专利名称：协同诱导成骨分化的bmp组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及协同诱导成骨分化的骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein, BMP)组合物、BMP基因重组病毒组合物和BMP双基因共表达重组病毒，还涉及上述BMP组合物、BMP基因重组病毒组合物和BMP双基因共表达重组病毒的应用。
背景技术：
由外伤、肿瘤、感染或骨折治疗不当等引起的骨缺损、骨折不连接在临床极为常见。其常规治疗方法是骨移植。传统的骨移植材料有自体骨、同种异体骨和异种骨。自体骨具有与受区骨相同的骨性支架，保留有成骨细胞、细胞因子等生物活性物质，具有骨诱导、 骨传导和骨形成作用，成骨迅速，且无免疫排斥反应，安全性好，但其来源有限，常不足以修复大块的骨缺损，且采集时会增加手术创伤，还有可能引起并发症。同种异体骨供骨量大， 无自体取骨的并发症，但细胞成分多已坏死，骨诱导和骨形成作用弱，植入后仅能起到充填和支架作用，且易发生疲劳骨折，同时有可能导致交叉感染。异种骨来源广泛、取材方便，没有同种异体骨可能导致交叉感染的危险，但免疫排斥反应严重，生物相容性差，对骨形成有阻滞作用。因此，多年来人们一直致力于寻找其它理想的骨移植材料和骨再生方法。近年来，组织工程技术的迅猛发展为骨缺损、骨折不连接等疾病的治疗带来了希望，其技术思路是从种子细胞、促进种子细胞增殖和成骨分化的细胞因子和生物支架三方面着手构建组织工程人工骨，以替代传统骨移植材料。目前，骨髓间充质干细胞(BMSCs)和海绵状胶原的研究和应用已从很大程度上解决了组织工程人工骨的种子细胞和生物支架问题，而促进种子细胞增殖和成骨分化的细胞因子和技术的研究相对薄弱，故成为现阶段组织工程人工骨研究的关键环节和热点。BMP是转化生长因子β超家族的成员。目前共分离鉴定了 20余种BMP，其中ΒΜΡ2 和BMP7曾被认为是最有效和最具有临床应用前景的诱导成骨分化因子，并应用于骨缺损、 骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱融合术等骨再生治疗。但近来的研究和临床实践显示重组 BMP2和BMP7制备工艺复杂、成本高，且在体内迅速降解、使用剂量大，副作用明显，临床治疗费用昂贵，患者难以承受；而且，单独使用时诱导成骨分化能力仍不理想。本发明人在前期研究工作中，通过重组腺病毒介导的方法，系统研究了 14种 BMP(BMP2 15)在骨形成中的作用，体外(C2C12和C3H10细胞)和体内(裸鼠)实验结果显示，除BMP2和BMP7以外，BMP4、6和9也具有诱导成骨分化作用，且BMP9的诱导成骨分化作用远强于BMP2和BMP7，是诱导成骨分化作用最强的BMP成员(Characterization of the distinct orthotopic bone-forming activity of 14 BMPs using recombinant adenovirus-mediated gene delivery. Kang Q et al. Gene Therapy,11,1312 1320, 2004.)。但迄今为止，BMP之间是否具有协同诱导成骨分化作用尚未见报道
发明内容
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种协同诱导成骨分化的BMP组合物，可获得较单一 BMP更强的诱导成骨分化作用。为达到此目的，在本发明的第一方面，提供了一种协同诱导成骨分化的BMP组合物，由两种BMP组成一种为BMP9，另一种为BMP2、BMP4、BMP6或BMP7。本发明的目的之二在于提供一种在真核细胞中表达所述协同诱导成骨分化的BMP 组合物的BMP基因重组病毒组合物，通过共同转染将两种BMP基因导入靶细胞并使其高效、 稳定地表达所述协同诱导成骨分化的BMP组合物，不需在体外翻译和分离纯化BMP，从而节省制备BMP的过程和成本。为达到此目的，在本发明的第二方面，提供了一种BMP基因重组病毒组合物，由两种BMP基因重组病毒组成一种为BMP9基因重组病毒，其包含BMP9基因，在真核细胞中表达BMP9 ；另一种为BMP2、BMP4、BMP6或BMP7基因重组病毒，对应地包含BMP2、BMP4、BMP6或 BMP7基因，在真核细胞中对应地表达BMP2、BMP4、BMP6或BMP7。进一步，所述重组病毒为重组腺病毒。本发明的目的之三在于提供一种在真核细胞中表达所述协同诱导成骨分化的BMP 组合物的BMP双基因共表达重组病毒，可通过病毒载体将两种BMP基因导入靶细胞并使其高效、稳定地表达所述协同诱导成骨分化的BMP组合物，不需在体外翻译和分离纯化BMP， 从而节省制备BMP的过程和成本；与前述BMP基因重组病毒组合物相比，具有转染方法简单、避免了 BMP基因重组病毒组合物在共同转染时的相互影响等优点。为达到此目的，在本发明的第三方面，提供了一种协同诱导成骨分化的BMP双基因共表达重组病毒，包含两种BMP基因，一种为BMP9基因，另一种为BMP2、BMP4、BMP6或 BMP7基因，在真核细胞中同时表达两种BMP，一种为BMP9，另一种为BMP2、BMP4、BMP6或 BMP7。进一步，所述重组病毒为重组腺病毒；进一步，所述两种BMP基因由两个独立的含有CMV启动子的表达盒分别调控。本发明的目的之四在于提供所述协同诱导成骨分化的BMP组合物的应用。为达到此目的，在本发明的第四方面，提供了所述协同诱导成骨分化的BMP组合物在制备组织工程人工骨以及治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物中的应用。将所述协同诱导成骨分化的BMP组合物、种子细胞(患者自体或同种异体细胞，如间充质干细胞、成骨干细胞或成纤维细胞等)和生物支架(如海绵状胶原等)在体外共培养，可以制得高效的组织工程人工骨，从而为传统骨移植后新骨形成缓慢或形成不良等技术难题提供一种有效的解决办法。将所述协同诱导成骨分化的BMP组合物和药学上可接受的载体组合，按照药剂学常规方法，可以制得治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物，从而为骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱融合术等骨再生治疗提供一种高效的治疗药物。本发明的目的之五在于提供所述BMP基因重组病毒组合物的应用。为达到此目的，在本发明的第五方面，提供了所述BMP基因重组病毒组合物在制备组织工程人工骨以及治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物中的应用。将所述BMP基因重组病毒组合物共同转染种子细胞(患者自体或同种异体目的细胞，如间充质干细胞、成骨干细胞或成纤维细胞等)，再将感染病毒的种子细胞和生物支架 (如海绵状胶原等)在体外共培养，可以制得高效、价廉的组织工程人工骨，从而为传统骨移植后新骨形成缓慢或形成不良等技术难题提供一种有效的解决办法。将所述BMP基因重组病毒组合物和药学上可接受的载体组合，按照药剂学常规方法，可以制得治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物，从而为骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱融合术等骨再生治疗提供一种高效、价廉的治疗药物。本发明的目的之六在于提供所述BMP双基因共表达重组病毒的应用。为达到此目的，在本发明的第六方面，提供了所述BMP双基因共表达重组病毒在制备组织工程人工骨以及治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物中的应用。将所述BMP双基因共表达重组病毒转染种子细胞(患者自体或同种异体目的细胞，如间充质干细胞、成骨干细胞或成纤维细胞等)，再将感染病毒的种子细胞和生物支架 (如海绵状胶原等)在体外共培养，可制得高效、价廉的组织工程人工骨，从而为传统骨移植后新骨形成缓慢或形成不良等技术难题提供一种有效的解决途径。将所述BMP双基因共表达重组病毒和药学上可接受的载体组合，按照药剂学常规方法，可以制得治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物，从而为骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱融合术等骨再生治疗提供一种高效、价廉的治疗方法。本发明的有益效果在于本发明提供了一种协同诱导成骨分化的BMP组合物，由 BMP9与BMP2、4、6或7组成，可获得较单一 BMP更强的诱导成骨分化作用；还提供了在真核细胞中表达所述协同诱导成骨分化的BMP组合物的BMP基因重组病毒组合物以及BMP双基因共表达重组病毒，可通过病毒载体将BMP9与BMP2、4、6或7的基因导入靶细胞并使其高效、稳定地表达，不需在体外翻译和分离纯化BMP，从而节省制备BMP的过程和成本；与BMP 基因重组病毒组合物比较，BMP双基因共表达重组病毒具有转染方法简单、避免了 BMP基因重组病毒组合物在共同转染时的相互影响等优点；上述协同诱导成骨分化的BMP组合物、 BMP基因重组病毒组合物或BMP双基因共表达重组病毒可以和种子细胞和生物支架结合， 构建组织工程人工骨，从而为传统骨移植后新骨形成缓慢或形成不良等技术难题提供一种有效的解决办法；也可以和药学上可接受的载体组合，制得治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物，从而为骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱融合术等骨再生治疗提供一种高效、价廉的治疗药物。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为BMP基因重组腺病毒及BMP双基因共表达重组腺病毒的构建示意
图2为BMP基因重组腺病毒及BMP双基因共表达重组腺病毒分别转染MEFs (含有不同阶段的间充质干细胞)、C2C12(早期间充质干细胞)和C3H10 (晚期间充质干细胞)后绿色荧光蛋白(GFP)检测鉴定图；图3为BMP双基因共表达重组腺病毒转染C3H10细胞后碱性磷酸酶(ALP)活性检测图4为BMP双基因共表达重组腺病毒转染MEFs细胞后ALP活性检测图；图5为BMP双基因共表达重组腺病毒转染MEFs细胞后骨钙素(OCN)和骨桥素 (OPN)免疫组化染色检测图；图6为BMP双基因共表达重组腺病毒转染MEFs细胞后在裸鼠背部皮下异位成骨的大体标本Micro CT检测图。
:5， -cgcggtaccggatccaccaccatggtggccgggacccgctgtcttc-3' (SEQ ID
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一、BMP基因重组腺病毒的构建和鉴定一、BMP基因重组腺病毒的构建BMP基因重组腺病毒的构建过程如图1所示，包括以下步骤1、BMP基因的扩增根据GenBank报道的5种人BMP的编码基因序列BMP2 (登录号为NM-001200. 2， SEQ ID No. 1)、BMP4(登录号为 NM-001202. 3，SEQ ID No. 2)、BMP6 (登录号为 NM-001718. 4， SEQ ID Νο·3)、ΒΜΡ7(登录号为 ΝΜ-001719. 1，SEQ ID No. 4)禾Π ΒΜΡ9 (登录号为 ΝΜ-016204. 1，SEQ ID No. 5)，设计并合成 5 对引物BMP2F/BMP2R、BMP4F/BMP4R、BMP6F/ BMP6R、BMP7F/BMP7R、BMP9F/BMP9R,分别用于 PCR 扩增 BMP2、4、6、7、9 基因，引物序列如下BMP2F No. 6)，BMP2RBMP4F ID No.8)，BMP4RBMP6F ID No. 10)，BMP6RBMP7F ID No. 12)，BMP7RBMP9F ID No. 14)，BMP9R其中，BMP2F、BMP4F、BMP6F、BMP7F和 BMP9F 的 5，端含有 BamH I 酶切位点(下划线部分)，BMP2R、BMP4R、BMP6R、BMP7R和BMP9R的5，端含有Hind III酶切位点(下划线
部分)。以 EST cDNA(Open Biosystems 公司)为模板，以引物BMP2F/BMP2R、BMP4F/BMP4R、 BMP6F/BMP6R、BMP7F/BMP7R或BMP9F/BMP9R为上下游引物进行PCR扩增，反应条件为95°C
-tgctctagaaagcttctagcgacacccacaaccctccac-3' (SEQ ID No. 7)； -cgcggtaccggatccaccaccatgggcatgattcctggtaaccgaatgctg-3， (SEQ
-tgctctagaaagctttcagcggcacccacatccctctac-3' (SEQ ID No. 9)； -cgcggtaccggatccaccaccatgggcatgccggggctggggcggagggcg-3， (SEQ
-tgctctagaaagctttagtggcatccacaagctcttac-3' (SEQ ID No. 11)； -cgcggtaccggatccaccaccatgggcatgcacgtgcgctcactgcgagctg-3， (SEQ
-tgctctagaaagcttctagtggcagccacaggcccggac-3' (SEQ ID No. 13)； -cgcggtaccggatccaccaccatgggcatgtgtcctggggcactgtgggtg-3， (SEQ5' -tgctctagaaagcttctacctgcacccacactctgccac-3' (SEQ ID No. 15)；预变性3分钟；然后92°C变性20秒、68°C退火30秒、72°C延伸75秒，共循环14次，每循环 1次退火温度降低l°c ；再后95°C变性20秒、55°C退火30秒、72°C延伸75秒，共循环15 20次；最后70°C延伸5分钟。采用10g/L的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切胶回收纯化目的基因，即得BMP2、 4、6、7或9基因。2、BMP基因重组腺病毒穿梭载体的构建将BMP2、4、6、7或9基因用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切后，定向亚克隆至同样经BamH I和Hind III双酶切的携带有GFP基因的重组腺病毒穿梭载体pASG2中， 再电转化感受态大肠杆菌DH10B，用卡那霉素抗性LB平板培养过夜，挑选菌落，提取质粒， 用BamH I和Hind III双酶切鉴定阳性克隆质粒并进行DNA序列分析，结果显示插入基因序列与GenBank报道的BMP2、4、6、7或9编码基因序列一致，即得BMP基因重组腺病毒穿梭载体 pASG2-BMP2、pASG2_BMP4、pASG2_BMP6、pASG2_BMP7 或 pASG2_BMP9。3、BMP基因重组腺病毒载体的构建将BMP 基因重组腺病毒穿梭载体 pASG2-BMP2、pASG2_BMP4、pASG2_BMP6、 PASG2-BMP7或pASG2-BMP9用限制性内切酶Rne I酶切线性化，再与El区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι同时电转化感受态大肠杆菌BJ5183，进行菌体内同源重组，用卡那霉素抗性LB平板培养过夜，挑选较小菌落，用卡那霉素抗性LB液体培养基培养过夜，提取质粒，用限制性内切酶he I酶切鉴定阳性克隆质粒，即得BMP基因重组腺病毒载体 pAd-BMP2、pAd-BMP4、pAd_BMP6、pAd_BMP7 或 pAd_BMP9。4、BMP基因重组腺病毒的包装将人胚胎肾细胞系HEK293细胞以30% 50%的细胞密度接种至T_25培养瓶中， 待细胞生长至50% 70%融合时弃去培养液，采用Lipofectamine 2000转染试剂将BMP 基因重组腺病毒载体 pAd-BMP2、pAd-BMP4、pAd-BMP6、pAd-BMP7 或 pAd_BMP9 转染 HEK293 细胞，转染2 3周后收集细胞，反复冻融3次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，将上清(含病毒)再次转染HEK293细胞以扩增病毒，重复扩增病毒2 3次，最后将上清用氯化铯密度梯度离心法纯化，即得高滴度的BMP基因重组腺病毒Ad-BMP2、Ad_BMP4、Ad_BMP6、Ad_BMP7 或Ad-BMP9。二、BMP基因重组腺病毒的鉴定将 BMP 基因重组腺病毒 Ad-BMP2、Ad_BMP4、Ad_BMP6、Ad_BMP7 或 Ad_BMP9 按感染复数(MOI)为50 200分别转染MEFs、C2C12和C3H10细胞，转染2天后用荧光显微镜检测GFP表达情况以鉴定BMP的表达，结果如图2所示，在BMP基因重组腺病毒Ad_BMP2、 Ad-BMP4、Ad-BMP6、Ad-BMP7、或 Ad-BMP9 转染的 MEFs、C2C12 和 C3H10 细胞中均可见 GFP 表达，说明BMP基因重组腺病毒Ad-BMP2、Ad-BMP4、Ad-BMP6、Ad-BMP7和Ad_BMP9可以将相应的BMP基因导入靶细胞并使其表达相应的BMP。实施例二、BMP双基因共表达重组腺病毒的构建和鉴定一、BMP双基因共表达重组腺病毒的构建BMP双基因共表达重组腺病毒的构建过程如图1所示，包括以下步骤1、BMP双基因的扩增根据GenBank报道的5种人BMP的编码基因序列，设计并合成5对引物BMP2F/BMP2R,BMP4F/BMP4R,BMP6F/BMP6R,BMP7F/BMP7R,BMP9F*/BMP9R*,分别用于 PCR 扩增 BMP2、 4、6、7、9 基因，其中，引物 BMP2F/BMP^、BMP4F/BMP4R、BMP6F/BMP6R、BMP7F/BMP7R 序列与实施例一所述相同，引物BMP9F*/BMP9R*序列如下BMP9F氺5，cgcggtacc.accaccatgggcatgtgtcctggggcactgtgggtg-3‘ (SEQ ID No. 16)，BMP9R* 5' -tgctctagactacctgcacccacactctgccac-3' (SEQ ID No. 17)；其中，引物BMP9F*的5’端含有Kpn I酶切位点(下划线部分)、BMP9R*的5’端含有)(ba I酶切位点(下划线部分)。以实施例一构建的BMP基因重组腺病毒载体pAd-BMP2、pAd_BMP4、pAd_BMP6、 pAd-BMP7 或 pAd-BMP9 为模板，以引物 BMP2F/BMP2R、BMP4F/BMP4R、BMP6F/BMP6R、BMP7F/ BMP7R或BMP9F*/BMP9R*为上下游引物进行PCR扩增，反应条件与实施例一所述相同。采用8g/L的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切胶回收纯化目的基因，即得BMP2、4、 6、7或9基因。2、BMP双基因共表达重组腺病毒穿梭载体的构建将BMP9基因用限制性内切酶Kpn I和)(ba I双酶切后，定向亚克隆至同样经Kpn I和)(ba I双酶切的带有两个独立CMV表达盒的腺病毒穿梭载体PASG2中，再电转化感受态大肠杆菌DH10B，用卡那霉素抗性LB平板培养过夜，挑选菌落，提取质粒，用Kpn I和)(ba I 双酶切鉴定阳性克隆质粒并进行DNA序列分析，结果显示插入基因序列与GenBank报道的 BMP9编码基因序列一致，即得重组腺病毒穿梭载体pASG2-CMVl-CMV2-BMP9。将BMP2、4、6或7基因用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切后，定向亚克隆至同样经BamH I和Hind III双酶切的重组腺病毒穿梭载体pASG2_CMVl-CMV2_BMP9 中，再电转化感受态大肠杆菌DH10B，用卡那霉素抗性LB平板培养过夜，挑选菌落，提取质粒，用BamH I和Hind III双酶切鉴定阳性克隆质粒并进行DNA序列分析，结果显示插入基因序列与GenBank报道的BMP2、4、6或7编码基因序列一致，即得BMP双基因共表达重组腺病毒穿梭载体 pASG2-CMVl-BMP2-CMV2-BMP9、pASG2_CMVl-BMP4-CMV2_BMP9、 PASG2-CMV1-BMP6-CMV2-BMP9 或 pASG2_CMVl-BMP7-CMV2_BMP9。3、BMP双基因共表达重组腺病毒载体的构建将BMP双基因共表达重组腺病毒穿梭载体pASG2-CMVl-BMP2-CMV2-BMP9、 pASG2-CMV 1-BMP4-CMV2-BMP9、ρ A S G2 - CMV 1 -BMP 6 - CMV 2 - BMP 9 或 PASG2-CMV1-BMP7-CMV2-BMP9用限制性内切酶Pme I酶切线性化，再与El区和Ε3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι同时电转化感受态大肠杆菌BJ5183，进行菌体内同源重组，用卡那霉素抗性LB平板培养过夜，挑选较小菌落，用卡那霉素抗性LB液体培养基培养过夜，提取质粒，用限制性内切酶I^c I酶切鉴定阳性克隆质粒，即得BMP双基因共表达重组腺病毒载体 pAd-BMP9/BMP2、pAd_BMP9/BMP4、pAd_BMP9/BMP6、pAd_BMP9/BMP7。4、BMP双基因共表达重组腺病毒的包装将人胚胎肾细胞系HEK293细胞以40 % 60 %的细胞密度接种至T_25培养瓶中，待细胞生长至30% 50%融合时弃去培养液，采用Lipofectamine 2000转染试剂将BMP双基因共表达重组腺病毒载体pAd-BMP9/BMP2、pAd_BMP9/BMP4、pAd_BMP9/BMP6或 pAd-BMP9/BMP7转染HEK293细胞，转染2 3周后收集细胞，反复冻融3次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，将上清(含病毒)再次转染HEK293细胞以扩增病毒，重复扩增病毒2 3次，最后将上清用氯化铯密度梯度离心法纯化，即得高滴度的BMP双基因共表达重组腺病毒 Ad-BMP9/BMP2、Ad-BMP9/BMP4、Ad_BMP9/BMP6 或 Ad_BMP9/BMP7。二、BMP双基因共表达重组腺病毒的鉴定将BMP 双基因共表达重组腺病毒 Ad-BMP9/BMP2、Ad-BMP9/BMP4、Ad_BMP9/BMP6 或 Ad-BMP9/BMP7按MOI为50 200分别转染MEFs、C2C12和C3H10细胞，感染2天后用荧光显微镜观察GFP表达情况以鉴定BMP的表达，结果如图2所示，在BMP双基因共表达重组腺病毒 Ad-BMP9/BMP2、Ad-BMP9/BMP4、Ad-BMP9/BMP6 或 Ad_BMP9/BMP7 转染的 MEFs、C2C12 和 C3H10细胞中均可见GFP表达，表明BMP双基因共表达重组腺病毒Ad-BMP9/BMP2、Ad_BMP9/ BMP4、Ad-BMP9/BMP6或Ad_BMP9/BMP7可以将相应的两种BMP基因导入靶细胞并使其表达相应的两种BMP。实验例一、BMP9与BMP2、4、6或7协同诱导C3H10细胞成骨分化作用检测早期成骨分化标志——ALP活性检测将C3C10细胞接种至IOOmm2培养皿中，待细胞贴壁后，分别将BMP双基因共表达重组腺病毒 Ad-BMP9/BMP2、Ad-BMP9/BMP4、Ad_BMP9/BMP6 或 Ad_BMP9/BMP7 按 MOI 为 50 200转染C3C10细胞，转染后第9天，用细胞培养裂解液(Lot#27134901，Promega公司)裂解细胞，离心取上清，用碱性磷酸酶化学发光检测试剂盒(SEAP Chemiluminescent Assay Kit, BD Clontech公司)进行ALP活性检测，按照试剂盒说明书操作。结果如图3所示，BMP双基因共表达重组腺病毒Ad-BMP9/BMP2、Ad_BMP9/BMP4、 Ad-BMP9/BMP6或Ad_BMP9/BMP7转染的C3C10细胞的ALP活性明显高于相应对照组，显示 BMP9与BMP2、4、6或7对早期成骨分化均有协同诱导作用，其中BMP9与BMP2或4的协同诱导作用较强。实验例二、BMP9与BMP2、4、6或7协同诱导MEFs细胞成骨分化作用检测在无菌条件下，将孕14.5天(E14.5)胚鼠自母体内取出，除去头部、尾部、四肢及所有脏器，仅保留胚鼠躯干。将捣碎后的胚鼠躯干在温度37°C条件下，用质量分数为 0. 25%的胰酶溶液消化10 15分钟，再转移至IOOmm2培养皿中，用完全DMEM培养基在温度为37°C、体积分数为5%的CO2条件下培养，24小时后更换新鲜培养基并去除未贴壁细胞，以后每3天更换新鲜培养基，培养12 15天至细胞接近全部融合，即得MEFs细胞。1、早期成骨分化标志——ALP活性检测将MEFs细胞接种至IOOmm2培养皿中，待细胞贴壁后，分别将BMP双基因共表达重组腺病毒 Ad-BMP9/BMP2、Ad-BMP9/BMP4、Ad-BMP9/BMP6 或 Ad-BMP9/BMP7 按 MOI 为 50 200 转染MEFs细胞，按照实验例一中所述方法进行ALP活性检测。结果如图4所示，BMP双基因共表达重组腺病毒Ad-BMP9/BMP2、Ad_BMP9/BMP4、 Ad-BMP9/BMP6或Ad_BMP9/BMP7转染的MEF s细胞的ALP活性明显高于相应对照组，显示 BMP9与BMP2、4、6或7对早期成骨分化均有协同诱导作用，其中BMP9与BMP2或4的协同诱
导作用较强。2、晚期成骨分化标志——OCN和OPN检测 将MEFs细胞接种至底部铺有盖玻片的24孔板中，待细胞贴壁后，分别将BMP双基因共表达重组腺病毒 Ad-BMP9/BMP2、Ad-BMP9/BMP4、Ad-BMP9/BMP6 或 Ad_BMP9/BMP7 按 MOI为50 200转染MEFs细胞，转染后第9天，取细胞爬片，用多聚甲醛固定后，采用SP法分别进行OCN和OPN免疫组化染色检测。结果如图5所示，BMP双基因共表达重组腺病毒Ad-BMP9/BMP2、Ad_BMP9/BMP4、 Ad-BMP9/BMP6或Ad_BMP9/BMP7转染的MEFs细胞的OCN和OPN(棕黄色染色)含量明显高于相应对照组，显示BMP9与BMP2、4、6或7对晚期成骨分化均有协同诱导作用，其中BMP9 与BMP2或4的协同诱导作用较强。3、裸鼠体内成骨检测将MEFs细胞接种至IOOmm2培养皿中，待细胞贴壁后，分别将BMP双基因共表达重组腺病毒Ad-BMP9/BMP2或Ad_BMP9/BMP4按MOI为50 200转染MEFs细胞，待感染细胞密度达到80% 90%时，胰酶消化，离心，细胞沉淀用无菌PBS 50 100 μ 1重悬，注射至裸鼠(Taconic Farms公司)背部皮下，5周后进行micro-CT扫描。结果如图6所示，BMP双基因共表达重组腺病毒Ad-BMP9/BMP2或Ad_BMP9/BMP4转染的MEFs细胞在裸鼠体内的成骨体积明显大于相应对照组(见图中画圈部分)，显示BMP9 与BMP2或4对体内成骨均有协同诱导作用。综合上述实验结果，BMP双基因共表达重组腺病毒Ad-BMP9/BMP2、Ad-BMP9/BMP4、 Ad-BMP9/BMP6 或 Ad_BMP9/BMP7 转染的 C3H10 或 MEFs 细胞可以同时表达 BMP9 与 BMP2、4、6 或7，并协同诱导OHIO或MEFs细胞向成骨母细胞分化，感染病毒的MEFs细胞可以在裸鼠体内成骨，表明BMP9与BMP2、4、6或7之间均具有协同诱导成骨分化作用。BMP9与BMP2、 4、6或7的协同诱导成骨分化作用在实际应用时有多种形式，包括但不限于(1)采用基因重组技术分别制备BMP9与BMP2、4、6或7，再将其组成协同诱导成骨分化的BMP组合物；(2) 以病毒(如腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒等)为基因载体，分别制备BMP9基因重组病毒与BMP2、4、6或7基因重组病毒，再将其组成协同诱导成骨分化的BMP基因重组病毒组合物；(3)以病毒(如腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒等)为基因载体，制备BMP9与BMP2、 4、6或7双基因共表达重组病毒。其中，采用(2)和(3)两种重组病毒形式，不需在体外翻译和分离纯化BMP，可以节省制备BMP的过程和成本，同时，重组病毒可通过自身抗原性刺激患者产生免疫反应而清除，避免了重组病毒感染的细胞在体内无限制诱导成骨的问题。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.协同诱导成骨分化的BMP组合物，其特征在于由两种BMP组成一种为BMP9，另一种为 BMP2、BMP4、BMP6 或 BMP7。
2.在真核细胞中表达权利要求1所述协同诱导成骨分化的BMP组合物的BMP基因重组病毒组合物，其特征在于由两种BMP基因重组病毒组成一种为BMP9基因重组病毒，其包含BMP9基因，在真核细胞中表达BMP9 ；另一种为BMP2、BMP4、BMP6或BMP7基因重组病毒， 对应地包含BMP2、BMP4、BMP6或BMP7基因，在真核细胞中对应地表达BMP2、BMP4、BMP6或 BMP7。
3.根据权利要求2所述的BMP基因重组病毒组合物，其特征在于所述重组病毒为重组腺病毒。
4.在真核细胞中表达权利要求1所述协同诱导成骨分化的BMP组合物的BMP双基因共表达重组病毒，其特征在于包含两种BMP基因一种为BMP9基因，另一种为BMP2、BMP4、 BMP6或BMP7基因，在真核细胞中同时表达两种BMP，一种为BMP9，另一种为BMP2、BMP4、 BMP6 或 BMP7。
5.根据权利要求4所述的BMP双基因共表达重组病毒，其特征在于所述重组病毒为重组腺病毒。
6.根据权利要求5所述的BMP双基因共表达重组病毒，其特征在于所述两种BMP基因由两个独立的含有CMV启动子的表达盒分别调控。
7.权利要求1所述的协同诱导成骨分化的BMP组合物在制备组织工程人工骨以及治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物中的应用。
8.权利要求2所述的BMP基因重组病毒组合物在制备组织工程人工骨以及治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物中的应用。
9.权利要求4所述的BMP双基因共表达重组病毒在制备组织工程人工骨以及治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了协同诱导成骨分化的BMP组合物，由BMP9与BMP2、4、6或7组成，可获得较单一BMP更强的诱导成骨分化作用；还公开了在真核细胞中表达所述协同诱导成骨分化的BMP组合物的BMP基因重组病毒组合物以及BMP双基因共表达重组病毒，可将BMP9与BMP2、4、6或7的基因导入靶细胞并使其高效、稳定地表达，不需在体外翻译和分离纯化BMP，节省制备BMP的过程和成本；本发明的BMP组合物、BMP基因重组病毒组合物和BMP双基因共表达重组病毒可以用于制备组织工程人工骨以及治疗骨缺损、骨延迟愈合、骨折不连接和脊柱疾病的药物。
文档编号C12N15/86GK102205112SQ200910191458
公开日2011年10月5日 申请日期2009年11月11日 优先权日2009年11月11日
发明者何百成, 何通川, 康权, 罗小辑, 罗进勇, 邓忠良, 陈亮 申请人:重庆医科大学