专利名称：一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法
一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法技术领域一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法，属于定向改变和优化微生物 代谢功能、优化发酵过程技术领域。 技术背景丙酮酸是多种氨基酸、维生素及其它有用物质的重要前体，在化工、制药 及农用化学品工业中有着广泛的用途，因价格昂贵，故推广应用受到限制。丙酮酸是一种十分重要的有机化工中间体，主要应用于医药、农药和曰化 工业，近年来丙酮酸的开发应用已成为国内外研究的热点。丙酮酸在医药工业中被用于合成治疗高血压新药血管紧张肽n抗药、系列蛋白酶抑制剂、镇静剂、消炎阵痛药辛可芬、抗结核药异烟肼丙酮酸钙、解热药2-苯基喹啉-4-羧酸、驱 虫药恩波吡维胺、药物磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸、抗病毒剂氮杂喹喔啉以及 噻咪唑药物等。值得一提的是，丙酮酸在人体柠檬酸循环和合成氨基酸及其糖 类中是重要的中间体，可以使脂肪代谢率达到48%，对人体安全性高，因此近 年来国外发达国家利用丙酮酸这一特性，以其钙盐作为减肥保健药品。国外有 关媒体已经报道，含有丙酮酸钙的减肥药已经风靡全球，成为减肥药市场上的 新宠。在丙酮酸的发酵过程中，为了维持发酵体系pH处于最适范围而流加一定量 的NaOH等碱性物质，且随着NaOH等的添加，发酵液的渗透压不断升高，导 致细胞凋亡和积累丙酮酸能力的下降，最终影响有机酸生产效率。本发明通过研究脯氨酸对高渗条件下酵母细胞的保护作用，提出针对性更 强的发酵过程优化策略。 发明内容本发明的目的是提供一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法，添加脯 氨酸作为渗透相容性物质实现丙酮酸过量积累，利用本发明能提高丙酮酸发酵 的产量、生产强度和得率。本发明的技术方案 一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T. g/"6rato)CCTCC M202019为 生产菌株，当发酵过程中丙酮酸钠浓虔达到0.4mol/L时，向培养基中添加脯氨 酸，使培养基中脯氨酸浓度达到lg/L，脯氨酸作为渗透相容性物质保护光滑球 拟酵母细胞，促进CCTCCM202019合成丙酮酸。 1、菌株光滑球拟酵母( :g/a6rato)CCTCCM202019为烟酸(NA)、生物素(Bio)、硫 胺素(BO和吡哆醇(Pdx)四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降 低，为本研究室选育的菌株，该菌种已申请中国专利，专利号为02113142.2。2、 培养基种子和斜面培养基(g/L):葡萄糖30，蛋白胨10，磷酸二氢钾1，七水硫 酸镁0.5;琼脂20 (斜面培养基)，pH5.5。基本发酵培养基(L):葡萄糖100g， NH4S04 7 g,乙酸钠6g， KC1 5 g， KH2P045 g， Mg2S047H20 0,8 g， pH5.5。3、 培养斜面培养30°C 、 200rpm下培养24h;摇瓶培养将种子以10%的接种量转入基本发酵培养基于30°C、 200 rpm 条件下培养24h，按实验要求添加不同浓度的烟酸、生物素、硫胺素和吡哆醇。发酵培养最后在71^发酵罐中进^1发酵，发酵条件为pH5.5，搅拌转速 400rpm，通气速率l.Ovvm。细胞干重的测定取一定量的菌悬液置于10 mL容量瓶中，加2 mL盐酸 溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10 mL，摇匀，用UV 7500型可 见分光光度计，于660nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。丙酮酸浓度的测定高效液相色谱(HPLC)仪器Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器 和工作站)， 色谱条件色谱柱C18柱，5 [xm， 4.6 mm x250 mm流动相0.1%H3PO4流速1 mIVmin柱温28 °C 进样量10 pL紫外检测器波长210 nm样品制备5mL发酵液在10000 rpm下离心10min，取上清液移入试管中 以备测丙酮酸时用。测丙酮酸时，取l mL上清液移入50mL容量瓶中，去离 子水定容至刻线，经0.45 pm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。本发明的有益效果脯氨酸并不是作为营养成分促进了光滑球拟酵母的生 长，而是脯氨酸可以作为渗透相容性物质保护光滑球拟酵母细胞。本发明采用 向培养基中添加1,0g/L脯氨酸后使(1)发酵时间由72h缩短到64h; (2)丙酮 酸产量从68.0 g提高到71.7 g，生产强度从0.944 g/L/h提高到1.12 g/L/h。促使 丙酮酸发酵周期縮短8h,丙酮酸产量和生产强度分别提高5.4%和18.6%。这一研究结果可应用于有机酸发酵等其他典型工业生物的过程，为工业生物技术特别是发酵过程优化提供新的技术思路。
具体实施方式
对照实施例本发明^f用菌种为光滑球拟酵母(7bnJo戸^ g/"6rato)CCTCC M202019，先转斜面在30。C培养箱中培养24h，然后进行摇瓶培养24 h，温度30 °C，转速200rpm，最后在7L发酵罐中进行发酵72 h，发酵条件为pH5.5，搅拌 转速400rpm，通气速率l.Ovvm。发酵培养基为(L):葡萄糖100g， NH4S04 7 g,乙酸钠6g， KC15g， KH2P045g， Mg2S04'7H20 0.8 g，维生素溶液10mL， 微量元素溶液10mL， pH5.5。丙酮酸的得率为0.60g/g，产量为68.0g/L。所用维生素液组成为烟酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40 mg，生物 素4mg，核黄素10mg，自来水定容至1L。所用微量元素液组成为:CaCl2*2H20 2 g， FeS04'7恥2 g， ZnCl2 0.5 g， MnCl2'41120 12 g， CuS04*5H20 0.05 g， 2 mol/L HC1溶解后定容至1 L。实施例当丙酮酸钠浓度达到0.4mol/L时，向培养基中添加脯氨酸，使培 养基中脯氨酸浓度达到lg/L。其余发酵条件同对照实施例，发酵时间64 h，丙 酮酸得率为0.61 g/g，产量为71.2 g/L
权利要求
1、一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019为生产菌株，当发酵过程中丙酮酸钠浓度达到0.4mol/L时，向培养基中添加脯氨酸，使培养基中脯氨酸浓度达到1g/L，脯氨酸作为渗透相容性物质保护光滑球拟酵母细胞，促进CCTCC M202019合成丙酮酸。
全文摘要
一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法，属于定向改变和优化微生物代谢功能、优化发酵过程技术领域。本发明利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019为生产菌株，当发酵过程中丙酮酸钠浓度达到0.4mol/L时，向培养基中添加脯氨酸，使培养基中脯氨酸浓度达到1g/L，脯氨酸作为渗透相容性物质保护光滑球拟酵母细胞，促进CCTCC M202019合成丙酮酸。本发明采用向培养基中添加1g/L脯氨酸促使丙酮酸发酵周期缩短8h，丙酮酸产量和生产强度分别提高5.4％和18.6％。这一研究结果可应用于有机酸发酵等其他典型工业生物的过程，为工业生物技术特别是发酵过程优化提供新的技术思路。
文档编号C12P7/40GK101225410SQ20081002057
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月29日 优先权日2008年1月29日
发明者刘立明, 堵国成, 沙 徐, 坚 陈 申请人:江南大学