专利名称：：一种复合酶制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种黑曲霉液态发酵生产酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的方法。
背景技术：
：甘露聚糖酶对甘露聚糖原料的分解原理e-甘露聚糖酶(e-1，4-D-mannanmannohy-drolase，EC3*2*1'78)是一类能水解含{3-1，4-D-甘露糖苷键的甘露聚糖(包括均一甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖)的半纤维素酶，广泛存在于动植物和微生物中。甘露聚糖是以l，4-e-D-吡喃甘露糖苷键连结而成的线状多糖，如果主链某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过l，6-a-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝。则称之为异甘露聚糖。主要有半乳甘露聚糖(galactornannan)、葡萄甘露聚糖(glucomannan)、半乳葡萄甘露聚糖(galactoglucomannan)。上述物质构成了植物半纤维素的第二大组份，这些物质的降解主要依靠的酶就是e-甘露聚糖酶。完全降解还需要e-甘露糖苷酶(e-mannosidase)、外切{3-D-甘露聚糖酶(Exo-{3-D秋annanase)、葡萄糖苷酶(glucosidase)，半乳糖苷酶(galactosidase)等支链酶的协同作用。现行的甘露聚糖酶检测底物主要是甘露糖与葡萄糖聚合的甘露聚糖，能够体现出除半乳糖苷酶外的其他全部酶组分的协同效果，但是对于自然界中的半乳糖含量比较多的甘露聚糖原料，此酶还不足以对底物进行彻底的分解，由于半乳糖支链的存在，还会影响到其他酶分子对底物直链部分的分解作用。甘露聚糖酶在饲料上的应用e-甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中，可将甘露聚糖等多糖降解为甘露寡糖等低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物各种营养索的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用。近年来随着对自然界半纤维素资源的开发应用，微生物e-甘露聚糖酶的开发和利用研究进入了一个新阶段。研究表明在富含e-甘露聚糖的动物饲粮中添加外源e-甘露聚糖酶可以有效消除e-甘露聚糖的抗营养作用，从而提高动物的生长性能。e-甘露聚糖酶的作用机理主要表现在以下几个方面。①降低消化道内容物粘度。甘露聚糖在e-甘露聚糖酶的作用下降解为低聚糖，大大减少了e-甘露聚糖与水分子的相互作用，从而降低肠道内容物的粘度，有利于营养物质的进一步消化吸收。②破坏植物性饲料细胞壁结构，使营养物质与消化酶充分接触。植物细胞中淀粉和蛋白质等营养物质被细胞壁包裹，细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶等组成的一种复杂化合物，单胃动物不能很好地消化这一类物质。饲料中适当地添加能够分解这类物质的酶，可以破坏饲料中存在的植物细胞壁，使营养物质释放出来，提高饲料的营养价值。e-甘露聚糖是半纤维素的主要组成成分之一，添加e-甘露聚糖酶可起到降解细胞壁的作用。③改善肠道微生物菌群和提高肠黏膜的完整性。甘露聚糖的降解产物为甘露低聚糖(MOS)，它能显著地促进动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌的增殖，减少病原菌在肠道的定植，调节动物的免疫反应，提高肠黏膜的完整性，最终提高动物的生产性能。甘露寡糖可选择性地抑制有害微生物在肠道中的增殖。微生物病原菌的第一步是结合在消化道肠黏膜表面，这种结合是特异性的，其机理为细菌细胞壁表面蛋白如植物凝血素与动物肠道黏膜上皮细胞表面糖脂或糖蛋白的糖残基结合。当肠道内存在一定量的MOS等寡糖时，可结合细菌的植物凝血素，而减少了与肠黏膜上皮细胞结合的机会，这样外源病菌就会被排出体外，根据竞争性排阻作用，促进有益菌在肠道中增殖。④e-甘露聚糖酶能够提高动物的生长性能。e-甘露聚糖酶可有效地改进猪与家禽等单胃动物的生长性能。特别是在应激条件下，e-甘露聚糖酶可使其生长性能显著改善。一般认为类胰岛素生长因子((IGF-I)是畜禽真正的生长调控因子。生长激素(GH)的促生长作用是IGF-I介导的。IGF-I作用于生长组织，刺激细胞对氨基酸的利用从而促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，最终导致蛋白质的净增长。在石油上的应用在石油进行二次开采时，为打通地下油的通道，采取用瓜尔胶携带沙子支撑细缝，在瓜尔胶在把沙子带入细缝后，要降解成水样，利于油液的渗透。甘露聚糖酶即可起到这样的作用，并且甘露聚糖酶还具有作用时间长，可以调控和减轻环境污染等优点国内现在多利用固体发酵生产甘露聚糖酶，发酵产品中除含有需要的酶成分外，还会含有发酵的原料废渣、发酵菌体和杂菌，会影响到产品在饲料上的应用效果；在石油上应用，由于固态残渣过多会堵塞石油的渗透缝隙，达不到疏通地下油道的效果。本发明目的在于提供一种采用菌体液体发酵，同时生产出含有液体酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶两种复合酶制剂，这样就可以更彻底的分解甘露聚糖大分子成为低聚糖直至分解成为甘露糖，在饲料和石油上的应用效果更好。本发明复合酶制剂，其包含以下酶种及活性液体酸性e—甘露聚糖酶，1300u/ml，液体a-半乳糖苷酶，300u/ml。本发明复合酶制剂的制备方法该方法包括以下工艺步骤将斜面培养的黑曲霉，经液态发酵，得到发酵菌种；1)在无菌操作下，把斜面种子接入，在12rC下灭菌30分钟并冷却至29。C的700立升种子罐中，在罐压O.05MPa，29°C±1°C的条件下培养48-60小时，经灭菌后的移种管路转入在12rC灭菌30分钟并冷却到29。C士rC含10T培养基的发酵罐中，在通风量l:O.6，罐压O.05MPa，温度29。C±1°C的条件下培养100-125小时，达到放罐标准后，经灭菌后的放料管路放入灭菌后的絮凝罐加入絮凝剂，在经清洗处理过后的板框压滤机进行压滤，清液打入循环罐进入超滤膜浓縮器进行超滤浓縮至要求的活力后，即制得液体酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的复合酶制剂。所述种子罐的培养基是1%魔芋粉，8%麸子，2%硫酸铵，灭菌后pH值为4.6-5.3。所述发酵罐的培养基是1%魔芋粉，8%麸子，2%硫酸铵，0.2%磷酸二氢钾、0.5%氯化钙，灭菌后pH值为4.6-5.3。所述液体酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶，应用在饲料和石油上。本发明的优点及技术指标i、一次一菌株液态深层发酵，产品同时含有液体酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶。2、发酵酶活酸性e—甘露聚糖酶1300u/ml，a-半乳糖苷酶300u/ml。3、此两种酶在pH2.0-7.5，温度20-70范围内均可较高的发挥酶活力，能够满足动物不同消化道环境的酸碱要求和不同石油开采深度对温度的要求。具体实施例方式在无菌操作下，把黑曲霉斜面种子接入，在12rC下灭菌30分钟并冷却至29。C的700立升种子罐中，在不断通入无菌空气(通风量为1:0.6)罐压0.05MPa，29°C±1°C的条件下培养48-60小时，经化验检测成熟这到标准后，经灭菌后的移种管路转入在12rC灭菌30分钟并冷却到29。C士rC含10T培养基的发酵罐中，在通风量l:O.6，罐压O.05MPa，温度29。C士1。C的条件下培养100-125小时，达到放罐标准后，经灭菌后的放料管路放入灭菌后的絮凝罐加入絮凝剂硅藻土助滤剂，在经清洗处理过后的板框压滤机进行压滤(浑液回流絮凝罐)，清液打入循环罐进入超滤膜浓縮器进行超滤浓縮至要求的活力后，化验合格后，即制得液体酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的复合酶制剂。将食用淀粉或稻壳粉投入混合机内，按淀粉或稻壳粉体积的75%比例加入成品酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶浓縮液，在混合机内搅拌5-10分钟以上，待混均后，放入干燥盘中，送入烘房45。C以下进行干燥，在干燥过程中要间歇翻盘，大约36小时可达到干燥要求，按上述操作再进行第二次吸附干燥，然后粉碎混粉，检验合格后即为成品粉剂酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的复合酶产品。各种发酵原料的选定原料+2%硫酸铵添加量％酶活U/mL魔芋粉0.6219豆粕0.6128菜籽粕0.697麸皮6103稻糠687玉米皮623原料不同比例的确定魔芋粉添加量％+6%麸皮+2%硫酸铵酶活U/mL0.54220.88511.09501.259251.57202.0324麸皮添加量％+1%魔芋粉+2%硫酸铵酶活U/mL273148536926898710920由于在发酵过程中我们添加了0.2%的磷酸二氢钾和0.5。/。的氯化钙来缓解发酵过程中pH的变化，使产品的发酵酶活达到1300u/ml。本发明在饲料上的应用及效果试验测定了添加此复合酶量控制在O.04%—0.05%之间对饲喂玉米-大豆日粮的产蛋母鸡性能的影响。结果表明如表l，在日粮中添加此复合酶可以显著提高母鸡日产蛋率，降低蛋料比和破蛋率。试验还表明在日粮中添加e-甘露聚糖酶也可以增加产蛋母鸡早期的平均蛋重，提高产蛋量，明显延迟产蛋高峰的急剧下降。表l产品饲喂蛋鸡的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明复合酶制剂在石油上的使用及效果试验在每kg石油压裂液中添加O.6g本产品的应用效果如表2原料黏度下降速度采油量(吨)携沙压裂液不下降--携沙压裂液+过硫酸铵黏度迅速下降39.8携沙压裂液+此产品黏度下降可控，持续下降63.7此表表明在携沙压裂液中添加此产品可以达到降低压裂液黏度的要求，又因其具有黏度下降慢，携沙效果好等优点使采油的时间和量得到了提高，可多采油60%。权利要求1.一种复合酶制剂，其特征在于包含以下酶种及活性液体酸性β-甘露聚糖酶，1300u/ml，液体α-半乳糖苷酶，300u/ml。2.如权利要求l所述复合酶制剂的制备方法其特征在于该方法包括以下工艺步骤将斜面培养的黑曲霉，经液态发酵，得到发酵菌种；1)在无菌操作下，把斜面种子接入，在12rC下灭菌30分钟并冷却至29。C的700立升种子罐中，在罐压O.05MPa，29。C士1。C的条件下培养48-60小时，经灭菌后的移种管路转入在12rC灭菌30分钟并冷却到29i:士rC含10T培养基的发酵罐中，在通风量1:0.6，罐压0.05MPa，温度29。C±1°C的条件下培养100-125小时，达到放罐标准后，经灭菌后的放料管路放入灭菌后的絮凝罐加入絮凝剂，在经清洗处理过后的板框压滤机进行压滤，清液打入循环罐进入超滤膜浓縮器进行超滤浓縮至要求的活力后，即制得液体酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的复合酶制剂。3.根据权利要求2所述的复合酶制剂的制备方法，其特征在于所述种子罐的培养基是1%魔芋粉，8%麸子，2%硫酸铵，灭菌后pH值为4.6-5.3。4.根据权利要求2所述的复合酶制剂的制备方法，其特征在于所述发酵罐的培养基是1%魔芋粉，8%麸子，2%硫酸铵，0.2%磷酸二氢钾、0.5%氯化钙，灭菌后pH值为4.6-5.3。5.如权利要求i所述的液体酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶，在饲料和石油上的应用。全文摘要本发明公开了一种复合酶制剂及其制备方法和应用，本发明复合酶制剂，其包含以下酶种及活性液体酸性β-甘露聚糖酶，1300u/ml，液体α-半乳糖苷酶，300u/ml。本发明复合酶制剂的制备方法，将斜面培养的黑曲霉，经液态发酵，得到液体酸性β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的复合酶制剂。此两种酶在pH2.0-7.5，温度20-70范围内均可较高的发挥酶活力，能够满足动物不同消化道环境的酸碱要求和不同石油开采深度对温度的要求。文档编号C12N9/42GK101608175SQ20091030486公开日2009年12月23日申请日期2009年7月27日优先权日2009年7月27日发明者任树文,勇何,孟令文,张丰杰,李树俊,梁东升,王福兴,蔡松岩,薛立新申请人:肇东市日成酶制剂有限公司