以树鼩CD81基因构建的质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法

专利名称：：以树鼩CD81基因构建的质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测和评价树駒被HCV(丙型肝炎病毒)体内、体外感染前后CD81分子变化情况的方法，更具体的说，涉及一种以克隆的树駒CD81质粒为标准物，在此基础上建立的以Taqman探针荧光定量PCR的检测方法。
背景技术：
：丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液/体液传播，占输血后肝炎的70%。HCV感染是全世界范围内造成慢性肝病的主要原因。WHO估计全球有1.7亿人感染丙型肝炎病毒。在我国健康人群中抗HCV阳性率为0.7X3.1X，约3800万人[2]。HCV感染易导致慢性化，50%80%的成人急性感染易发展为慢性肝炎，其中20%30%将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1%4%发展成肝细胞癌。然而，到目前为止还没有相关的疫苗和有效治愈的药物，最主要的原因在于没有有效的体外细胞培养体系和适合的小动物模型。致使其慢性化感染机制不清楚，导致于HCV疫苗研制，临床治疗举步为坚。树駒(Tupaiabelangeri，Treeshrew)大量分布于我国云南、广西，及东南亚一带，体型小，易饲养，繁殖快。由于生物学等级高，树駒对许多与人类疾病相关的病毒易感，很早就被用作灵长目包括人类的疾病动物模型。近年来研究发现，在神经传导、视觉、糖尿病、肝癌等疾病的研究中得到广泛应用。除此之外，研究显示树駒不仅可以被丙型肝炎病毒(HCV)在体内感染，而且树駒的原代肝细胞宜可以体外被感染。这样就为HCV慢性感染机制的研究提供了良好的研究平台。对于HCV慢性感染机制的研究，其受体的研究又是研究的最大热点，研究表明HCV的感染由多个受体介导进入靶细胞，这些受体主要包括CD81、B族I型清道夫受体(SR-BI)、低密度脂蛋白受体(LDLr)、树突状细胞特异性细胞间粘附分子扑获的非整合素分子(DC-SIGN)和淋巴细胞特异性细胞间粘附分子扑获的非整合素分子(LC-SIGN)及最近报道的HCV辅助受体紧密连接蛋白(Claudin-1)其中CD81是对HCV受体研究中，被认为最可能的一种主要受体。CD81它属于四跨膜蛋白(teraspanin，TM4SF)超家族成员，含有4个跨膜转膜区和2个胞外区，在多种组织中表达，具有十分重要的生物学功能。人CD81分子量为25.8kD，其蛋白质分子有236个氨基酸残基，有4个跨膜区(TMl-4)，一大一小两个膜外区(EC1和EC2)，其氨基与羧基末端序列均位于细胞膜内侧，EC1位于跨膜区TM1和TM2之间，形成的小环SEL高度保守，它对于EC2优势的细胞表面表达具有非常重要的作用。EC2位于TM3禾PTM4之间，形成不同的大环LEL决定各个物种CD81的多样性，介导CD81与HCV的结合有非常重要的作用。树駒作为一种可能的新的HCV动物模型，在其体内和体外，HCV的感染与CD81的表达相关性如何呢，作为一种可能的动物模型就CD81表达这个层面上与人相比有什么异同呢，CD81的表达又与其它那些受体相关呢(比如Claudin-1)等等，就树駒CD81这些分子生物学方面的到目前为止研究很少，然而要想对这些方面有更清楚的研究，那么对树駒CD81基因表达技术的研究更为基础。实时荧光定量PCR检测技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，其中Taqman探针的方法更是特异性强、灵敏性高、重复性好、定量准确、速度快等特点。由于现在没有找到合适的HCV小动物模型，并且HCV的受体和辅助受体没有确定，致使被认为最重要的受体之一CD81的研究也仅限于对人类CD81研究局限中，树駒作为一种很有可能成为HCV合适的小动物模型，对它的CD81的认识更是知知甚少。
发明内容鉴于现有技术中存在的空缺，本发明的目的就在于建立树駒CD81基因荧光定量TaqmanPCR检测方法。建立一种稳定性强、重复性好、灵敏性高的树駒CD81检测方法，从受体的层面，进一步证实树駒是作为HCV研究合适的小动物模型。为HCV慢性感染化机制、HCV的药物治疗以及疫苗的研究提供一定的基础。为了实现本发明的上述目的，本发明采取荧光定量TaqmanPCR技术，根据克隆的树駒CD81cDNA序列，设计特异性引物和探针，建立了用于检测树駒CD81基因表达量的标准曲线，并验证其在批间、批内、组间、组内四个方面的重复性问题和灵敏性。本发明提供的技术方案如下一种以树駒CD81质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法，包括对树駒CD81基因片段的克隆并测序，以克隆的树駒CD81基因片段为目标，设计TaqmanPCR引物和探针，设计实验找到最优条件下引物的退火温度、引物浓度、探针浓度，提纯树駒CD81质粒计算CD81基因片段拷贝数，以计算好的树駒CD81质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为l(fl(fcopies阳性质粒建立标准曲线，用该检测体系对HCV体外感染的树駒原代肝细胞样品CD81的变化情况进行检测。其中，(i;)PCR引物为两条CD81寡聚核苷酸引物F/R:F:5'-ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAA-3'R:5'-TCAGTACACGGAGCTGTTCCGGATG-3'(2)以树駒肝脏中提取的RNA为模板，获得树駒CD81cDNA片段，将该片段纯化并测序；(3)该片段纯化后，通过T-A克隆导入PMD-18T质粒中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞JM-109中进行扩增；筛选阳性克隆子提取克隆子并进行纯化，获得树駒CD81分子测定的外参照阳性质粒。此外，CD81寡聚核苷酸引物和探针为CD81FP:5'-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3'CD81RP:5'-CAGCACCATGCTCAGGATCA-3'CD81Probe:5'(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3，该方法包括(1)检测体系退火温度的确定，(2)检测体系探针浓度和引物浓度的确定，(3)配置103107拷贝数的CD81质粒，以此为模板建立了该检测体系的标准曲线，(4)在批间、批内、组间、组内四个层次验证该方法体系的重复性和稳定性，(5)利用确定浓度的CD81质粒分别10倍梯度稀释107、106、105、104、103、102、101、10°copies，得到动力学曲线，检测该检测体系的灵敏性；(6)利用该检测体系，对不同HCV感染剂量的树駒原代肝细胞中CD81基因进行检测，确定不同感染剂量后的细胞中CD81的拷贝数。本发明以树駒CD81质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法的建立，它包括的步骤概括为A对树駒CD81基因片段的克隆并测序。B以克隆的树駒CD81基因片段为目标，通过PrimerExpress2.0软件在该片段上设计合适的引物和探针。C设计实验得到最优条件下的引物的退火温度、引物浓度、探针浓度并提纯质粒计算CD81基因片段拷贝数。D以计算好的树駒CD81质粒，以10倍梯度稀释，配制拷贝数为103107COpieS阳性质粒建立标准曲线。E验证本方法的重复性、稳定性和灵敏性。F通过该检测方法对不同HCV感染剂量的树駒原代肝细胞样品中CD81基因进行检测。下面结合附图，用本发明的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。图1为树駒HCV受体CD81基因片段RT-PCR电泳检测结果。图2为树駒中HCV受体CD81的全基因组核苷酸序列测序结果。图3为不同退火温度条件下CD81基因片段扩增电泳检测结果。图4为不同引物浓度下CD81基因片段扩增电泳检测结果。图5为不同探针浓度(50nm、100nm、150nm)扩增曲线和Ct值。图6为以IX103IX107拷贝数为模板建立的标准曲线和线性关系。图7为批内TaqmanPCR重复性检测扩增曲线。图8为组间重复性检测TaqmanPCR扩增曲线。图9为不同浓度的样品TaqmanPCR扩增曲线和线性关系。图10为HCV感染剂量的树駒原代肝细胞样品中CD81基因检测结果。具体实施例方式实施例1:以树駒CD81质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法的建实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或彭秀玲等人，基因工程实验技术，(科学技术出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。丙肝病毒的基因图谱参考已报道的文献如金奇主编，医学分子病毒学(科学出版社，2001)。对树駒CD81基因片段的克隆并测序1.PCR弓I物的设计和PCR的扩增PCR引物是根据GenBank中下载的40余条不同物种的CD81核酸序列，通过序列比对后得到保守序列，在其中设计而获得，由美国genebase公司合成。从树駒肝组织(lOOmg)中用TrL20LSystem(GIBCO/BRL)提取RNA，用100y1的10mMDDT加上5%RNasin(Promega)悬浮。10y1的样品保存在-80。C用于每次RT-PCR。—步法RT-PCR反应，10XOneStepRNAPCRBuffer5iU、MgCl2(25Mm)10ii1、dNTPMixture(各10mM)5ii1、RNaseInhibitor(40U/P1)1P1、AMVRTaseXL(5U/y1)1y1、AMV-OptimizedTaq(5U/y1)1P1、外围上游特异性引物(20yM)ly1、外围下游特异性引物(20iiM)ly1、树駒总RNA1y1、RNaseFressdH2024y1。以50y1反应体系，按以下条件进行RT-PCR反应50°C30min、94°C2min;然后进行40个循环扩增94°C30sec、57°C30sec72°C2min;72°C5min、-20"冰箱保存备用。扩增产物大小为711bp，1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。2.PCR产物的纯化使用DNAGelExtractionKit(BBI，USA)完成PCR产物的纯化。具体操作步骤如下(l).配制1%琼脂糖凝胶，将上述步骤1所得PCR产物点样，80伏电压电泳25分钟。(2).紫外灯下切下含有目的DNA琼脂糖胶块，放入新的1.5mleppendorftube中。(3).按每400ii1/lOOmg琼脂糖凝胶的比例加入BindingBuffer,置于50S0。C水浴中10分钟，使胶彻底融化。(4).将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的纯化柱中，室温放置2分钟。8000rpm离心1分钟。(5).取下纯化柱，倒掉收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，加入500ii1WashSolution,8000rpm室温离心1分钟。(6).重复步骤(5)—次。(7).取下纯化柱，倒掉收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，12,000rpm室温离心15秒。(8).将纯化柱放入一个新的l.5mleppendorftube中，在柱子膜中央加入30y1ElutionBuffer或水(pH>7.0)，室温或37。C放置2分钟。(9).12,000rpm室温离心1分钟。纯化的PCR产物储存于-70°C，待用。3.纯化产物与pMD18-T载体的连接和转化3.1受体菌JM109感受态细胞的制备(1).从37。C培养16-20小时的JM109新鲜平板上挑取一个单菌落，转至5mlLB培养液中，37°C，150rpm振荡培养过夜。(2).将培养物转至50mlLB培养液中，37°C，250rpm振荡培养3小时。(3).将培养物转移至离心管中，在冰上放置15分钟，使培养物冷却至Ot:。然后12000rpm4。C离心IO分钟，以回收细胞。(4).弃上清，用预冷的0.1MCaCl2洗涤细胞沉淀，12000rpm离心IO分钟；然后用10mlO.IMCaCl2悬浮菌体，冰浴30分钟，然后12000rpm4。C离心10分钟，以回收细胞。(5).尽量倒出上清液。然后用4ml0.1MCaCl2溶液重悬细胞。(6).于4t:放置1224小时后方可使用。制备好的感受态细胞可以直接使用或加入30^甘油分装贮存于-7(TC，待用。3.2纯化产物与pMD18-T载体的连接和转化使用pMD18-TVector(大连宝生物工程公司)与步骤2纯化的PCR产物进行连接反应先用0.2mlPCR管将0.5y1pMD18-TVector和4.5y1PCR纯化产物混合均匀，再加入5ii1ligationSolutionl混合均匀，16°C连接30分钟或过夜连接。3.3转化感受态细胞JM109(1).将100ii1JM109感受态细胞与10ii1连接反应液轻轻混合均匀。(2).冰浴30分钟，然后42。C热激活90秒，再冰浴2分钟。(3).加400ii137t:预热的LB液体培养基，于37。C摇床振荡150rpm培养45分钟。(4).取培养菌液涂布含100iig/mlAmp的LB固体培养基。(5).将培养平皿放置于37t:培养12-16小时后，挑取若干(4-6个/样品)长出的单菌落进行PCR快速鉴定。3.4阳性重组子的筛选和鉴定(1).挑取在Amp+选择培养基上长出的菌落若干个(4-6个/样品)，先置于含有100iig/ml青霉素的LB液体培养基中培养5ml，37。C振荡过夜培养。(2).取500iU菌悬液，12000rpm离心1分钟以沉淀菌体，弃上清，向沉淀中加入170ii1STET裂解液，重悬菌体。(3).煮沸裂解45秒，12000rpm离心10分钟，小心吸取上清，弃沉淀。(4).以此上清作为模板，用nested-PCR内引物(YF2/YR2、C3/C4或El/E3)进行PCR扩增和电泳检测。检测到特异性条带者即为阳性克隆。挑选阳性克隆置于50ml含有100iig/ml青霉素的LB液体培养基中进行扩大培养。3.5阳性重组质粒的提取使用MiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0(大连宝生物工程公司)完成阳性重组质粒的提取。具体操作步骤如下(1).取14ml的过夜培养菌液，l2,000rpm离心2分钟，弃上清。(2).用250ii1的SolutionI(含RNaseAl)充分悬浮细菌沉淀。(3).加入250ii1的SolutionII轻轻地上下翻转混合56次，使菌体充分裂解，形成透明液体。(4).加入400ii1的4。C预冷的SolutionIII，轻轻地上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。(5).室温12,000rpm离心5分钟，取上清。(6).将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。[OO91](7).将上述操作(5)中上清液转移至SpinColumn中l2,000rpm离心1分钟，弃滤液。(8).将500ii1RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。(9).将700ii1RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。(10).重复操作步骤(9)。(11).将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60ii1的ElutionBuffer,室温静置1分钟。(12).12,000rpm离心1分钟洗脱重组质粒DNA。4.重组质粒的核苷酸序列测定本研究中所有重组质粒的核苷酸序列测定均委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序工作(图2)。5.TaqmanPCR检测体系的建立5.1TaqmanPCR引物探针序列的设计和合成根据重组质粒片段711bp序列，利用Primerexpress.2.0设计引物和探针，弓|物跨越内含子，目的片段长度118bp。序列情况如下Tupaia-CD81FP:5'-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3，Tupaia-CD81RP:5'-CAGCACCATGCTCAGGATCA'-3，T邵aia-CD81probe:5'(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3，弓I物和探针均由大连宝生物有限公司合成。5.2PCR扩增及退火温度的确定根据本引物和探针特点分别设计退火温度56t:、58°C、60°C、62。C确定其最佳退火温度。采用下述反应体系和条件，以PMD-18TCD81质粒为模板应用PCR仪进行扩增PermixTaq酶Buffer25ul、DEPC处理水16ul、T邵aia-CD81FP/RP各自2ul、模板5ul混合均匀。循环次数为40个，94。C2min;94°C30s，(56°C、58°C、60°C、62°C)30s，72°Clmin，40个循环。72°C5min扩增；4。C备用。扩增产物2.5%琼脂糖电泳检测。通过电泳检测结果可知不同退火温度下都能得到112bp的扩增片段，但54t:和56t:条件下有明显的非特异性扩增，6(TC条件下电泳条带清晰，条带位置正确无非特异性扩增，因此本检测体系确定Tm=60°C(图3)。5.3引物和探针浓度的确定引物浓度以相同条件下能够检测到的模板浓度最低，扩增产物条带单一、清晰为引物选择标准。以100nm、200nm、300nm、400nm4个不同浓度的CD81TaqManPCR上下游引物浓度，分别用于同一浓度CD81重组质粒为模板，共分为4个反应系列组，同时进行PCR扩增。反应体系为25iiL:RealtimePCRMasterMix12.5y1、T邵aia-CD81FP/RP各自2yL、DEPC处理水6yL、模板2.5y1混合均匀。循环参数为40个，循环次数为40个，94°C2min;94°C30s，X°C30s，72°Clmin，40个循环。72。C5min扩增；fC备用。扩增产物2.5%琼脂糖电泳检测。不同引物浓度下电泳显示引物200nm条件下为最低浓度，该浓度能很好的扩增目的片段(图4)。探针浓度以相同模板浓度下循环域值(Ct)最小、荧光信号比(Rn)活度最大8为探针选择标准。采用50nm、lOOnm、150nm3个探针浓度，分别用于同一浓度CD81重组质粒为模板，进行TaqManPCR检测。反应体系为25yL:RealtimePCRMasterMixl2.5iiL、T邵aia-CD81FP/RP各自2iiL、T邵aia-CD81probe0.5iiLDEPC处理水5.5iiL、模板2.5iiL混合均匀。循环参数为40个，循环次数为40个，94°C2min;94°C30s，X°C30s，72°Clmin，40个循环。72。C5min扩增；4。C备用。观察扩增曲线和检测报告。通过不同探针浓度扩增曲线和Ct值显示，该检测体系在100nm条件下Ct=8.45值最小，Rn最大扩增曲线良好(图5)。5.4质粒的纯化及拷贝数的测定质粒的纯化步骤参见大连宝生物相关试剂盒说明书。纯化质粒测其A26。/A28。(1.82.0)根据以下公式计算拷贝数拷贝数(copies/m)二质粒浓度(ug/ul)X阿氏常数/质粒分子量。阿氏常数为6.02X1023;质粒分子量二一个碱基对的分子量(649)X重组质粒的总长度(bp)。5.5TaqmanPCR标准曲线的建立将已知拷贝数的质粒按照1X1041Xl(f拷贝数浓度进行10倍系列稀释，得到5个不同分子含量的PMD-18TCD81阳性质粒浓度样品，分别进行TaqManPCR分析，根据反应结果中样品的分子数的对数值及其Ct值的对应关系绘制出定量标准曲线。从上图可知本检测体系标准曲线扩增曲线标准，线性关系良好，其斜率-4.784，截距48.185，R2=0.9996。可得本检测体系线形方程为Ct=-4.7841og(Copynumber)+48.185(图6)6.TaqManPCR检测体系的评价6.1检测体系重复性、稳定性的评价该检测体系重复性、稳定性从批间、批内、组间、组内四个方面设计实验进行验证。批间不同批次间配置的同浓度重组质粒，IO倍梯度稀释拷贝数为103107copies各批间不同时间检测3次(每5天一次)，分别计算它们各自曲线相关系数的变异系数。过不同批次每隔五天测定标准曲线的相关系数的变异系数为0.155%，远小于5%可见该检测体系变异系数小，准确性高(见表1)。表1不同批次间配置的同浓度重组质粒各自曲线相关系数的变异系数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>批内同一批配置的一定浓度重组质粒，IO倍梯度稀释拷贝数为1031(fcopies同时检测6次，计算它们曲线相关系数的变异系数。通过计算同批次组内6组扩增曲线CT值的标准差为0.232，变异系数为1.079%，变异系数小重复性好(图7)。组间对重组质粒高、中、低不同浓度(l()8copies、106copies、104copies)各3次重复同时检测，计算它们各自Ct值变异系数。三次检测结果Ct值的变异系数分别为0.816%、0.582%、0.308%，变异系数小重复性好(图8)。组内对一定浓度重组质粒，以-2(TC保存隔30天重检。计算它们Ct值变异系数。组内两次实验Ct值变异系数分别为1.343%和1.079%均小于5%，该检测体系稳定性、重复性好(见表2)。表2—定浓度重组质粒的t值变异系数时间组间各ct值_标准差变异系数初检21.3621.7321,6322,1122.1021,930.2931,343%30天重检21.662.1.6621.5221.522L3921.(M0,2321,079%6.2检测体系灵敏性的评价将计算得到的标准重组质粒做10倍梯度稀释，拷贝数分别为108、107、106、105、104、103、102、101、10°COpieS，得到动力学曲线，以Ct值〉35个循环为下限检测该检测体系的灵敏性。通过扩增曲线图可知本检测体系可检测到102拷贝数级别(图9)。6.3树駒原代肝细胞样品中CD81基因进行检测不同HCV感染齐U量1X106、5X105、3X105、1X105、5X104、3X104、1X104、5X103、3X103、lXl()5copies的树駒原代肝细胞感染后的样品，进行CD81基因的检测。通过扩增曲线图可知随着HCV的感染剂量的增大，CD81的表达呈下降的变化(图10)。1.CD81基因片段PCR扩增的两条寡聚核苷酸引物序列F/R:F:5'-ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAA-3'R:5'-TCAGTACACGGAGCTGTTCCGGATG-3'2.以树駒CD81质粒为标准品的Taqman探针PCR方法中CD81寡聚核苷酸引物和探针序列为CD81FP:5'-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3'CD81RP:5'-CAGCACCATGCTCAGGATCA-3'CD81Probe:5'(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3，3.树駒中HCV受体CD81的全基因组核苷酸序列测序结果001ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAAGTGCATCAAGTACCTGCTCTTCGTCTTCAACTTCGTC061TTCTGGCTGGCCGGCAGGTGGATCCTAGGTGTGGCCCTTTGGCTCCGGCATGATCCACAG121ACCACCAACCTCCTCTATTTGGAGCTGGGAGACCGACCTGCACCCAATACCTTCTACGTA10181GGCATCTACATCCTCATTGCCGTGGGTGCCGTGATGATGTTCGTGGGCTTCCTGGGCTGC241TACGGGGCCATCCAGGAGTCCCAGTGCCTGCTGGGGACGTTCTTCACCTGCCTGGTGATC301CTCTTTGCCTGTGAGGTGGCCGCCGGCATCTGGGGCTTTGTCAACAAGGACCAGATCGCC361AAGGACGTGAAGCAGTTCTACGACCAGGCCCTACAGCAGGCTGTGGTGGATGACGAAGCC421AACAACGCCAAGGCCGTGGTGAAGACTTTCCACGAGACGCTCAACTGCTGTGGTTCTGGC481ACGCTGTTCACCCTGACCACCTCAGTGCTGAAGAACAACCTGTGTCCCTCAGGCAGCAAC541GTCATCAGCAACTTGTTTAAGGAGGACTGCCACCAGAAGATAGATGACCTCTTCTCTGGG601AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCGGCCATCGTGGTCGCTGTGATCATGATCTTTGAGATG661ATCCTGAGCATGGTGCTGTGCTGTGGCATCCGGAACAGCTCCGTGTACTGA权利要求一种以树鼩CD81基因构建的质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法，包括对树鼩CD81基因片段的克隆并测序，通过T-A克隆技术构建了PMD-18T-CD81质粒，以克隆的树鼩CD81基因片段为目标，设计TaqmanPCR引物和探针，设计实验找到最优条件下引物的退火温度、引物浓度、探针浓度，提纯该质粒并计算CD81基因片段拷贝数，以计算好的质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为103～107copies阳性质粒建立标准曲线，用该检测体系对HCV体外感染的树鼩原代肝细胞样品CD81的变化情况进行检测。2.根据权利要求1所述以树駒CD81质粒为标准品的Taqman探针PCR方法，其特征在于(1)PCR引物为两条CD81寡聚核苷酸引物F/R:F:5'-ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAA-3'R:5'-TCAGTACACGGAGCTGTTCCGGATG-3'(2)以树駒肝脏中提取的RNA为模板，获得树駒CD81cDNA片段，将该片段纯化并测序；(3)该片段纯化后，通过T-A克隆连接到PMD-18T质粒中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞JM-109中进行扩增；筛选阳性克隆子提取克隆子并进行纯化，获得树駒CD81分子测定的外参照阳性质粒。3.根据权利要求1所述以树駒CD81质粒为标准品的Taqman探针PCR方法，其特征在于CD81寡聚核苷酸引物和探针为CD81FP:5'-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3'CD81RP:5'-CAGCACCATGCTCAGGATCA-3'CD81Probe:5'(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3，4.根据权利要求1以树駒CD81质粒为标准品的Taqman探针PCR方法，其特征在于(1)检测体系退火温度的确定，(2)检测体系探针浓度和引物浓度的确定，(3)配置103107拷贝数的CD81质粒，以此为模板建立了该检测体系的标准曲线，(4)在批间、批内、组间、组内四个层次验证该方法体系的重复性和稳定性，(5)利用确定浓度的CD81质粒分别IO倍梯度稀释107、106、105、104、103、102、101、10°COpieS，得到动力学曲线，检测该检测体系的灵敏性；(6)利用该检测体系，对不同HCV感染剂量的树駒原代肝细胞中CD81基因进行检测，确定不同感染剂量后的细胞中CD81的拷贝数。全文摘要本发明涉及一种检测和评价树鼩被HCV(丙型肝炎病毒)体内、体外感染前后CD81分子变化情况的方法，更具体的说，涉及一种以克隆的树鼩CD81质粒为标准物，在此基础上建立的以Taqman探针荧光定量PCR的检测方法。属于分子生物学领域.。该方法包括对树鼩CD81基因片段的克隆；在克隆的CD81基因片段上利用PrimerExpress2.0软件设计合理的探针和引物；设计实验找到最优条件下的退火温度(Tm值)、引物浓度、探针浓度；进一步以树鼩CD81质粒为标准品以10倍梯度稀释建立了标准曲线；并且验证了该方法重复性、稳定性和灵敏性。最后用该检测体系，对HCV体外感染的树鼩原代肝细胞样品CD81的变化情况进行了检测。该方法可以准确、快速、便捷的检测出树鼩CD81的变化情况。文档编号C12Q1/68GK101691602SQ20081023373公开日2010年4月7日申请日期2008年12月22日优先权日2008年12月22日发明者冯悦,刘丽,夏雪山,赵文华,魏大巧申请人:昆明理工大学