专利名称：海南粗榧细胞培养生产抗癌生物碱的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物细胞培养生产抗癌生物碱方法，具体讲是以植物细胞培养技术为手 段，通过在细胞生物反应器内进行的海南粗榧大规模细胞培养生产抗癌生物碱如脱氧三尖杉 酉旨喊(deoxyharringtonine)、异三尖杉酉旨喊(isoharringtonine)、三尖杉酉旨减(harringtonine) 和高三尖杉酯碱(homoharringtonine)等多种生物碱的方法。
背景技术：
海南粗榧(Ce;^a/otoxws/w!'mmera&Li)为三尖杉科植物，别名红壳松、薄叶蓖子杉，为 多年生高大常绿乔木。是我国特有的珍稀树种，其分布范围极为狭窄，仅见于海南及广东、 云南等局部地区。研究表明，海南粗榧不仅抗癌有效生物碱(如脱氧三尖杉酯碱 (deoxyharringtonine)、异三尖杉酉旨减(isoharringtonine)、三尖杉酉旨喊(harringtonine)和高三 尖杉酯碱(homoharringtonine)等多种生物碱)含量为三尖杉科中最高，而且疗效最显著， 是目前公认的最好抗癌树种之一。不过，目前还不能通过人工方法合成脱氧三尖杉酯碱、异 三尖杉酯碱、三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱等生物碱，只有依靠从海南粗榧植物材料天然提取， 所以海南粗榧原料保障就成为该药市场的关键所在。但是，由于该树种为雌雄异株、种子产 量和萌发率很低，再加之该树种因材质优良而屡遭砍伐，加之种群数量少，是我国最重要的 珍稀濒危植物之一，自然资源十分有限，受生态和人为破坏等因素而导致瀕临灭绝，很难满 足日益增长的需求。
另外，海南粗榧地上部分，特别是树皮为提取脱氧三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、三尖杉 酯碱和高三尖杉酯碱等生物碱的主要原料。要满足治疗一个患者，约需要2 g左右脱氧三尖 杉酯碱、异三尖杉酯碱、三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱等生物碱；而提取1g以上生物碱约需 100-1000 kg树干或10-100 kg树皮，即约10-50棵约50龄海南粗榧。现今国际市场对脱氧 三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱等生物碱年需求量为1000 kg，并且 这一需求正日益增加。依靠天然海南粗榧的有限资源已不可能满足需求。但是直到目前为止， 虽然人们还不能全人工合成以上有效生物碱；但是人们可以以从海南粗榧提取的中间物通过 半人工合成的方法合成以上有效生物碱，但是其合成效率低下，而且由于手性特征，其生物 活性难以保证，而且成本高昂。因此，人们不得不放弃使用此类有效生物碱治疗相关疾病， 转而利用疗效相对较差或具有一定毒副作用的其它药物。所以，本发明提供了一种系统的从 高产生物碱材料选择、外植体诱导、高产生物碱悬浮细胞培养系的建立和悬浮细胞培养到生物碱分离、纯化等过程，实现了一个培养周期可收获脱氧三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、三尖 杉酯碱和高三尖杉酯碱等有效生物碱约50mg'U1的结果，为下一步通过细胞培养生产脱氧三 尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱等有效生物碱产业化提供了可能与保 障；从而可以不用以天然海南粗榧为原材料提取分离有效生物碱。这对海南粗榧自然资源的 保护和开发利用具有十分重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明解决的关键技术问题是通过筛选海南粗榧高产脱氧三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、 三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱等有效生物碱植株，外植体诱导，高产生物碱悬浮细胞培养系的 建立和悬浮细胞培养到生物碱分离、纯化等过程，为通过细胞培养生产脱氧三尖杉酯碱、异 三尖杉酯碱、三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱等有效生物碱产业化提供技术保障。这对海南粗榧 自然资源的保护和开发利用具有十分重要的理论和实践意义。 本发明解决上述问题的技术方案包括如下步骤
(1) 高产有效生物碱海南粗榧植株筛选采集不同来源的海南粗榧成年植株，进行有效 生物碱含量分析，选择含量最高植株作为外植体来源；
(2) 外植体诱导取有效生物碱含量最高植株树皮作为外植体，用蒸馏水清洗干净，滤 纸吸干后放入约0.5-2.0M次氯酸钠溶液中真空抽滤灭菌约3-8min ，然后无菌水反复冲洗3-6 次；将外植体切成约0.5 cm x0.5 cm方块，接种于如下愈伤组织诱导培养基上0.5-1 MS(Murashige and Skoog Stock培养基)+ 0.01-0.1 mg.U1 6-BA (6-节基嘌呤)+ 0.5-1 mg-L" NAA (萘乙酸)+ 0.05-0.5 mg.L"KT (激动素)+ 0-100 mg.L"肌醇+ 0.2-0.6%琼脂+1-5% 蔗糖十l-5c/。椰子乳,pH值5.0-6.0;暗培养2d后再置于光照周期161rd—1、光照强度 2000-3000 Lux的冷光灯下、环境温度25士2 °C中继续培养3个月(每月继代一次，继代时 用无菌解剖刀和无菌镊子挑、切取带生长旺盛愈伤组织的外植体接种到新培养基)，便获得所 需愈伤组织。
(3) 高产生物碱悬浮细胞培养系的建立取愈伤组织接种到如下培养基里进行震荡培养 0.5-1 MS + 0.01-0.1 mg.L-1 6-BA+ 0.5-1 mg'L" NAA + 0.05-0.5 mg.L-1KT + 0-100 mg.l/肌醇 + 1-5%蔗糖+1-5%椰子乳^11值5.0-6.0;暗培养2d后再置于光照周期161vcT1、光照强度 2000-3000 Lux的冷光灯下、环境温度25士2。C，摇床转速为60-200 rpm;继续培养25-35 d后继代1次；继代5-10次后分别测定悬浮细胞系产有效生物碱效率；选择产有效生物碱效 率高者为高产生物碱悬浮细胞培养系。
(4) 悬浮细胞培养采用二段法进行悬浮细胞培养，即细胞株系先在生长培养基中培养一段时间以累积生物量，再转入生产培养基促使细胞大量合成有效生物碱。将高产生物碱悬 浮细胞培养系经无菌操作转入以下生长培养基中pH值5.0-6.5,含碳源浓度为2-6。/。(W/V)、 无机氮源离子浓度为40-80 mM、磷酸盐浓度为2-6mM，激素水平是2， 4-D (2, 4-二氯苯 氧乙酸)为0.5-2 mg-L-1、 6-BA为0.5-2 mg-I/1、 NAA为0.5-3 mg'L4、 KT为0.5-2 mg.lA GA (赤霉素)为0.5-2 mg丄"、ZT(反玉米素)为0.5-2.5 mg'L/1及0.5-1MS营养源的液体生长 培养基进行悬浮培养，光照强度2000-3000 Lux的冷光灯下、环境温度25士2 °C，摇床及 搅拌式反应器转速为60-250卬m，反应器的通气量0.1-0.5 wm，培养25-35天后，换生产培 养基继续悬浮培养；生产培养基是pH为5.0-6.0，含碳源浓度为2-4% (W/V)、无机氮源离 子浓度为30-60 mM、磷酸盐浓度为l-3mM，激素种类及水平范围不变，及0.5-1 MS营养源 的液体培养基，在如上所述的培养条件下继续培养25-35天；
(5)生物碱分离与纯化收获细胞上述培养的细胞，研碎，氨水湿润，加氯仿浸没，密 闭，置摇床上振荡24 h，滤取清液，减压浓縮至干，甲醇溶解残渣，进一步对细胞培养物中的 有效生物碱采用半制备型HPLC法进行分离纯化(流动相为甲醇-乙睛-水(29 : 27 : 44 )，并 用氨水调节pH为8.5左右，流速lml/min，检测波长290nm,柱温:35 'C,进样量:100uL。 用本发明的方法，可得到产量较高的有效生物碱，采用2L有效体积的搅拌式反应器在适宜 条件下进行两步法培养50-70天，细胞生物量增至约4倍，细胞培养物中有效生物碱含量达 细胞干重0.08 %。最好情况可达到细胞干重的0.12%,这一结果比天然植物中含量高出约一 个数量级。
3、有益效果
本发明的有益效果是用本发明的方法，可得到产量较高的有效生物碱，采用2L有效
体积的搅拌式反应器在适宜条件下进行两步法培养50-70天，细胞生物量增至约4倍，细胞 培养物中有效生物碱含量达细胞干重0.08 %。最好情况可达到细胞干重的0.12%,这一结果 比天然植物中含量高出约一个数量级。从而为解决珍稀濒危植物海南粗榧保护与资源开发利 用提供技术保障；也为进一步探索海南粗榧的基因工程等莫定了基础。具体实施例方式
本发明具体实施方式
下面结合实例予以阐明培养基中所需各种药品试剂均可市售获得， 按商品说明书所示常规方法配用，为行业所通用。 实施例1:
(1)高产有效生物碱海南粗榧植株筛选采集不同种群来源的海南粗榧成年植株约60 株，进行有效生物碱含量分析，选择含量最高植株作为外植体来源；(2) 外植体诱导取有效生物碱含量最高植株树皮作为外植体，用蒸馏水清洗干净，滤 纸吸干后放入0.5^次氯酸钠溶液中真空抽滤灭菌8min ，然后无菌水反复冲洗3次；将外植 体切成约0.5 cm x0.5 cm方块，接种于如下愈伤组织诱导培养基上0.5 MS(Murashige and Skoog Stock培养基)+ 0.01 mgL-1 6-BA(6-节基嘌呤H 0.5 mg'!/1 NAA(萘乙酸)+ 0.05 mg'U1 KT(激动素)+0.2Q/。琼脂+1%蔗糖+1%椰子乳^11值5,0;暗培养2d后再置于光照周期16 h-d—1、光照强度2000 Lux的冷光灯下、环境温度25士2'C中继续培养3个月(每月继代一 次)，便获得所需愈伤组织；
(3) 高产生物碱悬浮细胞培养系的建立:取愈伤组织接种到如下培养基里进行震荡培养: 0.5 MS + 0.01 rng'U1 6-BA + 0.5 mg七-1 NAA + 0.05 mg'l/1 KT + 1%蔗糖+ 1%椰子乳，pH值 5.0;暗培养2d后再置于光照周期16h'cT1、光照强度2000 Lux的冷光灯下、环境温度25 士2'C，摇床转速为60ipm;继续培养约25d后继代l次；继代5次后分别测定悬浮细胞 系产有效生物碱效率；选择产有效生物碱效率高者为高产生物碱悬浮细胞培养系；
(4) 悬浮细胞培养将高产生物碱悬浮细胞培养系经无菌操作转入以下培养基中pH 值5.0,含碳源浓度为2% (W/V)、无机氮源离子浓度为40mM、磷酸盐浓度为2mM,激素 水平是2， 4-D(2， 4-二氯苯氧乙酸)为0.5 mgi;1、 6-BA为0.5 mg'L'1、 NAA为0.5 mg'I/1、 KT为0.5 mg'i;1、 GA(赤霉素)为0.5 mg丄-1、 ZT(反玉米素)为0.5 tng'I/1及0.5 MS营养源的液 体生长培养基进行悬浮培养，光照强度2000 Lux的冷光灯下、环境温度25士2。C，摇床及 搅拌式反应器转速为60rpm，反应器的通气量O.l wm，培养25d后，换生产培养基继续悬 浮培养；生产培养基是pH为5.0,含碳源浓度为2% (W/V)、无机氮源离子浓度为30mM、 磷酸盐浓度为lmM，激素种类及水平范围不变，同时还含有0.5MS营养源的液体培养基， 在如上所述的培养条件下继续培养25 d;
(5) 生物碱分离与纯化收获细胞上述培养的细胞，研碎，氨水湿润，加氯仿浸没，密 闭，置摇床上振荡24 h,滤取清液，减压浓縮至干，甲醇溶解残渣，进一步对细胞培养物中的 有效生物碱采用半制备型HPLC法进行分离纯化(流动相为甲醇-乙睛-水(29:27:44)，并 用氨水调节pH为8.5左右，流速lmWmin，检测波长290 nm ,柱温:35 °C,进样量:100y L,细胞培养物中有效生物碱含量达细胞干重0.07% 。
实施例2:
(1) 高产有效生物碱海南粗榧植株筛选采集不同种群来源的海南粗榧成年植株约60 株，进行有效生物碱含量分析，选择含量最高植株作为外植体来源；
(2) 外植体诱导取有效生物碱含量最高植株树皮作为外植体，用蒸馏水清洗干净，滤
6纸吸干后放入2.0X次氯酸钠溶液中真空抽滤灭菌3min ，然后无菌水反复冲洗6次；将外植 体切成约0.5 cm x0.5 cm方块，接种于如下愈伤组织诱导培养基上1 MS(Murashige and Skoog Stock培养基)+ 0.1 mg'L-1 6-BA (6-节基嘌呤)十1 mg-U1 NAA (萘乙酸)+ 0.5 mg-L" KT (激 动素)+10011^丄-1肌醇+0.6%琼月旨+5%蔗糖+5%椰子乳,？11值6.0;暗培养2d后再置 于光照周期16 h《1、光照强度3000 Lux的冷光灯下、环境温度25士2'C中继续培养3个 月(每月继代一次)，便获得所需愈伤组织；
(3) 高产生物碱悬浮细胞培养系的建立取愈伤组织接种到如下培养基里进行震荡培养
1 MS + 0.1 mg.L" 6-BA + 1 mg-L1 NAA + 0.5 mg-I/1 KT + 100 mg.L-1肌醇+ 5%蔗糖+ 5%椰 子乳,pH值6.0;暗培养2d后再置于光照周期16h'd人光照强度3000 Lux的冷光灯下、 环境温度25士2-C，摇床转速为200rpm;继续培养约35d后继代l次；继代10次后分别 测定悬浮细胞系产有效生物碱效率；选择产有效生物碱效率高者为高产生物碱悬浮细胞培养 系；
(4) 悬浮细胞培养将高产生物碱悬浮细胞培养系经无菌操作转入以下培养基中pH 值6.5，含碳源浓度为6% (W/V)、无机氮源离子浓度为80mM、磷酸盐浓度为6mM，激素 水平是2， 4-D(2, 4-二氯苯氧乙酸)为2mg'I/1、 6-BA为2 mg'U1 、 NAA为3 mg.lA KT为
2 mg丄—1、 GA(赤霉素)为2 ing'U1、 ZT(反玉米素)为2.5 mg七—1及1 MS营养源的液体生长培养 基进行悬浮培养，光照强度3000 Lux的冷光灯下、环境温度25士2'C，摇床及搅拌式反应 器转速为250rpm,反应器的通气量0.5 wm,培养35d后，换生产培养基继续悬浮培养；生 产培养基是pH为6.0，含碳源浓度为4% (W/V)、无机氮源离子浓度为60mM、磷酸盐浓 度为3mM，激素种类及水平范围不变，同时还含有1MS营养源的液体培养基，在如上所述 的培养条件下继续培养35d;
(5) 生物碱分离与纯化生物碱分离与纯化收获细胞上述培养的细胞，研碎，氨水湿 润，加氯仿浸没，密闭，置摇床上振荡24h,滤取清液，减压浓縮至干，甲醇溶解残渣，进一步 对细胞培养物中的有效生物碱采用半制备型HPLC法进行分离纯化(流动相为甲醇-乙睛-水
(29:27:44)，并用氨水调节pH为8.5左右，流速lml/min，检测波长290 nm ,柱温:35 'C,进样量:100PL,细胞培养物中有效生物碱含量达细胞干重0.10%。
按本发明的技术方法实施，培养基中成分相对比例差异会导致有效生物碱生产效率的差 异，总的说，数值越接近最佳值，实施结果越理想。
权利要求
1、海南粗榧细胞培养生产抗癌生物碱的方法，其特征在于按照下述步骤进行(1)高产有效生物碱海南粗榧植株筛选采集不同来源的海南粗榧成年植株，进行有效生物碱含量分析，选择含量最高植株作为外植体来源；(2)外植体诱导取有效生物碱含量最高植株树皮作为外植体，用蒸馏水清洗干净，滤纸吸干后放入0.5-2.0％次氯酸钠溶液中真空抽滤灭菌3-8min，然后无菌水反复冲洗3-6次；将外植体切成约0.5cm×0.5cm方块，接种于如下愈伤组织诱导培养基上0.5-1 Murashige andSkoog Stock培养基+0.01-0.1mg·L-1 6-苄基嘌呤+0.5-1mg·L-1萘乙酸+0.05-0.5mg·L-1激动素+0-100mg·L-1肌醇+0.2-0.6％琼脂+1-5％蔗糖+1-5％椰子乳，pH值5.0-6.0；暗培养2d后再置于光照周期16h·d-1、光照强度2000-3000Lux的冷光灯下、环境温度25±2℃中继续培养3个月，每月继代一次，继代时用无菌解剖刀和无菌镊子挑、切取带生长旺盛愈伤组织的外植体接种到新培养基，便获得所需愈伤组织；(3)高产生物碱悬浮细胞培养系的建立取愈伤组织接种到如下培养基里进行震荡培养0.5-1 Murashige and Skoog Stock培养基+0.01-0.1mg·L-1 6-苄基嘌呤+0.5-1mg·L-1萘乙酸+0.05-0.5mg·L-1激动素+0-100 mg·L-1肌醇+1-5％蔗糖+1-5％椰子乳，pH值5.0-6.0；暗培养2d后再置于光照周期16h·d-1、光照强度2000-3000Lux的冷光灯下、环境温度25±2℃，摇床转速为60-200rpm；继续培养25-35d后继代1次；继代5-10次后分别测定悬浮细胞系产有效生物碱效率；选择产有效生物碱效率高者为高产生物碱悬浮细胞培养系；(4)悬浮细胞培养采用二段法进行悬浮细胞培养，即细胞株系先在生长培养基中培养一段时间以累积生物量，再转入生产培养基促使细胞大量合成有效生物碱，将高产生物碱悬浮细胞培养系经无菌操作转入以下生长培养基中pH值5.0-6.5，含碳源浓度以质量与体积计为2-6％、无机氮源离子浓度为40-80mM、磷酸盐浓度为2-6mM，激素水平是2，4-二氯苯氧乙酸为0.5-2mg·L-1、6-苄基嘌呤为0.5-2mg·L-1、萘乙酸为0.5-3mg·L-1、激动素为0.5-2mg·L-1、赤霉素为0.5-2mg·L-1、反玉米素为0.5-2.5mg·L-1及0.5-1 Murashige and Skoog Stock营养源的液体生长培养基进行悬浮培养，光照强度2000-3000Lux的冷光灯下、环境温度25±2℃，摇床及搅拌式反应器转速为60-250rpm，反应器的通气量0.1-0.5vvm，培养25-35天后，换生产培养基继续悬浮培养；生产培养基是pH为5.0-6.0，含碳源浓度为以质量与体积计2-4％、无机氮源离子浓度为30-60mM、磷酸盐浓度为1-3mM，激素种类及水平范围不变，及0.5-1 Murashige and Skoog Stock营养源的液体培养基，在如上所述的培养条件下继续培养25-35天；(5)生物碱分离与纯化收获细胞上述培养的细胞，研碎，氨水湿润，加氯仿浸没，密闭，置摇床上振荡24h，滤取清液，减压浓缩至干，甲醇溶解残渣，进一步对细胞培养物中的有效生物碱采用半制备型HPLC法进行分离纯化(流动相为甲醇-乙睛-水(29∶27∶44)，并用氨水调节pH为8.5左右，流速1ml/min，检测波长290nm，柱温35℃，进样量100μL。
全文摘要
海南粗榧细胞培养生产抗癌生物碱的方法，涉及一种植物细胞培养生产抗癌生物碱方法。按照下述步骤进行(1)高产有效生物碱海南粗榧植株筛选；(2)外植体诱导；(3)高产生物碱悬浮细胞培养系的建立；(4)二段法进行悬浮细胞培养；(5)生物碱分离与纯化。本发明可得到产量较高的有效生物碱，采用2L有效体积的搅拌式反应器在适宜条件下进行两步法培养50-70天，细胞生物量增至约4倍，细胞培养物中有效生物碱含量达细胞干重0.08％。最好情况可达到细胞干重的0.12％，这一结果比天然植物中含量高出约一个数量级。从而为解决珍稀濒危植物海南粗榧保护与资源开发利用提供技术保障；也为进一步探索海南粗榧的基因工程等莫定了基础。
文档编号C12P17/18GK101629193SQ200910184210
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者宋经元, 戴志聪, 杜道林, 王有生, 祁珊珊, 符文英, 魏建和 申请人:江苏大学