专利名称：针对pcdh10c端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种针对PCDHIO C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法。
技术背景PCDHIO是属于(^2+依赖性钙粘蛋白超家族的一员，具有6个重复串联的 胞外区和1个独特的胞内区。我们在对原代肿瘤干细胞基因表达谱时用病毒文 库技术筛选时发现pc^l(T"细胞易游出和穿过"Transweir的半透膜，而/^^10+/+ 的细胞迁移性较弱。通过生物信息学分析，进一步克隆了/x^zlO的全长cDNA 序列并构建了表达/ "/710的真核细胞表达载体，通过脂质体瞬时转染K562细 胞、SW480大肠癌细胞发现异位表达PCDHIO抑制了这些细胞在体外的增殖， 并增加了细胞的凋亡。进一步发现对这些细胞进行无血清饥饿和添加化疗药物 等处理后PCDHIO表达水平随时间和浓度的增加而增加，提示PCDHIO参与了 细胞凋亡，可能是一个肿瘤抑制基因。然对其参与细胞凋亡的分子机制尚不明 了。为探讨PCDH10在大肠癌组织中的表达改变，我们用1种针对PCDH10胞 外区的单抗和多抗时发现PCDHIO在大肠癌组织中并无明显的改变。而用针对 C末端的引物进行PCR扩增时发现在大肠癌干细胞样细胞中出现了显著的转录 下调，表明PCDH10在大肠癌细胞中出现了剪拼改变，PCDH10C端蛋白分子 片段可能链接了 1个独特的细胞信息转导通路，但目前尚未发现有针对PCDHIO C端蛋白分子片段的特异性抗体。 发明内容本发明的目的是提供一种研究PCDHIO C端蛋白质功能的特异性抗体。 针对PCDHIO C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法包括如下步骤1) 采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3'端碱 基序列克隆至原核细胞，构建PCDHIO C端融合蛋白的原核细胞PCDH10C /pET15b表达载体；2) 将PCDH10C /pET15b表达载体转化BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，建立 PCDHIO C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化PCDHIO C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDHIO C端融合蛋白N端的His-tag标签， 得到PCDHIO C端融合蛋白；3) 用己切除标签的PCDHIO C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗PCDHIO C端抗体，收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲 和柱纯化兔抗PCDHIO C端抗体。所述的采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3' 端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDHIO C端融合蛋白的原核细胞表达载体 的方法是将表达PCDHIO的lxl()5 xl07人白血病K562细胞离心沉淀，加入 0.5 1.5mlTrizol充分混匀，提取总RNA，再用逆转录酶逆转录RNA至cDNA; 然后设计上游引物包含Nde I内切酶位点CATATG和下游引物包含BamH I内 切酶位点GGATCC，通过PCR的方法直接将PCDH10C端DNA序列克隆至 pET15bNde I /BamH I位点，经Nde I和BamH I内切酶酶切鉴定合格后，进一 步用DNA测序验证，合格即为PCDH10C /pET15b表达载体。所述的将PCDH10C /pET15b表达载体转化BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，建 立PCDH10 C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化 PCDHIO C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDHIO C端融合蛋白N端的His-tag 标签包括如下步骤1) 取1 3 pl鉴定合格的APCDH10/pET15b重组质粒加至10 90pl感受态 的BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，冰浴15 45 min, 38 46°C 60s，加入50 350|il LB液30 44°C 30 90 min,涂布含50 150 pg/mL的LB平板，30 44。C培养 过夜，次日，挑取菌落接种50 200mlLB液，37卩摇动培养过夜，接种2000 4000ml LB液，30 44'C扩大培养2 8 h，加入终浓度为1 7 mM的IPTG诱导 0.5 6 h,离心收集细菌沉淀。2) 将细菌沉淀以每克湿重细菌加入1 5 ml pH6 8，含0.5 1.5% Triton, 0.02 0.08M的磷酸盐缓冲液，重悬细菌，冰浴下超声粉碎细菌，高速冷冻离心 取上清液，沉淀继续超声粉碎，高速冷冻离心，合并上清液，上His金属螯和 树脂柱，用含5mM咪唑的pH6 8,0.02 0.08M的磷酸盐缓冲液充分洗柱，用 5%的柳硫汞检测至无蛋白流出为止，改用含500mM咪唑，pH6 8, 0.02 0.08 M 的磷酸盐缓冲液洗脱，收集流出的蛋白液，装入透析袋，2 8'C对pH6 8、 0.005 0.015M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔3 12h换液l次，共3 9次。 在透析平衡结束后，用MW10000 30000的聚乙二醇浓縮至0.5 1.5mg/ml ， 取5 10 mg重组蛋白用Thrombin酶切除N端的His-tag标签，同时通过加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到纯化的PCDHIO C端重组蛋白， 该蛋白用SDS-PAGE电泳时，5 20pg/lane应无杂蛋白区带发现。所述的用己切除标签的PCDHIO C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生 抗PCDH10 C端抗体的方法包括如下步骤1) 分别取0.2 2mg的PCDH10 C端重组蛋白与完全福氏佐剂混匀，充分 乳化，接种大白兔皮下3 20余点，每隔5 12天强化免疫1次，待第3 4周 末，用0.5m 1.5mg PCDH10 C端重组蛋白进行直接的兔耳静脉内注射，5 7 天后分离大白兔颈总动脉，剪断放血至三角烧瓶，2 8-C倾斜放置过夜，次日 离心收集血清。2) 所述的收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharcse亲和柱 纯化兔抗PCDH10 C端抗体的方法是将收集的兔血清用2 6倍预冷的的 0.005 0.03 M, pH 6 8 PBS稀释，在不断搅拌的同时缓慢加入1 2倍体积的饱 和(NH4)2SO4,2 8'C放置20 30min，离心，去上清，沉淀用0.5 2倍原体积的 PBS复溶后，再分别用50%和33.3%的饱和0^4)^04重复沉淀各1次，最后蛋 白沉淀用2-3ml PBS复溶后，装入透析袋，2 8。C对0.005 0.03 M， pH 6 8 PBS 透析除盐，每隔3 12h换液1次，共3 9次，在透析平衡结束后，蛋白液13000 rpm 4。C离心15 min，取上清液，加至预经0.01 M， pH 6 8 PBS平衡的Protein A-Sepharose柱，流速0.5 ml/min,流尽后，用0.02 0.08 M， pH 6 8的磷酸盐 缓冲液充分洗柱至无蛋白流出为至，改用3 M, pH 6 8硫氰酸钠洗脱结合的 IgG，合并洗脱液，2 8。C对pH6 8、 0.005 0.015M的磷酸盐缓冲液透析除 盐，每隔3 12h换液l次，共3 9次，用MW10000 30000的聚乙二醇浓縮 至0.5 1.5mg/ml，分装，-2(TC保存。本发明具有的有益效果1) PCDH10是属于Ca2+依赖性钙粘蛋白超家族的一员，具有6个重复串联 的胞外区和1个独特的胞内区。由于大肠癌干细胞样细胞中pcdhlO一出现了显著 的表达下调，PCDH10可能参与了大肠癌干细胞样细胞独特的信息通路组成，但 其信息转导机制未明。由于针对PCDH10N端蛋白分子片段抗体与其他钙粘蛋 白存在重复性，因而，PCDHIOC端蛋白分子片段的特异性抗体是研究PCDHIO 介导信息通路转导的主要手段之一。2) PCDH10具有抑制肿瘤细胞增殖和增加细胞凋亡的功能，PCDH10C端 蛋白结构域是潜在的分子靶向治疗的靶点，PCDH10C端蛋白分子片段特异性抗 体表位是潜在的分子靶向治疗的靶点。3) PCDH10 C端蛋白分子片段的特异性抗体可用于临床评价肿瘤基因表达改变状况、转移潜能。
具体实施方式
针对PCDHIO C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法包括如下步骤1) 采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C3'端碱基 序列克隆至原核细胞，构建PCDHIO C端融合蛋白的原核细胞PCDH10C /pET15b表达载体；2) 将PCDH10C /pET15b表达载体转化BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，建立 PCDHIO C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化PCDHIO C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDHIO C端融合蛋白N端的His-tag标签， 得到PCDHIO C端融合蛋白；3) 用己切除标签的PCDHIO C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗 PCDHIO C端抗体，收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲 和柱纯化兔抗PCDHIO C端抗体。所述的采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3' 端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDHIO C端融合蛋白的原核细胞表达载体 的方法是将表达PCDHIO的lxl05 xl()7人白血病K562细胞离心沉淀，加入 0.5 1.5mlTrizol充分混匀，提取总RNA，再用逆转录酶逆转录RNA至cDNA; 然后设计上游引物包含Nde I内切酶位点CATATG和下游引物包含BamH I内 切酶位点GGATCC，通过PCR的方法直接将PCDH10C端DNA序列克隆至 pET15bNde I /BamH I位点，经Nde I和BamH I内切酶酶切鉴定合格后，进一 步用DNA测序验证，合格即为PCDH10C /pET15b表达载体。所述的将PCDH10C /pET15b表达载体转化BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，建 立PCDHIO C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化 PCDHl0 C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDHl0 C端融合蛋白N端的His-tag 标签，得到PCDHIO C端融合蛋白，包括如下步骤l)取1 3 jil鉴定合格的APCDH10/pET15b重组质粒加至10 卯|11感受态 的BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，冰浴15 45 min, 38 46°C 60s,加入50 350pl LB液30 44°C 30 卯min，涂布含50 150 pg/mL的LB平板，30 44。C培养 过夜，次日，挑取菌落接种50 200mlLB液，37i:摇动培养过夜，接种2000 4000ml LB液，30 44'C扩大培养2 8 h，加入终浓度为1 7 mM的IPTG诱导 0.5 6h，离心收集细菌沉淀。2)将细菌沉淀以每克湿重细菌加入1 5 ml pH6 8，含0.5 1.5% Triton, 0.02 0.08M的磷酸盐缓冲液，重悬细菌，冰浴下超声粉碎细菌，高速冷冻离心 取上清液，沉淀继续超声粉碎，高速冷冻离心，合并上清液，上His金属螯和 树脂柱，用含5mM咪唑的pH6 8，0.02 0.08M的磷酸盐缓冲液充分洗柱，用 5%的柳硫汞检测至无蛋白流出为止，改用含500mM咪唑，pH6 8, 0.02 0.08 M 的磷酸盐缓冲液洗脱，收集流出的蛋白液，装入透析袋，2 8"C对pH6 8、 0.005 0.015 M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔3 12h换液1次，共3 9次。 在透析平衡结束后，用MW10000 30000的聚乙二醇浓縮至0.5 1.5mg/ml ， 取5 10 mg重组蛋白用Thrombin酶切除N端的His-tag标签，同时通过加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到纯化的PCDHIO C端重组蛋白， 该蛋白用SDS-PAGE电泳时，5 20pg/lane应无杂蛋白区带发现。所述的用己切除标签的PCDHIO C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生 抗PCDHIO C端抗体的方法包括如下步骤1) 分别取0.2 2mg的PCDH10 C端重组蛋白与完全福氏佐剂混匀，充分 乳化，接种大白兔皮下3 20余点，每隔5 12天强化免疫1次，待第3 4周 末，用0.5m 1.5mg PCDHIO C端重组蛋白进行直接的兔耳静脉内注射，5 7 天后分离大白兔颈总动脉，剪断放血至三角烧瓶，2 8。C倾斜放置过夜，次日 离心收集血清。2) 所述的收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲和柱 纯化兔抗PCDHIO C端抗体的方法是将收集的兔血清用2 6倍预冷的的 0.005 0.03 M, pH 6 8 PBS稀释，在不断搅拌的同时缓慢加入1 2倍体积的饱 和(NH4)2SO4,2 8。C放置20 30min，离心，去上清，沉淀用0.5 2倍原体积的 PBS复溶后，再分别用50n/o和33.3。/。的饱和(NH4)2S04重复沉淀各l次，最后蛋 白沉淀用2-3ml PBS复溶后，装入透析袋，2 8。C对0.005 0.03 M， pH 6 8 PBS 透析除盐，每隔3 12h换液1次，共3 9次，在透析平衡结束后，蛋白液13000 rpm4。C离心15min，取上清液，加至预经0.01 M， pH 6 8 PBS平衡的Protein A-Sepharose柱，流速0.5 ml/min，流尽后，用0.02 0.08 M， pH 6 8的磷酸盐 缓冲液充分洗柱至无蛋白流出为至，改用3 M, pH 6 8硫氰酸钠洗脱结合的 IgG，合并洗脱液，2 8。C对pH6 8、 0.005 0.015M的磷酸盐缓冲液透析除 盐，每隔3 12h换液l次，共3 9次，用MW10000 30000的聚乙二醇浓縮 至0.5 1.5mg/ml，分装，-20。C保存。本发明的测定原理利用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将pcdh10 3'端碱基序列 克隆至原核细胞表达载体，通过大肠杆菌进行表达包含PCDH10 C端氨基酸序 列的重组蛋白，对重组蛋白经过过柱和蛋白标签切除等处理后获得高纯度的 PCDH10 C端蛋白片段分子。再将该PCDH10 C端蛋白片段分子免疫家兔获得抗 PCDH10C端蛋白特异性抗血清。最后进行Protein A亲和层析获得高纯度、高 活性的兔抗PCDH10 C端蛋白特异性抗体。 实施例1:构建PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达载体将表达PCDH10的lxl()5人白血病K562细胞离心沉淀，加入0.5 mlTrizol 总RNA提取试剂充分混匀，提取总RNA，再用逆转录酶逆转录RNA至cDNA; 然后设计上游引物包含Nde I内切酶位点CATATG和下游引物包含BamH I内 切酶位点GGATCC，通过聚合酶链式反应技术直接将PCDH10C端DNA序列克 隆至pET15b Nde I /BamH I位点，经Nde I和BamH I内切酶酶切鉴定合格后， 进一步用DNA测序验证，合格即为PCDH10C /pET15b表达载体。 实施例2:构建PCDH10 C端融合蛋白的原核细胞表达载体将表达PCDH10的1107人白血病K562细胞离心沉淀，加入1.5 mlTrizol 充分混匀，提取总RNA,再用逆转录酶逆转录RNA至cDNA;然后设计上游引 物包含Ndel内切酶位点CATATG和下游引物包含BamH I内切酶位点 GGATCC，通过PCR的方法直接将PCDH10C端DNA序列克隆至pET15b Nde I /BamH I位点，经Nde I和BamH I内切酶酶切鉴定合格后，进一步用DNA 测序验证，合格即为APCDH10C/pET15b表达载体。 实施例3: PCDH10 C端融合蛋白的原核细胞表达和纯化取1 ^鉴定合格的APCDH10/pET15b表达载体加至1(^1感受态的BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，冰浴15 min, 38°C 60s，加入50|il LB液30°C 30 min，涂布 含50pg/mL的LB平板，3(TC培养过夜，次日，挑取菌落接种50mlLB液，37°C 摇动培养过夜，接种2000ml LB液，3(TC扩大培养2h，加入终浓度为1 7 mM 的IPTG诱导0.5 h,离心收集细菌沉淀。将细菌沉淀以每克湿重细菌加入lml pH6,含0.5% Triton, 0.02M的磷酸盐缓 冲液，重悬细菌，冰浴下超声粉碎细菌，高速冷冻离心取上清液，沉淀继续超 声粉碎，高速冷冻离心，合并上清液，上His金属螯和树脂柱，用含5mM咪唑 的pH6， 0.02 M的磷酸盐缓冲液充分洗柱，用5%的柳硫汞检测至无蛋白流出为止，改用含500mM咪唑，pH6， 0.02 M的磷酸盐缓冲液洗脱，收集流出的蛋白 液，装入透析袋，2t:对pH6、 0.005 M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔3h换 液1次,共3次。在透析平衡结束后，用MW10000的聚乙二醇浓縮至0.5 mg/ml ， 取5 mg重组蛋白用Thrombin酶切除N端的His-tag标签，同时通过加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到纯化的PCDH10 C端重组蛋白， 该蛋白用SDS-PAGE电泳时，5pg/lane应无杂蛋白区带发现 实施例4: PCDH10 C端融合蛋白的原核细胞表达和纯化取3 ^鉴定合格的APCDH10/pET15b表达载体加至90^1感受态的BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，冰浴45 min, 46°C 60s,加入350^1 LB液44°C90 min，涂 布含150 pg/mL的LB平板，44。C培养过夜，次日，挑取菌落接种200mlLB液， 37匸摇动培养过夜，接种4000mlLB液，44。C扩大培养8h，加入终浓度为7mM 的IPTG诱导6 h,离心收集细菌沉淀。将细菌沉淀以每克湿重细菌加入5 ml pH8,含1.5% Triton， 0.08 M的磷酸盐缓 冲液，重悬细菌，冰浴下超声粉碎细菌，高速冷冻离心取上清液，沉淀继续超 声粉碎，高速冷冻离心，合并上清液，上His金属螯和树脂柱，用含5mM咪唑 的pH8， 0.08 M的磷酸盐缓冲液充分洗柱，用5%的柳硫荥检测至无蛋白流出为 止，改用含500mM咪唑，pH8， 0.08 M的磷酸盐缓冲液洗脱，收集流出的蛋白 液，装入透析袋，8"C对pH8、 0.015 M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔12h换 液1次，共9次。在透析平衡结束后，用MW30000的聚乙二醇浓縮至1.5 mg/ml ， 取10 mg重组蛋白用Thrombin酶切除N端的His-tag标签，同时通过加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到纯化的PCDH10 C端重组蛋白， 该蛋白用SDS-PAGE电泳时，20^g/lane应无杂蛋白区带发现 实施例5:产生抗PCDH10C端抗体并纯化取0.2mg的PCDH10 C端重组蛋白与完全福氏佐剂混匀，充分乳化，接种 大白兔皮下3余点，每隔5天强化免疫1次，待第3周末，用0.5mmgPCDH10 C端重组蛋白进行直接的兔耳静脉内注射，5天后分离大白兔颈总动脉，剪断放 血至三角烧瓶，2t:倾斜放置过夜，次日离心收集血清。收集的抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、ProteinA-Sepharose亲和柱纯化兔抗 PCDH10 C端抗体的方法是将收集的兔血清用2倍预冷的的0.005 M, pH 6 8 PBS稀释，在不断搅拌的同时缓慢加入1倍体积的饱和(NH4)2S04, 2"C放置 20min，离心，去上清，沉淀用0.5倍原体积的PBS复溶后，再分别用50%和33.3%的饱和(NH4)2S04重复沉淀各1次，最后蛋白沉淀用2mlPBS复溶后，装入透析 袋，2。C对0.005 M， pH6PBS透析除盐，每隔3h换液l次，共3次，在透析平 衡结束后，蛋白液13000 rpm4。C离心15 min，取上清液，加至预经0.01 M， pH 6PBS平衡的Protein A-Sepharose柱，流速0.5 ml/min，流尽后，用0.02 M， pH 6 8的磷酸盐缓冲液充分洗柱至无蛋白流出为至，改用3 M， pH 6硫氰酸钠洗脱结 合的IgG，合并洗脱液，2'C对pH6、 0.005 M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔 3h换液l次，共3次，用MW10000的聚乙二醇浓縮至0.5mg/ml，分装，-20°C 保存。实施例6:产生抗PCDH10C端抗体并纯化取2mg的PCDH10C端重组蛋白与完全福氏佐剂混匀，充分乳化，接种大 白兔皮下20余点，每隔12天强化免疫1次，待第4周末，用1.5mgPCDH10C 端重组蛋白进行直接的兔耳静脉内注射，7天后分离大白兔颈总动脉，剪断放 血至三角烧瓶，8t:倾斜放置过夜，次日离心收集血清。收集的抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、ProteinA-Sepharose亲和柱纯化兔抗 PCDH10 C端抗体的方法是将收集的兔血清用6倍预冷的的0.03 M， pH 6 8 PBS稀释，在不断搅拌的同时缓慢加入2倍体积的饱和(NH4)2S04， 8'C放置20 30min，离心，去上清，沉淀用2倍原体积的PBS复溶后，再分别用50%和33.3% 的饱和(NH4)2S04重复沉淀各1次，最后蛋白沉淀用2-3mlPBS复溶后，装入透 析袋，8'C对0.03 M， pH 6 8 PBS透析除盐，每隔12h换液1次，共9次，在 透析平衡结束后，蛋白液13000 rpm 4°〇离心15 min，取上清液，加至预经0.01 M， pH 8 PBS平衡的Protein A-S印harose柱，流速0.5 ml/min，流尽后，用0.08 M, pH 8的磷酸盐缓冲液充分洗柱至无蛋白流出为至，改用3 M， pH 8硫氰酸钠洗脱结 合的IgG,合并洗脱液，8"C对pH8、 0.015 M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔 12h换液1次，共9次，用MW30000的聚乙二醇浓縮至1.5 mg/ml，分装，-20°C 保存。
权利要求
1.一种针对PCDH10C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10C端融合蛋白的原核细胞PCDH10C/pET15b表达载体；2)将PCDH10C/pET15b表达载体转化BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，建立PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化PCDH10C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10C端融合蛋白N端的His-tag标签，得到PCDH10C端融合蛋白；3)用已切除标签的PCDH10C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗PCDH10C端抗体，收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲和柱纯化兔抗PCDH10C端抗体。
2. 根据权利要求1所述的一种针对PCDHIO C端蛋白片段分子的特异性抗 体的制备方法，其特征在于所述的采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细 胞株中将PCDH10C 3'端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10C端融合蛋 白的原核细胞表达载体的方法是:将表达PCDH10的lxl()S xl(^人白血病K562 细胞离心沉淀，加入0.5 1.5 mlTrizol总RNA提取试剂充分混匀，提取总RNA， 再用逆转录酶逆转录RNA至cDNA;然后设计上游引物包含NdeI内切酶位点 CATATG和下游引物包含BamH I内切酶位点GGATCC，通过聚合酶链式反应 技术直接将PCDH10C端DNA序列克隆至pET15b Nde I/BamH I位点，经 Nde I和BamH I内切酶酶切鉴定合格后，进一步用DNA测序验证，合格即为 PCDH10C /pET15b表达载体。
3. 根据权利要求1所述的一种针对PCDHIO C端蛋白片段分子的特异性抗 体的制备方法，其特征在于所述的将PCDH10C /pET15b表达载体转化BL21 DE3 pLysS大肠杆菌，建立PCDHIO C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金 属螯和树脂纯化PCDHIO C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDHIO C端融合 蛋白N端的His-tag标签包括如下步骤，得到PCDHIO C端融合蛋白l)取1 3 pl鉴定合格的APCDH10/pET15b重组质粒加至10 90pl感受态 的BL21DE3pLysS大肠杆菌，冰浴15 45 min, 38 46°C 60s,加入50 350plLB液30 44°C 30 90 min，涂布含50 150 pg/mL的LB平板，30 44。C培养 过夜，次日，挑取菌落接种50 200mlLB液，37'C摇动培养过夜，接种2000 4000ml LB液，30 44'C扩大培养2 8 h，加入终浓度为1 7 mM的IPTG诱导 0.5 6h，离心收集细菌沉淀。2)将细菌沉淀以每克湿重细菌加入1 5 ml pH6 8，含0.5 1.5% Triton, 0.02 0.08M的磷酸盐缓冲液，重悬细菌，冰浴下超声粉碎细菌，高速冷冻离心 取上清液，沉淀继续超声粉碎，高速冷冻离心，合并上清液，上His金属螯和 树脂柱，用含5mM咪唑的pH6 8，0.02 0.08M的磷酸盐缓冲液充分洗柱，用 5%的柳硫汞检测至无蛋白流出为止，改用含500mM咪唑，pH6 8， 0.02 0.08 M 的磷酸盐缓冲液洗脱，收集流出的蛋白液，装入透析袋，2 8'C对pH6 8、 0.005 0.015 M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔3 12h换液1次，共3 9次。 在透析平衡结束后，用MW10000 30000的聚乙二醇浓縮至0.5 1.5mg/ml , 取5 10 mg重组蛋白用Thrombin酶切除N端的His-tag标签，同时通过加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到纯化的PCDH10 C端重组蛋白， 该蛋白用SDS-PAGE电泳时，5 20pg/lane应无杂蛋白区带发现。
4. 根据权利要求1所述的一种针对PCDHIO C端蛋白片段分子的特异性抗 体的制备方法，其特征在于所述的用己切除标签的PCDHIO C端融合蛋白作为 抗原免疫大白兔，产生抗PCDH10 C端抗体的方法是分别取0.2 2mg的 PCDH10C端重组蛋白与完全福氏佐剂混匀，充分乳化，接种大白兔皮下3 20 余点，每隔5 12天强化免疫1次，待第3 4周末，用0.5m 1.5mgPCDH10C 端重组蛋白进行直接的兔耳静脉内注射，5 7天后分离大白兔颈总动脉，剪断 放血至三角烧瓶，2 8。C倾斜放置过夜，次日离心收集抗血清。
5. 根据权利要求1所述的一种针对PCDHIO C端蛋白片段分子的特异性抗 体的制备方法，其特征在于所述的收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲和柱纯化兔抗PCDHlO C端抗体的方法是:将收集的兔血清用2 6倍预冷的的0.005 0.03 M， pH 6 8 PBS稀释，在不断搅拌的同时缓慢加入l 2倍体积的饱和(NH4)2SO4，2 8。C放置20 30min，离心，去上清，沉淀用0.5 2倍原体积的PBS复溶后，再分别用50%和33.3%的饱和一)2804重复沉淀各 1次，最后蛋白沉淀用2-3mlPBS复溶后，装入透析袋，2 8'C对0.005 0.03 M， pH6 8PBS透析除盐，每隔3 12h换液l次，共3 9次，在透析平衡结束后， 蛋白液13000 rpm4。C离心15 min，取上清液，加至预经0.01 M， pH 6 8 PBS平衡的Protein A-Sepharose柱，流速0.5 ml/min,流尽后，用0.02 0.08 M, pH 6 8的磷酸盐缓冲液充分洗柱至无蛋白流出为至，改用3 M， pH 6 8硫氰酸钠洗 脱结合的IgG,合并洗脱液，2 8。C对pH6 8、 0.005 0.015M的磷酸盐缓冲 液透析除盐，每隔3 12h换液l次，共3 9次，用MW10000 30000的聚乙 二醇浓縮至0.5 1.5mg/ml，分装，-20*€保存。
全文摘要
本发明公开了一种针对PCDH10 C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法。采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10 C端融合蛋白的原核细胞表达载体；建立PCDH10 C端融合蛋白的原核细胞表达系统，纯化PCDH10 C端融合蛋白；用纯化的PCDH10 C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗PCDH10 C端抗体；收集抗血清，亲和纯化，获得高纯度、高活性的兔抗PCDH10 C端蛋白特异性抗体。本发明制备的PCDH10 C端蛋白分子片段的特异性抗体是研究PCDH10介导信息通路转导的主要手段之一。PCDH10 C端蛋白分子片段特异性抗体表位是潜在的分子靶向治疗的靶点。PCDH10 C端蛋白分子片段的特异性抗体可用于临床评价肿瘤基因表达改变状况、转移潜能。
文档编号C12N15/70GK101255193SQ20081006020
公开日2008年9月3日 申请日期2008年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者朱永良 申请人:浙江大学