体重。LT1009的首;欠剂量包4舌iv乡合予的100mg/kg。每天观测动物的死亡率。从治疗的第一天开始并且包括研究终止曰，每周两次收集胂瘤尺寸和体重。当在每项研究中用I武形剂治疗的对照组中的正中胂瘤达到大约4，000mg时，终止研究。收获来自每只动物的胂瘤，记录湿重，对肿瘤进行处理，以通过CD-31染色来确定MVD。利用用于椭J求的方程(/xw2)/2=mm3来计算肿瘤重量(mg)，其中/和w是指在每次测量时收集的更大和更小尺寸并且假设单位密度(1mm3=lmg)。表10:最终肿瘤重量-HT29治疗最终肿瘤重量(mg)显著性(p值)和H武形剂治疗小鼠才目比，减小%赋形剂LT1009阿瓦斯汀2723.672390.631927.441624.901.000.390.00113%30%41%LT1009+阿瓦斯汀5-FU1963.711948.000.0990.04928%29%LT1009+5-FU如通过肿瘤重量所测得的，当和来自盐水治疗动物的肺瘤比较时，50mg/kgLT1009会降低肿瘤进展13%,而阿瓦斯汀降〗氐肿瘤重量30%。LT1009和阿瓦斯汀的组合比1^壬何单独的制剂更有效，并显示当和盐水治疗动物相比时月中瘤重量统计显著;也减少41%。用5-FU进行的治疗降低了肿瘤重量28%。5-FU显示最小累积效应，其中LT1009显示抑制最终肺瘤重量29%。实施例25:在棵NCr小鼠中，SCDU145前列腺肿瘤异种拼接对用50mg/kgLT1009(单独或连同阿瓦斯汀或紫杉醇)所进4亍治疗此研究的目的是确定LT1009(单独和连同其它抗癌剂)延緩人前列腺(DU145)癌肺瘤进展的效力，其中上述癌肿瘤是皮下(sc)拼4妾的并建立在雌性Ncr(nu/nu)小鼠中。在右胁腹附近，从体内通道，棵鼠被sc植入一^殳/小鼠的DU145肿瘤。当在每项实验中60只小鼠的确立的肿瘤大小为大约100至200mm3的当天，开始所有治疗。然后用50mg/kg的LT1009、20mg/kg阿瓦斯汀、7.5mg/kg紫杉醇、50mg/kg的LT1009加上20mg/kg阿瓦斯汀、50mg/kg的LT1009加上7.5mg/kg紫杉醇或赋形剂(盐水)来治疗小鼠(11=10/组)。在实-验期间，ip给予50mg/kg的LT1009和盐水，q2d,容积为0.1mL/20g体重。以7.5mg/kg/剂量和20mg/kg/剂量的剂量，分别qldx5和q4d，iv和ip给予紫杉醇和阿瓦斯汀，注射容积为0.1mL/10g体重。LT1009的首次剂量包4舌iv#会予的100mg/kg。在研究期间，通过测量在三个轴向的sc肿瘤并if算容积、来监测肺瘤生长。在研究结束时，确定最终胂瘤重量和容积，然后处死小鼠，并收获肿瘤。然后通过CD-31染色来确定肿瘤的微血管密度(MVD)。表ll:发现的^t值总结-DU145<table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table>如通过最终肺瘤重量所测得的，50mg/kg的LT1009显著(pO.00)降低肺瘤进展28%。当和来自盐水治疗动物的肺瘤相比时，阿瓦斯汀和紫杉醇也显著(pO.00)降低最终肿瘤重量80%。LT1009并不显著增加阿瓦斯汀或紫杉醇的抗肺瘤活性，如通过最终肿瘤容积所测4寻的。实施例26:在CB17SCID小鼠中，RPMI8226人骨髓瘤肿瘤异种拼接对用25mg/kg或50mg/kg的LT1009(单独和连同Bortezomib)所进行治疗的AJl此研究的目的是相对于sc才直入在雌性CB17SCID小鼠中的人RPMI人骨髓瘤肿瘤异种^H妾评估LT1009(单独和连同抗癌剂Bortezomib)的#元月中瘤岁丈力。棵鼠(CB17SCID,4-5周龄，重量18-22g,雌性小鼠，获自Harlan)#皮sc注射收获自组织培养物的RPMI8226细月包(lx107个细力包/小鼠)。当肺瘤生长到大约100mn^的大小时，通过肿瘤大小动物;波配对成治疗和对照组(10只小鼠/组)。在配对后的第1天开始初次《合药。对于所有组的动物，是4姿重量,会药(0.01ml/g;10ml/kg)。通过腹腔内(IP)注射来给予赋形剂中的LT1009，每三天一次，直到研究结束(Q3D至结束)。通过经由尾静3永的静月永注射来纟合予Bortezomib,每三天一次，共6;欠治疗(Q3Dx6)。为了用作阴性对照，按照Q3D至结束的计划表，IP主会予LT1009赋形剂(0.9%盐水)。开始于第1天，每周两次记录个体和纟且的平均肺瘤容积士SEM，直到研究完成。在研究完成时，才艮道每组的最终平均肿瘤容积士SEM;按照这些计算结果，检查经受部分或完全肿瘤消退的动物或经受纟支术或药物相关死亡的动物。表12:最终胂瘤^P、-RPMI治疗最终肺瘤重量(mg)和赋形剂治疗小鼠相比，减小％贝武形剂20830Bortezomib166420%25mg/kgLT1009186011%50mg/kgLT層919785%50mg/kgLT1009183212%+Bortezomib*承*依据本文披露的内容，可以制备和实施本文描述和要求的所有组合物和方法而无需过度的实-验。虽然已参照优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，4旦本领域技术人员将明了，可以对组合物和方法作出一些变化。对本领域冲支术人员来说显而易见的所有这样的类似替代和改进被认为是在如由所附权利要求所限定的本发明的冲青神和范围内。在本说明书中提及的所有专利、专利申请、以及出版物表明与本发明有关领域的技术人员的水平。所有专利、专利申请、以及出版物(包括对其要求优先权或另外益处的那些专利、专利申请、以及出片反物)以引用方式结合于本文。可以在没有本文未具体描述的任何要素的条件下适当地实施本发明。因此，例如，在本文的每种情况下，任何术语"包含"、"基本上包括，，、以及"包括"可以与其它两个术语的任何一个替换。已采用的术语和措辞是用作描述性而不是限制性术语，并且在使用这样的术语和4晉辞时并不排除所显示和描述特点的任何等效物或其部分，而是应当明了在本发明的范围内各种改进是可能的。因此，应当明了，虽然已通过优选实施方式具体披露了本发明，但本领域技术人员可以利用本文所披露构想的可选的特点、改进和变化，并且这样的改进和变化被认为是在如由所附权利要求所限定的本发明的范围内。权利要求1.一种分离的抗S1P抗体重链，所述抗S1P抗体重链包含具有选自由SEQIDNO27和SEQIDNO35组成的组中的氨基酸序列的可变结构域。2.—种分离的抗SIP抗体轻链，所述抗SIP抗体轻链包含具有选自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37组成的组中的氨基酸序列的可变结构jt或。3.—种分离的抗S1P抗体，其中，每个免疫球蛋白重链包含具有选自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35组成的组中的氨基酸序列的可变结构域，而每个免疫球蛋白轻链包含具有选自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37组成的组中的氨基酸序列的可变结构域。4.一种组合物，包含载体，可选地包含药用载体，以及选自下述纟且中的4元SIP剂a.包含抗SIP抗体重链的抗SIP剂，所述抗SIP抗体重链包含选自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35组成的组中的具有氨基酸序列的可变结构域；b.包含抗SIP抗体轻链的抗SIP剂，所述抗SIP抗体轻链包含具有选自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37组成的组中的氨基酸序列的可变结构域；以及c.包含抗SIP抗体的抗SIP剂，其中每个免疫J求蛋白重链包含具有选自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35组成的组中的氨基酸序列的可变结构域，而每个免疫球蛋白轻链包含具有选自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37组成的组中的氨基酸序列的可变结构i戈。5.—种试剂盒，包含包装在容器中的根据权利要求4所述的組合物，并且可选地进一步包括所述组合物的使用说明。6.—种抗SIP剂，所述抗SIP剂在生理条件下对于鞘氨醇-l-石粦酸(SIP)是具有反应性的并且包含至少一种具有氨基酸序列的CDR肽，所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)、ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组。7.才艮据权利要求6所述的抗S1P剂，选自由抗体、抗体衍生物、以及非抗体源性成分组成的组，其中所述抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、全长抗体、抗体片段、以及亲和力成熟的4元体。8.根据权利要求6所述的抗S1P剂，其中，所述抗S1P剂是由两个重链和两个轻链组成的抗体，其中每个重链包含SEQIDNO:27的氨基酸序列而每个轻链包含SEQIDNO:30的氨基酸序列，或其中每个重链包含SEQIDNO:35的氨基酸序列而每个轻链包含SEQIDNO:37的氨基酸序列。9.根据权利要求6所述的抗SIP剂，其中，所述抗SIP剂共轭于选自由多聚体、；改射性核素、化疗药物、以及4企测剂组成的组中的部分。10.—种组合物，包含才艮据纟又利要求6所述的抗S1P剂和载体，可选地包含药用载体。11.根据权利要求6所述的抗S1P剂，与第二制剂结合，所述第二制剂可选地选自由抗体、抗体片,殳、抗体衍生物、抗体变体、不同于抗S1P剂的治疗剂、或包含对不同于S1P的分子具有反应性的结合部分的制剂组成的组，其中所述结合可选地是借助于所述抗S1P剂与所述第二制剂之间的4建，可选地共<介4建而结合的。12.—种分离的核酸分子，包含核香酸残基的序列，其中所述核苦酸残基的序列编码至少一个具有氨基S臾序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组。13.根据权利要求12所述的分离的核酸分子，其中，所述CDR肽具有肽氨基S臾序列，所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组，以及可选地其中所述分离的核酸分子编码至少两种CDR肽，其中每种CDR肽具有独立地选自由DHTIH(SEQIDNO:13);CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31);以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组的氨基酸序列，并且可选地其中所述分离的核酸分子编码第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一、第二、以及第三CDR肽中的每一种具有独立地选自由DHTIH(SEQIDNO:13);CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31);以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组中的氨基酸序列。14.根据权利要求12所述的分离的核酸分子，其中，所述第一CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13)，所述第二CDR肽包含氨基序列CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)。15.才艮据权利要求12所述的分离的核酸分子，编码包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域。16.根据权利要求12所述的分离的核酸分子，编码包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域。17.4艮据权利要求12所述的分离的核酸分子，编码免疫球蛋白重链的片段或全长免疫球蛋白重链。18.才艮据4又利要求12所述的分离的核酸分子，其中，所述免疫球_蛋白重链衍生自无脊推动物或脊推动物免疫球蛋白重链。19.根据权利要求12所述的分离的核酸分子，其中，所述脊推动物选自由鱼、可选地软骨鱼、鸟、以及哺乳动物组成的组，其中所述哺乳动物可选地选自由犬、猫、灵长类、啮齿动物、以及有^帝类动物《且成的纟且。20.—种载体，包含根据权利要求12所述的分离的核酸分子。21.—种用才艮据4又利要求10所述的分离的核酸分子或用才艮据^又利要求20所述的载体转染的宿主细胞。22.—种包含核苦酸残基序列的分离的核酸分子，编码至少一种具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选;也至少65°/。、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组。23.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其中，所述CDR肽具有肽氨基酸序列，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组，并且可选地其中所述分离的核酸分子编码至少两种CDR肽，其中每种CDR肽独立地选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)纟且成的组，并且可选i也其中所述分离的核酸分子编码第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一、第二、以及第三CDR肽中的每一种具有独立地选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的《且中的氨基酸序列。24.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其中，所述第一CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。25.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，编码包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域。26.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，编码包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域。27.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，编码免疫球蛋白轻链的片段或全长免疫球蛋白轻链。28.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其中，所述免疫球蛋白重链衍生自无脊推动物或脊推动物免疫球蛋白重链。29.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其中，所述脊推动物选自由鱼、可选地软骨鱼、鸟、以及哺乳动物组成的组，其中所述哺乳动物可选地选自由犬、猫、灵长类、啮齿动物、以及有蹄类动物組成的组。30.—种载体，包含根据权利要求22所述的分离的核酸分子。31.根据权利要求30所述的载体，进一步包含根据权利要求22所述的分离的核酸分子。32.根据权利要求21所述的宿主细胞，所述宿主细胞还被根据权利要求22所述的分离的核酸分子所转染。33.—种用根据权利要求22所述的核酸分子或用根据权利要求30所述的载体或才艮据纟又利要求31所述的载体转染的宿主细胞。34.—种用第一载体和第二载体转染的宿主细胞，其中，所述第一载体是根据权利要求20所述的载体而所述第二载体是根据权利要求30所述的载体。35.—种分离的多肽，所述多肽包含至少一个来自动物免疫^求蛋白重链的可变结构i或的骨架区，所述多肽在生理范围内对S1P具有反应性并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、优选至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组。36.根据权利要求35所述的分离的多肽，其中，所述CDR肽具有肽氨基酸序列，所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组；以及可选地其中每种CDR肽具有氨基酸序列，其中所述氨基酸序列独立地选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组，可选地其中所述第一、第二、以及第三CDR肽中的每一种具有独立地选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的《且中的氨基酸序列。37.根据权利要求35所述的分离的多肽，其中，所述第一CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13)，所述第二CDR肽包含氨基序列CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)或AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)。38.根据权利要求35所述的分离的多肽，选自由动物免疫球蛋白重链的片段、免疫球蛋白重链的全长可变结构域以及全长免疫S求蛋白重链组成的组。39.根据权利要求35所述的分离的多肽，其中，所述免疫球蛋白重链衍生自无脊推动物或脊推动物免疫球蛋白重链。40.根据权利要求39所述的分离的多肽，其中，所述脊推动物选自由鱼、可选;也岸欠骨鱼、鸟、以及哺乳动物组成的组，其中所述哺乳动物可选地选自由犬、猫、灵长类、啮齿动物、以及有^帝类动物組成的組。41.一种分离的多肽，所述多肽包含至少一个来自动物免疫王求蛋白轻链的可变结构域的骨架区，所述多肽对S1P具有反应性并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少至少95%的序列同一'性，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组。42.根据权利要求41所述的分离的多肽，其中，所述CDR肽具有肽氨基酸序列，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组，可选地其中所述分离的多肽包含至少两个CDR肽，其中每个CDR肽具有独立地选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组中的氨基酸序列，可选地其中所述分离的多肽包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一、第二、以及第三CDR肽的每一个具有独立地选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组中的氨基酸序列，可选地其中所述第一CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10),所述第二CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11),以及所述第三CDR肽包含氨基序列LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。43.根据权利要求41所述的分离的多肽，选自由动物免疫球蛋白轻链的片段、免疫球蛋白轻链的全长可变结构域以及全长免疫球蛋白轻链组成的组。44.才艮据片又利要求41所述的分离的多肽，其中，所述免疫J求蛋白重链衍生自无脊推动物或脊推动物免疫球蛋白重链。45.才艮据4又利要求41所述的分离的多肽，其中，所述脊才,动物选自由鱼、可选地软骨鱼、鸟、以及哺乳动物组成的组，其中所述哺乳动物可选地选自由犬、猫、灵长类、啮齿动物、以及有^帝类动物纟且成的纟且。46.—种分离的抗体分子，包含a.两个免疫球蛋白重链，其中每个免疫球蛋白重链是在生理范围内对S1P具有反应性的动物免疫王求蛋白重链，所述重链包含至少一个来自免疫J求蛋白重链的可变结构域的骨架区并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选;也至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组；并且与所述两个免疫球蛋白重链功能上相关，b.两个免疫球蛋白轻链，其中每个免疫球蛋白轻链是在生理范围内对SIP具有反应性的动物免疫5求蛋白轻链，所述轻链包含至少一个来自免疫J求蛋白轻链的可变结构域的骨架区并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选;也至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组。47.根据权利要求46所述的分离的抗体分子，其中，每个所述免疫球蛋白重链包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一、第二、以及第三免疫球蛋白重链CDR肽中的每一个具有独立t也选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组中的氨基酸序列，并且其中每个所述免疫球蛋白轻链还包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每个所述第一、第二、以及第三免疫球NO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组中的氨基酸序列，可选地其中每个所述免疫球蛋白重链包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一免疫球蛋白重链CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13),所述第二免疫球蛋白重链CDR肽包含氨基序列AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三免疫球蛋白重链CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)，而其中每个所述免疫球蛋白轻链包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一免疫球蛋白轻链CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10),所述第二免疫球蛋白轻链CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11),以及所述第三免疫3求蛋白轻链CDR肽包含氨基序列LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。48.—种分离的人源化抗体分子，包含a.两个免疫球蛋白重链，其中每个免疫球蛋白重链在生理范围内对SIP具有反应性并且包含至少一个来自人免疫^求蛋白重链的可变结构域的骨架区，所述重链包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选i也至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一'l"生，其中所述肽氨基卧臾序歹'J选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)纟且成的纟且；并且与所述两个免疫球蛋白重链功能上相关，b.两个免疫球蛋白轻链，其中每个免疫球蛋白轻链在生理范围内对SIP具有反应性并且包含至少一个来自人免疫J求蛋白轻链的可变结构域的骨架区，所述轻《连包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少65%、可选i也至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDD画(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组。49.根据权利要求48所述的分离的人源化抗体分子，其中每个所述免疫球蛋白重链包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每个所述第一、第二、以及第三免疫球蛋白重链CDR肽具有3虫立i也选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组中的氨基酸序歹'J，而其中每个所述免疫球蛋白轻链也包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每个所述第一、第二、以及第三免疫球蛋白轻链CDR肽具有独立地选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组中的氨基酸序列，可选地其中所述第一免疫球蛋白重链CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13),所述第二免疫球蛋白重链CDR肽包含氨基序列AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三免疫J求蛋白重链CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15),并且所述第一免疫球蛋白轻链CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)，所述第二免疫球蛋白轻链CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11),以及所述第三免疫球蛋白轻链CDR肽包含氨基序列LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。50.—种分离的人源化抗体分子，包含a.两个免疫球蛋白重链，其中每个免疫球蛋白重链在生理范围内对SIP具有反应性并且包含至少一个来自人免疫球蛋白重链的可变结构域的骨架区，其中每个免疫球蛋白重链包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中所述第一免疫球蛋白重链CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13)，所述第二免疫球蛋白重链CDR肽包含氨基序列AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)，以及所述第三免疫球蛋白重链CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15);并且与所述两个免疫J求蛋白重链功能上相关，b.两个免疫球蛋白轻链，其中每个免疫球蛋白轻链在生理范围内乂于SIP具有反应性并且包含至少一个来自人免疫^求蛋白轻链的可变结构域的骨架区，其中每个免疫球蛋白轻链包含第一、第二、以及第三CDR肽，并且其中所述第一免疫球蛋白轻链CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)，所述第二免疫球蛋白轻链CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11)，以及所述第三免疫球蛋白轻链CDR肽包含氨基序歹'JLQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。51.—种多i"介结合分子，包含至少第一和第二配体结合元件，其中所述第一配体结合元件对SIP具有反应性并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基商交序列具有至少50%、可选;1也至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一')~生，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组。52.根据权利要求51所述的多价结合分子，其中所述CDR肽具有选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组中的肽氨基酸序列，可选地其中所述多^f介结合分子包含至少两个CDR肽，其中每个CDR肽具有独立地选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组中的氨基酸序列，可选地其中所述多价结合分子包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每个所述第一、第二、以及第三CDR肽具有独立i也选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGST!WFDF(SEQIDNO:15)组成的組中的氨基酸序列。53.根据权利要求51所述的多价结合分子，其中所述第一CDR肽包含氨基序列DHTIH(SEQIDNO:13),所述第二CDR肽包含氨基序列AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31),以及所述第三CDR肽包含氨基序列GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)。54.根据权利要求51所述的多价结合分子，所述多价结合分子是动物免疫球蛋白重链的片段，其中所述片段可选地选自由免疫球蛋白重《连的全长可变结构域和全长免疫^求蛋白重链组成的组。55.根据权利要求51所述的多价结合分子，其中，所述免疫球蛋白重链衍生自无脊推动物或脊推动物免疫5求蛋白重链。56.根据权利要求51所述的多价结合分子，其中，所述第二配体结合元件也3寸S1P具有反应寸生。57.根据权利要求51所述的多价结合分子，进一步包含至少一个另外的配体结合元件，可选地包含2至约IO，OOO个配体结合元件，可选地其中每一个所述配体结合元件对S1P具有反应性。58.根据权利要求51所述的多价结合分子，其中所述配体结合元件连接于支架。59.—种多价结合分子，包含至少第一和第二配体结合元件，其中所述第一配体结合元件对SIP具有反应性并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组。60.根据权利要求59所述的多价结合分子，其中所述CDR肽具有选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)纟且成的纟且中的肽氨基酸序列，可选地其中所述多价结合分子包含至少两个CDR肽，其中每个CDR肽具有独立地选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组中的氨基酸序列，可选地其中所述多价结合分子包含第一、第二、以及第三CDR肽，其中每个所述第一、第二、以及第三CDR肽具有独立地选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组中的氨基酸序列。61.根据权利要求59所述的多价结合分子，其中所述第一CDR肽包含氨基序列ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)，所述第二CDR肽包含氨基序列EGNILRP(SEQIDNO:11)，以及所述第三CDR肽包含氨基序列LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)。62.根据权利要求59所述的多价结合分子，所述多价结合分子是动物免疫球蛋白轻链的片段，其中所述片段可选地选自由免疫球蛋白轻链的全长可变结构域和全长免疫球蛋白轻链组成的组。63.根据权利要求59所述的多价结合分子，其中所述免疫球蛋白轻链衍生自无脊推动物或脊推动物免疫球蛋白重链。64.根据权利要求59所述的多价结合分子，其中，所述第二配体结合元4牛也对S1P具有反应性。65.根据权利要求59所述的多价结合分子，进一步包含至少一个另外的配体结合元件，可选地包含2至约IO，OOO个配体结合元件，可选地其中每一个所述配体结合元件对S1P具有反应性。66.根据权利要求59所述的多价结合分子，其中，所述配体结合元件连接于支架。67.—种多价结合分子，包含连接于至少第一和第二配体结合元件的支架，其中所述第一配体结合元件对S1P具有反应性并且包含功能上相关的第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一寸生，其中所述月太氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)纟且成的纟且，以及所述第二多肽包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%、可选地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组。68.根据权利要求67所述的多价结合分子，其中，所述第一配体结合元件的所述第一多肽包含免疫球蛋白重链的可变结构域而所述第一配体结合元件的所述第二多肽包含免疫J求蛋白轻链的可变结构域，其中所述多价结合分子可选地包含2至约IO，OOO个配体结合元件，可选地其中每个所述配体结合元<牛乂于SIP具有反应寸生。69.—种用于治疗或予贞防与高水平的SIP有关的疾病或病症的方法，包括对需要上述治疗的受治疗者给予降〗氐SIP体内有效浓度的有效量的制剂，所述制剂选自由下述组成的组a.抗S1P剂，所述制剂在生理条件下对于鞘氨醇-l-磷酸(SIP)具有反应性并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)、ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组；b.分离的多肽，包含至少一个来自动物免疫^求蛋白重链的可变结构域的骨架区，所述多肽在生理范围内对SIP具有反应性并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、CISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:14)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组；c.分离的抗体分子，包含(i)两个免疫球蛋白重链，其中每个免疫球蛋白重链是在生J里范围内只于SIP具有反应性的动物免疫王求蛋白重链，所述重链包含至少一个来自免疫球蛋白重链的可变结构域的骨架区并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组；并且与所述两个免疫J求蛋白重链功能上相关，(ii)两个免疫球蛋白轻链，其中每个免疫球蛋白轻链是在生理范围内对SIP具有反应性的动物免疫J求蛋白轻链，所述轻链包含至少一个来自免疫5求蛋白轻链的可变结构域的骨架区并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:11)、以及LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)组成的组；d.多价结合分子，包含至少第一和第二配体结合元件，其中所述第一配体结合元件对SIP具有反应性并且包含至少一个具有氨基酸序列的CDR肽，其中所述氨基酸序列与肽氨基酸序列具有至少50%的序列同一性，其中所述肽氨基酸序列选自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、以及GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)组成的组；e.分离的抗S1P抗体重链，包含具有选自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35组成的组中的氨基S臾序列的可变结构域；f.分离的抗S1P抗体轻链，所述抗SIP抗体轻链包含具有氨基酸序列的可变结构域，其中所述氨基酸序列选自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37纟且成的组；以及g.分离的抗S1P抗体，其中每个免疫J求蛋白重链包含具有选自由SEQIDNO:27和SEQIDNO:35组成的组中的氨基酸序列的可变结构域，而每个免疫球蛋白轻链包含具有选自由SEQIDNO:30和SEQIDNO:37组成的组中的氨基酸序列的可变结构域；,人而治疗或予贞防f斤述疾病或病症。70.根据权利要求69所述的方法，其中，所述疾病或病症选自由癌症、炎性疾病、脑血管病、心血管疾病、目艮部疾病、与过多的纤维发生有关的疾病和障碍、以及与病理性血管发生有关的疾病或病症纟且成的纟且。71.才艮据4又利要求69所述的方法，其中，所述受治疗者是人。72.根据权利要求69所述的方法，其中，连同另一种治疗剂一起给予所述抗SIP剂、分离的多肽或抗体、多《介结合分子或分离的4元SIP#元体，以治疗或子贞防所述疾病或病症。73.—种用于检测SIP或SIP代谢物的方法，包括将怀疑包含鞘脂的样品暴露于相对于SIP具有反应性的化合物，其中所述分离的抗SIP抗体、根据权利要求6所述的抗SIP剂、根据权利要求35所述的分离的多肽以及根据权利要求51所述的多1"介结合分子组成的组，以及确定所述相对于SIP具有反应性的化合物与所述样品的结合。74.根据权利要求73所述的方法，其中，如果存在于所述样品中，在相对于SIP具有反应性的化合物结合于所述SIP或SIP代谢物的条件下，检测已知或怀疑包含所述SIP或SIP代谢物的样品暴露于所述相对于SIP具有反应性的化合物所获得的结合结果。75.根据权利要求73所述的方法，其中，所述样品是组织或液体才羊品。76.根据权利要求53所述的方法，其中，所述液体样品选自由全血、血浆、血清、尿、^青液、月旦汁、水才羊液、3皮璃体液、粘液、以及痰组成的组。77.4艮据4又利要求73所述的方法，其中，所述相对于S1P或S1P代谢物具有反应性的化合物选自由单克隆抗体、抗体片段、抗体变体、以及抗体书于生物组成的组。78.才艮据片又利要求73所述的方法，其中，所述相对于S1P或S1P代谢物具有反应性的化合物被附着于载体。79.根据权利要求73所述的方法是ELISA试验。全文摘要本发明涉及抗S1P剂，例如，人源化单克隆抗体，以及它们用于检测S1P或应用于治疗与S1P有关的疾病和病症的应用。文档编号C12N5/10GK101679506SQ200780048665公开日2010年3月24日申请日期2007年10月26日优先权日2006年10月27日发明者史蒂文·塔兰·琼斯,吉纳维芙·汉森,威廉·A·加兰,戴维·加雷斯·威廉斯,罗格·A·萨巴迪尼申请人:勒帕斯公司