专利名称：促进干细胞移植和植入的组合物和方法
技术领域：
本发明一般地涉及用于诱导有此需要的患者进行组织修复的组合物和方法。尤为 特别的是，本发明还与某些组合物和方法相关，该组合物和方法可用于诱导星散微组织损 伤并增强某部位的细胞生长，进而促进有此需要的患者体内的组织修复和/或置换。
背景技术：
间充质干细胞(MSC)是指位于血液、骨髓、真皮和骨膜中的多能性母细胞或胚胎 样细胞。通常情况下，这些细胞不但能够在一段时间后进行自我再生，而且在不同的环境条 件下，还可分化成软骨、骨骼和其它结缔组织。近来，许多研究人员已就利用这些细胞修复 或再生靶组织(如，骨骼、软骨、心肌等)的可能性展开研究。在这种情况下，据报道，MSC在 许多动物模型中都拥有再生能力。请参见Acosta等(2005) Neurosurg Focus 19(3) :E4 ； Barry(2003)Novartis Found Symp. 249 :86_102，170-4，239-41 ;Brisby 等(2004)Orthop Clin. North Am.35(1) 85-89 ；Buckwalter and Mankin(1998)Instr Course Lect. 47 487-504 ；Caplan(1991)J Orthop Res. 9(5) :641_650。近期研究发现，组织损伤能够作为一种导向信号，引导骨髓源MSC迁移至损伤部 位。(Agung 等，Knee Surg. Sports Traumatol Arthrosc, 2006,14(12) 1307—14)。然而，这 些研究是利用外科手术的方法，引入总体组织损伤，进而通过信号导向MSC至损伤部位，但 这种方法在临床护理上并不可行(例如，切除部分ACL韧带，进而通过信号导向MSC至ACL 部位，这样做可能会导致对ACL比实际修复更多的损害)。另外，还应注意的是，其他研究人 员也已对组织损伤作为导向信号并引导MSC进入各种组织的可能性进行了讨论。(Ramirez 等，Br J Sports Med.，2006 40(8) :719_22 ；Shyu 等，Front Biosci.，2006 11 :899_907)。此外，在临床环境下引发组织损伤及可能促进愈合的高渗物质注射剂已被用于进 行多项研究，并获得了成功。(Centeno 等，Pain Physician, 2005,8 (1) 67-72 ；Mooney, V., Spine J，2003 3(4) :253_4 ;Reeves 等，J Altern Complement Med. , 2000 6(4) :311_20 ； 以及 Reeves 等，Altern Ther Health Med 2000 6(2) :68_74)。然而，这些程序在健康护理 环境下所取得的实际成功却非常有限。采用微创医疗程序(即，将干细胞传递至患者体内有此需要的部位，例如，将MSC 经皮注射至有此需要的部位)能够获得临床优势。遗憾地是，经证明，单纯以此种方式移植 干细胞到部位在大多数情况下是无效的。就此而言，在健康护理环境下，有必要更加优化对 干细胞移植术的使用，并且在不对所述部位进行初始整体损伤以引发修复过程的情况下， 促进患者的部位修复。本发明就是在这一背景下做出的。
发明概要本发明提出了用于促进有此需要的患者组织修复和/或置换的修复组合物。修复 组合物包括与一种或更多种炎症诱导剂联合的有效量的细胞生长增强组合物。在细胞生长增强组合物方面，还包括使用自体和/或非自体的细胞生长增强材料。细胞生长增强组合物可包含掺有一种或更多种非自体因子的自体成分。典型的自体细 胞生长增强组合物包括富血小板纤维蛋白溶液，如5%至40%的血小板裂解物溶液和/或 血小板凝胶。典型的非自体生长组合物包括类胰岛素生长因子等重组生长因子。就炎症诱导剂而言，包括诱导在有修复需要部位的局部微星散损伤的试剂以及渗 透试剂、炎症细胞因子和/或硬化剂。在某些情况下，可使用这些试剂的组合，如渗透试剂 与硬化剂的组合。本发明的修复组合物还可包含对有修复需要之部位有用处的必要营养物(例如， 胶原质，其对应的修复部位是需要进行软骨修复的膝关节)。此外，修复组合物可包括用于 修复部位进一步组织生长信号传导的合成代谢激素(如，人类生长激素)。最后，本发明的修复组合物可包括干细胞，尤其是分离的干细胞，例如，分离的自 体或非自体间充质干细胞。干细胞能够以修复组合物的形式或以独立于修复组合物的形式 (即，彻底和暂时独立)被递送至所述部位。本发明还提供了几种方法，以促进有此需要的患者进行组织修复。该等方法包括， 获得和制备修复组合物(如，来自存在需要治疗的修复部位的患者的5%至40%的血小板 裂解物，和炎症诱导剂)；按照本发明所述的实施方式将所述修复组合物施用至修复部位 (施用量为忍受和保持修复所需的量)；任选地向修复部位施用干细胞或其它类似修复细 胞，以促进有此需要的部位的组织修复。就上述方法的某些方面而言，修复组合物是第一炎 症诱导剂组合物，和第二细胞生长增强组合物，其中第一组合物施用至修复部位，以诱导局 部微组织损伤，随后施用第二组合物，以增强该部位的细胞生长。在某些情况下，干细胞或 其它修复样细胞被施用至所述部位，以增强修复过程，通常伴随或稍稍滞后于细胞生长增 强组合物的施用。本文所述的方法可包括在1周至6个月的疗程中多次应用修复组合物。最后，本发明提供了用于治疗应用的药物组合物。在某些情况下，药物组合物用于 治疗有损伤部位修复需要的患者，而在某些时候，该等患者还罹患骨关节炎、骨质疏松症或 其它类似的变性疾病。阅读下列详细叙述并审核附加的权利要求，即可了解本发明的上述和各种其它特 点和优势。发明的详细说明本发明的实施方式提出了用于促进有此需要的患者进行组织修复和/或组织置 换的修复组合物。就本文所述的目的而言，患者是指需要本发明的组合物和/或方法的任 何哺乳动物，优选是人类。在一个实施方式中，修复组合物包括与一种或更多种炎症诱导剂 联合的治疗学上有效量的细胞生长增强组合物。本发明的实施方式包括了其中细胞生长增强组合物是自体或非自体生长因子，包 括例如重组生长因子，的修复组合物。在其它实施方式中，细胞生长增强组合物是指自体和 非自体生长因子的混合物。在典型的实施方式中，细胞生长增强组合物是指来自有此需要的患者(即，存在 需要修复的损伤部位的患者)中的一种或更多种自体生长因子。细胞生长增强生长因子可 包括自体血小板和/或血小板裂解物组合物。本发明的实施方式还包括了这样的修复组合物，其中炎症诱导剂是能够诱导有组 织修复需要的部位的微组织或局部损伤的试剂。本文中所用的炎症诱导剂包括渗透试剂、炎症细胞因子、硬化剂以及诸如此类的试剂。因此，修复组合物可包括与一种或更多种炎症 诱导剂联合的自体血小板裂解物。本发明的修复组合物可借助关节内窥镜和/或经皮通过手术切口施药。用于本发 明目的的患者修复部位是指需要进行组织修复或再生长的任何部位，例如，需要软骨的膝， 需要肝细胞的肝脏，需要骨细胞的骨骼等。本发明的实施方式还提供了方法，所述方法用于促进有此需要的患者进行组织修 复。该等方法包括施用含有细胞生长增强组合物和一种或更多种炎症诱导剂的修复组合 物；或先后施用一种或更多种炎症诱导剂和细胞生长增强组合物。在一个实施方式中，该等方法包括从有组织修复需要的患者中获得自体生长增强 组合物；为患者施用剂量足以诱导有组织修复需要的部位产生局部炎症的炎症诱导剂；在 需要进行组织修复的部位向患者施用剂量足以有效促进该部位细胞生长/扩增的自体生 长增强组合物。在某些实施方式中，炎症诱导剂和生长增强组合物是以单独组合物的形式 同时施药的；而在其它实施方式中，这两种试剂则是在24至96小时(更优选在72至96小 时)内各自施药的。在1至6个月(或由健康专业人士决定的更长时间)的疗程内可多次 施药。在其它实施方式中，炎症诱导剂和生长增强组合物可作为一种组合物合并施药。定义以下定义的提供，旨在促进对本文中常用的若干术语的理解，并无意限制本公开 的范围。“细胞生长增强组合物”指，生长因子(如，重组FGF、重组TGF-β )、自体组合物 (如血小板、富血小板纤维蛋白、富血小板血浆、血小板裂解物、血小板凝胶)以及其它类似 物质，并且可包含生长因子、细胞因子、激素、必要营养物或其它蛋白质、脂肪酸或碳水化合 物。“炎症诱导剂”指，能诱导某部位产生星散微组织损伤的任何试剂，包括诸如高渗 葡萄糖，炎症细胞因子，例如，MIP-U MIP-I α , MIP-I β和ΜΙΡ-2，鱼肝油酸钠，浮石及苯酚 的渗透试剂。“间充质干细胞”或“MSC”指，能够分化成造骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、 神经元细胞、胰岛细胞以及其它类似细胞(见下文)的多能干细胞。本发明的MSC的来源 通常为从需进行修复治疗的患者(或适合的供体，(非自体的))的髂骨嵴中获取，此类患者 在本文中被提述为“有此需要的患者”(注意，脂肪组织、滑膜组织、结缔组织等其它来源最 近已获识别，并且也被视为本发明范围内的MSC来源)。在一实施方式中，已采用Centeno 美国专利申请60/761，441中所述方法，或通过Caplan等，美国专利号5，486，359中所述的 塑胶粘附法，获取和“分离”约10-20CC骨髓。出于所有目的，以上各参考文献均全文并入 本文。“血小板裂解物”指，血小板中所含的自然生长因子，通过血小板裂解释放而形 成的混合物。这可以通过化学方法(即CaCl2)、渗透法(使用经蒸馏的吐0)或通过冷 冻/融化程序实现。本发明中的血小板裂解物也可以从全血中获得，并且可以采用美国 专利号5，198，357(其通过引用的方式并入本文)中所述的方法制备。或者，本文中使 用的血小板裂解物还可以通过采用Doucet的方法(Doucet，Ernou等，2005，Journal of Cellular Physiology, 205 (2) :228_236)，该参考文献已经通过全文引用的方式并入本
6文)，从收获的骨髓制备。典型裂解物包含约几千万到上千亿个血小板。如Martineau等在 Biomaterials, 2004 25 (18)p4489_503 (其通过全文引用的方式并入本文)中所说明，血小 板裂解物本身即包含促进稳定的MSC生长所需的生长因子。在典型实施方式中，血小板裂 解物为自体的，并且量为可用于在本文实施方式中有效及稳定使用的量。尤需注意的一点 是，当血小板裂解物中的生长因子(例如，TGF-β)的含量远远低于体外扩增MSC的通常用 量时，据信，将血小板裂解物中所含的所有低含量生长因子一起使用，将产生巨大的协同作 用。“蛋白质”、“肽”和“多肽”可交换使用，均指某种氨基酸聚合物，或两种或两种以上 相互作用或结合氨基酸聚合物的组。“干细胞”指具有未专门化、及能够通过细胞分裂长期更新，并且可诱导成为具有 专门功能的细胞的特征的任何细胞。本发明中的组织修复组合物本发明中的组合物包含具有增强有此需要的患者的组织修复和/或置换能力的 组织修复组合物。这类组合物通常含两种不同方面，第一方面针对诱导需进行组织修复的 部位产生局部炎症反应(在某些情况下，因致炎试剂导致细胞裂解而发挥作用)；并且第二 方面针对促进所述部位的细胞生长(自体或非自体细胞生长增强物质)。炎症和细胞生长 诱导的联合比传统组织修复疗法更显著和意想不到。在某些实施方式中，还包含第三方面， 即自体或非自体干细胞，用于促进修复组合物修复或置换有此需要的部位的组织的能力。本文所述典型修复组合物包括至少一种或更多种炎症诱导剂和至少一种或更多 种细胞生长增强组合物的组合。在一实施方式中，本文使用的细胞生长增强组合物可包含 一种或更多种自体因子。在另一实施方式中，本文使用的细胞生长增强组合物可包含一种 或更多种非自体因子。在其它实施方式中，修复组合物包括自体和非自体生长因子的组合。本文使用的典型自体生长因子包括血小板、富血小板血浆、富血小板纤维蛋白、 血小板裂解物，或以上物质的混合物。如本文所述，典型非自体因子包括重组生长因子(例如，表皮生长因子、纤维母细 胞生长因子-2、血管内皮生长因子、类胰岛素生长因子、转化生长因子-β和血小板源生长 因子)。重组生长因子可从众多生产商(例如，RDJ，Inc.、Bio Vision Inc.、Bio Clone Inc.等)处购买或通过熟知的分离和提纯技术获得。此外，本发明的修复组合物可包含富含重组生长因子的自体生长因子(例如，从 需要进行组织修复的患者中制备的、掺有重组转化生长因子的血小板裂解物)。本文的实施方式可包括含有一种或更多种炎症诱导剂的修复组合物。按照本文的 定义，炎症诱导剂指诱导局部细胞损害的药物，在某些情况下，炎症诱导剂为高渗葡萄糖、 鱼肝油酸钠、浮石、苯酚和/或一种或更多种炎症诱导细胞因子。本文中使用的炎症诱导细 胞因子包括巨噬细胞炎症蛋白-1 (MIP-I)、MIP-I α ,MIP-I β和ΜΙΡ-2。在一实施方式中，使用含5-50%的高渗葡萄糖的修复组合物对患者进行治疗。在 第二实施方式中，使用含-10%的剂量的鱼肝油酸钠的修复组合物对患者进行治疗。最 后，修复组合物可包含苯酚，并且可以介于约1 %到20 %的剂量用于有此需要的患者。本发 明在这一方面的总量可能存在差异，但是每次施用试剂量可介于1到5毫升。此外，本发明的炎症诱导剂可含加剧局部损伤，从而增强本发明的修复组合物的有效性的物质。本文中使用的物质包括凝胶、水凝胶和泡沫。在某些情况下，这类凝胶、水 凝胶和/或泡沫具有生物可吸收性。这些高密度混合物其后可通过人体自身的修复反应被 稀释，或可通过其后生理盐水的处理稀释回0. 9%的生理范围。因此，举例而言，修复组合物 可包含加剧局部损伤的试剂(凝胶、水凝胶、泡沫)，这些试剂可组合其它炎症诱导剂(包括 高渗葡萄糖、鱼肝油酸钠、苯酚及类似物质)。在典型实施方式中，修复组合物包括自体生长因子的细胞生长增强组合物(例 如，血小板裂解物)。优选约5 %到约40 %之间，更典型5 %到20 %的血小板裂解物，虽然也 可以使用其它浓度。血小板裂解物溶液可根据美国专利申请11/773，774(出于所有目的， 已通过引用方式并入本文)中所述的方法及组合物获取和制备(其它方法已经于前文中讨 论)。对患者施用的血小板裂解物制剂总量可介于1毫升到40毫升之间，在某些情况下，可 介于1毫升到20毫升之间。对患者临床使用血小板裂解物的一个问题是，特定血小板裂解物中生长因子的生 物利用度和浓度存在差异。因此，没有特定的生物分析确定裂解物中的因子水平，给药裂解 物变得困难。美国专利申请11/773，774中所讨论的研究明确表明，某些患者使用5%的裂 解物，即可达到最大可能体外扩增，而另一些患者需在PL浓度增加至400%的情况下才能 实现最大扩增。尽管生长因子分析在临床上可用，并且已被广泛使用，但这些生长因子的生 物利用度仍然难以估量。在此情况下，患者的血小板裂解物的培养扩增利用度数据提供关于这些生长因子 的活性的数据(如美国专利申请11/773，774中所讨论，并且已经通过引用方式并入本文)。 该数据可以被用来确定用于治疗目标患者的最佳血小板裂解物％ (即，用不同数量的自体 血小板裂解物培养自体MSC)。本发明的修复组合物还可包含必要营养物(例如，胶原质、糖胺聚糖、氨基酸、肽、 蛋白质、丙酮酸钠、葡萄糖、谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、碳水化合物、精油及类似物 质)，以进一步促进组织修复。因此，血小板裂解物溶液可掺有胶原质和各种氨基酸，以促进 患者的修复过程。本发明中的修复组合物还可包含合成代谢激素(例如，人类生长激素、睾丸激素 及类似物质)。此外，举例而言，还可在对有此需要的患者进行给药之前，在血小板裂解物中 掺入目标合成代谢激素。最后，本文所述的修复组合物可包含自体或非自体干细胞，以增强修复部位的修 复和再生长。在一实施方式中，已根据美国专利申请11/773，774(已于前文中通过引用方 式并入本文)制备和扩增间充质干细胞(MSC)，并将其植入修复部位。应注意，本发明范围 内还包含其它干细胞或细胞类型，然而，MSC在本文中被鉴定为一个潜在实施方式。最近，Centeno等(美国专利申请11/773，774)描述了一种使用生长渠道和自体 血小板裂解物扩增MSC的方法。此外，还描述了将某些水平的生长因子(血小板裂解物或 血小板)与扩增的MSC—同移植入患者需要修复的部位的方法。这些生长因子的水平根据 实现某些细胞最佳离体(ex-vivo)扩增所需的血小板裂解物百分比确定。这些技术也可以 被用来提供数量充足的MSC，以施用给有此需要的患者。促进有此需要的患者的组织修复的 方法本文中所述的实施方式包括对有此需要的患者的部位实施治疗修复的方法。例如，退变性椎间盘或有此需要的关节软骨的治疗修复。其它例子包括心脏内的心肌置换。本文所述方法包括初步确定对患者的修复部位实施最佳治疗的参数。例如，确定 什么及多少炎症诱导剂会对损伤部位产生最佳效果，以及确定应使用什么及使用多少细胞 增强生长组合物(自体、非自体、混合物等)。就这一点而言，所述部位应具有足够的微损 伤，以在避免对无法愈合的部位造成更多大损伤的情况下，引导细胞修复机制。此外，确定 是否使用本发明的修复组合物，或是否首先使用炎症诱导剂组合物，随后使用细胞生长增 强组合物接触。先对患者的修复部位施用修复组合物，然后进行损伤部位分析。治疗应用本发明的修复组合物能为有此需要的患者的部位修复提供最佳修复条件/环境。 修复组合物不仅诱导微组织损伤，从而传导患者炎症因子的信号，还能引发和/或促进所 述部位的细胞生长。在某些实施方式中，离体培养的干细胞被植入有关环境中，以进一步增 加成功修复修复部位的可能性。本文所述修复组合物可作为药物组合物配制，及施用于有此需要的患者，优选哺 乳动物宿主(包括人类患者)。修复组合物可配制成各种形式，以适应选定的给药途径。本文所载实施方式包括含药学上可接受的载体和/或特定递送药物的修复组合 物。对于将组合物作为注射溶液或混悬液给药，可按照本领域公知的方法，使用适当 的分散剂或湿润剂和悬浮剂(例如，灭菌油(包括合成甘油一酯或甘油二酯)和脂肪酸(包 括油酸)配制修复组合物。修复组合物溶液或混悬液可用水、等渗盐水(PBS)制备，任选与无毒表面活性剂 混合。分散剂也可以用甘油、液态聚乙烯、乙二醇、植物油、乙酸甘油酯和上述物质的混合物 制备。根据习惯用途和储存条件，本文所载修复组合物可能含一种或更多种防腐剂，用以防 止微生物的生长。本文所载治疗应用指，本发明的组合物以及方法用于治疗具有需进行组织修复的 损伤部位的患者的用途。需进行修复的损伤部位(即，修复部位)，包括需软骨修复和/或 再生长的关节、需骨骼修复或再生长的骨骼、需修复或再生长的肌腱/韧带、需功能细胞修 复和/或再生长的器官修复(例如，心脏内的心肌生长)等等。在某些实施方式中，本发明着眼于用于罹患限制其修复部位的固有细胞修复或再 生长能力的疾病的患者的治疗应用。例如，罹患骨关节炎、骨质疏松症、无血管性坏死的患 者，都将受益于本发明的促进的修复组合物和治疗方法。本发明着眼于创造模拟性炎症条件，以诱导组织修复。该领域的大多数动物研究 均在急性损伤模型(即指实验地创造，并且当MSC被引入用来促进组织修复时，仍属急性或 亚急性的损伤)中进行。这对于不存在急性损伤的慢性骨关节炎模型而言，是一种逊色的 替代。发明人在该领域的研究表明，创造急性渗透微损伤有助于与MSC有关的半月板修复 (见实例1)。在该等情况下，我们使用经皮递送的高渗葡萄糖引起损伤，然后经皮递送培养 扩增的MSC(扩增根据美国专利申请11/773，774(已就此目的通过引用方式并入本文)执 行)。一般地描述本发明后，参考以下实例将有助于更好地理解本发明，以下实例以举 例方式提供，绝无限制之意。实施例实施例1 本发明的实施方式的治疗用途从两名患者⑶(40岁，白人男性)和JV(28岁，白人男性)提取约20毫升全骨髓。 CD在手术前被诊断为患有严重的膝盖骨关节炎，依据为内侧>外侧半月板黏液样变性，而 JV则在手术前被诊断为内侧半月板后角慢性桶柄状破裂。将各患者俯卧置于OR台上，并用的利多卡因对将收获的区域实施麻醉，然后 使用无菌的一次性套管针分别从左边和右边的PSIS区域抽取IOcc骨髓血液。以IOOg离心全骨髓4-6分钟，以将血浆从RBC中分离出来。将血浆除去，放入单 独的试管中，并以IOOOg离心10分钟，以形成球状有核细胞部分。用PBS冲洗有核细胞一 次，计数，并然后将其悬浮于DMEM+10%的血小板裂解物(PL)中，并以IxlO6细胞/平方厘 米接种入单层培养瓶中。将培养物放置在37°C /5% CO2的潮湿环境中培育。3天后，更换 培养基，取出大部分非粘附细胞群。MSC群体在接种后生长6-12天。待生长至将近融合时， 让集落接受30-60秒的胰蛋白酶化，以便仅将形成群集的MSC分离开来。然后，将MSC以 12，000细胞/平方厘米的密度重接种入DMEM+5 %、10 %或20 %的PL中。达到40-50 %的 融合率后，将各培养物以1 3进行继代培养。待MSC生长至第3-5代后，将其悬浮在磷酸 盐缓冲盐水(PBS)中。要求患者返回诊所，并签署同意书。对患者实施以下手术程序1.首先，用12.5%的葡萄糖(高渗试剂)对各患者进行治疗，然后通过c形臂，经 由患病膝盖的内侧下端，在关节内注射局部麻醉剂。2. 3-5天后，首次注射产生的急性炎症反应消退后，将PBS中的培养扩增自体MSC 与10%的血小板裂解物一起注射。已向患者提供，并且已分别于手术前、手术后1个月和手术后3个月给予患者经修 改的VAS调查问卷和功能评级指数调查问卷。理疗师已分别于手术前、手术后1个月和手术 后3个月对患者进行膝盖活动度测量。此外，手术前MRI是以矢状冠状面在具有质子密度 迅速自旋序列的GE 3.0T磁体上进行的。手术后1个月和3个月时的图像，通过匹配激发 次数(NEX)、重复次数(TR)和回波次数(TE)获得。各兴趣区域(ROI)的相同检查员使用三 次追踪(trace)，用商业上可用的图像处理软件(OSIRIS-Digital Imaging Unit,Division of Medical Informatics,University Hospital of Geneva)进行定量半月板和关节软骨 体积(volume)分析。并且已计算这三次追踪与平均值之间的标准偏差。此外，还以类似方 式，对内侧承重股骨缺损区域进行追踪和计算。结果(见表1)表1 手术前、手术后1个月、手术后3个月和手术后6个月时，股骨软骨和半月板 的MRI体积变化患者 姓名关节时间测量区域体积 e (n=3)STDEVSE已注入的 细胞数量 (百万)与注射前 相比的％ 变化1.L膝盖注射前软骨 表面 半月板4535 2646215.37 126.05124.49 72.8632.661个月软骨5484128.3474.1920.93表面323395.3555.1122.18半月板3个月软骨4867378.02218.517.32表面2979154.4489.2712.59半月板6个月软骨5531120.9769.9321.96表面4055168.5797.4453.25半月板2.R膝盖注射前软骨 表面 半月板7994 2512113.51 178.565.61 103.1820.91个月软骨8150131.0475.751.95表面2632126.6573.214.78半月板3个月软骨9121468.93271.0614.10表面3322246.55142.5132.25半月板以上实例的结果表明，本发明的实施方式具有惊人的疗效，以及使用按照本发明 的组合物和治疗方法的效用。实例2 葡萄糖环境中的MSC扩增为确保血小板裂解物中常见的各种生长因子(TGF-β、FGF、IGF、PDGF)能被暴露 于高渗环境中，及仍具有支持间充质干细胞生长的功能，已使用培养扩增的人类MSC进行 以下实验方法在0.8毫升10%的血小板裂解物中，加0.2毫升50%的葡萄糖。在单独的条件 下，在0.8毫升10%的血小板裂解物(PL)中加0.2毫升的磷酸盐缓冲盐水。让两种样本在 37C、5%C02的环境下培育1小时。然后，各取出1毫升混悬液，并加9毫升的基本α mem 培养基中，得到最终比率10%的PL和的葡萄糖。之后，在6孔板的各个孔中接种每种 混悬液中的100，000个细胞。培育48小时后，所有细胞均呈现正常形态。结果
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PL+ =含葡萄糖PL-=对照
rnn7Ql .PL.t—— —PL 二―平均——标绝偏i —CV — 2.50E+05_ L90E+05 j2.20E+05^ 30000 ^ 13.636 该实施例表明，MSC在葡萄糖(炎症诱导剂)环境下可有效扩增，这是令人惊讶的 意外结果。
权利要求
用于促进有此需要的患者的组织修复的组合物，包括与一种或更多种炎症诱导剂相联合的治疗学上有效量的自体血小板裂解物。
2.权利要求1所述组合物，其中所述炎症诱导剂是能够在有此需要的患者中诱发局部 细胞损伤的试剂。
3.权利要求2所述组合物，其中所述用于诱发局部细胞损伤的试剂选自高渗葡萄糖、 鱼肝油酸钠、炎症细胞因子、浮石、苯酚和上述物质的混合物。
4.权利要求2所述组合物，其中所述用于诱发局部细胞损伤的试剂借助高渗或低渗试 剂，通过局部细胞裂解起作用。
5.权利要求1所述组合物，其中富血小板血浆、富血小板纤维蛋白或其它全血小板浓 缩物均可代替血小板裂解物。
6.权利要求1所述组合物，其中细胞因子被加入5%到40%的血小板裂解物中，以改变 血小板裂解物中的生长因子从血小板上脱粒的时间。
7.权利要求1所述组合物，还包含一种或更多种必要营养物，其中所述必要营养物进 一步促进组织修复。
8.权利要求7所述组合物，其中所述一种或更多种必要营养物选自糖胺聚糖、胶原质、 氨基酸、肽、蛋白质、丙酮酸钠、葡萄糖、谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、碳水化合物和 精油。
9.权利要求1所述组合物，还包含一种或更多种合成代谢激素，其被添加来增强局部 愈合效果。
10.权利要求1所述组合物，其中所述炎症诱导剂还包含凝胶、水凝胶、泡沫或其它物 质，用以局部化或最大化应用区域的微损伤。
11.用于促进有此需要的受试者的组织修复的方法，包括从受试者获取一定量的血小板；从所述血小板制备5%到40%的血小板裂解物溶液；对受试者施用用量足以诱发需进行组织修复的部位产生局部炎症的炎症诱导剂；并 且，向受试者需要进行组织修复的部位施用5%到40%的血小板裂解物溶液；其中所述炎症诱导剂和血小板裂解物的联合给药促进患者需进行组织修复的部位的 组织修复。
12.权利要求11所述方法，还包括通过首先确定实现患者间充质干细胞的最佳体外培 养扩增所需的血小板裂解物的％，来确定用于向患者施用的血小板裂解物的％，并向患者 施用所述％的血小板裂解物。
13.权利要求11所述方法，其中向患者施用指，借助关节内窥镜或经皮，通过手术切口 向需要修复的部位施用。
14.权利要求11所述方法，其中所述％的血小板裂解物和施用量，至少根据患者的年 龄、健康状况、修复部位和需修复的程度确定。
15.用于促进有此需要的患者的组织修复的组合物，包括与一种或更多种炎症诱导剂 相联合的治疗学上有效量的一种或更多种重组生长因子。
16.权利要求15所述组合物，其中所述炎症诱导剂选自高渗葡萄糖、鱼肝油酸钠、炎症 细胞因子、苯酚和上述物质的混合物。
17.权利要求15所述组合物，还包含5%到40%的血小板裂解物，其中该血小板裂解物 从需进行组织修复的患者中收获的全血制备。
全文摘要
体内组织修复取决于急性炎症，但在许多临床情况下，供血、合成代谢激素、生长因子及干细胞等其它主要愈合成分是缺乏的。本发明包含由诱发发炎性愈合反应的试剂，与已证实具有在体外扩增自体组织修复细胞的能力的特定浓度的自体血小板裂解物联合而组成的组合物。
文档编号C12N5/02GK101945994SQ200880127062
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月18日 优先权日2007年12月19日
发明者C·J·琴特诺 申请人:再生科学有限责任公司