专利名称：：一种猪卵母细胞体外培养成熟方法
技术领域：
：本发明属于细胞生物学领域，特别涉及一种猪卵母细胞体外培养成熟方法。
背景技术：
：目前，猪胚胎工程已极大地推进了畜牧业和医学的进程，通过它可以改良品种、培育抗病猪种、提高肉质、生产转基因猪或基因组修饰猪、制备人类疾病模型、进行器官移植、生产药物蛋白、研究发育机理等。猪的克隆和转基因生产等都需要大量成熟的，具有发育潜力的卵母细胞。至今为止，猪卵母细胞的体外成熟率不够理想。目前，现有猪卵母细胞体外培养成熟方法一般包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞筛选步骤以及卵母细胞成熟培养步骤。在卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有抗生素(青、链霉素)的生理盐水中,在3035。C温度下保存。但是添加双抗后，会使卯泡表面脆性增加，且双抗具有一定粘性，使用真空泵负压吸卵会产生大量气泡。另外经验证明此步添加抗生素会影响核质成熟。卵母细胞的筛选步骤中使用的洗卵液(ASP)的主要成分为TCM-199或赫佩斯(Hepes)液，其中添加的抗生素为青霉素或双抗，且不添加血清。不添加血清虽可以节省少量成本，但是大大降低了成熟效率。卵母细胞成熟培养步骤中，需先将卵母细胞放入含有激素FSH(促卵泡素)和hMG(人绝经期促性腺激素)的成熟培养液(IVM):无血清的TCM-1"基础液+10%猪卵泡液(PFF)+10ng/mL表皮生长因子(EGF)+0.1%mg/mL半胱氨酸(cysteine)的玻璃平皿中，放置在38.5。C，5%的C02和最大饱和湿度的培养箱中22~24h后，再放入不含激素的成熟培养液中成熟培养22-24h。成熟培养48h之后，观察极体(PB1)排出率，并以此计算卵母细胞的体外成熟率。此方法进行猪卵母细胞体外成熟需44~48h，培养周期长，且培养后极体率一般只能达到60%~70%。而且，培养过程中间须更换培养液，增加了工作量，增加了细胞污染的频率，不能满足大规模产业化克隆生产的需求。另外，国内屠宰场都是在凌晨屠宰，而屠宰场又是卵巢的最主要来源，这样取得的猪卵如果用上述方法成熟培养，后续的所有实验都必将在夜间进行。这将耗费更多的人力，不利于大量生产性克隆操作的进行。
发明内容本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种猪卵母细胞体外培养方法，用以解决目前猪卵母细胞体外成熟技术周期长，不利于大规模生产，培养后成熟率低的问题。本发明实施例是这样实现的，一种猪卵母细胞体外培养方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卯母细胞步骤，卵母细胞筛选步骤和成熟培养步骤，其特征在于，在卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有生理盐水的容器内保存，且容器内温度保持在32~34°C;卵母细胞筛选步骤采用的洗卵液中含有1~10吗/mL的两性霉素B,2%20%v/v的血清；卵母细胞成熟培养步骤采用的成熟培养液中含有50卯％v/v的TCM-199[IX]基础液，525IU/mL的hCG(人绒毛膜促性腺激素)和5~20IU/mL的PMSG(孕马血清促性腺激素)。与现有技术相比，上述技术方案由于在卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有未添加抗生素的生理盐水的容器内保存，且容器内温度保持在3234°C，是卵巢采集运输的最佳温度，又由于篩选卵母细胞的洗卵液中含有一定量的两性霉素B和血清，保证从卵巢采集、运输到卵母细胞采集、培养全过程都处于最佳条件；卯母细胞培养步骤采用的成熟培养液中以一定量的TCM-199[IX]为基础液，另外添加了一定量的hCG和PMSG,在整个卵母细胞培养过程中不仅无须更换培养液，操作简单，而且具有成熟效率高的特点，经36h成熟培养后极体率可稳定在80。/。以上。另外，针对国内屠宰场都是在凌晨屠宰的情况，从屠宰场取得的猪卵如果用上述方法成熟培养，后续的所有实验无须都在夜间进行。这将节省人力的耗费，有利于大量生产性克隆操作的进行。上述洗卵液中还包括碳酸氬钠丙酉同酸盐(Sodiumpyruvate)赫l風斯钠盐(HEPESsodiumsalt)赫佩斯酸(HEPESacid)TCM-199[10x]谷氨酰胺(L画Glutamine)肝素(Heparin)所述成熟培养液中还包括谷氨酰胺(L-Glutamine)庆大霉素(Gentamicin)猪卵泡液(PFF)血清0,10~0.17mg/mL0.20~0.30mg/mL3.005.00mg/mL2.00~3.00mg/mL，5~20%v/v0.050.30mg/mL10~40IU/mL;0.05-0.20mg/mL0.020.10mg/mL2~20%v/v220%v/v作为本发明的一个优选实施方式，上述洗卵液中两性霉素B浓度为2~5吗/mL,血清浓度为2%10%;所述成熟培养液中，TCM-199[IX]基础液的浓度为70~90%v/v，hCG浓度为10~20IU/mL,PMSG浓度为5~15IU/mL。洗卵液中还包括碳酸氢钠0.10-0.20mg/mL丙酮酸盐0.150.30mg/mL赫佩斯钠盐2.005.00mg/mL赫佩斯酸1.50~3.00mg/mL，TCM-199[10x]5~15o/ov/v谷氨酰胺0.10~0.30mg/mL肝素2035IU/mL;所述成熟培养液中还包括谷氨酰胺0.080.15mg/mL庆大霉素0.02-0.10mg/mL猪卵泡液815%v/v血清515%v/v作为本发明进一步优选实施方式，卵母细胞的采集步骤中釆用真空泵提供压力源，负压抽取卯子。这样，可以提高卵母细胞的采集效率，减少人力，满足大规模生产实验需求。本发明实施例所要解决的另一技术问题在于，提供一种猪卵母细胞体外培养用洗卵液，含有的组分及其含量如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>谷氨酰胺0.10-0.30mg/mL两性霉素B2.005.00jag/mL肝素20~35IU/mL血清210%v/v。本发明实施例所要解决的再一技术问题在于，提供一种猪卵母细胞体外培养用成熟培养液，含有的组分及其含量如下TCM-199[lx]50~90%v/vhCG5~25IU/mLPMSG520IU/mL谷氨酰胺0.050.2Omg/mL庆大霉素0.02~0.10mg/mL猪卵泡液220%v/v血清2~20%v/v作为上述成熟培养液的一个优选实施方式，含有的组分及其含量如下TCM-199[1X]7090%v/vhCG10~20IU/mLPMSG5~15IU/mL谷氨酰胺0.080.15mg/mL庆大霉素0.02-0.1Omg/mL猪卵泡液815°/ov/v血清515%v/v具体实施例方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1l.试剂及培养液的准备(1)洗卵液(ASP)预热:洗卵液组分及含量为碳酸氬钠丙酮酸盐赫佩斯钠盐赫佩斯酸TCM-199[10x]谷氨酰胺两性霉素B肝素血清0.17mg/0.22mg/mL3.60mg/mL2.63mg/mL10%v/v0.20mg/mL3.00|ig/mL30IU/mL2%v/v供卵子采集时使用将洗卵液预热至约38.5°C，(2)平衡卵母细胞体外培养液(IVM液)IVM液组分及含量为80%v/v15IU/mLlOIU/mL0,10mg/mL0,05mg/mL10%10%四孔板中每孔分别加入400nLIVM液，使其铺满底部，再于液体表面J盖400iaL矿物油(mineraloil)，置于5%032培养箱，至少平衡6小时；2、卵巢的采集TCM-199[IX]hCGPMSG谷氨酰胺庆大霉素猪卵泡液血清10收集卵巢时所需液体的准备将加热棒固定于保温箱底部，注入自来水，加热棒温度调至33。C;再将盛有预热后生理盐水的塑料盒置入，塑料盒用于存放采集到的卵巢；将在屠宰场取到的卵巢，置于上述塑料盒中，尽快(一般在2h之内，越快越好)带回实验室。3、卵母细胞的采集吸卵时，先将真空泵与缓沖瓶(大的抽滤瓶即可)。每个操作人员需要两根硅胶管。其中一根硅胶管用于连接緩冲瓶及采血管，另一根硅胶管用于连接采血管及抽吸卵巢表面卵泡的针头。抽取卵子时，手握注射器针头，选取36mm的卵泡，平行进针，在皮质层中釆集卵子，而须避免插入髓质层，以免抽取过多组织碎片，造成捡卵的困难，拖延捡卵的时间。4、卵母细胞的筛选(1)取23mL预热的洗卵液分别加入到2个35mm的培养亚里；(2)静置后的卵泡吸取物可见形成沉淀，使用巴氏滴管吸去上清液，再緩慢地加入洗卯液轻轻吸打混匀，将其铺于预先^故好标记的10cm培养皿里，在显微镜下挑选颗粒细胞层较多(大于三层)且致密，胞质均匀的卵母细胞，将其移至上述预热的洗卵液中，循环此操作，直至捡出盘中所有的优质卵母细胞；(3)进一步筛选卵母细胞，吸取35mm培养皿里经进一步确认为优质的卵母细胞转移入另一个35mm培养i中，清洗掉多余细胞的碎片。5、卯母细胞的成熟培养将上述筛选出来的卵母细胞，平均40-50个卵母细胞一个孔，移至四孔板中，38.5°C,5%C02成熟培养36小时后进行克隆操作。结果经成熟培养36小时后，极体率83%~87%实施例2本实施例与实施例1步骤基本相同，不同的是洗卵液组分及含量为碳酸氢钠0.17mg/mL丙酮酸盐0.22mg/mL赫佩斯钠盐3.60mg/mL赫佩斯酸2.63mg/mLTCM-199[10x]5%v/v谷氨酰胺0.10mg/mL两'性霉素B1.00pg/mL肝素lOIU/mL血清2%v/vIVM液组分及含量为TCM-199[IX]70%v/vhCG5IU/mLPMSG6IU/mL谷氨酰胺0.05mg/mL庆大霉素0.05mg/mL猪卵泡液20%血清5%结果经成熟培养36小时后，培养后极体率为80%81%。实施例3本实施例与实施例1步骤基本相同，不同的是:洗卵液组分及含量为碳酸氬钠丙酮酸盐赫佩斯钠盐赫佩斯酸TCM-199[10x]0.17mg/mL0.25mg/mL3.6mg/mL2.63mg/mL15%v/v谷氨酰胺0.30mg/mL两性霉素B5.00pg/mL肝素30IU/mL血清10%v/vIVM液组分及含量为TCM-199[IX]70%v/vhCG15IU/mLPMSGlOIU/mL谷氨酰胺O.lOmg/mL庆大霉素0.05mg/mL猪卵泡液12%血清18%结果经成熟培养36小时后，培养后4及体率为85%以上。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的l呆护范围之内。1权利要求1、一种猪卵母细胞体外培养方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞的筛选步骤和成熟培养步骤，其特征在于，在卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有生理盐水的容器内保存，且容器内温度保持在32～34℃；卵母细胞筛选步骤采用的洗卵液中含有1～10μg/mL的两性霉素B，2％～20％v/v的血清；卵母细胞成熟培养步骤采用的成熟培养液中含有50～90％v/v的TCM-199[1X]基础液，5～25IU/mL的hCG和5～20IU/mL的PMSG。2、如权利要求1所述的猪卵母细胞体外培养方法，其特征在于，所述洗卵液中还包括碳酸氬钠丙酮酸盐赫佩斯钠盐赫佩斯酸TCM-199[10x]谷氨酰胺肝素所述成熟培养液中还包括:谷氨酰胺庆大霉素猪卵泡液血清0.100.17mg/mL0.200.3Omg/mL3.00~5.00mg/mL2.00~3.00mg/mL,;~20%v/v0.050.30mg/mL1040IU/mL;0.050.20mg/mL0.02~0.10mg/mL2~20%v/v220%v/v。3、如权利要求1所述的猪卵母细胞体外培养方法，其特征在于，所述洗卵液中两性霉素B浓度为25(ig/mL,血清浓度为2%10%;所述成熟培养液中，TCM-199[IX]基础液的浓度为70~90%v/v，hCG浓度为10~20IU/mL，PMSG浓度为5~15IU/mL。4、如权利要求3所述的猪卵母细胞体外培养方法，其特征在于，所述洗卵液中还包括碳酸氬钠丙酮酸盐赫佩斯钠盐赫佩斯酸TCM-199[10x]谷氨酰胺肝素所述成熟培养液中还包括:谷氨酰胺庆大霉素猪卵泡液血清0.10~0.20mg/mL0.15~0.30mg/mL2.005.00mg/mL1.50~3.00mg/mL，-15%v/v0.10~0.30mg/mL2035IU/mL;0.08~0.15mg/mL0.02~0.10mg/mL815%v/v5~15%v/v。5、如权利要求14任一项所述的猪卵母细胞体外培养方法，其特征在于，所述卵母细胞的采集步骤中采用真空泵提供压力源，负压抽:f又卵子。6、一种猪卵母细胞体外培养用洗卵液，含有的组分及其含量如下丙酮酸m碳酸氬钠:盐赫佩斯钠盐赫佩斯酸TCM-199[10x]谷氨酰胺两性霉素B肝素血清、0.10~0.17mg/mL0.200.30mg/mL3.005.00mg/mL2.003.00mg/mL-20%v/v、0.050.30mg/mLl.O(MO.OO(ig/mL10~40IU/mL220%v/v。7、如权利要求6所述洗卵液，含有的组分及其含量如下:碳酸氢钠0.100.20mg/mL丙酮酸盐0.15~0.30mg/mL赫佩斯钠盐2.00~5.00mg/mL赫佩斯酸1.503.00mg/mLTCM-199[1Ox]515%v/v谷氨酰胺0.10~0.30mg/mL两性霉素B2.00~5.00|xg/mL肝素20~35IU/mL血清210%v/v。8、一种猪卵母细胞体外培养用成熟培养液，含有的组分及其含量如下TCM-199[lx]5090%v/vhCG5~25IU/mLPMSG520IU/mL谷氨酰胺0.050.20mg/mL庆大霉素0.020.10mg/mL猪卵泡液2~20%v/v血清2~20%v/v。9、如权利要求8所述猪卵母细胞体外培养用成熟培养液，含有的组分及其含量如下TCM-199[1x]70~90%v/vhCG10~20IU/mLPMSG515IU/mL谷氨酰胺0.080.15mg/mL庆大霉素0.020.10mg/mL猪卵泡液8-15%v/v血清515%v/v。全文摘要本发明提供了一种猪卵母细胞体外培养方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞筛选步骤和成熟培养步骤，其特征在于，在卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有生理盐水的容器内保存，且容器内温度保持在32～34℃；卵母细胞的筛选步骤采用的洗卵液中含有1～10μg/mL的两性霉素B，2％～20％v/v的血清；卵母细胞成熟培养步骤采用的成熟培养液中含有50～90％v/v的TCM-199[1X]基础液，5～25IU/mL的hCG和5～20IU/mL的PMSG。采用本方法能解决目前猪卵母细胞体外成熟技术周期长，不利于大规模生产，培养后成熟率低的问题。文档编号C12N5/06GK101429492SQ20081021833公开日2009年5月13日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者波律,颖徐,杜玉涛,杨珍珍,蔡雅兰,玉陈申请人:深圳华大基因科技有限公司