高纯度5’核苷酸的生产新工艺的制作方法

专利名称：：高纯度5’核苷酸的生产新工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及5'核苷酸的生产工艺。二
背景技术：
：目前同时生产四种5'核苷酸只能用专一性的核酸酶P,降解核糖核酸，经树脂吸附、解析分离纯化而获得，为此制备专一性、高活力、廉价酶是该工艺的关键点之一，目前国内外有使用固定化和固相化核酸酶Pi的方法，但技术要求很高，制备成本也高，不适宜在我国用于大规模生产5'核苷酸的工艺中。国内有报道使用浸泡麦芽提取核酸酶Pi，但是麦芽为粮食资源，保存也较困难。经核酸酶Pt降解核糖核酸成为5'核苷酸溶液后，在降解液中还留下变性的酶、其它杂蛋白及未能全部降解的核酸，这部分核酸通常不是3'—5'位连接结构或因主体构型使酶不能够作用到该部分核酸，它们在溶液中产生粘性，影响5'核苷酸在树脂上吸附和解析效果，有使用凝聚剂将它们凝聚和离心的方法。但都费时费力，降低收率，所得处理液也不够纯清。用陶瓷膜超滤虽可以解决部分杂蛋白、残余核酸等杂质，但是膜表面易被这些物质所粘附，造成膜孔堵塞而使通透量显著降低。所得核苷酸为四种5'混合核苷酸即5'腺苷酸(5'AMP)、5'鸟苷酸(5'GMP)、5'胞苷酸(5'CMP)、5'尿苷酸(5'UMP)，目前四种混合核苷酸的分离都是同时使用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂或者使用一种树脂分离开二种核苷酸以后，再用其它方法分开另二种核苷酸。其主要原因是在阳离子交换树脂上，酸性条件上柱，尿苷酸不能被吸附而流穿树脂，但鸟苷酸和胞苷酸却在以水为洗脱剂的条件下很大部分同时解析而不能分开，必须再用一根阴离子交换树脂将它们分开，腺苷酸在最后能被单独洗脱分开，因此在上世纪七、八十年代为了获得ATP的前体5'腺苷酸，也曾使用这样的工艺于工业生产中。如果使用一根阴离子交换树脂分离，则5'胞苷酸和5'鸟苷酸能够很好分离。但与其它二种核苷酸却分离不开，又要依靠一根阳树脂将它们重新分离。另外在核酸降解过程中，由于存在着少量单酯酶活性，以及核酸末端有3'端的磷酸根，因此降解过程中无机磷显著增加，据观测降解每公斤核酸会产生10g—15g无机磷，亟需研究一个除去无机磷而不影响核苷酸分离的方法。最后核苷酸树脂分离溶液浓度较稀且含有盐分，不能达到结晶浓度，常规可使用减压薄膜浓縮，但不能脱盐，影响产品纯度，使用活性炭吸附再解析能脱盐，但工艺复杂、收率降低。
发明内容本发明目的是克服上述不足问题，提供一种高纯度5'核苷酸的生产新工艺，工艺简单易操作，反应物稳定，产品收率高，纯度高。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是深层发酵培养一株桔青霉菌株M-71，产生胞外的核酸酶P^将2.55%的核糖核酸溶液降解，降解率达80%以上，然后使用高频振动筛除去杂蛋白和残余核糖核酸，除杂质后的纯清的5'核苷酸溶液经陶瓷膜超滤，除去大分子残留物质，再用装有强碱性阴离子交换树脂的四根柱串联吸附及洗脱核苷酸，为纯化单核苷酸，选择切割分子量为300道尔顿的纳滤膜脱盐并浓縮，活性炭脱色，结晶和干燥后制得四种高纯度的5'单核苷酸产品。所述培养桔青霉菌株M-71，在一个合适的培养基和深层发酵条件下，30小时内，产生核酸酶P!活力1200—1400单位/毫升。所述培养基所含成分及百分比是葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、K2HP040.05%、KH2P040.05%、MgS040.04%、CaCl20.04%、ZnS040.02%;PH6.0。所述除去杂蛋白和残余核糖核酸使用的高频振动筛，振动最高频率为3000次/分，使用滤网为200—300目。所述超滤所采用的陶瓷膜过滤为20—50nm的陶瓷膜过滤。所述基本纯化了的5'核苷酸溶液被吸附到四根装有强碱性阴离子交换树脂的串联柱上，并采用不同浓度的甲酸盐溶液进行分步洗脱，分离到四种单核苷酸的溶液。所述分离得到的四种单核苷酸溶液分别经纳滤膜脱盐、浓縮并经常规的活性炭脱色，在各自的等电点加入适量甲醇或水结晶成高纯度的5'核苷酸。所述高纯度5'核苷酸的生产新工艺，首先制备核酸酶Pw液体深层通风培养桔青霉菌株M-71得核酸酶Pu纳滤浓缩核酸酶h，将核酸酶P,经300—10000道尔顿纳滤膜纳滤浓縮6—16倍的酶液备用；然后采用浓縮核酸酶Pt进行核糖核酸的降解将RNA配成2.5—5.0%溶液，加浓縮酶1.4一4%(V/V)，降解成5'核苷酸混合液；降解液过高频振动筛温度304(TC的降解液，其最高振动频率为3000次/分，使用滤网200—300目，通过振动筛后的降解液除去大量固形蛋白质、残余核酸及其它杂质；降解液的超滤过振动筛的降解液经20—50nm的陶瓷膜超滤，除去可溶性蛋白，纯化5'核苷酸溶液，超滤时控制进口压为4kg/cm2，超滤后用纯水洗膜，得超滤液；在强碱性阴离子交换树脂上吸附、分离、洗脱四种5'核苷酸吸附树脂四根柱串联，将超滤后降解液打入串联柱，流速每小时0.6—1的柱体积，再用纯水洗至紫外测定0D湖〈20，水洗毕用甲酸溶液分步洗脱，分别收集0D柳〉20的洗脱液，收集液分别为5'CMP、5'AMP、5'UMP、5'GMP，吸附洗脱过程控制温度1215°C;洗脱中途采用甲酸-甲酸钠溶液(甲酸浓度0.04—0.08M，甲酸钠浓度0.03—0.05M)洗去柱上60%以上的磷酸盐；洗脱后的收集液脱盐、浓縮5'CMP收集液的纳滤采用NF和DK二种型号的膜，300道尔顿，控制进口压为11.2kg/cm2，得浓缩7—17倍的纳滤液。5'AMP收集液、5'UMP收集液和5'GMP收集液的纳滤同CMP。纳滤液升膜浓缩控制进蒸汽压力0.03—0.05MP，出口温度50—70°C，将纳滤液浓縮4.4一9倍，使浓縮液浓度达10—15%;升膜浓縮后的单核甘酸分别采用炭粉进行脱色，用公知的等电点结晶法，甲醇用量是浓縮液体积的0—2倍，时间2—10hr，结晶后离心，甲醇洗涤，产品置HWZ-20B型微波干燥机45—50。C，烘干。本发明新工艺与同类产品生产工艺相比具有显著的技术特点自主研发产生核酸酶P,菌株的培养，方法独特且获得高活性核酸酶P"该高活性核酸酶h降解核糖核酸产生5'核苷酸溶液，其降解率通常在80%以上。除杂质采用高频振动筛，将降解液通过振动筛除去大量固形蛋白质、残余核酸及其它杂质，通透流速快，操作使用方便。核苷酸的分离采用装有强碱性阴离子交换树脂的四根柱串联方式吸附和洗脱单核苷酸，由于是常规四倍的径高比，对单柱而言提高了核苷酸上柱量，选择适当的洗脱剂，极好地分离了四种核苷酸。针对核糖核酸降解过程中会产生一类含磷化合物，它能同时吸附到树脂上，洗脱时随产品一起洗下，影响产品纯度的问题，本发明在树脂洗脱过程中设计了洗脱无机磷的方法，即使用甲酸一甲酸钠(甲酸浓度0.04—0.08M，甲酸钠浓度0.03—0.05M)混合试剂能将磷酸盐除去60%以上，在产品结晶时磷酸盐不能再析出，保证制得高纯度的5'核苷酸产品，经HPLC检测产品纯度可达到98—102%。具体实施例方式实施例1按下述5'核苷酸的生产新工艺生产高纯度5'核苷酸，包括浓縮核酸酶P1降解核糖核酸(RNA)成5'核苷酸溶液，经振动筛、超滤、树脂吸附、分步洗脱、收集、纳滤、浓縮、脱色、结晶、干燥得四种含量》98%的纯核苷酸5'CMP、5'AMP、5'UMP、5'GMP。首先制备核酸酶P"液体深层通风培养桔青霉菌株M-71，经30小时培养得核酸酶P"酶活力1200单位/毫升。纳滤浓縮核酸酶P"将核酸酶h经300道尔顿纳滤膜浓縮成大于7500单位/毫升的酶液备用；然后采用浓縮核酸酶Pi进行核糖核酸的降解取纯17.5kgRNA配成2.5%溶液，加浓縮酶3.2°/。(V/V)，降解成5'核苷酸混合液。降解液过高频振动筛温度304(TC的降解液，以10001200L/hr的速度过高频振动筛，其最高振动频率为3000次/分，使用滤网300目，通过振动筛后的降解液除去大量固形蛋白质、残余核酸及其它杂质。降解液的超滤过振动筛的降解液经50nm膜面积为8M2的陶瓷膜超滤，除去可溶性蛋白，纯化5'核苷酸溶液，超滤时控制进口压为4kg/cm2，超滤后用400L纯水洗膜，平均通量137.5L/hrcm2，共得超滤液1100L，用时60分钟，超滤损失O.56%。在强碱性阴离子交换树脂上吸附、分离、洗脱四种5'核苷酸吸附树脂四根柱串联，共装树脂190L，将超滤后降解液打入串联柱，流速120L/hr，上柱率96.7%。水洗用380770L纯水洗至紫外测定0D26。<20结束，水洗损失4.2%。洗脱水洗毕用甲酸溶液分步洗脱，分别收集0D，〉20的洗脱液，收集液分别为5'CMP1680L、5'AMP2100L、5'UMP840L、5'GMP1530L，吸附洗脱过程控制温度1215°C，收集液总损失13.52°/0。由于在RNA降解过程中会产生一类含磷化合物，同时被吸附到树脂上，又随产品一起洗下，影响了产品纯度，因此洗脱时采用甲酸-甲酸钠溶液(甲酸浓度0.04—0.08M，甲酸钠浓度0.03—0.05M)洗去柱上60%以上的磷酸盐，这样产品在结晶时磷酸盐不会再析出，四种产品纯度均》98%。洗脱液的纳滤使收集液脱盐、浓縮。5'CMP收集液的纳滤采用NF膜，300道尔顿，膜面积30M2，1680LCMP溶液纳滤中途补水400L，平均通量21.73L/min，耗时110分钟，控制进口压为11.2kg/cm2，得纳滤液120L，渗透液中损失2.74%，膜内损失6.04%，总损失8.78%。2、5'AMP收集液的纳滤纳滤设备及控制压力同CMP。2100L5'AMP收集液，纳滤中途补水500L，平均通量27.47L/min，耗时95分钟，渗透液中损失2.26%，膜内损失8.6%，总损失10.86%，得纳滤液125L。3、5'UMP收集液的纳滤纳滤设备及控制压力同CMP。840L5'UMP收集液，纳滤中途补水500L，平均通量17.33L/min，耗时75分钟，渗透液中损失2.12%，膜内损失15.94%，总损失18.06%，得纳滤液120L。4、5'GMP收集液的纳滤纳滤设备及控制压力同CMP。1530L5'GMP收集液，纳滤中途补水630L，平均通量34L/min，耗时65分钟，渗透液损失1.77%，膜内损失1.07%，总损失2.84%，得纳滤液125L。升膜浓缩控制进蒸汽压力0.03-0.05MP，出口温度50—70。C，浓縮液浓度达10—15%，5'CMP从120L浓縮至13.5L，5'AMP从125L浓縮至16.72L，5'UMP从120L浓縮至27L，5'GMP从125L浓缩至20L。升膜后的单核甘酸分别采用炭粉进行脱色，用公知的等电点结晶法。甲醇用量是浓縮液体积的0—2倍，时间2—10hr。结晶后离心，甲醇洗涤。产品置HWZ-20B型微波干燥机45—50。C，烘干。所得产品进行分析和收率测算，产品经HPLC分析，结果见下表-<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1、高纯度5′核苷酸的生产新工艺，其特征是深层发酵培养一株桔青霉菌株M-71，产生胞外的核酸酶P1，将2.5～5％的核糖核酸溶液降解，降解率达80％以上，然后使用高频振动筛除去杂蛋白和残余核糖核酸，除杂质后的纯清的5′核苷酸溶液经陶瓷膜超滤，除去大分子残留物质，再用装有强碱性阴离子交换树脂的四根柱串联一次性吸附及分步洗脱、收集，收集到的四种单核苷酸溶液，选择切割分子量为300道尔顿的纳滤膜脱盐并浓缩，活性炭脱色，结晶和干燥后制得四种高纯度的5′单核苷酸产品。2、根据权利要求1所述的高纯度5'核苷酸的生产新工艺，其特征是培养桔青霉菌株M-71，在培养基和深层发酵条件下，30小时内，产生核酸酶Pr活力1200—1400单位/毫升。3、根据权利要求2所述的高纯度5'核苷酸的生产新工艺，其特征是:培养基所含成分及百分比是葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、K2HP040.05%、KH2P040.05%、MgS040.04%、CaCl20.040/0、ZnS040.02%;PH6.0。4、根据权利要求1所述的高纯度5'核苷酸的生产新工艺，其特征是除去杂蛋白和残余核糖核酸使用的高频振动筛，最高振动频率为3000次/分，使用滤网为200—300目。5、根据权利要求1所述的高纯度5'核苷酸的生产新工艺，其特征是超滤所采用的陶瓷膜过滤为20—50nm的陶瓷膜过滤。6、根据权利要求1所述的高纯度5'核苷酸的生产新工艺，其特征是基本纯化了的5'核苷酸溶液被吸附到四根装有强碱性阴离子交换树脂的串联柱上，并采用不同浓度的甲酸盐溶液进行分步洗脱，分离到四种单核苷酸的溶液。7、根据权利要求1所述的高纯度5'核苷酸的生产新工艺，其特征是分离得到的四种单核苷酸溶液分别经纳滤膜脱盐、浓縮并经常规的活性炭脱色，在各自的等电点加入适量甲醇或水结晶成高纯度的5'核苷酸。8、根据权利要求l一7任一所述的高纯度5'核苷酸的生产新工艺，其特征是首先制备核酸酶P1:液体深层通风培养桔青霉菌株M-71得核酸酶P"纳滤浓縮核酸酶P"将核酸酶Pi经300—10000道尔顿纳滤膜浓縮至6—16倍的酶液备用；然后采用浓缩核酸酶P:进行核糖核酸的降解将RNA配成2.5—5少。的溶液，加浓縮酶1.4一4%(V/V)，降解成5'核苷酸混合液；降解液过高频振动筛温度304(TC的降解液，其最高振动频率为3000次/分，使用滤网200—300目，通过振动筛后的降解液除去大量固形蛋白质、残余核酸及其它杂质；降解液的超滤过振动筛的降解液经20—50mn的陶瓷膜超滤，除去可溶性蛋白，纯化5'核苷酸溶液，超滤时控制进口压为4kg/cm2，超滤后用纯水洗膜，得超滤液；在强碱性阴离子交换树脂上吸附、分离、洗脱四种5'核苷酸吸附树脂四根柱串联，将超滤后降解液打入串联柱，流速0.6—1倍的柱体积，用纯水洗至紫外测定OD26Q<20结束，水洗毕用甲酸溶液分步洗脱，分别收集0D湖〉20的洗脱液，收集液分别为5'CMP、5'AMP、5'UMP、5'GMP，吸附洗脱过程控制温度1215°C，；洗脱时采用甲酸-甲酸钠溶液洗去柱上60%以上的磷酸盐；洗脱后的收集液脱盐、浓縮5'CMP收集液的纳滤采用NF膜，切割分子量为300道尔顿，控制进口压为11.2kg/cm2，得纳滤液。5'AMP收集液、5'UMP收集液和5'GMP收集液的纳滤同CMP;纳滤液升膜浓縮控制进蒸汽压力0.03—0.05MP，出口温度50—7(TC，浓縮液浓度达10—15%。浓縮后的单核甘酸分别用炭粉进行脱色，用公知的等电点结晶法，甲醇用量是浓縮液体积的0—2倍，时间2—10hr，结晶后离心，甲醇洗涤，产品置HWZ-20B型微波干燥机45—50。C，烘干。9、根据权利要求8所述的高纯度5'核苷酸的生产新工艺，其特征是洗脱时采用甲酸-甲酸钠溶液为甲酸浓度0.04—0.08M，甲酸钠浓度0.03—0.05M的溶液。全文摘要本发明涉及5′核苷酸的生产工艺。深层发酵培养一株桔青霉菌株M-71，产生胞外的核酸酶P₁，将2.5～5％的核糖核酸溶液降解，降解率达80％以上，然后使用高频振动筛除去杂蛋白和残余核糖核酸，除杂质后的纯清的5′核苷酸溶液经陶瓷膜超滤，除去大分子残留物质，再用装有强碱性阴离子交换树脂的四根柱串联一次性吸附及分步洗脱、收集，收集到的四种单核苷酸溶液，选择切割分子量为300道尔顿的纳滤膜脱盐并浓缩，活性炭脱色，结晶和干燥后制得产品。本发明极好地分离了四种核苷酸，洗脱除去无机磷，保证制得高纯度的5′核苷酸产品，经HPLC检测产品纯度可达到98-102％。文档编号C12R1/80GK101418327SQ20081022896公开日2009年4月29日申请日期2008年11月21日优先权日2008年11月21日发明者乔宾福,于喜庆,俞慧君,刘万峰,赵嘉庆,陈晓丽申请人:大连珍奥生物技术股份有限公司被以下专利引用(2),