用于心血管疾病的生物标记物的制作方法

专利名称：用于心血管疾病的生物标记物的制作方法
技术领域：
本发明属于诊断学领域，更具体地，属于心血管疾病的诊断、预测和治疗领域。本 发明涉及用于诊断和预测患者心血管疾病的生物标记物，用于诊断和预测对象心血管疾病 的方法，执行此种方法的试剂盒，及对此种方法有用的微阵列和诊断试剂。特别地，诊断的 心血管疾病涉及缺血性心脏病。本发明进一步涉及治疗患心血管疾病(患此病风险增大) 的对象的方法和适合用于此种治疗方法的药物组合物。
背景技术：
缺血性心脏病类疾病的特点是供应到心脏的血液减少，它是西方世界中发病率 和死亡率的主要原因。由于患者所需的加强医疗护理，该疾病构成健康护理医疗费用 和健康护理基础设施的主要投资。该疾病的早期诊断是困难的。实际上，没有适当的 测试可用于诊断进行性缺血(ongoing ischemia)和代偿性新血管形成(compensatory neovascularization)。缺血性心脏病的当前诊断以功率计(运动)测试(ergometric (exercise) testing)或心肌灌注成像为基础。这些技术具有有限的灵敏度和专一性。更可靠的方法是 执行冠脉血管造影术(coronary angiography)。但此种经皮和侵入性操作伴有相当大的风险。所以，需要用于诊断和预测缺血性心脏病的可靠的生物标记物。

发明内容
本发明的发明人现已发现，在许多情况下与成年血管生成过程(新血管发育)相 关的基因表达预示进行性缺血，因而这些基因表达可用于诊断和预测缺血。发明人首次获 得该发现是在注意到小鼠Flkl+细胞中大量基因在血管生成(新血管形成)期间被上调之 后。详细的跨物种验证(trans-species verification)表明这些基因在青春期小鼠模型 中在缺血期间被上调，在该跨物种验证中细察了小鼠和斑马鱼形成血管树期间与血管生成 相关的这些基因及其表达产物的表达。这将这些基因的表达与动脉疾病联系在一起。本发 明人因此现已发现，进行性缺血和其他心血管疾病的诊断，可通过检测代偿性新血管形成 过程，特别是通过检测与活化的EPC相关的基因表达谱。这些基因及其表达产物在缺血和 动脉修复期间提供了代偿系统，导致代偿性血管生成和血管修复。这些基因的表达与缺血 之间的联系进一步通过单个基因(克隆)及其基因产物的表达被分析证实，其中该基因及 其产物属于循环多形核白细胞(PML)、内皮祖细胞(作为PML组分的一部分)和血清或血 液样本的亚群(subset)，该血液样本来自患稳定型缺血性冠状动脉病和急性冠脉综合征患 者ο一方面，本发明现提供诊断或预测对象中心血管疾病的方法，所述方法包括在所 述对象循环流体(circulation fluid)的样本中检测活化的内皮祖细胞(EPC)的出现的步
马聚ο
在此种方法的优选实施例中，所述心血管疾病与动脉损伤或心肌损伤相关。在此种方法的可替换的优选实施例中，所述心血管疾病与缺血相关。在本发明的方法中，检测活化的EPC的步骤合适地包含在所述样本中检测EPC中 基因表达水平的升高，该基因为选自下面组中的至少1个基因和甚至更优选的至少2、3、4、 5、10、15、20、25、30、35个或所有基因，该组由下列基因组成，即，ADORAl、AD0RA2A、AD0RA2B、 AD0RA3、AGTRL 1 (APLNR)、AMPH、APLN、CCBE1、CDC42、CGNL1、CREBBP、CRIPl、CRIP2、CRIP3、 CYB5B、DLL4、DUSP5、EEAl、egr-l、ELKl、ELK3、ELK4(SAPl)、EP300、ERG1(KCNH2)、ETS1、ETS2、 EXOC3L、FO)l、Fa)2、FGD3、Fa)4、FGD5、FLTl、FST、GATA6、GRRPl、HO-l(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、 IFNG、ILlA、ILlB、LAMA4、Lambl-l、LGMN、MMP3、Nos2、PAIl、PHDl、PLVAP、RAB5a、RIN3、R0CK2、 S0X18、S0X7、SRF、STABU STAB2、STUBl、TFEC、THBS1、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSD1、 TNFAIP8，和XLKDl (LYVEl)，该基因又优选为选自由下面组中至少1个基因和更优选至少2、 3、4、5、10、15、20、25、30个或所有基因，该组由下列基因组成，S卩，AD0RA2A、AGTRL1 (APLNR)、 APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、 FGD5、GRRPl、HO-1 (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、LAMA4、Lamb 1-1、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、 S0X18、STABl、STAB2、STUBl、TFEC, THSDl、TNFAIP8，和 XLKDl (LYVEl)。基因表达水平的提 高可通过任何合适的方法检测并可针对核酸(例如，mRNA)或蛋白质检测。上面提及的基 因的蛋白质表达产物可由活化的EPC分泌，因而EPC中的基因表达水平可通过检测全血中 的蛋白质检测，而不是通过检测全血的EPC组分(fraction)。这个方法优于现有技术方法的重要优势(循环EPC数目的计数或功率计(运动) 测试)在于本方法更灵敏且该疾病可在更早期被检测到。基于此，本发明的发明人已发现动脉疾病、缺血和代偿性新血管形成的潜在生物 标记物，可在血管生成期间在活化的EPC中被上调的基因和这些基因的表达产物当中找 到，并发现该标记物可在血液、血液的血清或细胞组分中检测到。另一方面，本发明现提供用于诊断或预测患者的心血管疾病的生物标记物，所述 生物标记物包含其在血管生成期间表达被调节的基因的表达产物。优选地，所述生物标记 物包含在血管生成期间其表达被上调的基因(促血管生成基因，pro-vasculogenic gene) 的表达产物。在可替换的优选实施例中，该生物标记物存在于内皮祖细胞(EPC)或多形核 白细胞(PMN)或全血中。大体上，本发明以检测对象的血液中活化的EPC为基础。活化的EPC，作为循环EPC 标准池(normal pool)的一部分，最好通过它们的特异基因库(r印ertoire)(基因表达谱) 鉴定。因为基因表达产物中的一些可被周围血液中的细胞分泌，被分泌的生物标记物也可 在全血中检测到。在又一个优选的实施例中，所述EPC或P丽存在于患者的外周血中。优选地，所 述EPC是Flkl+(Flkl阳性)细胞。更优选地，活化的EPC显示基因表达谱，其中选自下面 组中的至少1个基因和更优选至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35个或所有基因的表达水平 与它们在未活化的EPC中相比被上调，该组由下列基因组成，即ADORA 1、AD0RA2A、AD0RA2B、 AD0RA3、AGTRLl (APLNR)、AMPH、APLN、CCBEl、CDC42、CGNLl、CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、 CYB5B、DLL4、DUSP5、EEAl、egr-l、ELKl、ELK3、ELK4(SAPl)、EP300、ERG1(KCNH2)、ETS1、ETS2、 EXOC3L、FO)l、Fa)2、FGD3、Fa)4、FGD5、FLTl、FST、GATA6、GRRPl、HO-l(HM0X1)、H0_2(HM0X2)、IFNG、ILlA、ILlB、LAMA4、Lambl-l、LGMN、MMP3、Nos2、PAIl、PHDl、PLVAP、RAB5a、RIN3、R0CK2、 S0X18、S0X7、SRF、STABU STAB2、STUBl、TFEC、THBSl、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSD1、 TNFAIP8和XLKDl (LYVEl)，还优选选自下面组中至少1个基因和又更优选至少2、3、4、5、 10、15、20、25、30个或所有基因在与它们在未活化的EPC中的表达水平被上调，该组由下列 基因组成，即 AD0RA2A、AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、 ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD5、GRRP1、HO-1 (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、LAMA4、 Lambl-I、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、S0X18、STABl、STAB2、STUBl、TFEC、THSDl、TNFAIP8 和 XLKDl (LYVEl)。本发明生物标记物优选为选自下面组中的至少1个基因和更优选至少2、3、4、5、 10、15、20、25、30、35个或所有基因的表达产物(多肽或多核糖核苷酸)，该组由下列基因组 成，即 ADORA1、AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、AGTRLl(APLNR)、AMPH、APLN、CCBE1、CDC42、CGNL1、 CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、DLL4、DUSP5、EEAl、egr_l、ELK1、ELK3、ELK4 (SAPl)、 EP300、ERG 1 (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD1、FGD2、FGD3、FGD4、FGD5、FLT1、FST、GATA6、 GRRPl、HO-I (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、IFNG、ILIA、IL1B、LAMA4、Lambl-U LGMN、MMP3、Nos2、 PAI1、PHDl、PLVAP, RAB5a、RIN3、R0CK2、S0X18、S0X7、SRF, STABl、STAB2、STUBl、TFEC, THBSl、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSDl、TNFAIP8，和 XLKDl (LYVEl)，还优选为选自下面 组中的至少1个基因而又更优选至少2、3、4、5、10、15、20、25、30个或所有基因的表达产物 (多肽或多核糖核苷酸)，该组由下列基因组成，即，AD0RA2A、AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBE1、 CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD5、GRRPl、 HO-I(HMOXl)、H0-2(HM0X2)、LAMA4、Lambl_l、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、S0X18、STABl、 STAB2、STUBU TFEC, THSD1、TNFAIΡ8，禾口 XLKDl (LYVEl)。本发明生物标记物可具有上面提到的基因之一的表达产物的形式，或可采取蛋白 质谱或RNA谱的形式。另一方面，本发明提供了如上定义的生物标记物在诊断或预测对象心血管疾病方 面的用途。另一方面，本发明提供了如上定义的生物标记物作为替代终点标记物(surrogate end-point marker)的用途。此种替代终点标记物可用在心血管疾病的预测研究中并可用 于测试治疗效果。另一方面，本发明提供了用于诊断或预测对象心血管疾病的方法，该方法包括在 所述对象血液中检测根据本发明的生物标记物。所述方法优选在所述对象的血液样本上进 行。在所述方法的其它优选实施例中，检测生物标记物的步骤可通过使用微阵列进行。在所 述方法的可替换的优选实施例中，检测生物标记物的步骤可通过使用串联质谱法(MS-MS)、 通过MALDI-FT质谱仪、MALDI-FT-ICR质谱仪、MALDI三重四极杆质谱仪、QPCR或其它杂交 方法或免疫分析进行。实际上，任何合适的检测方法均可用于鉴定该生物标记RNA或蛋白 质。另一方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒用于根据本发明的进行诊断或预测对 象心血管疾病的方法。所述试剂盒包含至少一个如上文定义的生物标记物，或特异性结合 到所述生物标记物的特异性结合伴侶。根据本发明的试剂盒可选地进一步包含下面的一个 或多个
至少一种参考样本或对照样本；关于生物标记物的参考值的信息；至少一种能够结合到所述特异性结合伴侣的测试化合物；至少一个用于检测所述生物标记物和所述特异性结合伴侣之间的结合的可检测 的标记物。另一方面，本发明提供了微阵列，该微阵列用于根据本发明进行诊断或预测对象 心血管疾病的方法。所述微阵列包含特异性结合伴侣，该伴侣特异性结合到至少两个如上 文定义的生物标记物上，其中该生物标记物结合到固体载体(solid support)上。另一方面，本发明提供了特异性结合到如上文定义的生物标记物上的诊断试剂。 优选地，该诊断试剂是与所述生物标记物在严格条件下特异性杂交的抗体或核酸分子。另一方面，本发明提供了包含本发明诊断试剂的诊断组合物。另一方面，本发明提供了本发明诊断组合物在诊断对象心血管疾病方面的用途。另一方面，本发明提供了治疗患心血管疾病(风险增大)的对象的方法，所述方法 包括使用如上文定义的生物标记物作为治疗靶或作为治疗剂。在治疗对象的根据本发明方法中，所述生物标记物作为治疗靶或作为治疗剂的 所述用途包含影响选自下面组中至少1个基因和更优选至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、 35个或所有基因的表达，该组由下列基因组成，即AD0RA1、AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、 AGTRLl (APLNR)、AMPH、APLN、CCBEl、CDC42、CGNLl、CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、 DLL4、DUSP5、EEAU egr_l、ELKU ELK3、ELK4 (SAPl)、EP300、ERGl (KCNH2)、ETSU ETS2、 EX0C3L、FGD1、F⑶2、FGD3、F⑶4、FGD5、FLT1、FST、GATA6、GRRP1、H0-1(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、 IFNG、ILIA、IL1B、LAMA4、Lambl-I、LGMN、MMP3、Nos2、PAI1、PHDl、PLVAP, RAB5a、RIN3、 R0CK2、S0X18、S0X7、SRF、STABU STAB2、STUBl、TFEC、THBS1、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、 THSDU TNFAIP8，和XLKDl (LYVEl)，更优选影响选自下面组中至少1个基因和还更优选 至少2、3、4、5、10、15、20、25、30个或所有基因的表达，该组由下列基因组成，即AD0RA2A、 AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETSl、 ETS2、EXOC3L、FO)5、GRRP1、HO-1(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、LAMA4、Lambl_l、LGMN、PLVAP、RIN3、 R0CK2、S0X7、S0X18、STABl、STAB2、STUBU TFEC, THSD1、TNFAIP8，和 XLKDl (LYVEl)。优选地，所述生物标记物作为治疗靶的所述用途包含，减少至少一种在患心血管 疾病(风险增大)的对象中过度表达的蛋白质量，或增大至少一种在患心血管疾病(风险 增大)的对象中被低表达的蛋白质的量。另一方面，本发明提供了用于治疗患心血管病症的风险增大的药物组合物，包含 选自下面化合物中的至少一种抑制剂化合物针对本发明生物标记物，优选针对在细胞膜上被表达的生物标记物的抗体或其 衍生物，且所述衍生物优选选自由scFv片段、Fab片段、嵌合抗体、双功能抗体、胞内抗体 (intrabody)、和其他抗体来源的分子组成的组；如在此定义的生物标记物；干扰所述生物标记物生物活性的小分子；反义分子，特别是反义RNA或反义寡脱氧核苷酸；RNAi 分子，和
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核酶和合适的赋形剂、载体或稀释剂。另一方面，本发明提供了治疗对象的方法，该方法包括给予所述对象可有效减低 心血管疾病(风险)的量的本发明的药物组合物。
具体实施例方式术语术语“内皮祖细胞(EPC) ”是指源自骨髓的循环细胞群体，其似乎参与血管生成和 血管内平衡(血管稳态，vascular homeostasis)。这个祖(干)细胞群体首次被Asahara 等人在1997年(Science Vol. 275，964-967)描述为骨髓细胞中的CD34+CD133+细胞，但是 祖(干)细胞可从血液的外周血单核细胞(PBMC)组分中分离出来。健康个体血液中看到 的数目少，它们的数目在血管受损之后倾向于增多。到目前为止，实验已经确定EPC在体外 形成集落(colony)的能力，这提示它在血管新生和在维持已有血管壁方面的作用。最近证 据已提示EPC与肿瘤血管生成相关。术语“活化的内皮祖细胞(EPC) ”是指具有不同于正常循环EPC的基因表达谱的 EPC0这个基因表达谱可例如借助表1中基因表达的上调识别。然而，因为表1中的基因表 示为可在血液中检测到的生物标记物，所以这些基因仅包括被上调并因而引起产物的阳性 表达的基因。本领域的普通技术人员将会意识到，在活化的EPC中也可观测到被下调的基 因，但此种基因不适合用作生物标记物。但此种下调基因可用作表示活化的EPC表达谱的 部分基因。可以通过以下的方法很好地评定EPC是否是活化的EPC，通过评定EPC表达谱 和将该谱与如在本文公开的包含表1中基因的表达增多的特异谱进行比较，或通过确定表 1中一个或更多基因的表达水平并确定该水平较对照组EPC(即，正常健康对象的血液中的 循环EPC)是否提高。“血管生成(vasculogenesis) ”(在本文中也称为新血管分布 (neovascularisation)或新血管新生(neoangiogenesis))是指在没有预先存在的血管时 的血管形成，而血管新生(angiogenesis)与之相反，血管新生术语指来自现存血管的血管 形成。血管生成最初被认为仅在胚胎发育期间发生，但现在已得知该过程也可发生在成年 有机体中。血管生成涉及内皮前体细胞(成血管细胞)的迁移和分化，以对局部提示(例 如，生长因子和胞外基质)和新血管(血管树)的形成作出反应。这些血管树然后被修剪 并通过血管新生延伸。已知循环内皮祖细胞(干细胞衍生物)可不同程度地促进新血管分 布。术语“在血管生成期间”，如在本文中使用的，是指基因表达朝向血管生成，而不是 朝向血管新生的时期。新血管形成通过血管生成和血管新生进行。在胚胎发生期间，血管 生成时期的特点是Flkl-阳性胚胎干细胞的优势达到峰值。小鼠Flkl基因编码主要信号 受体、针对血管内皮生长因子A(VEGF-A)的血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)，且对早期 胚胎中血管和造血系统的发育是必要的。在小鼠中，小鼠胚胎干(ES)细胞分化成Flkl+细 胞，该Flkl+细胞可产生两种类型的细胞，即周细胞(可通过(但并不排它地)α -平滑肌 肌动蛋白的表达鉴定的血管平滑肌细胞；SMA+)和内皮细胞(可通过(但并不排它地)血小 板-内皮细胞粘附分子的表达鉴定；PECAMI+)。这些周细胞和内皮细胞随后组装成原始血管。因而，源自胚胎干细胞的Flkl-阳性细胞可用作血管祖细胞(vascular progenitors) 0血管生成与血管新生可按如下方式区分。血管生成是血管从干细胞(祖细胞)从 头合成并涉及这些多向性(pleitrophic)细胞的募集和分化，而血管新生是从现存血管形 成新血管(内皮细胞的去分化，迁移/增生并再次分化成新管且重塑成重要的血液动力学 血管(“修剪”)。术语“缺血性心血管事件”或简称“缺血事件”，如在本文中使用的，是指向器官或 组织的血液供给中断。缺血事件通常是血栓(blood cloth)引起的，且在动脉粥样硬化狭 窄(atherosclerotic stenosis)患者中，当栓子离开动脉粥样硬化病变区时该缺血事件最 经常发生。因这个阻塞造成的动脉或其他血管狭窄，或窄化或堵塞，可导致许多有害状态， 其中许多对对象有严重后果。在本文中提及的缺血性心血管事件包括，但不局限于中风/ 短暂性缺血发作或脑血管病发作、心肌梗塞、心肌缺血(心绞痛)、任何心肌症并发心肌缺 血症(例如，有症状的主动脉狭窄，H0CM)、脑出血、外周(不稳定型)心绞痛、间歇性跛行 (claudicatio intermittens)(外周动脉粥样硬化疾病)和血管中发生的其他主要异常现 象。术语“血管中发生的异常现象”包括提及的冠脉(coronary)和脑血管事件，以及外周 血管疾病。术语“缺血性心血管事件”通常是被术语“心血管疾病”广泛包括的医疗病症的 急性阶段。术语“缺血”，如这里使用的，是指向器官、身体部分或组织的血液供给的绝对或相 对短缺，或流向器官、身体部分或组织的血的不足。相对短缺是指血供给(氧输送)和血需 要(经组织消耗的氧)之间的差异(discr印ancy)。血供给的限制，一般因血管中的因素 引起，最经常，但不排他地，由血栓栓塞(血凝)或动脉粥样硬化(阻塞动脉管腔的载脂斑 块(lipid-laden plaque))致使的血管收缩(constriction)或堵塞引起。缺血导致组织 损伤或功能异常。心肌缺血导致心绞痛，且在本文中指缺血性心脏病。术语“心血管疾病(CVD) ”一般是指影响心脏和循环系统的一些疾病，包括动脉瘤、 心绞痛、心律不齐、动脉粥样硬化、心肌症、脑血管破裂(中风)、脑血管疾病、先天性心脏 病、充血性心力衰竭、冠心病(CHID)，也称为冠状动脉病(CAD)、缺血性心脏病或动脉粥样 硬化性心脏病，扩张性心肌病、舒张功能不全、心内膜炎、心力衰竭、高血压病(高血压)、肥 厚型心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞(心脏病发作)、心肌炎、外周性血管疾病、风湿性心脏 病、瓣膜疾病和静脉血栓栓塞。如这里使用的，术语“心血管疾病”也包括提及的缺血，因物 理损伤(动脉内膜切除术(endartiectomie)，气囊血管成形术(balloon angioplasty))造 成的或由于慢性损伤(包括动脉粥样硬化)引起的动脉损伤(对内皮细胞谱系的损伤)，心 肌损伤(心肌坏死)，和肌坏死。总的来说，可引出新血管新生反应的任何生理学或病理生 理学病症均包括在本文中使用的术语“心血管疾病”中。术语“循环流体”是指淋巴流体和血液，优选血液。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可交换地用于指氨基酸残基的聚合物。该 术语可用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似 物或模拟物(mimetic)，该术语也可用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽可被修饰，例如，通 过加入碳水化合物残基修饰，从而形成糖蛋白。该术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括糖蛋 白和包含任何其他修饰的蛋白质，以及非糖蛋白和另外的未经修饰的蛋白质。“蛋白质谱”，如在本文中使用的，是指样本中存在的蛋白质、蛋白质片段，或肽的集合(collection)。蛋白质谱可包含集合中蛋白质的确认(identity)(例如，已知蛋白 质的种名或氨基酸序列特性，或分子量或关于还没有进一步表征的蛋白质的其他描述性信 息)，而没有提及存在的数量。在其他实施例中，蛋白质谱包括样本中示出的蛋白质的数量 信息。类似地，如在本文中使用的“基因表达谱”，是指样本中存在的基因表达产物的集合 (包括如蛋白质和RNA分子的这种产物)。如在本文中处使用的，有关基因表达谱中基因表达产物的“定量”，是指确定样本 中存在的特定蛋白、肽或RNA量。定量可以是绝对量(例如，yg/mL)或相对量(例如，信 号的相对强度)。通常，此种操作可通过专用的生物化学试验，例如色谱、质谱或杂交试验进 行。如在本文中使用的，有关循环流体中细胞的“定量”是指确定细胞的绝对或相对数目。 通常，此种操作可通过专用的细胞计数器执行，例如流式细胞仪。“标记物”和“生物标记物”可交换地用于指基因表达产物，将从两个不同对象，例 如，测试对象或患缺血事件(患此病风险)的患者中采取的样本与从参照组对象(例如，没 有患缺血事件(或患此病风险)的对象、正常或健康的对象)采取的可比较的样本相比较， 该表达产物差别地存在于二者样本中。可替换地，该术语指相对另外的细胞群体，差别存在 于细胞群体中的基因表达产物。短语“差别地存在”是指将从测试对象采取的样本与从对照组对象采取的样本相 比较，存在于二者样本中的标记物数量或频率(发生的发病率)是有差别的。例如，标记物 可以是，与参照组对象样本相比，有风险的对象(risk subject)血液样本中存在的水平升 高或降低的基因表达产物。或者，标记物可以是，与对照组对象样本相比，可在有风险的对 象血液样本中检测到的频率更高或更低的基因表达产物。如果一个样本中的基因表达产物数量与另一个样本中的基因表达产物数量在统 计学上显著不同，则该基因表达产物“差别地存在”于这两个样本中。例如，如果它存在于 一个样本中的量是存在于另一个样本中的量的至少约120%、至少约130%、至少约150%、 至少约180%、至少约200%、至少约300%、至少约500%、至少约700%、至少约900%，至 少约1000%之多，或如果它在一个样本中可检测到而在另一个样本中不可检测到，则该基 因表达产物差别地存在于这两个样本中。如在本文中使用的，术语“抗体”和“多种抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、合 成的抗体、人抗体、人化抗体、嵌合抗体、单链Fvs (scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、 二硫键接(disulfide-linked)的Fvs (sdFv)和抗独特型(anti-Id)抗体(包括，例如，本 发明抗体的anti-Id抗体)，和上面任何一个抗体的抗原表位结合片段。特别地，本发明抗 体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点的分子， 该抗原结合位点特异地免疫结合到多肽抗原，该多肽抗原被包括在基因组区中的基因编码 或受表1中列出的基因组区中的遗传转化影响。本发明免疫球蛋白分子可以是任何类型的 (例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、任何类别的(例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4, IgA1 和 IgA2)或可以是免疫球蛋白分子的亚类(subclass)。“免疫分析”是指使用抗体特异性结合抗原(例如，标记物)的试验。免疫分析的 特点是利用特定抗体的特异性结合特性来分离、靶向，和/或量化抗原。多种免疫分析法 可用于挑选与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析通常用于挑选 与蛋白特异性免疫反应的抗体(参见，例如，Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual (1988)，用于描述可用于确定特异性免疫反应性的免疫分析法和条件)。典型地，特 异性或选择性反应强度是本底(background)信号或噪音的至少两倍和更典型地大于本底 的10 100倍。当提及抗体时的短语“特异性(或选择性)结合”，或当提及蛋白质或肽时的短语
“与......特异性(选择性)免疫反应”，是指对蛋白质在蛋白质和其他生物物质的异质性
群体中的存在起决定性作用的结合反应。因而，在指定的免疫分析条件下，给定的抗体结合 到特定蛋白的强度至少是本底的两倍，且没有大量的抗体显著结合到样本中存在的其他蛋 白质上。在此种条件下，与抗体的特异性结合，需要挑选对特定蛋白有特异性的抗体。蛋白质或基因的术语“影响表达”和“调整表达”，如这里使用的，应当理解为， 调节、控制、阻断(block)、抑制、刺激、增强、活化、模仿(mimick)、绕开(bypass)、纠正 (correct)、移出，和/或取代所述表达，在更一般的术语中，应当理解为干预所述表达，例 如通过影响编码该蛋白质的基因的表达进行。术语“对象”或“患者”在本文中可交换地使用，并包括但不局限于，有机体、哺乳动 物和非哺乳动物，其中哺乳动物包括，例如，人、非人的灵长类动物、小鼠、猪、牛、山羊、猫、 兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴、绵羊或其他非人的哺乳动物；非哺乳动物包括，例如，非哺乳动 物的脊椎动物和非哺乳动物的无脊椎动物，非哺乳动物的脊椎动物为，例如禽(例如，鸡或 鸭)、两栖动物和鱼。优选实施例的描述生物标记物1999年，Asahara最先描述了患者外周血中的内皮祖细胞(EPC)构成募集的内皮 前体细胞池，内皮前体细胞对缺血和动脉损伤作出反应。其后，这些细胞被显示涉及生理状 态和病理生理状态下的新血管新生(新血管形成)。而且，EPC涉及内皮细胞谱系损伤之后 出现的进行性动脉修复和/或再生，该内皮细胞谱系不仅可由物理损伤(动脉内膜切除术， 气球血管成形术)导致，而且可由慢性损伤(包括动脉粥样硬化)和缺血/肌坏死(引出 新血管新生反应)导致。除了这些知识，迄今还没有提供用于诊断或预测心血管疾病的生物标记物。用于 心肌损伤的标记物(心肌坏死标记物)通常用在心脏学实践中，但主要包含细胞内心肌酶 的鉴定，细胞内心肌酶是在心肌组织损伤之后在循环中释放的，心肌组织包括肌钙蛋白和 肌酐激酶MB亚组分(creatinin kinase MB subfraction)。然而，至今还没有可以量化进 行性缺血事件或缺血前(previous ischemic)事件的标记物。稳定型心绞痛构成心血管实 践的大部分且在西方社会包含相当多的患者人数(就发病率和死亡率而言)。可替换的诊 断方法包括运动测试和灌注成像，这些方法并不是成本高效的且缺乏合适的灵敏度和特异 性。这种严重的健康威胁促进合适的生物标记物来鉴定处于危险中的患者和评价对抗缺血 治疗的合适反应。为了搜寻此种标记物，本发明人已进行小鼠和斑马鱼的胚胎血管形成的全基因组 分析(使用RNA微阵列分析)，并鉴定了以某些方式参与动脉形成的2000个以上的基因。 这大量基因最初是在使用Flkl+胚胎干细胞与Flkl-(阴性)群体(不相关细胞)之间的 差别表达，确定8-11天大的小鼠胚胎中Flkl+胚胎干细胞的RNA表达谱之后发现的。通过 使用整体原位杂交(WISH)，1150个基因被选作提供潜在的生物标记物。发明人进一步挑选和证实这些候选基因在小鼠和斑马鱼的血管树形成中的表达，以及在缺血期间它们在青春 期小鼠模型中的上调。基于直系同源物搜索，发明人在2000+个细胞中，鉴定出涉及人、鼠科动物和斑 马鱼血管生成的26个克隆。Flkl+细胞包括(designate)早期造血干细胞、专门的成 血管细胞(dedicated angioblasts)，和完全分化的内皮细胞，因此包括从血管母细胞 (hemangioblasts)到内皮细胞(EC)的全分化过程。已知Flkl和Tail是早期发育期间专 门的成血管细胞上最早期标记物中的两个，而Flkl的表达在胚外(extra-embryonic)造 血干细胞中被迅速下调，因为它们向造血谱系(hematopoietic lineage)转化。在斑马鱼 中运用原位杂交研究，发明人初始可以显示，通过差别显示分析(differential display analysis)比较Flkl+与Flkl-细胞所鉴定的基因的23%在血管生成位点被专门地表达， 其中另外的30%在血管生成和神经元及视网膜上皮样组织(retinal epitheloid tissue) 的位点被表达。这强调了本发明人的原始实验原理的正确性，从而通过这个特定基因筛 选鉴定血管生成的基因调节物(genetic regulator)。本发明人鉴定了在血管树中在小 鼠发育期间被差别表达的2000+鼠科动物基因，并在斑马鱼发育期间进行血管生成的高 通量整体原位杂交，以及使用从缺血的鼠科动物模型和人疾病中采集的各种组织，进行 挑选的基因的定量PCR分析，从而证实斑马鱼发育期间发育血管床中的适当的时空表达 (spatiotemperal expression)。使用这种涉及小鼠、斑马鱼和人血管生成的不同表现形式 的基因的筛选，发明人可以鉴定在各种物种和不同模型中保留的通用的调节基因产物，并 可以鉴定胚胎和成年小鼠中血管生成的通用基因调节子(regulator)。血管生成在成年新血管形成中的作用已充分确立，其是许多科学论文的主题。然 而，该过程的基因调节至今仍不清楚。发明人已研究并比较作为模型的小鼠和斑马鱼发育 期间的血管形成，从而在没有血生成和血管新生的情况下在体内分析血管形成过程。随后 本发明人使鉴定出的克隆表达与肢体缺血的(成年)小鼠模型和人疾病中的表达交叉关 联。通过这样做，本发明人可以鉴定在胚胎和成年血管生成期间被表达的克隆。在后肢缺 血的(成年)小鼠模型中并通过利用发育斑马鱼中的(吗啉环)敲低(knock down)分析， 对这些克隆进行了进一步的体内研究。使用这些技术，本发明人可以鉴定26个涉及成年和 胚胎血管生成的候选调节基因。尽管成年和胚胎血管生成是否由共同路径(common pathways)调节仍然不清楚， 但发明人可以鉴定出共有的表达模式，也许可以鉴定共有的基因调节物。最后，单个克隆的诱导表达可通过在血液样本的循环PML亚群(subset)中进行的 QPCR分析来证实，该血样样本从稳定型缺血性冠状动脉疾病患者和急性冠脉综合征患者中获得。基于通过这些研究得到的结果，发明人获得对缺血疾病和动脉修复中的血管生成 和成血管分化的分子机制的必要理解，并鉴定了基因库或基因表达谱，该基因库或基因表 达谱的特点是涉及EPC募集、活化和迁移的基因，其中该迁移是指迁移到因缺血和动脉受 损造成的新血管形成区域中，且该基因库或表达谱可用作活化的EPC存在的指示物，作为 特异性EPC表型，并因而可用作，在一般情况下的缺血和动脉受损之后，特别是与动脉损 伤、心肌损伤或缺血相关的那些心血管疾病之后出现的进行性血管生成和动脉修复的指示 物。
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共发现26个基因构成活化的EPC表型，且证明了它们作为用于这些障碍的生物 标记物的价值。技术人员应很快理解，这些基因不仅适合作为上面提及的病状的生物标记 物，而且适合作为用于血管生成，优选成年对象血管生成的生理过程的生物标记物，且这些 基因可用作治疗靶，以治疗这些病状，或用以刺激血管生成的生理过程。这些基因列在表1 中。表1.列出了在缺血性心脏病期间被上调的33个基因。应当理解其它物种的同源 物(homolog)包括在此。
权利要求
一种诊断或预测对象的心血管疾病的方法，所述方法包括在所述对象循环流体的样本中检测活化的内皮祖细胞(EPC)的出现。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述心血管疾病与动脉损伤或心肌损伤相关。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述心血管疾病与缺血相关。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述检测活化的EPC步骤包括在所 述样本中检测EPC中基因表达水平的提高，所述基因为选自以下组中的至少1个基因和 甚至更优选至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35个或所有基因，所述组由下列基因组成，即 ADORAU AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、AGTRLl (APLNR)、AMPH、APLN, CCBEU CDC42、CGNLU CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、DLL4、DUSP5、EEAl、egr_l、ELK1、ELK3、ELK4 (SAPl)、 EP300、ERG1 (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD1、FGD2、FGD3、FGD4、FGD5、FLT1、FST、GATA6、 GRRPl、HO-I (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、IFNG、ILIA、IL1B、LAMA4、Lambl-U LGMN、MMP3、Nos2、 PAIU PHDU PLVAP, RAB5a、RIN3、R0CK2、S0X18、S0X7、SRF, STABU STAB2、STUBU TFEC, THBSl、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSDl、TNFAIP8、和 XLKDl (LYVEl)，所述基因又优选为 选自以下组中至少1个基因和还更优选至少2、3、4、5、10、15、20、25、30个或所有基因，所述 组由下列基因组成，即 AD0RA2A、AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、 DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD5、GRRP1、HO-1 (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、 LAMA4、Lamb1-1、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、SOX18、STAB1、STAB2、STUB1、TFEC、THSD1、 TNFAIP8、和 XLKDl (LYVEl)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中EPC中基因表达水平的所述提高可通过检测蛋白 质来检测。
6.一种用于诊断或预测患者的心血管疾病的生物标记物，所述生物标记物包含内皮祖 细胞(EPC)的基因表达产物，所述内皮祖细胞的基因表达在血管生成期间被调节。
7.根据权利要求6所述的生物标记物，其中所述生物标记物包含内皮祖细胞(EPC)的 基因表达产物，与血管新生相比，所述内皮祖细胞的基因表达在血管生成期间被上调。
8.根据权利要求6或7所述的生物标记物，其中所述生物标记物存在于内皮祖细胞 (EPC)、多形核白细胞(PMN)或全血中。
9.根据权利要求3所述的生物标记物，其中所述EPC或PMN存在于患者的外周血中。
10.根据权利要求3或4所述的生物标记物，其中所述EPC是Flkl-阳性细胞。
11.根据上述权利要求中任一项所述的生物标记物，其中所述生物标记物为选自以下 组中的至少1个基因和甚至更优选至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35个或所有基因的表 达产物，所述组由下列基因组成，即 AD0RA1、AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、AGTRLl (APLNR)、 AMPH、APLN、CCBE1、CDC42、CGNL1、CREBBP、CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、DLL4、DUSP5、EEA1、 egr-1、ELKU ELK3、ELK4 (SAPl)、EP300、ERGl (KCNH2)、ETSU ETS2、EX0C3L、FGDU FGD2、 FGD3、FO)4、FGD5、FLT1、FST、GATA6、GRRP1、HO-1 (HMOXl)、H0_2 (HM0X2)、IFNG、ILIA、IL1B、 LAMA4、Lambl-I、LGMN、MMP3、Nos2、PAI1、PHDl、PLVAP, RAB5a、RIN3、R0CK2、S0X18、S0X7、 SRF, STABl、STAB2、STUBl、TFEC, THBSl、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSDl、TNFAIP8，禾P XLKDl (LYVEl)，还优选为选自下组中的至少1个基因和又更优选至少2、3、4、5、10、15、20、 25,30个或所有基因的表达产物，所述组由下列基因组成，即AD0RA2A、AGTRLl (APLNR)、 APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD5、GRRPl、HO-1 (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、LAMA4、Lambl-I、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、 S0X18、STABl、STAB2、STUBUTFEC,THSD1、TNFAIP8，禾口 XLKDl (LYVEl)。
12.根据上述权利要求中任一项所述的生物标记物，其中所述表达产物是蛋白质或 RNA分子。
13.根据上述权利要求中任一项所述的生物标记物，其中所述生物标记物是蛋白质谱 或RNA谱。
14.根据权利要求6-13中任一项限定的生物标记物在诊断或预测对象缺血方面的用途。
15.根据权利要求6-13中任一项所述的生物标记物作为替代终点标记物在确定治疗 方法功效方面的用途。
16.一种诊断或预测对象中缺血的方法，包含在所述对象血液中检测根据权利要求 6-13中任一项所述的生物标记物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法是在所述对象的血液样本上进行的。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述检测通过使用微阵列进行。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述检测通过使用串联质谱法(MS-MS)、 通过MALDI-FT质谱仪、MALDI-FT-ICR质谱仪、MALDI三重四极杆质谱仪或免疫分析进行。
20.用于执行根据权利要求1-5或16-19中任一项所述的方法的试剂盒，包含至少一种 如权利要求6-13中任一项限定的生物标记物或特异性结合于所述生物标记物的特异性结 合伴侣，所述试剂盒可选地进一步包含下面的一个或多个至少一种参考样品或对照样品；关于所述生物标记物的参考值的信息；至少一种能够结合于所述特异性结合伴侣的测试化合物；至少一种用于检测所述生物标记物和所述特异性结合伴侣之间的结合的可检测的标 记物。
21.用于执行根据权利要求16-19中任一项所述的方法的微阵列，包含特异性结合伴 侶，所述特异性结合伴侣特异性结合到至少两个如权利要求6-13中任一项限定的生物标 记物上，其中所述生物标记物结合在固体载体上。
22.—种特异性结合到如权利要求6-13中任一项限定的生物标记物上的诊断试剂。
23.根据权利要求22所述的诊断试剂，其中所述诊断试剂是与所述生物标记物在严格 条件下特异性杂交的抗体或核酸分子。
24.一种包含根据权利要求22或23所述的诊断试剂的诊断组合物。
25.根据权利要求24所述的诊断组合物在诊断对象缺血方面的用途。
26.一种治疗患缺血(风险增大)的对象的方法，所述方法包括使用如权利要求6-13 中任一项限定的生物标记物作为治疗靶或治疗剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物标记物作为治疗靶或作为治疗剂的 所述用途包含影响选自以下组中至少1个基因和更优选至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、 35个或所有基因的表达，所述组由下列基因组成，即AD0RA1、AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、 AGTRLl (APLNR)、AMPH、APLN、CCBEl、CDC42、CGNLl、CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、 DLL4、DUSP5、EEAU egr_l、ELKU ELK3、ELK4 (SAPl)、EP300、ERGl (KCNH2)、ETSU ETS2、EXOC3L、FGDl、FO)2、FGD3、Fa)4、FGD5、FLTl、FST、GATA6、GRRPl、HO-l(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、 IFNG、ILIA、IL1B、LAMA4、Lambl-I、LGMN, MMP3、Nos2、PAI1、PHDl、PLVAP, RAB5a、RIN3、 R0CK2、S0X18、S0X7、SRF、STABU STAB2、STUBl、TFEC、THBS1、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、 THSDU TNFAIP8，和XLKDl (LYVEl)，又优选影响选自下组中至少1个基因和还更优选至 少2、3、4、5、10、15、20、25、30个或所有基因的表达，所述组由下列基因组成，即AD0RA2A、 AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETSl、 ETS2、EXOC3L、FO)5、GRRP1、HO-1(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、LAMA4、Lambl_l、LGMN、PLVAP、RIN3、 R0CK2、S0X7、S0X18、STABl、STAB2、STUBU TFEC, THSD1、TNFAIP8，和 XLKDl (LYVEl)。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述生物标记物作为治疗靶的所述用途包 括减少在患缺血(风险增大)的对象中被过度表达的所述至少一种基因编码的至少一种蛋 白质的量，或增大在患缺血(风险增大)的对象中被低表达的所述至少一种基因编码的至 少一种蛋白质的量。
29.一种用于治疗患心血管事件风险增大的药物组合物，包括选自下面的至少一种抑 制剂化合物针对权利要求6-13中任一项所述的生物标记物，优选针对在细胞膜上表达的生物标 记物的抗体或其衍生物，并且所述衍生物优先选自由scFv片段、Fab片段、嵌合抗体、双功 能抗体、胞内抗体、和其他抗体来源的分子组成的组； 权利要求6-13中任一项所述的生物标记物； 干扰所述生物标记物生物活性的小分子； 反义分子，特别是反义RNA或反义寡脱氧核苷酸； RNAi分子， 核酶，和干扰指定的标记物/调节基因的功能的化学化合物，以及合适的赋形剂、载体或稀释剂。
30.一种治疗对象的方法，包含给予所述对象有效降低缺血(风险)的量的权利要求 29所述的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及诊断或预测对象的心血管疾病的方法，所述方法包括在所述对象的循环流体样本中检测活化的内皮祖细胞(EPC)出现的步骤。本发明进一步涉及用于诊断或预测患者体内的心血管疾病的生物标记物，所述生物标记物包含在血管生成期间其表达被调节的基因的表达产物。
文档编号C12Q1/68GK101946009SQ200880126603
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者亨利克斯·约翰内斯·迪凯尔 申请人:鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心