专利名称：：Ppard主效基因的鉴别、分子育种方法的建立及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及动物遗传育种领域，具体是涉及鉴别一个影响猪耳性状、脂肪沉积、体长和头重的主效基因、分子育种方法的建立及该基因在种猪遗传改良中的应用。
背景技术：
：中国是养猪大国，也是猪种资源最丰富的国家，很早就开始将野猪驯化为家猪。经过长期选择，形成了许多各具特色的地方品种，仅《中国猪品种志》(张仲葛主编，上海科技出版社，1986)记载的就有48个。与国外的商品猪相比，中国地方品种在长期的选育历史中形成了差异显著的体形外貌和种质特性。以耳性状和体长为例，耳大下垂的猪种有二花脸、梅山、八眉、河套大耳猪等，耳小竖立的猪种有藏猪、滇南小耳猪等；体型大的猪种有二花脸、梅山、河套大耳猪、莱芜猪等，体型小的猪种有藏猪、滇南小耳猪、五指山猪等。丰富的种质资源不仅为猪的遗传改良提供了宝贵的育种素材，同时也为人类医学研究提供了理想的动物模型(Andersson&Georges.NatRevGenet.2004，5:220_212)。本发明专利所述的猪重要经济性状分别涉及(1)耳性状，包括耳面积、耳重和耳型；(2)脂肪沉积性状，如屠宰体重时的平均背膘厚；(3)头重；(4)胴体长，包括胴体直长和胴体斜长。这些性状都属于数量性状，由多基因控制，其中存在主基因(majorgene)效应。采用常规育种方法对数量性状的选育需进行准确的表型测定，花费较多，选择周期较长。分子生物学技术的发展，使人们可以在DNA水平寻找控制猪数量性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中用于基因辅助选择(geneassistedselection)或标记辅助选择(markerassistedselection)，可获得更高的选择精度、更快的选择进展和更大的经济效益。国内外研究人员采用基因组扫描法，在猪7号染色体上(SSC7)定位了极显著影响猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的数量性状基因座(QTL)。Wei等以梅山X大白三代家系为材料，利用152个标记将影响耳面积和耳型的基因座定位在SSC758cM邻近区域内，置信区间小于20cM(Weietal.AnimalGenetic2007,38:222-226)。多个研究小组利用以梅山为母本的多个资源家系将影响脂肪沉积性状的主效QTL也定位于SSC758cM邻近区域(Sanchezetal.JAnimSci.2006,84526-537；Bidaneletal.GenetSelEvol.2001,33289-309；Rattinketal.MammGenome.2000，11:656_661)。Edwards等(JAnimSci.86254-266)利用124个微卫星标记对杜洛克X皮特兰猪F2资源群体进行基因组扫描，发现7号染色体上存在影响体长的主效QTL。Yue等(ScienceinChina.2003,4610-17)以野猪、梅山猪和皮特兰构成的三个F2群体为研究对象，在SSC7发现了数个影响体长、头重、13-14肋骨间的背膘厚、肩部膘厚等性状的QTL。申请人:从2001年到2006年，利用6年的时间构建了一个大规模的4代白色杜洛克X二花脸资源群体，在该群体中测定了7大类(表观、生产、胴体、肉质、繁殖、健康相关和行为性状)422项的表型指标，其中有耳性状、胴体长、头重和脂肪沉积表型记录的F2个体超过1000头，F3个体560头。由于始祖白色杜洛克是广泛应用于商业生产的瘦肉型父本品系，而二花脸猪是以产仔数多和易于脂肪沉积而闻名于世的中国地方猪种，因此在F2和F3群体中上述测定性状存在明显的表型分离现象。申请人利用194个微卫星标记对白色杜洛克X二花脸资源家系进行了全基因组扫描和QTL定位分析，在SSC758cM处发现了一个极显著影响耳性状、脂肪沉积、胴体长和头重的QTL，其中影响耳面积的QTL是在该资源群体所检测到的1，264个QTL中最显著的一个，置信区间仅为2cM，可解释超过40%的表型变异(Maetal.AnimGenet.2009，40:463_467)。引人注目的是二花脸的QTL基因型具有增加耳重、耳面积、体长、头重和减少脂肪沉积的作用。申请人在此工作基础上，深入开展了该QTL的遗传解析研究，最终鉴别到了影响该QTL的主效基因(QTG)和因果突变位点(QTN)，由此不仅揭示了这些表型性状的分子遗传机理，还建立相应的用于种猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长选育改良的新型分子育种技术
发明内容本发明的第一个目的是提供一个影响猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的主效基因。本发明的第二个目的是提供一种针对猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状的分子育种方法。本发明的第三个目的是影响猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状的主效基因在种猪遗传改良中的应用。本发明的第一个目的是这样实现的一个影响猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的主效基因，特征是该基因的cDNA序列具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQIDNo2的多核苷酸，它由2717个碱基组成，该cDNA序列的编码序列为自5’端第102位至1427位碱基，其序列如下所示gttgacaggaactgccctgtagaggtccatctgcactcagacccagatgatgccagagct60atgaccgggcctgcaggcgtggcgccgaggggaagtcagccatggagcagccgccggagg120aagcccctgaggtccgggaagaggagaagaaaaaggaagtggcagaggccgaaggaggcc180cagagctcaatgggggaccagagcactcgcttccctccagcagctgtacagatctctccc240agagctgctctccacccgcgctgctggaccagctgcagatgggctgcgacggggcctcgt300gcggtggcctcagcatggagtgccgggtgtgcggggacaaggcatcaggcttccactacg360gagtccacgcttgcgaggggtgcaagggcttcttccgccggacaatccgcatgaagctgg420agtacgagaagtgtgagcggatctgcaagatccagaagaagaaccgcaacaagtgccagt480actgccgcttccagaaatgcctggcgctgggcatgtctcacaacgccattcgctttggcc540ggatgcccgaggcagagaaaaggaagctggtggctgggctgacggcaaacgaggggagtc600agcacaacccgcaggtggctgacctgaaggccttctccaagcacctctacagcgcctacc660tgaaaaacttcaacatgaccaaaaagaaggcccgcgccatcctcaccggcaaggccagcc720acacagcgccctttgtgatccacgacatcgagacgttgtggcaggccgagaagggcctgg780tgtggaagcagctggtgaatggcctgccgccctacaaggagatcagcgtgcacgtcttct840accgctgccagtgcaccacggtggagacggtgcgcgagctgaccgagttcgccaagagca900tccccagcttcgaccacctcttcctcaacgaccaggtgacccttctcaagtacggcgtgc960acgaggccatcttcgccatgctggcctccatcgtcaataaggatgggctgctggtggcca1020acggcactggttttgtcacccgcgagttcctgcgcagcatccgaaagcccttcagtgaca1080tcattgagcccaagtttgagttcgctgtcaagttcaatgccctggaactcgatgatagtg1140acctggctctcttcatcgcagccatcattctgtgtggagaccggccaggcctcatgaacg1200tgtcacaggtggaggccatccaggacaccatcctgcgtgccctcgagttccacctgcagg1260ccaaccaccccgacgcccagtacctcttccccaagctgctgcagaagatggcagacctgc1320ggcagctggtcaccgagcacgcccagatgatgcagcggatcaagaagaccgagaccgaga1380cctcgctgcaccccctgctccaggagatctacaaggacatgtactgaggggtgcgccttg1440ggcctcccaacaggcctcccggagcaggtggacggcgcggggacagacactgcctgcggg1500acgtttccgttgaccagcccgagccctcagccgagcagcaggtcacaggctcagccagac1560gcacggcctcccactccttatagccctgcctcctctccctcctcagctcccctctctctc1620atctctttgctctttcttttccttcctctctcagcctcgctttctctctccccatcctgt1680ctgtccatctttctcttcctgtgagacagtttgtgttatttcaccagcaccaaaacaaga1740ccgctgctttgtcccctgctccccggccccggagcaggagggggcagggcctgccctctg1800caccaaccatcgccttctccagtcttcaaaggacacgcaggccatccaaagaaacactaa1860gctctccgggcctggcttactggggaagccacgcagggcctgggctgagtgccgagcagc1920cctagccacagggtccctgggggaggccgcccacccgaggctgaggctggcaccccatgg1980ctgagcggaccccgctcctgcagcatgcctcagccccacagacgcccacccctcttttgt2040ttttctttgcaccagtcttccaggccagtgccactgtgctggctgctggcggatgccccc2100agcctggatggaggtgggattccctccaggtgggggcgcccacacccccattgaagagga2160gcatgcctcaagggagcagttggtagggaaggcagtgggcagcagacttgattctgaccc2220caggccttgggtgggtcctccctcagcaccccactctctccagcctctgcagcagccact2280gagccctgcccacgctgtgtcagcatcgcacctcccacctccgcagcaccccggcttggc2340ctcagccacgcccttctttctccagccgggcgacactggctccagcccagctgaagcgca2400cactccctggagcgcctccagcacacgcagcacgagcactgaaatcactttacctgcagg2460ttccacaacctcggcctccctcctgaggcaggtggaccacagagctgtgcccctgactcc2520ccgggcgggcggggagccctgctgccccagcccagcactgctcgcaggggaggtacccag2580gatgaactgatcccgctcacttgtgacacccatttgttccagcagctctgctgccctccc2640ctttccttgtgattggcccagccaggcacctggagctctccctgcaccgcttctggtgac2700cagggaccctgccaggc2717(2)编码序列表中SEQIDNo1的氨基酸，它由441个氨基酸残基组成，其序列如下所示MEQPPEEAPEVREEEKKKEVAEAEGGPELNGEPEHSLPSSSCTDLSQSCSPPALLDQLQM60GCDGASCGGLSMECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRMKLEYEKCERICKIQKK120NRNKCQYCRFQKCLALGMSHNAIRFGRMPEAEKRKLVAGLTANEGSQHNPQVADLKAFSK180HLYSAYLKNFNMTKKKARAILTGKASHTAPFVIHDIETLffQAEKGLVWKQLVNGLPPYKE240ISVHVFYRCQCTTVETVRELTEFAKSIPSFDHFFLNDQVTLLKYGVHEAIFAMLASIVNK300DGLLVANGTGFVTREFLRSIRKPFSDIIEPKFEFAVKFNALELDDSDLALFIMIILCGD360RPGLMNVSQVEAIQDTILRALEFHLQANHPDAQYLFPKLLQKMADLRQLVTEHAQMMQRI420KKTETETSLHPLLQEIYKDMY441(3)与序列表中SEQIDNo2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQIDNo2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为杂交后用含0.IXSSPE(或0.1XSSC),0.1%SDS的溶液在65°C下洗膜。上述影响猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的主效基因所编码的蛋白质的名禾尔力_#±曾M^M舌g#D(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorDelta，PPARD)，来源于猪，具有序列表中SEQIDNo:1的氨基酸残基序列，经过1_10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状相关的由SEQIDNo:1衍生的蛋白质。本发明的第二个目的是这样实现的建立针对种猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状的分子育种方法(1)使用序列表中SEQIDNo3和SEQIDNo4的核苷酸序列，对待测的猪基因组DNA进行PCR扩增，染色对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQIDNo:3的5，端第565位碱基或SEQIDNo:4的5，端第121位碱基为G还是A；(2)如果PCR扩增产物的单核苷酸多态结果是自序列表中SEQIDNo:4的5’端第121位碱基(即自序列表中SEQIDNo3的5’端第565位碱基)为G，其纯合体的基因型为GG；自序列表中SEQIDNo4的5’端第121位碱基(即自序列表中SEQIDNo3的5’端第565位碱基)为A，其纯合体的基因型为AA;它们的杂合体基因型为GA;AA基因型个体耳面积、耳重、胴体长和头重极显著地高于GA基因型和GG基因型个体，在脂肪沉积性状(平均背膘厚)方面显著低于GA基因型和GG基因型个体。下面通过实验对本发明的第一个目的和第二个目的进行验证1.利用白色杜洛克X二花脸F2资源家系精细定位目的基因申请人:在前期已报道的SSC7QTL区间内增加了8个基因的17个SNP和11个微卫星标记，检测了白色杜洛克X二花脸资源家系Ftl，F1和F2代全部个体在这些标记位点的基因型。根据Nezer等(Genetics.2003，165，277-285)的标记辅助分离法，利用QTL区间内所有32个标记的信息，推断出F1和F2公猪的QTL基因型，结果显示9头F1公猪都是Qq基因型(附图1)。所有9条增加耳面积和耳重的Q染色体共享一段1.4Mb染色体区域(SW0671SRPKI)，而在q染色体中未发现共享单倍型(附图2)。上述结果充分表明目的基因(QTG)位于所确定的1.4Mb染色体区域内。鉴于二花脸和白色杜洛克品种间所表现出的极显著耳性状表型差异，申请人推定二花脸和白色杜洛克分别固定了Q和q等位基因，并且所有祖代二花脸母猪都携带Q染色体。为了验证该假设，申请人构建了19头祖代个体(2头公猪和17头母猪)的单倍型，发现所有二花脸始祖的34条染色体在SW0671SRPKI1.4Mb区域内共享一段1.OMb的单倍型，该单倍型具有极显著增加耳面积和耳重的效应(附图3)。基于该结果，我们将目的基因位点精细定位到HMGAl到NC3652之间1.OMb的染色体区域。2.利用远缘群体的选择效应进一步精细定位目的基因耳大下垂是二花脸猪的品种特征之一。在长期的选育历史中，大耳型的二花脸得以优先选留。农谤云“耳大者如佛、耳小者如贼”(张仲葛主编，中国猪品种志，上海科技出版社，1986)。申请人推测在此影响耳性状的QTG区域，二花脸猪由于受选择效应的影响会产生遗传变异显著减少的现象(selectionswe印)。为了验证这一假设，申请人收集了代表所有二花脸遗传背景的3个核心群的211个样品、6个中国地方猪的216个样品和3个西方商业品种的119个无相关个体样品。利用HMGA1-NC3652这1.OMb区域内7个微卫星和31个SNP标记对上述样品进行了检测，发现二花脸猪在PACSIN-FANCE的680kb区域内22个相邻标记的遗传变异度极显著下降，几乎所有标记的高频等位基因频率都超过了0.90。尤其值得一提的是，这22个标记在72头锡山二花脸猪中均无多态。相比之下，这些标记在其他中国地方猪种、西方商业猪种和野猪中都有较高的多态性(附图4)。这表明二花脸猪在此680kb区域内经历过强烈的正向选择，有明显的选择效应，由此可以推定目的基因位于该680kb的染色体区域内。3.目的基因(QTG)的鉴别上述680kb区间对应于人的同源区包括13个已注释的功能基因。申请人通过半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测了这13个基因在耳组织中的表达情况，发现PPARD,FANCE,TAFII,ZNF76和SNRPC等5个基因在耳组织中高度表达，其他基因的表达量非常低或不表达。在5个高丰度表达的基因中，FANCE，TAFll，ZNF76和SNRPC是看家基因，他们是目的基因的可能性不大。PPARD是配体调控的转录因子，属于核受体超家族，在生物多个重要过程中起关键作用(Barishetal.JClinInvest.2006，116:590_597)。例如，PPARD是促成CPLA2α活化β-catenin进而调控Wnt/β-catenin通路的关键分子(Hanetal.JCellBiochem.2008，105，534-545)，该通路在软骨细胞增殖和分化等多种细胞行为中发挥关键作用(Macsaietal.JCellPhysiol.2007，215:578_587)。此外，PPARD还是脂肪代谢中的关键调控因子，它促进脂肪细胞和肌细胞的脂肪燃烧、增加能量消耗，这使得该基因成为肥胖及相关疾病治疗中的研究热点(Wangetal.Cell.2003，113，159—170；Evansetal.NatMed.2004，10，355-361)。鉴于PPARD的已知生物学功能及其在软骨发育和脂肪代谢过程中的作用，PPARD是该QTL区域内最有可能的目的基因。申请人随后通过实时反转录PCR检测了PPARD基因在0，45，90，300日龄的二花脸和杜洛克猪耳组织中的表达情况，发现这两个品种间的PPARD基因表达量没有显著差异(附图5)，由此推论很可能是PPARD的结构突变而不是调节突变导致了该QTL的遗传效应。4.关键因果突变位点(QTN)的鉴别申请人:自ENSEMBLE网站(http://www.ensembl.org/index.html)上搜寻到含猪PPARD基因的CH242-397F5BAC克隆(位置为35255108-35468260)。自NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载到1826bp的猪PPARD基因的cDNA编码序列和部分3，，5，-UTR序列(序列接收号NM_214152)。通过Powerblast软件比对确定了PPARD的内含子，外显子和编码区。利用上述来自ENSEMBLE网站(http://www.ensembl.org/index.html)的囊括了猪PPARD基因的一段72kb的DNA序列，使用在线Primer3.0软件(http//frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计多对引物扩增2头白色杜洛克祖代和17头二花脸祖代个体的基因组DNA(脱氧核糖核酸)。扩增片段采用QIAquickPCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，德国)纯化。通过比较测序分析发现在引物1(F5'-TCCTGCCTGTCTTCTCGTGTC-3，；R5'-CCGGCTCTTCCTGAGGTCTGT-3，)扩增的1066个核苷酸组成序列(SEQIDNo3)的第565个核苷酸处存在一个鸟苷酸/腺苷酸替换的单核苷酸多态位点(SNPs)、即SNPG565A。该突变造成所编码的PPARD蛋白第32个氨基酸由Gly突变成Glu(G32E)。此突变位点发生在哺乳动物高度保守及具有重要生物学功能的Intrinsciallydisorderdomain(功能域)，在人、鼠、牛、羊等哺乳动物中该位点均为Gly。申请人:进一步检测了白色杜洛克X二花脸家系所有1000余个体的PPARDG32E基因型，通过标准关联、标记辅助相关分析和F-下降检验(Zhao等，2003)分析了PPARDG32E对于耳性状、脂肪沉积、胴体长和头重的影响效应。标准关联分析表明PPARDG32E与耳重(P=5.57XKr183)、耳面积(P=1.04XIO-164)、平均背膘厚(P=3.69XIO"158)、头重(P=6.68X10—134)和胴体长(P=3.46X10—134)等性状均呈极显著相关。标记辅助关联分析也显示PPARDG32E对于上述性状影响显著(P<0.001)。此外，在QTL模型中把PPARDG32E作为固定效应后，QTL效应基本消失。这些结果确证了PPARDG32E不仅是SSC7上影响耳性状的关键因果突变位点(QTN)，还对脂肪沉积、头重和胴体长等性状具有极显著的“一因多效”影响效应。为了确定PPARDG32E的突变起源及在不同猪种中的群体遗传学规律，申请人对来自10个中国地方猪种、11个欧洲猪种、3个西方商业品种及中、欧野猪的753个个体进行了PPARDG32E基因型判定。在中国地方猪种中，增加耳面积和耳重的A等位基因高频(>0.80)存在于耳大下垂的品种中，以中等频率存在于中型耳的品种中。相反，减小耳面积和耳重的G等位基因在所有野猪、欧洲地方猪、西方商业猪种和小型耳的中国地方猪种中固定(表1)。有2头欧洲大黑猪为GA杂合子。该品种耳大且垂，文献记录表明在19世I己M其月i亥[π禾中帛入了巾ISJftAIt白勺m(http//www.ansi.okstate.edu/breeds/swine/largeblack/index.htm)。这些结果进一步表明PPARDG32E是影响耳性状的主效基因。表1PPARDG32E在中外猪种中的等位基因频率分布<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本发明通过检测PPARDG32E的单核苷酸多态性，即可确定耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的有利等位基因型，选择有利的基因型个体留种，可以显著提高种猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状的选育改良效率并且性状遗传稳定。图1为通过标记辅助分离分析确定的白色杜洛克X二花脸家系9头F1公猪的QTL基因型；纵坐标表示右耳面积，横坐标表示F1公猪家系。横坐标上、下方分别标明公猪耳号和相应的Z值。每头公猪后代数列于标准误上方。根据Nezer等方法计算Z值，即logH1/Htl，其中H1假设公猪QTL基因型是Qqjtl假设公猪QTL基因型是QQ或qq。增加耳面积的Q等位基因型用菱形表示，q等位基因型用圆圈表示。图2为9头Fl公猪Q染色体在QTL区间共享的1.4Mb单倍型(见红色方框)；单倍型通过SimWalk2软件构建。微卫星标记用黑斜体表示，等位基因型片段从短到长用数字连续编号，SNP的基因型用1(高频)或2(低频)表示。QTL置信区间侧翼微卫星标记(S1856和S0666)用红色标注。F1公猪耳号列于坐标轴左侧，每条染色体QTL基因型列于右侧。Q染色体共享的约1.4Mb单倍型用红色框标示。图3为二花脸始祖个体34条染色体在QTL区间共享的1.OMb单倍型(见红色方框)；图4中外猪种在QTL区间内38个标记位点的遗传变异度；13个中外猪种的样品数量和38个标记的杂合度如图所示，微卫星标记用黑斜体表示。结果显示二花脸猪在PACSIN和FANCE间680-kb区域内几乎所有的标记位点趋于固定，表明在该区间二花脸猪发生了极强的选择漂变(selectionsweep)。图5为通过实时定量反转录PCR分析获得的PPARD基因在二花脸和杜洛克耳组织中的表达情况；分别采集了0，45士3，90士3和300士3共4个日龄的二花脸和杜洛克猪耳组织样品用于RNA的提取，其中每个日龄6个样品。实时定量反转录PCR做三次重复反应，取平均值作为终值。结果显示二花脸和杜洛克猪之间在这4个日龄段的PPARD表达水平无显者差升。图6为本发明鉴别的猪PPARDG32E点突变位点的序列峰图；图7为PPARDG32E的SNAPshot判型图，其中a为GG型；b为AA型；c为AG型。具体实施例方式实施例1:PPARDG32E在白色杜洛克X二花脸资源群体中对耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的影响效应。(I)PPARDG32E的基因型判定设计引物对F2和R2(F2:5，-CGGCTGTTTTACAGGAAGGA-3，；R2:5，-CTGCACTCAGACCCAGATGA-3，)扩增包含PPARDG32E的DNA片段，设计合成另一条用于SNAPshot反应的延伸引物(5，-TTTTTTTTTTGCTGGAGGGAAGCGAGTGCTCTGGT-3，)。利用引物对F2和R2扩增猪基因组DNA的15μ1的PCR反应体系中，包括40ng猪基因组DNA，35mMMgCl2,20mMdNTP，正反向引物各2pmol，2单位Taq酶及1XPCRbuffer(上海生物工程公司，中国)。扩增条件为94°C3min；94°C30s,67°C30s,72°C40s，共30个循环；最后在72°C延伸lOmin。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。取2.5μ1PCR产物，加入0.5μ1ExoSAP-IT酶(上海国药集团公司，中国)37°C孵育45min，然后80°C处理15min灭活酶。SNAPshot反应体系为SNAPshot反应混合物(MultiplexReadyReactionMix)2μ1；SNAPshot延伸引物0.2μ1(引物终浓度为0.4ymol/L)；上述纯化PCR产物2.Oμ1；去离子水0.7μ1。SNAPshot循环参数为96°C10s，50°C5s，60°C30s，共30循环。取5μ1SNAPshot反应产物加入0.57μ1IOXbufffer和0.1μ1CIP(SNAPshot反应产物纯化酶)在37°C下孵育lh，然后75°C处理15min灭活酶达到产物纯化效果，_20°C保存备用。取1.75μ1上述经纯化后的SNAPshot反应产物、8.Oμ1甲酰胺变性剂(Hi-Diformamide)和0.25μ1GeneScan120LIZsizestandard(电泳分子内标)。体系混合后于95°C变性5min，然后立即置于冰上处理2min，离心上样于ABI3130XL遗传分析仪进行毛细管电泳分离和基因型判定。具体判型方法如附图2所示。2.PPARDG32E对耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的影响效应以白色杜洛克X二花脸资源家系1000余头F2代个体为实验对象进行PPARDG32E与猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状的关联性分析，具体方法如下按照上述步骤1的方法，分别以1000多头F2代猪的猪耳组织基因组的总DNA为模板，在引物对F2和R2的引导下进行PCR扩增，利用ABI公司SNAPshot技术检测5’_TTTTTTTTTTGCTGGAGGGAAGCGAGTGCTCTGGT-3，延伸后3，端的碱基。如检测结果表明自序列表中SEQIDNo4的5，端第121位碱基，即序列表中SEQIDNo3的5，端565位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；自序列表中SEQIDNO4的5’端第121位碱基，即序列表中序列3的5’端第565位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为GA。用标准关联、标记辅助相关分析和F-下降检验分析PPARDG32E与耳性状(耳面积和耳重)，脂肪沉积性状(平均背膘厚)、胴体长和头重性状的相关性。标准关联分析表明PPARDG32E与耳重(P=5.57X1(Γ183)、耳面积(P=1.04Χ1(Γ164)、平均背膘厚(P=3.69Χ10_158)、头重(P=6.68Χ10_134)和胴体长(P=3.46Χ10_134)极显著相关。标记辅助关联分析也显示PPARDG32E对于上述性状影响显著(P<0.001)。此外，在QTL模型中把该SNP作为固定效应后，QTL效应基本消失，该SNP位点可以解释大于97%的QTL效应(表2)。这些结果都证实了PPARDG32E是猪7号染色体上影响耳性状、头重、体长和脂肪沉积的主效突变位点。AA基因型个体的耳面积、耳重、胴体长和头重极显著地高于GA和GG基因型个体，而在脂肪沉积性状(平均背膘厚)方面极显著地低于GA和GG基因型个体。通过群体继代选育不同基因型的个体，可以对种猪的耳面积、耳重、胴体长、头重和脂肪沉积性状获得高效的选育改良效果。表2PPARDG32E对白色杜洛克X二花脸资源家系F2群体目的性状的影响效应<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>a相关计算根据Zhao等报道(2003)。我们用4个模型进行相关性检测y=μ+SNP+固定效应+协变量+y=μ+SNP+固定效应+协变量+e(模型1，SNP模型)；y=μ+固定效应+协变量+e(模型2，简约模型)；y=μ+QTL+SNP+固定效应+协变量+e(模型3，QTL+SNP模型)；y=μ+QTL+固定效应+协变量+e(模型4，QTL模型)；y是性状值，μ是平均值，e表示残差。模型中固定效应为性别和批次，协变量为胴体重。标准相关通过模型1和模型2残差平方和的F比率计算；标记辅助相关通过模型3和模型4残差平方和的F比率计算；F下降检验通过模型1和模型3残差平方和的F比率计算。实施例2=PPARDG32E在6个远缘群体中对耳面积的影响效应。申请人:采集了二花脸猪、杭猪、玉山黑猪、苏钟猪、苏姜猪和苏太猪等6个远缘群体中经产2胎以上的574头成年母猪的耳组织样品，提取基因组DNA。对受试个体采用如下方法进行耳面积的测量将一把标准直尺与猪耳平行放置，通过垂直对焦拍摄高分辨率的猪耳照片，以标准直尺为参照，利用LaicaQwin面积测量软件计算出每个个体的猪耳面积。按照实施例1中步骤1的方法，以上述远缘群体个体的基因组DNA为模板，在引物对F2和R2的引导下进行PCR扩增，利用ABI公司SNAPshot技术检测5，-TTTTTTTTTTGCTGGAGGGAAGCGAGTGCTCTGGT-3，延伸后3，端的碱基(即扩增产物121bp处碱基)。如检测结果表明自序列表中SEQIDNo4的5’端第121位碱基，即序列表中SEQIDNo3的5，端565位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；自序列表中SEQIDNO4的5，端第121位碱基，即序列表中序列3的5’端第565位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为GA。利用SAS9.0软件的GLM程序进行PPARDG32E与耳面积的标准关联分析。结果表明PPARDG32E与各个群体的耳面积性状均显著相关(P<0.05)，AA基因型个体的耳面积显著地高于GA和GG基因型个体(表3)。这些结果再次证实了PPARDG32E是影响猪耳面积的关键因果突变位点(QTN)。表3PPARDG32E在6个远缘群体中对耳面积的影响效应<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求一个影响猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的主效基因，其特征在于cDNA序列具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQIDNo2的多核苷酸，它由2717个碱基组成，其序列如下所示gttgacaggaactgccctgtagaggtccatctgcactcagacccagatgatgccagagct60atgaccgggcctgcaggcgtggcgccgaggggaagtcagccatggagcagccgccggagg120aagcccctgaggtccgggaagaggagaagaaaaaggaagtggcagaggccgaaggaggcc180cagagctcaatgggggaccagagcactcgcttccctccagcagctgtacagatctctccc240agagctgctctccacccgcgctgctggaccagctgcagatgggctgcgacggggcctcgt300gcggtggcctcagcatggagtgccgggtgtgcggggacaaggcatcaggcttccactacg360gagtccacgcttgcgaggggtgcaagggcttcttccgccggacaatccgcatgaagctgg420agtacgagaagtgtgagcggatctgcaagatccagaagaagaaccgcaacaagtgccagt480actgccgcttccagaaatgcctggcgctgggcatgtctcacaacgccattcgctttggcc540ggatgcccgaggcagagaaaaggaagctggtggctgggctgacggcaaacgaggggagtc600agcacaacccgcaggtggctgacctgaaggccttctccaagcacctctacagcgcctacc660tgaaaaacttcaacatgaccaaaaagaaggcccgcgccatcctcaccggcaaggccagcc720acacagcgccctttgtgatccacgacatcgagacgttgtggcaggccgagaagggcctgg780tgtggaagcagctggtgaatggcctgccgccctacaaggagatcagcgtgcacgtcttct840accgctgccagtgcaccacggtggagacggtgcgcgagctgaccgagttcgccaagagca900tccccagcttcgaccacctcttcctcaacgaccaggtgacccttctcaagtacggcgtgc960acgaggccatcttcgccatgctggcctccatcgtcaataaggatgggctgctggtggcca1020acggcactggttttgtcacccgcgagttcctgcgcagcatccgaaagcccttcagtgaca1080tcattgagcccaagtttgagttcgctgtcaagttcaatgccctggaactcgatgatagtg1140acctggctctcttcatcgcagccatcattctgtgtggagaccggccaggcctcatgaacg1200tgtcacaggtggaggccatccaggacaccatcctgcgtgccctcgagttccacctgcagg1260ccaaccaccccgacgcccagtacctcttccccaagctgctgcagaagatggcagacctgc1320ggcagctggtcaccgagcacgcccagatgatgcagcggatcaagaagaccgagaccgaga1380cctcgctgcaccccctgctccaggagatctacaaggacatgtactgaggggtgcgccttg1440ggcctcccaacaggcctcccggagcaggtggacggcgcggggacagacactgcctgcggg1500acgtttccgttgaccagcccgagccctcagccgagcagcaggtcacaggctcagccagac1560gcacggcctcccactccttatagccctgcctcctctccctcctcagctcccctctctctc1620atctctttgctctttcttttccttcctctctcagcctcgctttctctctccccatcctgt1680ctgtccatctttctcttcctgtgagacagtttgtgttatttcaccagcaccaaaacaaga1740ccgctgctttgtcccctgctccccggccccggagcaggagggggcagggcctgccctctg1800caccaaccatcgccttctccagtcttcaaaggacacgcaggccatccaaagaaacactaa1860gctctccgggcctggcttactggggaagccacgcagggcctgggctgagtgccgagcagc1920cctagccacagggtccctgggggaggccgcccacccgaggctgaggctggcaccccatgg1980ctgagcggaccccgctcctgcagcatgcctcagccccacagacgcccacccctcttttgt2040ttttctttgcaccagtcttccaggccagtgccactgtgctggctgctggcggatgccccc2100agcctggatggaggtgggattccctccaggtgggggcgcccacacccccattgaagagga2160gcatgcctcaagggagcagttggtagggaaggcagtgggcagcagacttgattctgaccc2220caggccttgggtgggtcctccctcagcaccccactctctccagcctctgcagcagccact2280gagccctgcccacgctgtgtcagcatcgcacctcccacctccgcagcaccccggcttggc2340ctcagccacgcccttctttctccagccgggcgacactggctccagcccagctgaagcgca2400cactccctggagcgcctccagcacacgcagcacgagcactgaaatcactttacctgcagg2460ttccacaacctcggcctccctcctgaggcaggtggaccacagagctgtgcccctgactcc2520ccgggcgggcggggagccctgctgccccagcccagcactgctcgcaggggaggtacccag2580gatgaactgatcccgctcacttgtgacacccatttgttccagcagctctgctgccctccc2640ctttccttgtgattggcccagccaggcacctggagctctccctgcaccgcttctggtgac2700cagggaccctgccaggc2717；(2)编码序列表中SEQIDNo1的氨基酸，它由441个氨基酸残基组成，其序列如下所示MEQPPEEAPEVREEEKKKEVAEAEGGPELNGEPEHSLPSSSCTDLSQSCSPPALLDQLQM60GCDGASCGGLSMECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRMKLEYEKCERICKIQKK120NRNKCQYCRFQKCLALGMSHNAIRFGRMPEAEKRKLVAGLTANEGSQHNPQVADLKAFSK180HLYSAYLKNFNMTKKKARAILTGKASHTAPFVIHDIETLWQAEKGLVWKQLVNGLPPYKE240ISVHVFYRCQCTTVETVRELTEFAKSIPSFDHFFLNDQVTLLKYGVHEAIFAMLASIVNK300DGLLVANGTGFVTREFLRSIRKPFSDIIEPKFEFAVKFNALELDDSDLALFIAAIILCGD360RPGLMNVSQVEAIQDTILRALEFHLQANHPDAQYLFPKLLQKMADLRQLVTEHAQMMQRI420KKTETETSLHPLLQEIYKDMY441；(3)与序列表中SEQIDNo2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQIDNo2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的主效基因，其特征在于所述cDNA序列的编码序列为序列表中SEQIDNo:2的自5，端第102位至1427位的碱基。3.如权利要求1所述的主效基因，其特征在于主效基因所翻译的蛋白质的名称为过氧化物酶体增殖物激活受体D，来源于猪，具有序列表中SEQIDNo:1的氨基酸残基序列，经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状相关的由SEQIDNo1衍生的蛋白质。4.一种针对种猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状的分子育种方法，其特征在于(1)、使用序列表中SEQIDNo:3和SEQIDNo:4的核苷酸序列，对待测的猪基因组DNA进行PCR扩增，染色对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQIDNo3的5’端第565位碱基或SEQIDNo:4的5’端第121位碱基为G还是A；(2)、如果PCR扩增产物的单核苷酸多态结果是自序列表中SEQIDNo:4的5’端第121位碱基(即自序列表中SEQIDNo:3的5’端第565位碱基)为G，其纯合体的基因型为GG;自序列表中SEQIDNo4的5，端第121位碱基(即自序列表中SEQIDNo3的5，端第565位碱基)为A，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为GA；AA基因型个体耳面积、耳重、胴体长和头重极显著地高于GA基因型和GG基因型个体，在脂肪沉积性状(平均背膘厚)方面显著低于GA基因型和GG基因型个体。5.猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状的主效基因在种猪遗传改良中的应用。全文摘要本发明涉及PPARD主效基因的鉴别、分子育种方法的建立及在种猪遗传改良中的应用。本发明通过利用白色杜洛克×二花脸资源群体和中外猪种远缘群体，通过全基因组扫描连锁定位、目的区域基于高密度SNP标记的IBD精细定位和远缘群体的选择效应分析、最后鉴别了猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长的主效基因-PPARD和关键因果突变位点-G32E。通过现代分子生物学技术检测该位点，利用基因辅助选择的方法，选择有利的基因型个体留种，可以显著提高种猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长性状的选育改良效率。本发明还公开了上述基因及其因果突变位点的鉴别过程以及利用本发明的基因标记进行猪耳性状、脂肪沉积、头重和胴体长选育的方法。文档编号C12Q1/68GK101805739SQ20091018671公开日2010年8月18日申请日期2009年12月15日优先权日2009年12月15日发明者乔瑞敏,任军,姚飞,段艳宇,黄路生申请人:江西农业大学